组织芯片检测LIMK1、uPA、uPAR在人胃腺癌中表达的临床病理意义

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分类号Ｒ５７３密级公开ＵＤＣ６１０学校代码１０５５５考义梦硕士学位论文（专业学位）组织芯片检测ＬＩＭＫ１、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ在人胃腺癌中表达的临床病理意义Ｉ研究生姓名：刘炯明指导教师、职称：张琍教授？专业学位类别（领域）：临床医学（内科学）．研究方向（胃肠道肿瘤）：内科学所在学院：南华大学第二临床学院二。一八年五月 ＠系考太拿组织芯片检測ＬＩＭＫ１、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ在人胃腺癌中表达的临床病理意义论文作者签名》：土如习丨兩指导教师签名一论文评阅人１：萎政教桴重庆屎科欠学附属第保院评阅人２：田德安教桴华中科枝大学附属同济医院一答辩委员会主席：杨铭教捋永州市第人民阪院委员张明亮教授南华大学附属第二民院委员２：二民陈宏辉主仟医师南华大学附属第Ｐ完委员３：宁玄锋副主仟民师南华太学附属第二民院委员４：柯涛副主仔医师南屮人学附属第二民院答辩日期：山说年Ｙ月义曰 ＾南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名如細ｒ月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读Ｍ（硕博）士学位期间在导师指导下完成的／学位论文＾本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名位论义发文表。本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，Ｓ卩：学校有权保留学以采，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可送交用复印、缩印或其它手段保留学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定学位论文。同意学校将论文加入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》，并按科《中学信国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。同意授权中国息技术研宄所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。作者签＂名：１屮刁既号…％洛年申ｙ月＞５曰导师签名：Ｊ月曰＃故副 组织芯片检测LIMK1、uPA、uPAR在人胃腺癌中表达的临床病理意义摘要：目的通过检测LIMK1、uPA、uPAR在人胃腺癌组织、癌旁组织、正常胃粘膜中的表达，研究它们与临床病理特征的关联，探索三者在人胃腺癌中的作用及相关性。方法收集南华大学附属第二医院手术切除的45例人胃腺癌组织标本，相应癌旁组织45例，正常胃粘膜10例。将所采集的标本制成10x10组织芯片。运用免疫组织化学技术，在不同组织中检测LIMK1、uPA、uPAR蛋白表达水平。结果（1）在正常胃粘膜、癌旁组织、胃腺癌组织中，LIMK1阳性表达率分别为30.00%、42.22%、75.56%（p<0.05）。LIMK1表达与性别、年龄无相关性。其在胃癌TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期人胃腺癌组织中阳性表达率分别为33.33%、66.67%、91.67%，差异明显（p<0.05）。高分化、中分化、低分化组表达阳性率分别为37.50%、50.00%、90.32%，差异有统计意义（p<0.05）。肿瘤直径≥3cm组LIMK1阳性率为89.29%，远高于<3cm组的52.94%（p<0.05）。淋巴结转移组阳性率90.00%，显著高于无淋巴结转移组的46.67%（p<0.05）。（2）在正常胃粘膜、癌旁组织、胃腺癌组织中，uPA阳性表达率分别为20.00%、35.56%、71.11%（p<0.05）。uPA表达与性别、年龄无显著关联。其在胃癌TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期人胃腺癌组织中阳性表达率分别为50.00%、53.33%、87.50%,差异显著（p<0.05）。高分化、中分化、I 低分化组表达阳性率分别为37.50%、66.67%、80.65%，有显著差异（p<0.05）。肿瘤直径≥3cm组uPA阳性率为82.14%，明显高于<3cm组的52.94%（p<0.05）。淋巴结转移组阳性率83.33%，显著高于无淋巴结转移组的46.67%（p<0.05）。（3）uPAR在正常胃粘膜中不表达，在胃腺癌组织、癌旁组织中阳性表达率分别为60.00%、26.67%（p<0.05）。uPAR表达与性别、年龄无相关性。其在胃癌TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期人胃腺癌组织中阳性表达率分别为50.00%、33.33%、79.17%，差异具有显著性（p<0.05）。高分化、中分化、低分化组表达阳性率分别为25.00%、50.00%、70.97%（p<0.05），差异明显（p<0.05）。肿瘤直径≥3cm组uPAR阳性率为71.43%，明显高于<3cm组的41.18%（p<0.05）。淋巴结转移组阳性率73.33%，远高于无淋巴结转移组的33.33%（p<0.05）。（4）在34例LIMK1阳性表达样本中，有28例uPA表达阳性；在13例uPA表达阴性样本中，有7例LIMK1表达阴性(r>0，p<0.05)。34例LIMK1表达阳性样本中，有25例uPAR表达阳性；18例uPAR表达阴性样本中，有9例LIMK1表达阴性(r>0，p<0.05)。32例uPA阳性表达样本中,有26例uPAR表达阳性；18例uPAR表达阴性样本中，有12例uPA表达阴性(r>0，p<0.05)。LIMK1与uPA，LIMK与uPAR，uPA与uPAR在人胃腺中的表达呈现出正相关性。结论（1）LIMK1、uPA、uPAR在人胃腺癌组织中高表达，可能是人胃腺癌发生的早期事件。（2）LIMK1、uPA、uPAR的表达与胃腺癌TNM分期、组织分化、 肿瘤大小、淋巴结转移有关，其表达水平的变化可能与人胃腺癌的侵袭、转移存在关联。（3）人胃腺癌中LIMK1、uPA、uPAR两两间蛋白表达具有相关性,且呈正相关关系。关键词：免疫组织化学；人胃腺癌；LIMK1；uPA；uPARIII