基于转录组测序技术的重症手足口病差异表达基因研究

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：Ｉ：分类号Ｒ５１密级公开Ｉ？ＵＤＣ６１０学校代码１０５５５＠杂＃义索硕±学位论文（专业学位）基于转录组测序技禾的重症手足口病差异表达基因研究？Ｉ．研究生姓名：陈程；指导教师、职称：彭忠田副教授接’专业学位类别（领域）：临床医学（内科学）扳；辛？．片．’起研究方向：手足口病所在学院一临床学院；第＇；ｔＶ．．端－二０－六年五月．＇＇：論旅Ｖ、； ＠義考乂拿基于转录组测序技术的重症手足口病差异表达基因研究、论义作者签名：巧：．指导教师签名论文评阅人１：干双，副教巧，硕导，南化女学民挙部评阅人２：龙湘珍，丰件睽师，衔阳市第Ｈ人民医院答辩委员会主席：王宗宅，教授，硕导，南単大学药学院１委员：郑兴，教授，硕导，南华大学药学院委员么张艳，教授，硕导，南华大学展学院３委员；教授彭翠革，硕导，南华大学医学院，委员４；胡四海，教授，硕导，南华大学戾学院答辩日期１６年５月１９日：２０ 南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研巧工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研巧所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：法年Ｃ月Ｗ日Ｐ南华大学学位论文版权±使用授权书位论本学位论文是本人在南华大学攻读（博／学位期间在导师指导下完成的学＾义发文表。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研充内容不得［＾＾其它单位的名论文。本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位采，允许学位论文被查阐和借阅；学校可Ｗ公布学位论文的全部或部分内容，可Ｗ交学用位复论印文、缩印或其它手段保留学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部口规定送。同意学校将论文加入《中国优秀博硕±学位论文全文数据库》，并按《中国优秀博硕±学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。同意授权中国科学会信息技术研巧所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社公众提供信息服务。对于涉密的学位论文作，者解签密后适用该授权。导名；师签年内疋日＾八ｋ 基于转录组测序技术的重症手足口病差异表达基因研究摘要目的：应用转录组测序技术（RNA-sequencing,RNA-seq）分析重症手足口病（severhand,footandmouthdisease,SHFMD）患儿外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）转录组情况，筛选SHFMD显著差异表达基因（differentlyexpressgenes,DEGs），为SHFMD的早期识别、及时治疗提供理论依据，为减少疾病死亡率、改善疾病愈后提供帮助。方法：收集2014年5月-2014年8月深圳市第三人民医院收治的重症和普通型手足口病（mildhand,footandmouthdisease,MHFMD）患儿各5例，以及5例健康体检儿童的外周静脉血5ml，分离PBMC并提取总RNA，采用RNA-seq技术筛选DEGs，并通过实时荧光定量PCR（quantitativereal-timePCR,qRT-PCR）及酶联免疫吸附测定法（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）从转录组和蛋白组水平分别对RNA-seq筛选所得DEGs结果进行再次检测。结果：RNA-seq分析示SHFMD相对健康对照组（healthycontrol,HC组）共117个DEGs，其中108个基因上调，9个基因下调；SHFMD相对MHFMD组共26个DEGs，其中14个基因上调，12个基因下调；两组DEGs中共有8个相同表达基因，其中S100A8、S100A12、IL-8和IL-1β表达上调，TNFRSF13C、IL-7R、THBS1和VEGFA表达下调。进一步qRT-PCR及ELISA检测结果均与RNA-seq结果一致（P＜0.05）。I 结论：1.RNA-seq技术初步建立了HFMD差异基因表达谱。2.表达上调的S100A8、S100A12、IL-8、IL-1β和表达下调的TNFRSF13C、IL-7R、THBS1、VEGFA是SHFMD差异表达基因，有望成为HFMD重症化的预测指标。关键词：转录组测序；重症手足口病；差异表达基因；实时荧光定量PCR；酶联免疫吸附测定法II RESEARCHOFTHESEVEREHAND,FOOTANDMOUTHDISEASEDIFFERENTIALLYEXPRESSEDGENESBASEDONTHERNASEQUENCINGTECHNOLOGYChengChen(InfectiousDisease)Directedby:Zhong-tianPengAbstractObjectiveToscreenseverehand,footandmouthdisease(SHFMD)differentiallyexpressedgenes(DEGs),andforprovidetheoreticalbasisfortheearlyidentificationandtimelytreatmentofSHFMDbyhigh-throughputtranscriptomesequencingtechnology(RNAsequencing,RNA-seq).Andtoreducethemortalityandimprovetheprognosisofthedisease.MethodsAtotalof15PBMCsampleswerecollectedfrom5SHFMDpatients,5MHFMD(mildhand,footandmouthdisease,MHFMD)patientsand5healthycontrol(HC),duringMay2014andAugust2014,inthethirdpeople'shospitalofshenzhen.UsingtheRNA-seqtechnologywesequencedtheRNAofthePBMC,onthebasisofRPKM(ReadsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads)multiplesandexpressionlevelfold-change,andscreenedthedifferentiallyexpressedgenes.Furthermore,weconfirmedtheexpressionlevelsoftheDEGsbyquantitativereal-timePCR(qRT-PCR)andIII enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA).ResultsRNA-seqfound117DEGsbetweenSHFMDandMHFMD,including108up-regulatedgenesand9down-regulatedgenes;and26DEGsbetweenSHFMDandHC,including14up-regulatedgenesand12down-regulatedgenes.ThetwogroupsofDEGshad8genesincommon,ofwhichS100A8,S100A12,IL-8andIL-1βwereup-regulated,whileTNFRSF13C,IL-7R,THBS1andVEGFAweredown-regulated.AndqRT-PCRandELISAdetectionresultsareconsistentwiththeresultsofRNA-seq(P＜0.05).Conclusions1.RNA-seqtechnologysuccessfullyestablishmentofgeneexpressionprofilesofHFMD.2.Up-regulationofS100A8,S100A12,IL-8,IL-1βanddown-regulatedTNFRSF13C,IL-7R,THBS1,VEGFAwereSHFMDdifferentiallyexpressedgenes,isexpectedtobecomethepredictorofsevereHFMD.Keywords：RNAsequencingSHFMDdifferentiallyexpressedgenesquantitativereal-timePCRenzyme-linkedimmunosorbentassayIV 