CLINICOPATHOLOGICSIGNIFICANCEOFEXPRESSIONOFLIMK1,UPAANDUPARINHUMANGASTRICADENOCARCINOMADETECTEDBYTISSUECHIPLiuJiongming(Gastroenterology)Directedby:ZhangLiAbstract：ObjectiveToinvestigatethecorrelationofLIMK1,uPAanduPARwithclinicopathologicalcharacteristicsbydetectingtheirexpressioninhumangastricadenocarcinoma,pericarcinomatoustissueandnormalgastricmucosa,andtoexploretheeffectandcorrelationofLIMK1,uPAanduPARingastricadenocarcinoma.MethodsTotally45casesofhumangastricadenocarcinomaspecimen,45casesofcorrespondingpericarcinomatoustissueand10casesofnormalgastricmucosaexcisedinthesecondhospitalaffiliatedtouniversityofsouthchinawerecollected.Thecollectedspecimensweremadeinto10*10tissuechiptodetecttheexpressionlevelofLIMK1,uPA,uPARproteinsindifferenttissuesbyimmunohistochemistrytechnique.Results(1)ThepositiveexpressionrateofLIMK1innormalgastricmucosa,pericarcinomatoustissueandgastricadenocarcinomawas30.00%,42.22%and75.56%,respectively(p<0.05).TherewasnocorrelationbetweenLIMK1expressionandsexorage.ThepositiveexpressionrateofLIMK1inTNMstageI,stageIIandstageIIIgastricadenocarcinomawas33.33%,V 66.67%and91.67%,respectively,withsignificantdifferenceamongthem(p<0.05).ThepositiveexpressionrateofLIMK1inhigh,moderateandlowdifferentiationgroupwas37.50%,50.00%and90.32%,respectively,andthedifferencewasstatisticallysignificant(p<0.05).ThepositiveexpressionrateofLIMK1intumordiameter≥3cmgroupwas89.29%,whichwasconsiderablyhigherthan52.94%intumordiameter<3cmgroup(p<0.05).ThepositiveexpressionrateofLIMK1inlymphnodemetastasisgroupwas90.00%,whichwasdramaticallyhighthan46.67%innon-lymphnodemetastasisgroup(p<0.05).(2)ThepositiveexpressionrateofuPAinnormalgastricmucosa,pericarcinomatoustissueandgastricadenocarcinomawas20.00%,35.56%and71.11%,respectively(p<0.05).NosignificantcorrelationbetweenuPAexpressionandsexoragewasfound.ThepositiveexpressionrateofuPAinTNMstageI,stageIIandstageIIIgastricadenocarcinomawas50.00%,53.33%and87.50%,respectively,anddifferenceamongthemhadstatisticalsignificance(p<0.05).ThepositiveexpressionrateofuPAinhigh,moderateandlowdifferentiationgroupwas37.50%,66.67%and80.65%,respectively,andtherewasasignificantdifferenceamongthesethreegroups(p<0.05).ThepositiveexpressionrateofuPAintumordiameter≥3cmgroupwas82.14%,whichwasobviouslyhigherthan52.94%intumordiameter<3cmgroup(p<0.05).ThepositiveexpressionrateofuPAinlymphnodemetastasisgroupwas83.33%,whichwasprominentlyhigherthan46.67%innon-lymphnodeVI metastasisgroup(p<0.05).(3)NoexpressionofuPARinnormalgastricmucosawasobserved,anditspositiveexpressionrateingastricadenocarcinomaandpericarcinomatoustissuewas60.00%and26.67%,respectively(p<0.05).TheuPARexpressionwasnotcorrelatedwithsexorage.ThepositiveexpressionrateofuPARinTNMstageI,stageIIandstageIIIgastricadenocarcinomawas50.00%,33.33%and79.17%,respectively,andstatisticaldifferencewasfoundamongthem(p<0.05).ThepositiveexpressionrateofuPARinhigh,moderateandlowdifferentiationgroupwas25.00%,50.00%and70.97%,respectively,andthedifferenceshowedstatisticalsignificance(p<0.05).ThepositiveexpressionrateofuPARintumordiameter≥3cmgroupwas71.43%,whichwasobviouslyhigherthan41.18%intumordiameter<3cmgroup(p<0.05).ThepositiveexpressionrateofuPARinlymphnodemetastasisgroupwas73.33%,whichwasprominentlyhigherthan33.33%innon-lymphnodemetastasisgroup(p<0.05).(4)Inthe34casesofspecimenswithLIMK1positiveexpression,uPApositiveexpressionwasdiscoveredin28cases;inthe13casesofspecimenswithuPAnegativeexpression,LIMK1negativeexpressionwasdiscoveredin7cases(r>0，p<0.05).Inthe34casesofspecimenswithLIMK1positiveexpression,uPARpositiveexpressionwasfoundin25cases;inthe18casesofspecimenswithuPARnegativeexpression,LIMK1negativeexpressionwasfoundin9cases(r>0，p<0.05).Inthe32casesofspecimenswithuPAVII positiveexpression,uPARpositiveexpressionwasobservedin26cases;inthe18casesofspecimenswithuPARnegativeexpression,uPAnegativeexpressionwasobservedin12cases(r>0，p<0.05).TherewasapositivecorrelationbetweentheLIMK1expressionanduPAexpression,betweenLIMKexpressionanduPARexpression,betweenuPAexpressionanduPARexpressioninhumangastricgland.Conclusion(1)TheLIMK1,uPAanduPARarehighlyexpressedinhumangastricadenocarcinomatissue,whichmightbetheearlyeventinthepathogenesisofhumangastricadenocarcinoma.(2)TheexpressionofLIMK1,uPAoruPARarecorrelatedwithTNMstagingofgastriccarcinoma,tissuedifferentiation,tumorsize,orlymphaticmetastasis,thechangesofexpressionlevelofLIMK1,uPAoruPARmaybeassociatedwiththeinvasionormetastasisofhumangastricadenocarcinoma.(3)TheexpressionofanytwoofLIMK1,uPAanduPARproteinsinhumangastricadenocarcinomaarepositivelycorrelatedwitheachother.Keywords:Immunohistochemistry;Humangastricadenocarcinoma;LIMK1;uPA;uPARVIII 主要缩略语英文索引缩略词英文全称中文全称ECMextracellularmatrix细胞外基质MMPsmatrixmetalloproteinases基质金属蛋白酶EMTepithelial–mesenchymaltransitions上皮间质转化LIMK1LIMkinase1LIM蛋白激酶1COFILINcofilin微丝切割蛋白uPAUrokinaseplasminogenactivator尿激酶型纤溶酶原激活物uPARuPAreceptor尿激酶型纤溶酶原激活物受体IHCImmunohistochemistry免疫组织化学HEhematoxuylin-eosin苏木精-伊红DADSdiallyldisulfide二烯丙基二硫PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液XI 目录中文摘要……………………………………………………………………Ⅰ英文摘要……………………………………………………………………Ⅴ第1章前言……………………………………………………………………1第2章材料和方法…………………………………………………………5第3章实验结果…………………………………………………………11第4章讨论……………………………………………………………21第5章结论………………………………………………………………25参考文献……………………………………………………………………27文献综述……………………………………………………………………31硕士期间发表的论文…………………………………………………37文献综述……………………………………………………………………39XIII 第一章前言在200多种人类恶性肿瘤中，胃癌（gastriccancer）的发病率、死亡率均居前列，是当前国内外最为常见的消化道癌症之一。胃癌发病呈现出显著的地域化特点，约60%的病例分布在日中韩、东欧、中东以及中南美洲等胃癌高发地区，西方国家发病率相对较低。中国是胃癌高负担国家，2012年全球约有951600起新发胃癌病例和[1,2]723100例胃癌死亡病例，中国分占42.6%和45.0%。当前，胃癌诊疗技术发展日新月异，内镜、腔镜等微创技术在临床实际工作中得到了广泛开展和应用，如：ESD（内镜粘膜下剥离术）、腹腔镜下胃癌根治术等。籍此，胃癌患者的总体疗效和生活质量得到了一定程度提升。数据显示，进展期胃癌患者术后总体5年生存率不足30%，[2]而接受内镜下根治治疗的早癌患者预后明显改善，5年生存率大于90%。但由于早期胃癌起病隐匿，无特异性临床表现，部分患者可仅有轻微剑突下不适、饱胀、纳差等症状，多数患者就诊时病情已经进展，错过了最佳手术时机。受国民生活水平提高、居民健康意识提升、胃癌诊疗技术的进步与发展、胃癌筛查工作的开展与深入等综合因素的影响，我国胃癌发病率和死亡率呈现出下降趋势。然而，对比日韩等邻国，我[3]国早期胃癌诊断率仍明显偏低。且因我国人口基数大，人口老龄化负担重，胃癌防治工作形式仍十分严峻。目前开放手术、放化疗仍是我国胃癌临床治疗主要手段。这些传统治疗手段带来诸多如手术创伤、全身毒副作用等治疗相关问题，已经难以满足我国当前医疗需求。随着肿瘤研究的深入，肿瘤形成、发展的分子机制正被逐步揭示，分子生物治疗应运而生，并已经发展形成了恶性肿瘤治疗的重要分枝。其中，分子靶向治疗已经成为当前肿瘤研究工作热点，它主要针对肿瘤细胞中的特定分子进行特异性治疗干预，可通过减少病患体内残存癌细胞从而减少癌症的复发和转移，具有耐受性好、特异性强、毒副反应轻等诸多优点。其作为一种新的治疗模式，既可以与传统治疗手段相结合，也可以单独运用于肿瘤临床治疗。目前，部分分子靶向药物已经在肿瘤临床救治中取得了可喜成果，如利妥昔单抗、伊马替尼。但由于靶向药物费用较高，许多病患经济上难以承受，限制了其在临床上的应用。大量分子生物学研究发现，肿瘤的发生、发展过程依赖多个复杂、交互的信号转导网络。在抑制单一细胞增殖信号通路后，肿瘤细胞有可能产生耐药，建立代偿信号通路。因此阻断单一肿瘤细胞信号转导通路可能难以取得令人满意的疗效。进一步挖1 掘肿瘤发生和发展的病理分子机制及其中的内在关联，寻找新的治疗靶点，研发出安全、有效、廉价的抗肿瘤药物对恶性肿瘤的治疗意义重大。研究发现，LIMK1、uPAR是三个重要的肿瘤相关蛋白。LIMK（LIMkinase1）为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其家族包括LIMK1和LIMK2两个成员,两者在结构上相似并且共享50％氨基酸同源性。LIMK1定位于真核生物细胞质，在多种人体正常组织细胞中均有表达，如：脑、肾、肺、胃、睾丸。早期研究表明，LIMK1活性与细胞周期的进展有关，其在细胞分裂的前期和中期被磷酸化激活，末期逐渐恢复至基础水平。随着对LIMK1研究的深入，研究者们发现LIMK1是多条化学信号通路的下游靶点，它主要被Rho/Rock,Rac/PAK1等通路调控。Cofilin（丝切蛋白）是LIMK1的已知底物，它能通过切割肌动蛋白微丝促进其解聚，从而调节细胞对基质的黏附，促进细胞运动。LIMK1通过磷酸化和去磷酸化cofilin，调控它与肌动蛋白的结合，进而影响细胞移动和细胞质的分裂，对肿瘤的侵袭、转移能[4-6]力的有重要决定作用。许多研究者在多种人类恶性肿瘤中检测到了LIMK1异于正[7][8][9][10][6][11]常组织的高表达，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌[12]等。LIMK1的作用并不局限于促上皮间质转化，其还可激活MMP(基质金属蛋白[13,14]酶)促进基质降解。VleckenDH等人指出，在人胰腺癌发展过程中LIMK1具有[15]诱导肿瘤血管生成的作用。对胃肠道肿瘤的研究中发现，LIMK1可能与胃癌临床[16]分期，浸润深度，组织分化，淋巴结转移和临床预后存在显著关联。体外实验已经证实，DADS（二烯丙基二硫）可下调LIMK1的表达，经DADS处理的人胃癌MGC803[16]细胞，上皮间质转化能力明显受限，基质金属蛋白酶活性显著减低。