主要缩略词英文索引英文缩写英文全称中文全称CoxA16CoxsackievirusAgroup16strain柯萨奇A组16型DEGsDifferentiallyexpressiongenes差异表达基因EV71Enterovirus71肠道病毒71型ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定法IL-1βInterleukin1beta白细胞介素1βIL-7RInterleukin7receptor白细胞介素7受体IL-8Interleukin8白细胞介素8MHFMDMildhand,footandmouthdisease普通型手足口病PBMCPeripheralBloodMononuclearCell外周血单个核细胞qRT-PCRQuantitativeReal-timePCR实时荧光定量PCRRNA-seqRNAsequencing转录组测序每百万reads中来自于某基RPKMReadsperKilobaseperMillionmappedreads因每千碱基长度的reads数SNPSinglenucleotidepolymorphisms,单核苷酸多态性S100A8S100calciumbindingproteinA8S100钙结合蛋白A8S100A12S100calciumbindingproteinA12S100钙结合蛋白A12SHFMDServerhand,footandmouthdisease重症手足口病TNFRSF13CTumornecrosisfactorreceptorfamily13c肿瘤坏死因子受体家族13CTHBS1Plateletresponseprotein1血小板反应蛋白1VEGFAVascularendothelialgrowthfactorA血管内皮生长因子A 目录摘要....................................................................................................................IAbstract............................................................................................................III第1章绪论...................................................................................................1第2章材料与方法.........................................................................................52.1材料..........................................................................................................52.1.1临床样本收集...................................................................................52.1.2重症/普通型手足口病诊断标准......................................................52.2试剂、耗材和仪器.................................................................................52.2.1RNA-seq文库制备主要试剂............................................................52.2.2RNA-seq文库制备主要耗材/仪器设备...........................................62.2.3其他试剂...........................................................................................62.2.4其他耗材/仪器设备..........................................................................72.3方法.........................................................................................................82.3.1实验分组...........................................................................................92.3.2临床样本处理...................................................................................92.3.3RNA质检.........................................................................................102.3.4RNA-seq文库制备与测序.............................................................102.3.5差异表达基因（DEGs）筛选.......................................................122.3.6实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证.........................................122.3.7酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测..........................................142.3.8统计学方法.....................................................................................15 