LIMK1的体外抑制剂CRT0105446和CRT0105950，可有效抑制cofilin磷酸化，并在横纹肌肉[17]瘤、神经母细胞瘤、肾细胞癌中得到了很好的印证。虽然LIMK1在胃癌中的表达及具体分子机制仍然不甚清楚，但种种迹象表明，LIMK1极有可能成为胃癌治疗的新靶点，投入临床应用。纤溶酶原激活剂（PA）系统含括组织型PA（tPA）和尿激酶型PA（uPA），其组分参与基底膜（BM）和细胞外基质（ECM）重塑，促进组织再生及血管生成。uPA系统介导的细胞外基质降解是肿瘤转移过程的重要环节。虽然肿瘤细胞中tPA也有表达，但没有确切证据显示它参与肿瘤发展进程，其主要应用于血栓疾病的治疗。uPA(尿激酶型纤溶酶原激活物)、uPAR（尿激酶型纤溶酶原激活物受体）及PAI（纤溶酶原激活物抑制剂）共同组成uPA系统，其是多条肿瘤化学信号转导通路的重要组分。2 uPA为丝氨酸蛋白酶，由两条经二硫键连接的多肽链组成。它与uPAR的结合位点位于氨基末端。在细胞中，uPA以其低活性的单链酶原形态（pro-uPA）出现。双链形式的uPA比单链pro-uPA活性高250倍。uPAR是糖基-磷脂酰肌醇连接（GPI锚）的细胞表面蛋白，其缺乏跨膜结构域。它含有三个内部二硫键结合域（D1，D2和D3），uPA与其在D1结构域结合。Pro-uPA与uPAR在细胞膜上结合后，可通过纤溶酶或组织蛋白酶、胰蛋白酶等切割Lys158-Ile159肽键被激活，而被活化的uPA又可激活纤溶酶原，形成一个正反馈循环。尽管并非跨膜受体，uPAR可通过激活各种信号分子，例如酪氨酸激酶（Src），丝氨酸激酶（Raf），粘着斑激酶（FAK）和细胞外[18]信号调节激酶（ERK）/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），完成信号传导。uPAR可[19]通过作为uPA的停靠位点来增强多种细胞基质成分的降解，如：层粘连蛋白（LN），[20,21]IV型胶原，基底膜蛋白聚糖等。除uPA外，玻连蛋白是uPAR的另一个关键配体，它可促进内皮细胞贴附、伸展和增殖。uPAR可同时与这两种配体相互作用以协调下游调控。除与uPAR结合参与细胞基质降解和重塑外，uPA也可直接催化激活数[21,22]种基质金属蛋白酶，进一步降解基质成分，亦可直接或通过纤溶酶形成促进血管[20,23]生成因子如VEGF的激活和释放，诱导肿瘤血管生成。另外，GPI-锚可以通过细胞外蛋白水解切割从uPAR中去除，这使得膜结合的uPAR可溶。uPAR的内化和循[24]环利用使得其可通过在细胞表面重新分配未被占据的uPAR来促进uPA的作用。PAI-1一方面可以抑制uPA活性，同时还可以通过影响uPA-uPAR的细胞表面表达和内化起到对uPA的调控作用。uPA/uPAR在一些肿瘤组织中高表达，如甲状腺癌、胰[25]腺癌、乳腺癌等。许多文献指出，胃肠肿瘤患者的血浆和组织中，uPA、uPAR表[26,达水平显著升高。两者表达水平的变化可能是胃癌恶性表型和预后的独立预测因素27]。目前关于LIMK1与uPA系统在胃癌中的表达、具体作用机制及其间存在的联系尚未完全明确，有待我们进一步探究。NunziaMontuori等人的研究证实，uPA或[19]uPAR的过表达可以通过某些机制诱导和促进另者的分泌。另有研究指出LIMK1在MDA-MB-435乳腺癌细胞中过表达，并上调uPA系统，增加uPA启动子活性，诱[28]导uPA和uPARmRNA和蛋白表达。颜鸿飞的实验则在大肠癌中检测到了LIMK1[29]和uPAR蛋白表达的正相关关系。曾有文献报道，uPAR通过不同信号通路整合，[30]促进肌动蛋白细胞骨架收缩。Li等人的一项关于槲皮素对胃癌细胞侵袭、转移作用影响的研究发现，下调uPAR表达，在降低基质金属蛋白酶活性的同时，亦阻断了3 [31]Rac/PAK1/LIMK1/Cofilin信号传导。由此我们大胆推测，LIMK1诱导的细胞运动和侵袭功能可能是由uPAR调节介导的。组织芯片（TissueChipsTC）的概念由Kononen等人在1998年提出，又被称之为组织微阵列技术(tissuemicroarray，TMA)。这项技术可将数目不等的组织样本有序排列在同一个载体上，使得研究者可通过免疫组织化学、荧光原位杂交等技术同时对成百上千个材料进行分子水平检测和分析。因为具备省时、高效、节约经费等诸多优点，组织芯片技术在国内外都得到快速发展和广泛应用，尤其是分子肿瘤学研究。本实验利用组织芯片和免疫组化技术，检测LIMK1、uPA、uPAR在人胃腺癌组织、癌旁组织及正常胃粘膜中的表达，研究它们与临床病理特征的关联，探索三者在人胃腺癌中的作用及相关性。4 第二章材料与方法2.1一般资料2.1.1标本来源收集2016年1月-2017年8月来自南华大学附属第二医院经肿瘤外科手术切除后病理明确诊断为原发性胃癌组织样本45例(术前均未行放化疗、生物靶向治疗)，其中男性33例，女性12例，样本年龄在30～76（58.6±11.52）岁，均为不同分化程度腺癌。45例组织样本含Ⅰb期样本6例，Ⅱ期15例，Ⅲ期24例（AJCC胃癌第八版TNM分期）。收集相应癌旁组织（距离肿瘤边缘1.5cm的非瘤组织）45例。同时收集正常胃粘膜样本(2016年1月-2017年8月南华大学附属第二医院胃镜下活检证实)10例，其中男性7例，女性3例，样本年龄37～62（50.7±8.97）岁。样本详细数据见表2.1。表2.1人胃腺癌组织、正常胃粘膜一般资料一般资料胃腺癌组织正常胃粘膜性别男337女123年龄标准差58.6±11.5250.7±8.97TNM分期Ⅰ期6-Ⅱ期15-Ⅲ期24-肿瘤直径＜3cm17-≥3cm28-分化程度高8-中6-低31-淋巴结转移有30-无15-2.1.2实验主要试剂Anti-LIMK1antibody(ab81046)Abcam贸易有限公司PLANantibody(DF6904)AffintyBiosciencesAnti-uPAReceptorantibody（ab103791）Abcam贸易有限公司免疫组化染色试剂盒武汉Boster生物公司DAB显色剂武汉Boster生物公司Tris-EDTA抗原修复液上海赛博生物科技公司0.01MPBS缓冲液上海一研生物科技公司5 2.1.3主要试剂配制(1)PBS溶液（0.01mol/l，PH7.4）NaCL9.0g、NaH2PO45.9g、Na2HPO40.5g加蒸馏水定容至1000ml，调整PH值至7.4。(2)DAB显色试剂取显色剂A、B、C液各1滴，加至1ml蒸馏水中，充分混匀，用前临时配制。2.1.4主要材料及仪器设备高压锅中国双喜电器烤箱上海发瑞仪器科技公司石蜡组织切片机上海精学科学有限公司微量移液器芬兰BLACKDECKER超低温冰箱德国NewBrunswick公司光学显微镜日本奥林巴斯公司显微摄像系统日本奥林巴斯公司电子天平日本HTACH公司恒温箱上海建恒仪器有限公司打孔针、取样针骨穿针及腰穿针改制2.2方法与步骤2.2.1组织芯片的制作过程2.2.1.1组织芯片的构建设计根据实验目的及标本量，每块芯片设计为10x10点阵，自上而下每行分别用字母A-J标记，从左至右每列以数字1-10标记，以方便定位。2.2.1.2定位挑选出事先确定的不同发展阶段的胃腺癌组织蜡块，在显微镜下HE切片上选取病变典型、具有代表性的区域，用标记笔标记所需靶点。2.2.1.3受体蜡块制备将融化的蜡块注入包埋框中，冷却后去除包埋框，形成受体蜡块。挑选出无气泡及裂缝的蜡块，将蜡块表面修平。6 2.2.1.4打孔在受体蜡块上使用端磨平的内径为1mm的16号骨穿针按照设计10×10点阵依次垂直扎入蜡块中，稍施加压力后垂直拔出。两孔间距尽量保持一致，控制在0.8-1mm之间。2.2.1.5组织蜡芯的获取和置入将内径为0.75mm的国产12号腰穿针针鞘尖端磨平，作为取样针尖，根据事先设计的排序，依次从供体蜡块获取蜡芯片。先将蜡块置于45℃烤箱中约5min，以防蜡块开裂。垂直于蜡块取样点加压，旋转取样针钻取组织后垂直拔出。缓慢推动腰穿针内芯，使组织蜡芯固定于受体蜡块内设计位点，注意使其与蜡块表面平齐。在排列好的受体芯片表面浇注融化的石蜡，放置于37℃恒温箱，使其更好的融合。2.2.1.6切片和裱片对组织芯片蜡块快速连续切片，厚度约3-4μm。将切好的组织芯片裱于经粘附剂防脱处理的载玻片上，使之紧密结合。2.2.2HE染色（1）脱蜡：将芯片置入二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）中各处理10min；（2）入水：无水乙醇、95%、90%、80%、70%浓度乙醇，各浓度依次浸泡5min，自来水冲洗10s；（3）染核：苏木精染色20min，水洗1min，后用1%盐酸乙醇进行分色30s,水洗蓝化20min；（4）染质：伊红染色20min，染色后水洗1min；（5）脱水：70%、80%、90%、95%、无水乙醇，各浓度依次浸泡5min；（6）透明：二甲苯(Ⅰ)、二甲苯（II）中依次浸泡5min；（7）封片：中性树胶封固。2.2.3免疫组化染色（1）68℃烤箱中烘烤约2h；（2）脱蜡（步骤同HE染色）；（3）入水（步骤同HE染色）；（4）将置芯片置于Tris-EDTA抗原修复液中浸泡5min，高压锅高温高压修复抗原2min,使抗原充分暴露，自然冷却。7 （5）加入3%H2O2，室温孵育10min，以清除内源性过氧化酶，甩干双氧水，PBS溶液冲洗3×5min；（6）在芯片上滴加稀释后的一抗(LIMK1，1:200；uPA，1:200；uPAR，1:500)，室温下孵育2h，之后PBS溶液冲洗3×5min；（7）去除PBS，在芯片上滴加50μl聚合物增强剂，于室温下孵育约20min,PBS溶液冲洗3×5min；（8）去除PBS，在芯片上滴加50μl酶标抗鼠/兔聚合物，于室温下孵育约30min,PBS溶液冲洗3×5min；（9）去除PBS，在芯片上滴加50μl新配置的DAB显色液，光学显微镜下观察显色3-5min,自来水充分冲洗；（10）苏木精复染3min，自来水冲洗返蓝5min；(11)脱水(同HE染色)；（12）透明（同HE染色）；（13）中性树胶封固。2.2.4结果判定(1)个别位点脱片者，以供体蜡片组织切片代替；(2)PBS液代替一抗作为阴性对照；(3)表达强度主要根据肿瘤细胞胞浆和胞膜的染色阳性强度和染色阳性面积百分率判定。表2.2染色强度评分标准染色强度（多数细胞呈现的染色颜色）分值无阳性染色0浅黄色1棕黄色2棕褐色38 表2.3染色面积评分标准染色面积分值0-5%06%-25%126%-50%250%-75%3>75%4每个位点染色情况作出分析判断后，两项分值相加，总分0-1分为（-）；2-3分为（±）；4-5分为中等阳性（+），6-7分为（++），（-）及（±）表达判为阴性，（+）及（++）表达判为阳性。2.2.5统计学分析运用SPSS19.0软件对实验数据进行统计分析，对各组织间及各临床病理特征组内的指标表达比较采用χ2检验或Fisher精确检验，各指标间表达相关性采用Spearman等级相关分析，以p<0.05为有统计学意义。9 10 第三章实验结果3.1LIMK1的表达与人胃腺癌临床病理特征的相关性分析3.1.1LIMK1在人胃腺癌组织、相应癌旁组织及正常胃粘膜中的表达分析LIMK1在人胃腺癌组织、癌旁组织、正常胃粘膜中可见不同程度的阳性表达，阳性表达为胞质和（或）胞膜中呈现浅黄色、棕黄色或棕褐色颗粒沉积。LIMK1在人胃腺癌组织、癌旁组织、正常胃粘膜中的阳性表达率依次为75.56%、42.22%、30.00%，三组之间差异有显著性（p<0.05，具体见表3.1）。将3组数据两两比较分析后发现：（1）人癌腺组织与癌旁组织LIMK1阳性表达率差异明显（χ2=10.326，p<0.05）；（2）人胃腺癌组织与正常胃粘膜阳性表达率差异有显著性（p<0.05）；（3）LIMK1在癌旁组织与正常胃粘膜中的阳性表达率差异无统计学意义（p>0.05）（详见表3.2）。表3.1LIMK1在人胃腺癌组织、癌旁组织、正常胃粘膜中的表达LIMK1表达（例）对比组合计阳性率p阳性阴性胃腺癌组织34114575.56%癌旁组织19264542.22%0.001正常胃粘膜371030.00%表3.2LIMK1在三者中的两两比较LIMK1表达（例）对比组合计χ2p阳性阴性胃腺癌组织341145癌旁组织19264510.3260.002合计533790胃腺癌组织341145正常胃粘膜3710-0.010合计371855癌旁组织192645正常胃粘膜3710-0.723合计22335511 3.1.2LIMK1的表达与人胃腺癌临床病理数据的关联LIMK1在癌组织中的阳性表达率与患者的年龄、性别无相关性，但与胃癌TNM分期、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移存在关联。TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期人胃腺癌组织LIMK1表达阳性率分别为33.33%、66.67%、91.67%，差异具有显著性（p<0.05）；肿瘤直径<3cm组阳性表达率为52.94%，≥3cm组为89.29%，有显著差异（p<0.05）；高、中、低分化组表达阳性率依次为37.50%、50.00%、90.32%，表达差异显著（p<0.05）；淋巴结转移组阳性表达率为90.00%，显著高于无淋巴结转移组46.67%，差异具有统计学意义（p<0.05）（详见表3.3）。表3.3LIMK1表达与人胃腺癌临床病理数据的关联例数LIMK1表达（例）临床指标阳性率χ2p（45）阳性（34）阴性（11）性别男3324972.73%-0.699女1210283.33%年龄<59岁2418675.00%0.0090.926≥59岁2116576.19%TNM分期Ⅰ期62433.33%Ⅱ期1510566.67%-0.007Ⅲ期2422291.67%肿瘤直径<3cm179852.94%-0.011≥3cm2825389.29%分化程度高83537.50%中63350.00%-0.002低3128390.32%淋巴结转移有3027390.00%-0.003无157846.67%12 3.2uPA的表达与人胃腺癌临床病理特征的相关性分析3.2.1uPA的表达与人胃腺癌组织、相应癌旁组织及正常胃粘膜表达的分析uPA在人胃腺癌组织、癌旁组织、正常胃粘膜中可见不同程度的阳性表达，阳性表达为胞质和（或）胞膜中呈现浅黄色、棕黄色或棕褐色颗粒沉积。uPA在人胃腺癌组织、相应癌旁组织、正常胃粘膜组织中的阳性表达率依次为71.11%、35.56%、20.00%，三组之间的阳性表达率差异显著（p<0.05，详见表3.4）。将3组数据两两比较分析后发现：（1）人胃腺癌组织与相应癌旁组织阳性表达率差异显著（χ2=11.429，p<0.05）；（2）人胃腺癌组织与正常胃粘膜阳性表达率差异具有统计学意义（p<0.05）；（3）癌旁组织与正常胃粘膜阳性表达率差异无显著性（p>0.05）（详见表3.5）表3.4uPA在人胃腺癌组织、癌旁组织、正常胃粘膜中的表达uPA表达（例）对比组合计阳性率p阳性阴性胃腺癌组织32134571.11%癌旁组织16294535.56%0.000正常胃粘膜281020.00%表3.5uPA在三者中的两两比较uPA表达（例）对比组合计χ2p阳性阴性胃腺癌组织321345癌旁组织16294511.4290.001合计484290胃腺癌组织321345正常胃粘膜2810-0.004合计342155癌旁组织162945正常胃粘膜2810-0.470合计18375513 3.2.2uPA的表达与人胃腺癌临床病理数据的关联uPA在人胃腺癌中的表达水平与患者的年龄、性别差异无明显关联，但与胃癌TNM分期、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移存在相关性。