第3章结果.................................................................................................173.1临床资料...............................................................................................173.2总RNA质检结果.................................................................................173.3引物验证结果.......................................................................................213.4差异表达基因RNA-seq筛选结果......................................................213.5差异表达基因qRT-PCR验证结果......................................................223.6差异表达基因ELISA检测结果..........................................................24第4章讨论...................................................................................................26第5章结论...................................................................................................30参考文献.........................................................................................................32综述.................................................................................................................38硕士期间发表论文.........................................................................................48致谢...............................................................................................................50 第1章绪论手足口病（hand,footandmouthdisease,HFMD）主要是由肠道病毒71型（Enterovirus71,EV71）和柯萨奇A组16型（CoxsackievirusAgroup16strain,CoxA16）引起的急性小儿传染病，主要表现为手、足、口腔等部位的疱疹、斑丘疹。HFMD自1957年被新西兰首次报道以来[1]，已在全球各地引起广泛的流行与暴发，如1997年马来西亚发生主要由EV71引起的HFMD流行，4～8月共2628例发病，仅4～6月就有29例死亡。我国自1981年在上海发现本病以来HFMD疫情反复出现在各个省市。如1983年天津发生主要由CoxA16引起的HFMD暴发流行，5～10月间发病7000余例。1998年中国台湾省发生主要由EV71引起的HFMD和疱疹性咽峡炎暴发流行，在6月和10月两波流行中，共监测到129,106例患者，其中重症405例，死亡78例[2,3]。而2008年至2014年，全国HFMD每年总发病数从488,955人增加至2,778,861[4,5]人，总死亡数从126人增加至501人，发病数和死亡数均居丙类传染病的首位，可见HFMD已成为严重危害我国儿童健康疾病之一。重症手足口病（severehand,footandmouthdisease,SHFMD）是指少数病情进展迅速，在发病1~5d左右出现神经系统受累、呼吸及循环障碍，甚至死亡等危重症表现者。SHFMD主要由EV71引起，作为单股正链RNA病毒的EV71，具有高度嗜神经性，对于中枢神经系统有极高的感染性，可沿周围神经的轴索浆向心性扩散到达脑干及延髓，2008年至2012年死亡病例中EV71检出率达93.7%[6]。2012年饶子和等人揭示出了EV71独特的结构特征：一种通常定位在病毒保护壳口袋内被称为“口袋因子”的分子在EV71中部分暴露出来。当EV71与人类细胞结合时，这一口袋因子被挤出口袋，导致病毒颗粒失稳，随后分解并将其遗传物质释放到感染细胞中进行复制，加重组织病理损伤[7]，这或许可以部分解释感染EV71后重症发生几率大大增加的原因。然而一个疾病的发生是由致病菌与宿主间相互作用的结果。有研究发现，不同基因型和等位基因的人发生手足口重症的概率是不一样的[8]。Yuan等人采用单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms,SNP）方法分析发现IL-6-572G等位基因多态性在手足口病脑炎患儿血清中显著高于普通型手足口病患儿[9]，此外，血清CCL2-2510等位基因水平在并发脑炎的手足口病人中高表达[10]。Li等人通过临床大样1 本试验（SHFMD350例，MHFMD221例）提出SHFMD患儿血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α水平显著高于MHFMD[11]。同时，冯慧芬等人采用ELISA法亦发现SHFMD神经源性肺水肿（neurogenicpulmonaryedema,NPE）患儿血清TNF-α、IL-10及INF-γ水平显著高于未发生NPE患儿，并提出IL-10是SHFMD发生NPE的危险因素[12]。这些都提示个体差异、遗传因素等在疾病重症化发生发展过程中亦起一定作用。临床上，对于处于心肺功能衰竭前期的SHFMD患儿若能及早发现并及时治疗一般愈后较好，一但进入心肺功能衰竭期则病情变化快且凶险，死亡率较高。李佩青等人系统观察并记录了54例EV71感染重症死亡病例的93项症状和体征。结果示发病至死亡时间中位数为78.5h（6~432h），120h内死亡43例（79.6%），其中SHFMD救治指南中涉及的生命体征等指标出现异常的病例却不足50%[13]。这就提醒临床医务人员应及早发现生命体征以外的指标，也促使研究者们去寻找敏感且可靠的重症预警指标，以阻止疾病恶化。然而，SHFMD相关因子研究的方法不管是SNP还是ELISA等，都有一个共同缺点，即研究基因位点有限，并没有全面的展示宿主免疫反应状态，未确定是否还有其他因子协同作用导致SHFMD发生，因此对早期临床干预指导意义不够充分。近30年来分子生物学的研究取得了巨大进展，其中转录组测序技术（RNA-sequencing,RNA-seq）的诞生具有里程碑式的意义。所谓RNA-seq技术即利用高通量测序方法对cDNA进行测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录组和基因组。相对于传统的基因芯片技术而言，转录组测序无需预先设计探针，即可对任意物种的任意细胞类型的转录组进行检测，能够提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围。自2005年出现以来RNA-seq技术已广泛应用于医学领域，如前列腺癌、肺癌、丙肝病毒[14-16]。Xiao等人使用RNA-seq分析发现SIM2、ADAMTS6、FOXD4L4及DNAH5可能在结直肠癌的发展过程中扮演着重要角色，并可为该疾病的诊断、预后和治疗提供指导[17]。Zhang等则利用RNA-seq技术对感染EV71的恒河猴PBMC进行分析，发现TAC1、IL17A与EV71感染SHFMD明显相关[18]。然而，目前关于人类患HFMD的转录组研究尚罕见报道，因此我们的研究应用覆盖率和灵敏度更高的RNA-seq技术，检测EV71感染患儿PBMC转录组表达情况，2 通过全面分析SHFMD、MHFMD患儿和健康小儿PBMC中RNA转录组情况，筛选差异表达基因，试图发现所有与SHFMD发生相关的差异表达基因，为SHFMD的早期识别、及时治疗提供科学依据，为减少疾病死亡率改善疾病愈后提供帮助。3 4 第2章材料与方法2.1材料2.1.1临床样本收集重症/普通型病例取样均在入院12时内（纳入本研究的患儿均处于手足口出疹期），取外周静脉血5ml，血液采集后立即进行血浆和PBMC分离，程序降温后，再分别置于-80℃冰箱冻存，备用。