TNM分期Ⅰ、Ⅱ期、Ⅲ期组阳性表达率分别为50.00%、53.33%、87.50%，三者阳性表达率差异有统计学意义（p<0.05）；肿瘤直径＜3cm组阳性表达率为52.94%，明显低于≥3cm组的82.14%（χ2=4.391，p<0.05）；高、中、低分化组阳性表达率分别为37.50%、66.67%、80.65%，差异具有显著性（p<0.05）；有淋巴结转移组阳性表达率为83.33%，远高于无淋巴结转移组的46.67%，组间差异显著（χ2=6.544，p<0.05）（详见表3.4）。表3.4uPA表达与人胃腺癌临床病理数据的关联uPA表达（例）临床指标例数阳性率χ2p（45）阳性（32）阴性（13）性别男33231069.70%-1.000女129375.00%年龄＜59岁2417770.83%0.0020.965≥59岁2115671.43%TNM分期Ⅰ期63350.00%Ⅱ期158753.33%-0.024Ⅲ期2421387.50%肿瘤直径＜3cm179852.94%4.3910.036≥3cm2823582.14%分化程度高83537.50%中64266.67%-0.045低3125680.65%淋巴结转移有3025583.33%6.5440.011无157846.67%14 3.3uPAR的表达与人胃腺癌临床病理特征的相关性分析3.3.1uPAR的表达与人胃腺癌组织、相应癌旁组织及正常胃粘膜表达的分析uPAR在正常胃粘膜中未见阳性表达，在人胃腺癌组织、相应癌旁组织中均有一定程度阳性表达，阳性表达为胞膜和（或）胞质中呈现浅黄色、棕黄色或棕褐色颗粒沉积。uPA在人胃腺癌组织、相应癌旁组织中的阳性表达率分别为60.00%、26.67%，三者之间阳性表达率差异有统计学意义（p<0.05，详见表3.7）。将3组数据两两比较分析后发现：（1）人胃腺癌组织与癌旁组织的uPAR阳性表达率差异明显（χ2=10.181，p<0.05）；（2）人胃腺癌组织与正常胃粘膜阳性表达率差异有显著性（p<0.05）；（3）uPAR在癌旁组织与正常胃粘膜中的阳性表达率差异无统计学意义（p>0.05）（详见表3.8）。表3.7uPAR在人胃腺癌组织、癌旁组织、正常胃粘膜中的表达uPAR表达（例）p对比组合计阳性率阳性阴性胃腺癌组织27184560.00%癌旁组织12334526.67%0.000正常胃粘膜010100.00%表3.8uPAR在三者中的两两比较uPAR表达（例）对比组合计χ2p阳性阴性胃腺癌组织271845癌旁组织12334510.1810.001合计395190胃腺癌组织271845正常胃粘膜01010-0.001合计272855癌旁组织123345正常胃粘膜01010-0.096合计12435515 3.3.2uPAR的表达与人胃腺癌临床病理数据的关联uPAR在人胃腺癌中的表达水平与患者的年龄、性别差异无关联，但与胃癌TNM分期、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移相关。TNM分期Ⅰ、Ⅱ期、Ⅲ期组阳性表达率分别为50.00%、33.33%、79.17%，三者阳性表达率差异具有统计学意义（p<0.05）；肿瘤直径＜3cm组阳性表达率为41.18%，明显低于≥3cm组的71.43%（χ2=4.034，p<0.05）；高、中、低分化组阳性表达率为25.00%、50.00%、70.97%，差异具有显著性（p<0.05）；有淋巴结转移组阳性表达率为73.33%，明显高于无淋巴结转移组的33.33%（χ2=6.667，p<0.05）（详见表3.9）。表3.9uPAR表达与人胃腺癌临床病理数据的关联uPAR表达（例）例数2临床指标阳性率χp（45）阳性（27）阴性（18）性别男33191457.58%-0.735女128466.67%年龄＜59岁2415962.50%0.1340.714≥59岁2112957.14%TNM分期Ⅰ期63350.00%Ⅱ期1551033.33%-0.011Ⅲ期2419579.17%肿瘤直径＜3cm1771041.18%4.0340.045≥3cm2820871.43%分化程度高82625.00%中63350.00%-0.044低3122970.97%淋巴结转移有3022873.33%6.6670.010无1551033.33%3.4人胃腺癌中LIMK1与uPA表达的相关性分析在34例LIMK1阳性表达的人胃腺癌组织中，有28例uPA表达阳性；在13例uPA表达阴性的样本中，有7例LIMK1表达阴性。根据LIMK、uPA表达结果的等16 级资料进行Spearman等级相关分析，提示人胃腺癌中LIMK1和uPA的表达呈现出正相关性（r为0.436，p<0.01）（详见表3.10）表3.10LIMK与uPA在人胃腺癌中表达的相关性uPALIMK1合计χ2pr阳性阴性阳性28634阴性47116.4640.0030.436合计3213453.5人胃腺癌中LIMK1与uPAR表达的相关性分析在34例LIMK1阳性表达的人胃腺癌组织中，有25例uPAR表达阳性；在18例uPAR表达阴性的样本中，有9例LIMK1表达阴性。根据LIMK、uPAR表达结果的等级资料进行Spearman等级相关分析，提示人胃腺癌中LIMK1和uPAR的表达呈现出正相关性（r为0.486，p<0.01）（详见表3.11）。表3.11LIMK与uPAR在人胃腺癌中表达的相关性uPARLIMK1合计χ2pr阳性阴性阳性25934阴性29118.4270.0010.486合计2718453.6人胃腺癌中uPA与uPAR表达的相关性分析在32例uPA阳性表达的人胃腺癌组织中，有26例uPAR表达阳性；在18例uPAR表达阴性的样本中，有12例uPA表达阴性。根据uPA、uPAR表达结果的等级资料进行Spearman等级相关分析，提示人胃腺癌中uPA和uPAR的表达呈现出正相关性（r为0.681，p＜0.01）（详见表3.12）。表3.12uPA与uPAR在人胃腺癌中表达的相关性uPARuPA合计χ2pr阳性阴性阳性26632阴性1121317.8890.0000.681合计27184517 附图图1.组织芯片HE染色图2.组织芯片免疫组化染色图3.胃腺癌组织HE染色（×100）图4.胃腺癌组织HE染色（×400）图5.癌旁组织HE染色（×100）图6.癌旁组织HE染色（×400）18 图7.正常胃粘膜HE染色（×100）图8.正常胃粘膜HE染色（×400）图9.LIMK1正常胃粘膜中阳性表达(x400)图10.LIMK1癌旁组织中阳性表达（x400）图11.LIMK1胃腺癌组织中阳性表达(x100)图12.LIMK1胃腺癌组织中阳性表达（x400）图13.uPA正常胃粘膜中阳性表达(x400)图14.uPA癌旁组织中阳性表达（x400）19 图15.uPA胃腺癌组织中阳性表达(x100)图16.uPA胃腺癌组织中阳性表达(x400)）图17.uPAR正常胃粘膜中阴性表达(x400)图18.uPAR癌旁组织中阳性表达（x400）图19.uPAR胃腺癌组织中阳性表达(x100)图20.uPAR胃腺癌组织中阳性表达（x400）20 第四章讨论胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，其粘膜本质上可分为胃固有粘膜和肠上皮化生粘膜。根据组织学分类，大致可将胃癌分为腺癌、腺鳞癌、鳞癌、类癌、未分化癌和未分类癌六大类。其中，胃腺癌最为常见，占总数的90%以上。胃癌从遗传学角度可分为遗传相关胃癌和非遗传相关胃癌。遗传相关胃癌多与遗传因素有关，有家族聚集倾向。非遗传相关胃癌也即散发性胃癌，其发生与幽门螺杆菌感染、EB病毒感染、不良的生活饮食习惯、地域环境、癌前病变、胃切除术史等多个因素有关。90%以上的非贲门胃癌归因于幽门螺杆菌感染，其是胃癌最重要的独立危险因素。而在分子肿瘤学层面，胃癌发生较为明确的机制有TP53、PIK3CA、ERBB3、ERBB2、[32,33]ARID1A、BCOR、EGFR、CDH1、RHOA等基因突变，RHO家族基因GTP酶[34,35]活化蛋白基因融合，染色体不稳定，DNA超甲基化等。其中基因突变、染色体不稳定等分子机制与细胞信号通路的异常激活紧密相关。除少部分早期发现早期治疗的患者，死亡是大多数肿瘤病人的最终转归。九成以上肿瘤患者死于癌细胞转移。肿瘤侵袭、转移是一个十分繁杂的过程，肿瘤细胞同质型粘附降低，从原发灶脱离后，同时通过分泌蛋白酶促进ECM成分降解，形成肿瘤细胞转移的通道，其在粘附降解的过程中，穿透ECM和血管壁基底膜进入血液循环，在到达部位，在新生血管形成的前提下增殖，形成转移灶。近些年在对多种恶性肿瘤的研究中发现，LIMK1、uPA、uPAR三者共同参与肿瘤进程的调控，并通过某些机制相互作用。其中LIMK1主要涉及调控细胞增殖、趋化和运动，而uPA系统则重点致力于细胞外基质的降解。4.1LIMK1在人胃腺癌中的表达与胃腺癌的侵袭、转移Rho/ROCK/LIMK1/Cofilin1、Rac/PAK1/LIMK1/Cofilin1通路的异常激活被证明与多个肿瘤的迁徙、侵袭密切相关。上文提及的RHOA基因是第一个通路的重要靶基因，而LIMK1则是两条信号通路的核心部分。LIMK1在肿瘤细胞信号转导中的核心作用使其成为肿瘤发生过程中较为活跃的下游靶点之一。其对Cofilin1磷酸化和去磷酸化的调节，可能是肿瘤侵袭潜能的重要决定因素。有相关研究表明，LIMK1参与细胞分裂，可促进细胞过渡到G2/M期，敲低LIMK的表达1可以使细胞堆积在G2[36]期，从而抑制细胞的增殖。此外，国内外的研究还在不同肿瘤间发现LIMK1具有[13，14][15]活化基质金属蛋白酶促进基质降解，诱导肿瘤血管新生等多重作用，愈发揭示21 了其在肿瘤发生发展过程中的重要地位。本研究发现，LIMK1在正常胃粘膜、癌旁组织和人胃腺癌组织均有不同程度的表达，阳性表达率依次增高，分别为30.00%、42.22%、75.56%，差异明显（p＜0.05）。提示LIMK1的表达增高可能是预测胃腺癌发生的重要标志。胃癌TNM分期是目前临床上常用的肿瘤分期方法，与患者的生存期有着较好的联系。而胃癌的分化程度与其恶性程度紧密相关，直接决定了胃癌的预后。本实验中，胃腺癌TNM分期中Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期的LIMK1蛋白表达依次升高，三者差异有显著性(p<0.05)；高分化、中分化、低分化组蛋白阳性表达率逐渐增高，三者存在显著差异(p<0.01)；肿瘤直径＜3cm组阳性表达率远低于≥3cm组，两者差异有统计学意义(p<0.05)；淋巴结转移组阳性表达率明显高于无淋巴结转移组，差异明显(p<0.05)。实验数据表明，LIMK1蛋白的表达与胃腺癌TNM分期、肿瘤大小、组织分化、淋巴结转移存在关联，但与患者的年龄、性别无显著相关性。据此推测，LIMK1表达水平的变化可能与胃癌的侵袭、迁移存在相关性，其有望成为评估胃癌进展和预后的重要标志物，可能成为胃癌治疗的潜在靶点。4.2uPA在人胃腺癌中的表达与胃腺癌的侵袭、转移uPA基因位于人类10号染色体上。uPA基因（PLAU）的表达受到在5'侧翼区域中鉴定的几种调控元件以及许多表观遗传学和转录后机制的紧密调节。uPA可能在启动蛋白水解级联反应中发挥核心作用，其主要通过uPAR介导催化纤溶酶原转化为纤[19][21,22]溶酶降解多种细胞基质蛋白，也可直接活化多种基质金属蛋白酶，进一步降解[20,23]基质成分。同时，它可通过调节血管生成因子的激活和释放，促进肿瘤细胞血管生成，在肿瘤侵袭、迁徙过程的多个环节发挥重要作用。本研究发现，人胃腺癌组织、癌旁组织、正常胃粘膜中均可见uPA蛋白阳性表达，但uPA在癌组织中的表达阳性率（71.11%）明显高于癌旁组织（35.56%）和正常胃粘膜（20.00%），差异有显著性（p<0.05）。提示uPA可能是胃腺癌发生的早期分子事件。本实验未在不同性别和年龄组中观察到uPA蛋白表达的明显差异，同时发现胃腺癌TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期人胃腺癌组织的uPA蛋白表达依次增高，三者差异明显(p<0.05)；高分化、中分化、低分化组蛋白阳性表达率逐渐升高，三者差异有显著性(p<0.05)；肿瘤直径<3cm组阳性表达率明显低于≥3cm组(p<0.05)；淋巴结转移组阳性表达率远高于无淋巴结转移组，差异具有显著性(p<0.05)。上述数据提示uPA22 蛋白的表达与胃腺癌TNM分期、肿瘤大小、组织分化、淋巴结转移存在关联，与[26]Alpizar-AlpizarW等人的研究结果相符。据此推断，uPA可能在人胃腺癌的侵袭和转移中扮演某种角色，可能是人胃腺癌恶性程度评估的重要指标，对胃癌预后的判断具有重要参考价值。4.3uPAR在人胃腺癌中的表达与胃腺癌的侵袭、转移uPAR在uPA系统中处于枢纽地位，低活性的pro-uPA依赖与其结合向活性形式转化，从而实现对细胞质基质的降解。尽管uPAR被命名为与uPA特异性结合的细胞表面受体，但它可通过激活Src、Raf、FAK、ERK、MAPK等多个重要的信号分子完[19]成信号转导。除与uPA结合外，uPAR还可与玻连蛋白相互作用，共同实现对肿瘤细胞侵袭转移的调控。uPAR在多种恶性肿瘤中高表达，并被认为可能与癌症的预后存在关联。本实验中，uPAR在正常胃粘膜组织中未见阳性表达，在癌旁组织和人胃腺癌组织阳性表达率分别为26.67%，60.00%，三者间差异显著（p<0.05）。提示uPAR可能参与了人胃腺癌的形成。不同性别、年龄组的人胃腺癌样本中，uPAR蛋白表达阳性率无明显差异。而胃腺癌TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期人胃腺癌组织的uPAR蛋白表达差异有显著性(p<0.05)；高分化、中分化、低分化组蛋白阳性表达率差异明显（p<0.05）；肿瘤直径<3cm组阳性表达率较≥3cm组低，两者有显著差异（p<0.05）；淋巴结转移组阳性表达率明显高于无淋巴结转移组（p<0.01）。结合数据，我们推测uPAR以某种形式参与了人胃腺癌的侵袭、转移，uPAR蛋白的高表达可能促进了胃癌的进展，其可能是独立的人胃腺癌恶性程度及预后评估的分子生物学标志。4.4LIMK1、uPA、uPAR在人胃腺癌中的表达相关性及意义随着LIMK1、uPA、uPAR的生物学功能逐渐被明确，其在肿瘤中的作用及相互关系也正渐被揭示。相关文献显示，在乳腺癌细胞中，LIMK1高表达的同时上调了uPA[28]和uPARmRNA和蛋白的表达。另有研究证实，uPAR可能通过与玻连蛋白相互作[30，31]用等机制激活Rac信号通路，诱导细胞骨架重排和增加细胞运动。种种研究指向三者可能共同参与了肿瘤的发生、发展过程，并可能从中起协同作用。本研究中，LIMK1、uPA、uPAR在人胃腺癌组织中呈现高表达。在34例LIMK1阳性表达的人胃腺癌组织中，有28例uPA表达阳性；34例LIMK1阳性表达的组织中，uPAR阳性者有25例；32例uPA阳性表达的样本中，26例uPAR表达阳性。相23 关性分析显示，LIMK1与uPA、LIMK1与uPAR、uPA与uPAR在人胃腺癌中的蛋白表达呈现出正相关关系(r>0，p<0.05)。该一结果也提示检测人胃腺癌中LIMK1、uPA、uPAR的表达有助于其恶性程度以及侵袭、转移潜能的判定，三者可能通过某些信号通路相互调控，共同参与了人胃腺癌的发生、发展过程，并可能存在协同作用。4.5存在的不足和展望因实际临床工作中，内镜直视下活检处粘膜多有明显病理改变或呈慢性炎症改变，正常胃粘膜组织样本数量少，故本实验共收集正常胃粘膜10例，样本量偏小，可能降低了检验效能。