健康样本为同时期来医院行常规体检的健康小儿，采外周静脉血5ml，同样的方法进行PBMC与血浆的分离、冻存。2.1.2重症/普通型手足口病诊断标准对于学龄前儿童（1~3岁组多见），在流行季节发病，依据典型的临床表现及体征，可以达到HFMD临床病例诊断，若加上病原学和（或）血清学（急性期与恢复期血清EV71中和抗体滴度升高4倍以上）证据即可确诊HFMD。具体诊断标准参照《手足口病防治指南（2013年版）》。SHFMD患儿纳入标准：A.肠道病毒三项检查：EV71阳性，CoxA16阴性，通用型；B.持续高热≥3天，最高体温≥38.5℃；C.合并中枢神经系统改变：惊跳、嗜睡、抽搐等；D.或合并循环功能障碍：心率明显增快、高血压或低血压、末梢循环不良等；9E.实验室检查：血常规白细胞明显升高（WBC≥15×10/L），血糖升高≥11.1mmol/L等；F.或有典型的脑电图或（和）头颅CT改变；G.排除合并其他常见小儿感染性疾病，如麻疹、水痘、巨细胞病毒感染、流行性腮腺炎等。2.2试剂、耗材和仪器2.2.1RNA-seq文库制备主要试剂5 试剂名称公司QIAquickPCRextractionkitQIAGEN（德国）AMPureXpbeadsBeckmanCoulterAgilentBioAnalyzerDNAHigh-SensitivityAgilentTechnologiesLabChipIonPI™TemplateOT2200Kitv3ThermoFisherScientificIonPI™Sequencing200Kitv3ThermoFisherScientific2.2.2RNA-seq文库制备主要耗材/仪器设备耗材/仪器名称公司CovarisE210打断仪CovarisAgilent2100BioAnalyzerAgilentTechnologiesIonOneTouchinstrumentThermoFisherScientificIonOneTouchESinstrumentThermoFisherScientificIonTorrentProtonplatformThermoFisherScientific2.2.3其他试剂试剂名称公司SYBRPremixExTaqII(TliRNaseHTakara(RR820A)Plus)PrimeScript™II1stStrandcDNASynthesisTakara(6210A)KitQIAampViralRNAMiniKitQIAGEN（德国）TMTaKaRaExTaqTakara(RR001B)人淋巴细胞分离液天津灝洋生物制品科技有限公司磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma公司（美国）6 胎牛血清Gibco公司（美国）人IL-1β酶联免疫检测试剂盒武汉伊莱瑞特生物科技有限公司人IL-8酶联免疫检测试剂盒武汉伊莱瑞特生物科技有限公司人S100A8酶联免疫检测试剂盒武汉伊莱瑞特生物科技有限公司人S100A12酶联免疫检测试剂盒武汉伊莱瑞特生物科技有限公司人VEGFA酶联免疫检测试剂盒武汉伊莱瑞特生物科技有限公司人THBS1酶联免疫检测试剂盒武汉伊莱瑞特生物科技有限公司人IL-7R酶联免疫检测试剂盒武汉伊莱瑞特生物科技有限公司人TNFRSF13C酶联免疫检测试剂盒武汉伊莱瑞特生物科技有限公司引物合成深圳华大基因研究院β-actin英国Abcam公司2.2.4其他耗材/仪器设备耗材/仪器名称公司液氮上海化学试剂厂4℃冰箱Thermo公司（美国）-20℃低温冰箱Thermo公司（美国）-80℃低温冰箱Thermo公司（美国）BeckmanX-12R离心机美国Beckman公司DYY-6C型电泳仪DYY-6C型电泳仪BIO-RAD凝胶图像分析仪Bio-Rad公司（美国）StepOnePlus™实时荧光定量PCR系统ABI公司（美国）MicroAmpFastOptical96-WellABI公司（美国）ReactionPlatewithBarcode,0.1ml超净工作台美国FORMA公司连续波长酶标仪Thermo公司（美国）7 2.3方法图1：实验设计及目的图解8 2.3.1实验分组本研究分为SHFMD组、MHFMD组及健康对照（HC）组，每组各5人（S1~5，M1~5，H1~5），全转录组测序分别对3组共15例样本进行深度测序，然后将SHFMD组与MHFMD组、SHFMD组与HC组两两进行比较分析。2.3.2临床样本处理2.3.2.1血浆和PBMC分离a.采集3ml静脉血于抗凝管，轻柔颠倒混匀10次，使血液与抗凝剂充分混合，然后4℃3000rpm离心10min，上清液即无血细胞的血浆，取上清分装于0.5ml/管。b.采集的抗凝血分离出血浆后，往抗凝管沉淀中加入3-4mlPBS至总体积5ml，用巴斯滴管混匀。c.取15ml离心管加入5ml淋巴分离液，将混合血液沿管壁缓慢加入15ml离心管中（不能破坏分离液与混合血液的界面），400g（1900rpm），离心20min。d.离心后取中间白色云雾层至新的15ml离心管中，加入5-10mlPBS，至总体积10ml，600g（2300rpm），离心5min，弃上清。e.重复步骤c加入5-10mlPBS清洗。f.加入2mlPBS，混匀，各取1ml分装至两个1.5ml离心管中，600g（2300rpm），离心5min，弃上清，做好标记。若无法立即提取，可于-80℃低温冷冻储存。2.3.2.2血液样本总RNA提取采用QIAampViralRNAMiniKit（QIAGEN）试剂盒对15例PBMC样本中的总RNA进行提取，具体步骤按说明书进行：1)取1mlPBMC样本，用0.45μm的过滤器过滤，将过滤液转至新的EP管中。2)另取2ml无菌EP管，作好标记，取离心后的上清液，用0.22μm的过滤器过滤，滤液转至新的EP管中，用于下一步实验。3)用RNA酶和DNA酶（1*DNaseIbuffer条件下）处理，去除游离的RNA和DNA。4)后加入4倍体积的AVL，后剧烈震荡混匀15s，室温静置10min。5)简短低速离心后，加4倍样品体积（即和AVL等体积）的无水乙醇。剧烈震荡混匀15s，然后简短低速离心。9 6)取700μl加入QIAampMinicolumn（放置在2ml收集离心管中），6000g（8000rpm）离心30s后弃去滤液，把QIAampMinicolumn放回2ml收集离心管中。7)重复6)多次，直到样品离心收集吸附完毕。8)取500μlBufferAW1加入QIAampMinicolumn（放置在2ml收集离心管中），6000g（8000rpm）离心30s，弃滤液。9)重复8)。（当样品起始量＞500μl时，推荐此步；若＜500μl，可不做）。10)取500μlBufferAW2加入QIAampMinicolumn（置于一个新的2ml收集离心管中），20000g（14000rpm），离心3min。弃滤液。11)20000g（14000rpm），空离1min。12)小心取出QIAampMinicolumn放置于新干净的1.5ml离心管。取50-70μlbufferAVE或者无核酸酶无菌水，悬空竖直滴加入QIAampMinicolumn（确保滴至吸附膜膜中央）。室温静置1min。6000g（8000rpm）离心1分钟，收集样品并标记为一次洗脱。-80℃冰箱存放。（若提取样品起始量大于400μl，需进行二次洗脱。）2.3.3RNA质检RNA浓度和纯度使用Agilent2100生物分析仪（Agilent）进行检测，要求所有样本总RNA完整性（RNAintegritynumber,RIN）＞7.0，28S:18SrRNA>1.0。2.3.4RNA-seq文库制备与测序质检合格的RNA，用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。加Fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（randomhexamers）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二条cDNA链，在经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加poly（A）并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择（目的片段230-250bp；备份210-230bp，250-270bp），最后进行PCR扩增，建好的测序文库（200bp）用IlluminaHiSeq™2000平台进行测序。