且正常胃粘膜样本与人胃腺癌组织样本源自不同个体，一般资料不尽一致，所以在对正常胃黏膜和人胃腺癌组织、癌旁组织的阳性表达率进行统计学分析时，可能存在些许偏差。本实验通过组织芯片、免疫组化等手段初步证实了LIMK1、uPA、uPAR表达水平的变化可能与人胃腺癌的发生、发展存在关联，三者可能通过某些机制相互联系。但其究竟通过何种机制参与人胃腺癌进程，三者之间是否存在直接相互作用及其具体机制，亟待我们进一步研究。明确三者在人胃腺癌中的关联，有助于进一步探索LIMK1与uPA系统是如何参与人胃腺癌的形成与发展的，为人胃腺癌的生物靶向治疗提供了新的治疗思路。24 第五章结论（1）LIMK1、uPA、uPAR在人胃腺癌组织中高表达，可能是人胃腺癌发生的早期事件。（2）LIMK1、uPA、uPAR的表达与胃腺癌TNM分期、组织分化、肿瘤大小、淋巴结转移有关，其表达水平的变化可能与人胃腺癌的侵袭、转移存在关联。（3）人胃腺癌中LIMK1、uPA、uPAR两两间蛋白表达具有相关性,且呈正相关关系。25 26 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综述胃动蛋白在胃癌细胞增殖中的作用及其机制研究进展刘炯明（综述）张琍（审校）摘要：源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤为胃癌，该疾病的发病率在我国各种恶性肿瘤中排名第一，疾病多发于年龄50岁以上的人群中，男性的发病率远远高于女性，对人们身体健康的影响极大。本文主要针对胃动蛋白在胃癌细胞增殖中的作用以及机制进行了研究，综述如下。关键词：胃动蛋白；胃癌细胞增殖；作用；机制[1]胃癌是一种危害极大的消化系统恶性肿瘤，大部分胃癌为腺癌，通常患者早期无显著表现，可能只发生嗳气和上腹不适等非特异性表现，因为其症状和胃溃疡、胃炎等疾病现象类似，所以极易被患者忽视，因而，该疾病早期往往得不到有效的诊断和治疗，从而导致病情发展至晚期。胃动蛋白是一种由胃部产生的能够对胃癌细胞生长进行抑制的蛋白，其在胃癌组织中具有明显降低的表达性，可起到抑制胃癌增殖、[2]促进黏膜修复以及保护胃黏膜的作用。本文此次主要研究在胃癌细胞的增殖中，胃动蛋白的临床价值，特对其作用以及机制进行了以下综述。1.胃动蛋白结构胃动蛋白是一种包括胃动蛋白1、胃动蛋白2以及胃动蛋白3的肿瘤抑制因子，其三种胃动蛋白均带有一对保留的半胱氨酸残基和100个残基BRICHOS结构域，其中BRICHOS结构域包括C端、BRICHOS、连接体以及疏水端这4个不一样的区域，同时还具有β键。研究指出，癌症、痴呆等疾病均与BRICHOS结构域具有密切联系[3，4]。胃动蛋白1是一种处于染色体2p13.3的分泌性蛋白质，为6kB左右，具有5个内含子和6个外显子，由185个氨基酸组成其蛋白，氨基酸中有20个为处于N端的信号肽。胃动蛋白1的生理功能和富含半胱氨酸的三叶因子1类似，其带有BRICHOS结构域特征性。胃动蛋白2是一种基因图包含染色体2p13的特异性蛋白，其具有的外显子5个能够对18.3KDa的蛋白进行编码。胃癌组织中胃动蛋白2含量较少，同时该蛋白也31 带有BRICHOS结构域特征性。胃动蛋白3是一种具有特异功能的胃动蛋白，若其表达过量，将会对萎缩胃黏膜的表皮细胞增生产生抑制。2.胃动蛋白的生理特点胃动蛋白1可促进黏膜损伤后的增生以及恢复，起到对胃窦黏膜进行保护的作用，其发挥功能主要通过稳定的链接旁蛋白和特异性的紧密连接蛋白进行。胃动蛋白1是一种潜在的原癌基因抑制剂，可通过对胃癌细胞的端粒有关蛋白进行调节、对端[5]粒长度进行缩短，而产生抑制细胞生长的作用，可造成胃癌细胞产生死亡和衰老。胃动蛋白1在胃癌前病变以及胃癌组织中减少，是一种具有抗淀粉形成性质的抑癌因[6]子，可对淀粉－β肽聚合产生阻止，对原纤维的形成和淀粉的聚集进行阻止，其表达过度会导致癌细胞死亡。胃动蛋白2能够促进稳态的消化道上皮的发挥，通过对消化道上皮的增生产生调控，而起到对黏膜的完整进行维护的作用。胃动蛋白2对胃癌细胞的增生有抑制作用，[7]其表达若发生变化将会导致癌变。胃动蛋白2在胃癌细胞和胃炎中表达减少，可对黏膜屏障的完整性进行调节。同时，在受伤的情况下，由于黏膜出现改变将对胃动蛋白2的功能进行激活。3.胃癌细胞增殖和胃动蛋白的联系3.1胃动蛋白1胃动蛋白1的凋亡包括内源性通路和外源性通路两种分子信号通路，其中外源性通路涉及FASL和FAS的结合，FASL在胃癌组织中增多，而FAS则减少。胃动蛋白1通过下调S期激酶相关蛋白2的表达以及上调p16、p27、p21、p53来激发凋亡，其主要通过成视网膜细胞瘤基因、p16、FASL以及FAS途径导致胃癌细胞发生凋亡[8][9,10]。研究发现胃动蛋白1的高表达会增高胃癌细胞系中的FAS受体表达，而细胞凋亡的一个关键分子就是FAS受体，因而可推测胃动蛋白1具有调节胃癌增殖的作用。胃动蛋白1协同5－氟尿嘧啶可对p21和p53进行上调，从而对细胞的增殖和活[11]性产生抑制，起到对胃癌细胞增殖进行抑制的作用。胃动蛋白1的BRICHOS结构域和N端疏水端可对细胞的增殖和活力产生抑制，并诱导细胞周期停滞于G2/M期以及G0/G1期，同时可对微小MIR-185的表达进行诱导，MIR-185主要对G2-M期产生阻碍，从而起到抑制细胞增殖的作用。32 [12]胃动蛋白1在胃癌组织中的表达显著低于非癌组织，其能够对细胞因子的表达[13]和NF-kB信号通路进行调节，从而对胃表皮细胞的生长进行抑制。NF-kB是一种具有不稳定的基因组和凋亡消失的潜在转录因子，其激活异常将引发癌细胞出现无节[14]制的增殖。NF-kB的激活被胃动蛋白1抑制后，可起到对胃癌增殖进行抑制的效应。端粒在原癌基因刺激细胞生长后，其酶活性会发生延长和增加，而胃动蛋白1可与原癌基因进行结合，从而产生调节端粒酶活性和端粒长度的作用，可引发胃癌细[15]胞发生凋亡和衰老。3.2胃动蛋白2胃动蛋白2若表达过量将减少基质金属蛋白酶9、细胞周期蛋白E1和细胞周期[5]蛋白D1等与癌细胞变异和增殖有关的蛋白，促使细胞循环停滞在G1-S分裂相，而对胃癌细胞的侵袭、迁移以及增生产生抑制。胃动蛋白2可对蛋白激酶8以及蛋白激[16]酶3的表达进行诱导，同时对FAS的表达产生激活，从而促使其诱导的凋亡转化[8]为外源性途径，通过对胃动蛋白1的肿瘤活性进行抑制来保持胃上皮细胞的稳态。结语综上所述，胃动蛋白通过多方面因素产生综合作用起到抑制胃癌增殖的效果，牵涉到凋亡有关蛋白和大量的分子信号通路。虽然研究已了解到其功能和结构，但对胃癌增殖产生抑制的确切机制还有待研究。待临床对胃动蛋白的抑癌机制进行深入研究，对其作用位点进行明确后，可为胃癌的治疗提供新的帮助，达到预防、缓解以及诊治胃癌的目标参考文献[1]陈万青,郑寿荣,张思维,等.2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析[J].中国肿瘤,2016(01):1-8.[2]罗云,王崇数.胃动蛋白基因1在胃粘膜相关疾病中的作用[J].中国普外基础与临床杂志,2015,9(22):1143-1147.[3]PavoneLM,DelVecchioP,MallardoP,etal.Structuralcharacterizationandbiologicalpropertiesofhumangastrokine1[J].MolBiosyst,2013,9(3):412-421．[4]DaiJ，ZhangN，WangJ，etal．Gastrokine-2isdownregulatedingastriccanceranditsrestorationsuppressesgastrictumorigenesisandcancermetastasis[J]．TumorBiol，33 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