此部分由华大基因研究院实验员协助完成。10 （1）打断CovarisE210打断二链产物检测：3μlDNA+5μlTE+2μl溴酚黄；1%琼脂糖凝胶;50bpMarker，D2000Marker；150V30min;打断：①条件：30μl样本加入70μl的TEbuffer，转入snaptube中；②程序：covarisE210；Dutycycle10%intensity5；cycle/burst20060s；打断产物检测：5μlDNA+3μlTE+2μl溴酚黄；1%琼脂糖凝胶；50bpMarker，D2000Marker；150V30min；产物纯化：180μl的AmpureXpBeads(1.8×)纯化回收cDNA产物，回收42μl。（2）末端修复：反应试剂单个样本使用量DNA42μl10×PNKbuffer5.0μldNTP(25mM)0.4μlT4PNK1.2μlT4DNApol(3U/ul)1.2μlKlenowfragment(5U/ul)0.2μl反应程序：20℃30min；反应产物纯化：90ulAmpureXpBeads(1.8×)纯化修复产物，回收21μl。（3）加接头反应试剂单个样本使用量DNA21μl2×Rapidligation25μlP1Adapter(12.5pmol/ul)1.0μlT4quickDNAligase(1U/ul)2.0μlBarcodeAdapter（12.5pmol/ul）1.0μl反应程序：20℃20min产物纯化：90μlAmpureXPBeads(1.8×)纯化连接产物，回收30μl。11 （4）PCR反应试剂单个样本使用量DNA17.6μlMgSO4(50nM)1.0μl10×Pfxbuffer2.5μldNTP（25mM）1.0μlPlatinumPfxDNApolymerase0.4μlAprimer(10uM)1.25μlPPrimer(10uM)1.25μl反应条件：72℃20min，95℃5min，（95℃30s，58℃30s，70℃1min）×12循环，70℃10min，12℃Forever2.3.5差异表达基因（DEGs）筛选测序原始数据经质量评估和过滤之后，将reads映射到参考人类基因组和转录组（用于本研究的人类基因组和转录组序列从网站http://genome.ucsc.edu/index.html下载）。然后使用这些映射结果计算基因的RPKM（ReadsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads），即每1百万个map上的reads中map到外显子的每1千个碱9基上的reads个数，其计算公式为：RPKM=（10×C）/（N×L）（RPKM为某基因的表达量，C为唯一比对到该基因的reads数，N为唯一比对到参考基因的总reads数，L为该基因编码区的碱基数），最后使用NOISeq程序比较各组中不同基因的RPKM值，筛选出差异表达基因（DEGs）。DEGs遵循标准：比较两组的差异表达，表达值变化倍数Fold-change≥2或Fold-change≤-2.0；概率＞0.8。2.3.6实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证2.3.6.1RNA反转录即cDNA合成20μl体系（Takara6210A试剂盒）A.反应混合液配置10ul试剂体积N6引物1.0μldNTP1.0μlRNA样本1.16μldH2O（灭菌蒸馏水）6.84μl65℃保温5min后，冰上迅速冷却，大于1min12 B.反转录反应液配置试剂体积上述变性后反应液10μl5×PrimeScriptIIBuffer4.0μlRNase0.5μlPrimeScriptIIRTase1.0μldH2O（灭菌蒸馏水）4.5μl反应条件：缓慢混匀；30℃，10min；42℃，60min；75℃，15min；4℃，forever2.3.6.2qRT-PCR引物设计与合成qRT-PCR引物的设计使用PrimerPremier5软件设计，所有引物最终序列如表所示，内参选用β-actin，所有的引物均经过普通PCR进行特异性验证（引物由深圳华大基因合成）。表1.实时荧光定量PCR引物序列表基因名称引物序列（5’→3’）扩增长度（bp）上游引物：GCCGATTCAGCTCTTCACTCTNFRSF13C120下游引物：GCAAGCACACCAAACTCCAT上游引物：GGCAGGCTCAAGAGGGAATAIL-7R111下游引物：GCTCTGAGATCATGGACGGAT上游引物：ATCCATACCCGAGACGATTGTHBS1135下游引物：ACCTGGGTTAATCAGCTAACG上游引物：GCGACACATTGTTGGAAGAAVEGFA109下游引物：CGACATAGGTCCTTTTAGGCT上游引物：TACCATCATGTTGACCGAGCS100A8106下游引物：GTCATCCCTGTAGACGGCAT上游引物：CAGGCTGACACCCTCTCTAAS100A12130下游引物：CGTCTTGATTAGCATCCAGG上游引物：TGACTCCAAACCTTTCCACCIL-8129下游引物：TCCTTGGGGTCCAGACAGA上游引物：TCTACGAATCTCCGACCACCIL-1β101下游引物：TTAGGCAGGGAACCAGCAT上游引物：TCCTTCCTGGGCATGGAGTβ-Actin132下游引物：AGCACTGTGTTGGCGTACAG13 2.3.6.3引物验证20μlPCR体系(TakaraRR001B试剂盒)试剂体积ExTaqTM0.1μl10×ExTaqTMBuffer2.0μldNTP1.6μlcDNA1.0μl上游引物1.2μl下游引物1.2μldH2O（灭菌蒸馏水）12.9μl反应条件：预变性94℃，2min；(94℃，30s；60℃，30s；72℃,20s)×35循环；72℃，8min；12℃，forever2.3.6.4qRT-PCR反应体系10μl(TakaraRR820A试剂盒)试剂体积SYBR®PremixExTaqTMII（2×）5.0μl上游引物0.4μl下游引物0.4μlROXReferenceDye（50×）0.2μlcDNA0.5μldH2O3.5μl反应条件：预变性95℃，30s；(95℃，5s；60℃，30s)×40循环；75℃，15s；60℃，1min；95℃，15s2.3.7酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测ELISA试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。特异性抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的抗原会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的特异性抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素化的特异性抗体与结合在包被抗体上的抗原结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，抗原浓度与OD值之间呈正比，通过绘制14 标准曲线计算出样品中抗原的浓度。试剂盒内含ELISA酶标板（可拆卸）、冻干标准品、标准品&样品稀释液、浓缩生物素化抗体、生物素化抗体稀释液、浓缩HRP酶结合物、酶结合物稀释液、浓缩洗涤液（25×）、底物溶液（TMB）、反应终止液、封板覆膜。操作步骤按试剂盒说明书进行：1)分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液100μL，余孔分别加标准品或待测样品100μL，给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟；2)弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入100μL生物素化抗体工作液，覆膜，37℃孵育60分钟；3)弃去孔内液体，甩干，洗涤3次；4)加入100μL酶结合物工作液，覆膜，37℃孵育30分钟；5)同步骤3）洗涤5次；6)每孔加入90μL底物溶液，覆膜，37℃避光孵育15分钟左右；7)每孔加入50μL终止液，立即在450nm波长处测量OD值，进行结果统计。2.3.8统计学方法采用统计软件SPSS18.0对初级数据进行统计分析，同个样本多次测试结果统计采用x±S；同一基因不同组间比较采用单因素方差分析，令P＜0.05为有统计学意义；显著差异表达基因筛选采用泊松分布。15 16 第3章结果3.1临床资料依据入组标准，纳入2014年5月-2014年8月深圳市第三人民医院感二科收治的SHFMD和MHFMD患儿各5例，以及同时期来院体检的5例健康儿童，下表为15例儿童的基本临床资料统计。表3.115例儿童基本临床资料（x±S）病例总数SHFMD组MHFMD组HC组参考值（n=10）（n=5）（n=5）（n=5）性别（男/女）（10/5）（3/2）（3/2）（4/1）年龄（月）25.9±4.624.2±5.627.2±3.226.4±5.2发热天数3.4±1.12.0±0.7体温峰值(℃)39.3±0.338.1±0.2436.7±0.636～379白细胞(10/L)12.2±4.215.5±3.613.6±2.77.6±1.05～12中性粒细胞(%)6.6±2.48.3±1.47.6±1.84.0±1.054～62淋巴细胞(%)4.3±2.14.9±2.94.9±1.83.1±0.620～40血红蛋白(g/L)125.8±9.4126.4±6.1129.2±13.3121.8±7.7110～1609血小板(10/L)307.3±122.1385.4±186.7289.8±63.4264.6±25.899～303C反应蛋白(mg/L)9.9±7.315.1±5.410.9±8.43.5±1.5<8血糖(mmol/L)8.2±3.112.0±2.06.8±0.965.74±0.888.9～6.11ALT(U/L)25.7±14.727.1±9.933.9±19.916.0±7.90～45AST(U/L)36.2±10.640.1±7.438.4±16.230.0±1.30～45CK-MB(U/L)*2.1±1.7**0～5注：ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶；CK-MB：肌酸磷酸激酶同工酶；*指部分小儿未检查该项目，数据无法统计。3.2总RNA质检结果根据华大基因研究院RNA-seq文库制备对总RNA的要求，我们采用Agilent2100对各样本总RNA进行质检，全部合格。表3.215个PBMC样本总RNAAgilent2100质检结果样本编号浓度（ng/ul）体积（ul）总量(ug)RIN28S/18S结果说明S1292205.847.51.0A类S2184203.688.81.6B类S3260205.208.11.3A类S4402208.048.91.5A类17 续表样本编号浓度（ng/ul）体积（ul）总量(ug)RIN28S/18S结果说明S5228204.567.41.0B类M1162203.329.31.7B类M2148202.969.21.4B类M3294204.879.31.6A类M4196203.929.31.6B类M5172203.449.01.5B类H1172203.449.01.4B类H2118202.368.91.7B类H3184203.689.11.5B类H4142202.847.41.0B类H5214204.289.01.6A类注：根据深圳华大基因研究院以往数据统计，对于A类、B类样品，RNA-Seq一次建库成功率在90%-95%范围内。S1S2S3S418 S5M11.0M2M3M4M519 H1H2H3H41.0H5图3.115例临床样本总RNAAgilent2100质检结果图20 3.3引物验证结果使用普通PCR对引物进行扩增，然后琼脂糖凝胶电泳对引物特异性进行验证，如下图所示，各引物特异性均较好。图3.28个DEGs引物RNA电泳图注：图A为4个上调基因，图B为4个下调基因3.4差异表达基因RNA-seq筛选结果将所有样本所测的reads数映射到人类参考基因组和转录组上，然后计算各映射结果的RPKM值，最后使用NOISeq程序、泊松分布统计分析我们得出：SHFMD组与MHFMD组比较共26个DEGs（其中14个基因上调，12个基因下调）；SHFMD组相对HC组共117个DEGs（其中108个基因上调，9个基因下调）；对两组DEGs进行进一步比较，得8个表达方向一致的DEGs，其中IL-1β、IL-8、S100A8和S100A12表达上调；VEGFA、THBS1、IL-7R和TNFRSF13C表达下调，P＜0.05（表3.3所示）。表3.3转录组测序筛选得8个差异表达基因的RPKM值（x±S）表达GeneID基因名称SHFMD组MHFMD组HC组ab上调3553IL-1β105.92±11.1628.06±14.2236.22±3.40ab6283IL-844.30±9.278.45±2.0710.44±0.67ab3576S100A81426.75±61.64496.42±50.78453.94±31.94ab6279S100A12527.75±60.00169.95±50.37191.26±18.58ab下调7422VEGFA9.86±1.4629.77±4.5827.89±3.92ab7057THBS116.73±2.2754.71±5.2252.48±5.40ab115650IL-7R32.98±3.2977.54±9.6977.83±7.28ab3575TNFRSF13C59.29±5.69149.14±14.57141.09±21.14注：a代表SHFMD组相较于MHFMD组P＜0.05，b代表SHFMD组相较于H健康对照组P＜0.0521 3.5差异表达基因qRT-PCR验证结果依据RNA-seq筛选出的SHFMD差异表达基因结果，我们采用qRT-PCR对8个DEGs在转录组水平进行验证。每个样本均对8个DEGs进行同步检测，以β-actin为内参，以灭菌蒸馏水（dH2O）为空白对照，每个基因重复3孔（图3.4），选取各样本相对内参的ΔCTMean值所得结果统计如下图表。可以看出qRT-PCR结果中各基因的表达情况与RNA-seq结果完全一致。表3.4RT-PCR对8个差异表达基因验证结果（x±S）表达GeneID基因名称SHFMD组MHFMD组HC组ab上调3553IL-1β8.98±0.343.81±0.614.06±0.48ab6283IL-823.50±0.358.54±0.378.77±0.42ab3576S100A88.74±0.422.15±0.242.38±0.32ab6279S100A1212.98±0.437.67±0.427.90±0.44ab下调7422VEGFA4.52±0.249.50±0.439.11±0.32ab7057THBS12.59±0.365.50±0.275.80±0.27ab115650IL-7R2.56±0.556.55±0.576.14±0.67ab3575TNFRSF13C2.77±0.537.16±0.187.07±0.50注：a代表SHFMD组相较于MHFMD组P＜0.05，b代表SHFMD组相较于H健康对照组P＜0.0522 图3.3RNA-seq、qRT-PCR对8个DEGs检测结果比较（x）注：图A、B纵坐标分别为log2(SHFMD/MHFMD)、log2(SHFMD/HC)，比较值为均数AB图3.4qRT-PCR溶解曲线及扩增曲线图注：图A为扩增曲线，图B为溶解曲线，不同颜色线条代表不同基因，每个基因3个复孔23 3.6差异表达基因ELISA检测结果依据RNA-seq筛选出的SHFMD差异表达基因结果，我们采用ELISA对8个DEGs在所有样本中蛋白组水平进行进一步检测，ELISA所得结果与转录组测序结果均一致，结果如下图表所示。可以看出不管是在转录组还是蛋白组水平，筛选出的8个基因在SHFMD组中均存在特异性表达，进一步说明该8个DEGs作为SHFMD特异差异表达基因的可靠性。表3.5ELISA对8个差异表达基因验证结果（x±S）表达GeneID基因名称SHFMD组MHFMD组HC组ab上调3553IL-1β(pg/ml)48.96±1.9136.24±1.5738.76±2.11ab6283IL-8(pg/ml)580±52.22200±26.11180±20.12ab3576S100A8(ng/ml)0.75±0.1300.32±0.100.350±0.09ab6279S100A12(ng/ml)3862.31±568.223290.04±480.303122.20±526.44ab下调7422VEGFA(pg/ml)13.27±5.8430.71±2.7028.57±2.98ab7057THBS1(ng/ml)152.41±62.24298.12±45.60302.11±51.13ab115650IL-7R(pg/ml)45.15±15.3285.42±6.5079.24±7.33TNFRSF13Cab3575489.32±243.35920.33±153.07979.25±163.50(pg/ml)注：a代表SHFMD组相较于MHFMD组P＜0.05，b代表SHFMD组相较于H健康对照组P＜0.0524 图3.5RNA-seq、ELISA对8个DEGs检测结果比较（x）注：图A、B纵坐标分别为log2(SHFMD/MHFMD)、log2(SHFMD/HC)，比较值为均数25 第4章讨论随着SHFMD发病数和死亡数的连年上升，其发病机制受到越来越多研究者的关注，已有大量证据表明年龄、免疫系统功能、白细胞及血糖水平、促炎和抗炎因子等在SHFMD的发生发展中发挥重要作用，但至今SHFMD的发病机制仍未明确。随着人类基因组计划的完成及基因检测技术平台不断发展和完善，基因检测成为临床诊断和科学研究热点，得到了突飞猛进的发展。本研究主要目的是从基因分子水平寻找与SHFMD有关特异的差异表达因子，对于没有明确候选基因（或候选基因数量较多的大样本病例）运用常用的qRT-PCR、ELISA或基因芯片等技术来筛查是难以完成的，因此我们选用了具有通量大、精确度高和信息量丰富等优点的新一代测序技术。早期Nicholas等使用基因芯片联合新一代测序技术，成功发现头小畸形的新基因WDR62[19]，[20]类似的研究在家族性乳腺癌中确定了8个候选变异位点和在家族性渗出性玻璃体视网膜病变发现易感基因TSPAN12[21]。本研究，我们应用RNA-seq技术对患儿PBMC中的RNA进行全转录组深度测序，全面分析SHFMD相对于MHFMD及健康儿童间显著差异表达基因，试图筛选出SHFMD特异性的差异表达基因，并希望这些显著差异表达基因能作为疾病早期的重症预警标志物。通过比较SHFMD组与MHFMD组、SHFMD组与HC组，我们发现了8个在两比较组中表达方向一致的DEGs：其中IL-1β、IL-8、S100A8和S100A12显著上调，VEGFA、THBS1、IL-7R和TNFRSF13C显著下调。因此我们认为这8个基因为SHFMD显著差异表达基因，其表达情况可能与SHFMD的发生发展密切相关。上调基因IL-1β是重要的炎症反应介质之一，参与各种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡，促进单核巨噬细胞分泌炎症因子。IL-1由IL-1β和IL-1α两种存在形式，又称淋巴细胞刺激因子，局部低浓度时协同刺激抗原提呈细胞（antigenpresentingcell,APC）和T细胞活化，促进B细胞增殖和分泌抗体，进行免疫调节。大量产生时有内分泌效应：诱导肝脏急性期蛋白合成，引起发热和恶病质[22]。同时，IL-1还可作为内生致热源，可以直接作用于下丘脑引起发热反应，具有较强的致热作用[23]。研究表明，手足口病并发脑炎、心肺衰竭者IL-1β明显升高，IL-1β受体拮抗剂和粒细胞集落刺激因子的水平可作为判断HFMD预后的标志物[24]。SHFMD患儿常有持续高热、合并多种严重并发症，这可能与致炎细胞因子IL-1β，广泛参与宿主组织破坏、水肿形成等26 多种病理损伤有关。白介素家族的另一成员IL-8，主要由单核-巨噬细胞分泌，而IL-1、TNF等可诱导单核-巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞等合成和分泌IL-8，其主要生物活性为招募和激活中性粒细胞等炎症细胞[25,26]。中性粒细胞与IL-8接触后形态发生改变，定向游走到反应部位并释放一系列活性产物，可导致机体局部的炎症反应，达到杀菌和细胞损伤的目的。另外，1L-8还可以趋化嗜碱性粒细胞，并刺激其释放组织胺，可能与速发型超敏反应的发生有关[27]。Wan等报道血清中IL-8水平与HFMD的严重程度密切相关，并可能在疾病的早期阶段用作重症预测标志物[28]。这些研究与我们的检测结果一致，因而从转录组和蛋白组水平都表明IL-1β、IL-8在SHFMD中扮演者重要角色，可能成为SHFMD早期预测因子。S100A8/A12为S100钙结合蛋白家族成员，是单核巨噬细胞蛋白质重要组成部分。作为“警戒素”成员之一的S100蛋白主要通过活化内皮细胞，诱导特定的炎症反应，增加血管通透性和促进血栓形成，其还可通过toll样受体（Tolllikereceptor,TLR）或高级糖化终末产物（advancedglycationendproducts,AGEs）来激活先天性免疫，在炎症反应中起关键作用[29-31]。此外S100B蛋白在脑组织中也有表达，因其浓度不同而发挥营养神经或促凋亡作用。研究发现血清中S100A8/A9水平可能与目前实验室常用炎症指标显著相关，如C反应蛋白、红细胞沉降率、类风湿因子等，可作为某些疾病的分子标志，如类风湿性关节炎和心血管疾病[32-34]。S100A12可调节单核细胞迁移，并诱导巨噬细胞释放炎症因子。我们的研究发现，S100A8/A12在SHFMD中明显上调，因此我们推测S100A8/A12同样通过影响多种炎性细胞因子和蛋白，加重炎症反应和脑组织损伤，从而导致SHFMD的发生。下调基因THBS1是一种由血小板、平滑肌细胞、内皮细胞等多种细胞产生的细胞外基质糖蛋白，1971年首次从凝血酶刺激后的血小板细胞膜中分离出，主要分布于[35]血小板α颗粒和多种组织的细胞外基质中。血管生成是创伤治愈、月经周期、肿瘤、各种局部缺血和炎症疾病的共同特征，大量体外和体内实验证明THBS-1可以抑制血管生成[36]，是一种天然的血管生成抑制剂，因此与多种肿瘤的生长、转移和预后关系密切[37,38]。其抑制血管生成的机制可以概括为两类，一是直接作用于内皮细胞，抑制迁移、诱导内皮细胞凋亡；二是间接影响的各种细胞因子（如转化生长因子β）、蛋白酶（如基质蛋白酶2、蛋白酶9）和生长因子（如成纤维细胞生长因子、VEGFA）27 来调节血管生成[39]。VEGFA是血管生成和淋巴血管生成的诱导因子，它是一种对内皮细胞高度特异的促细胞分裂剂，信号转导包括酪氨酸激酶受体的结合和内皮细胞的增殖、移动，以及新的血管形成[40]。VEGFA除增加血管通透性、刺激血管内皮生长以外，在趋化单核/巨噬细胞、增强免疫炎症、增加粘附分子表达等多方面发挥作用。Huang等研究发现VEGFA在EV71感染致HFMD患者的临床表现中亦扮演着多个角色，如可诱发神经系统症状，其过表达可引起神经源性肺水肿（NPE），然而他们的实验还认为EV71的存在可诱导VEGFA降解[41]。我们的研究发现SHFMD转录组THBS1、VEGFA水平均显著下调，我们推测THBS1下调使VEGFA过表达，导致HFMD向危重症病情发展，但由于EV71可诱导VEGFA降解，从而导致两者在EV71所致SHFMD患儿中表达均下调。IL-7是一种调节免疫系统细胞活性蛋白质，与其受体结合可引发了一系列细胞内的化学信号。在未成熟造血细胞内通过IL-7受体信号可确保成熟B细胞和T细胞功能得以发挥，此外IL-7受体信号可刺激这些未成熟细胞的生长、增殖和存活[42]。因此IL-7在维持幼稚和记忆CD4、CD8T淋巴细胞在外周循环的生存和平衡中起关键作用。同样与IL-7类似，TNFRSF13C可增强B细胞的体外存活，因而也称B细胞活化因子受体（Bcellactivatingfactorreceptor,BAFFR），是外周B细胞群的调节器[43]。B细胞的存活需要BAFF及受体BAFFR引发的下游信号，但其机制尚不清楚。英国的一项研究表明，B细胞受体（Bcellreceptor,BCR）信号中关键蛋白Syk的失活是B细胞凋亡的主要原因，而BAFFR信号则能够重新活化Syk，进而激活ERK和PI3K等下游信号，维持B细胞的存活[44]。IL-7与TNFRSF13C两种因子均参与调节免疫细胞的成熟与生存，而越来越多的研究表明，SHFMD的发生发展与免疫功能的成熟度密切相关，免疫系统较成熟的年长儿童患HFMD多仅表现为轻微发热和少量出疹，疾病多呈自限性发展，IL-7与TNFRSF13C的下调引起免疫细胞成熟延迟、功能减退，从而增加SHFMD发生的可能。重症手足口病作为儿童“头号杀手”，目前仍没有上市的疫苗和有效的抗病毒药物出现，使得疫情一直难以控制，早期甄别重症表现仍是减少死亡率的关键。本研究通过转录组测序技术筛选出上调的S100A8、S100A12、IL8、IL1B和下调的TNFRSF13C、IL-7R、THBS1、VEGFA为SHFMD特异的差异表达基因，这些差异表达基因有望成为疾病的早期预测因子，以指导医护人员对患儿进行早期干预治疗，改善疾病愈后。28 但本研究仍存在一定的局限性，包括病例数较少，未涉及其它肠道病毒，未对发现的基因进行进一步鉴定及功能研究等；这也是我们下一步需进行的工作，即加大样本量对DEGs进行验证，并对DEGs的功能进行研究，寻找SHFMD相关通路，构建SHFMD预警模型。29 第5章结论1.RNA-seq技术初步建立了HFMD差异基因表达谱。2.表达上调的S100A8、S100A12、IL-8、IL-1β和表达下调的TNFRSF13C、IL-7R、THBS1、VEGFA是SHFMD差异表达基因，有望成为HFMD重症化的预测指标。30 31 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综述肠道病毒71型感染致重症手足口病研究进展手足口病（hand,footandmouthdisease,HFMD）主要是由肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇A组16型（CoxA16）引起的急性丙类传染病，以3岁以下儿童多见，多呈自限性。相较于CoxA16及其他肠道病毒感染所致手足口病，EV71感染易累及神经系统（如无菌性脑炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿等），病情重、死亡率高，已成为儿童的头号杀手。本文就EV71感染致重症HFMD的临床特征、发病机制、早期诊断以及治疗进展作一综述。EV71所致HFMD临床表现多样，包括轻微发热、呼吸道症状、疱疹性咽峡炎、中枢神经系统（CNS）并发症、甚至死亡。约2/10,000的患儿感染EV71可发生严重并发症，约80%~85%的HFMD死亡病例可分离出EV71病毒[1]。EV71自1969年被分离出后，在亚太地区迅速暴发流行，已严重危害儿童健康。过去的几十年里，EV71的研究已取得很大进步，为HFMD的预防和控制铺平了道路。此文主要就EV71感染致危重症HFMD发病机理、治疗和预防的研究进展进行总结。1、病原学人肠道病毒71型属于肠道病毒属小RNA病毒科A组，核酸为长约7.4kb。病毒颗粒为二十面体立体对称无包膜、无突起的球型结构，其衣壳蛋白由病毒蛋白VP1~4（viralprotein,VP）四种结构组成，其中VP4位于衣壳的内侧，其余均暴露在病毒衣壳的表面（图[2]）。依据衣壳蛋白VP1核苷酸序列不同EV71可分为A、B、C、D四个基因型，其中B、C型进一步分为B1~5，C1~5亚型，不同基因亚型与疾病严重程度之间的是否存在关联至今尚未确定[3-4]。从2008年到2014年，手足口病疫情反复出现在我国的各个省市，全国手足口病发病数从488955人增加至2778861人，死亡数从126人增加至501人，发病数和死亡数均占丙类传染病的首位[5-6]。在此期间，CoxA2、A4、A5、A6，A10、A12、A16，和EV71共菌株流行、循环爆发，其中EV71是手足口病危重症的主要责任病原。38 [2]图1：EV71病毒颗粒结构和基因组结构图EV71病毒颗粒为直径约30nm的二十面体立体对称球型结构，内含单股正链RNA。RNA中仅有一个开放阅读框（ORF），在其两侧为5′和3′非编码区（UTR），核酸长约7.4kb，其5′末端共价结合有一个小分子量的蛋白（VPg），3′末端有多聚腺苷酸（polyA）尾。P1前体蛋白编码所有的结构蛋白VP1~4，P2和P3共编码七个非结构蛋白，分别为2A~C和3A~D。2、发病机制2.1病毒因素EV71感染具泛嗜细胞性，主要利用特定的细胞分子作为受体侵犯宿主细胞。一种是清道夫受体B2（scavengerreceptor,SCARB2），亦称溶酶体整合膜蛋白2(lysosomesintegralmemberaneprotein,LIMP-2)，广泛表达在不同类型的细胞，包括神经元，直接参与EV71中枢神经系统的感染。另一种EV71受体，P-选择素糖蛋白配体-1（P-selectinglycoproteinligand1,PSGL-1,PSGL-1，CD162）。PSGL-1是一种粘附分子，通过PSGL-1与选择素分子间的相互作用介导白细胞在血管内皮细胞上产生滚动(即起始黏附)，进而使白细胞逐步活化并稳定黏附于血管内皮[7-8]。单核巨嗜细胞是EV71的靶细胞，且其可通过血脑屏障分化为小胶质细胞，EV71感染单核细胞后是否随血液中单核细胞一起流入CNS还有待进一步研究。另有报道称唾液酸化的葡聚糖和DC-SIGN（DendriticCell-SpecificIntercellularadhesionmolecule-3-GrabbingNon-integrin）受体也与EV71的感染有关。而唾液酸化葡聚糖在呼吸道和消化道上皮细胞中表达丰富，EV71可以借此进入肠上皮细胞。此外，39 DC-SIGN是树突细胞（dendriticcell,DC）和巨噬细胞大量表达的受体，研究表明EV71进入树突状细胞部分是通过与DC-SIGN的相互作用[9]。EV71通过与这些特异性受体结合而吸附于被感染的细胞表面，然后经细胞内吞作用进入细胞或将病毒核酸释放入细胞。Yu等发现EV71通过感染广泛的小胶质细胞、巨噬细胞和中性粒细胞浸润到中枢神经系统导致严重的神经损伤[10]。Fan等亦发现肠病毒71和人类中介复合体亚基25（humanmediatorcomplexsubunit25,MED25）蛋白之间拥有共同抗原表位[11]。这些发现表明EV71可促进炎症细胞的聚集，并可诱导抗体产生与神经组织表达的自身抗原相结合，引发自身免疫反应引起神经系统疾病，因而易致重症HFMD的发生。2.2宿主因素病毒感染可以激发多种宿主的免疫反应，以限制病毒传播。先天免疫反应是抵抗病原体入侵的第一道防线，随之获得性免疫应答出现，消除入侵病毒。婴幼儿易感染EV71，且病程进展快、病情重，这可能与婴幼儿免疫系统极不成熟有关[12】。多项血清学研究证实，EV71抗体滴度随着年龄的增长而增长，而这些中和抗体的产生可以防止EV71个体感染[13-14]。因此，这或许可以解释为什么婴幼儿容易发生EV71感染。此外EV71引起严重并发症，一是病毒对机体的直接损伤；二是通过白细胞、内皮细胞和树突细胞的大量复制产生全身炎症反应，同时释放多种细胞因子和趋化因子导致免疫损伤和并发症。研究发现重症手足口肺水肿患儿脑脊液中可检测到高水平的IL-6和IFN-γ，TNF-α、IL-β和IL-10表达也有明显升高[15-16]。这些过表达的炎症因子，在超表达趋化因子（chemokines）CCL2、CXCL10和IL8的作用下加重CNS损害和肺组织炎症，使HFMD病情迅速恶化。3、临床表现EV71是一种高度嗜神经病毒，对于中枢神经系统有极高的感染性，可沿周围神经的轴索浆向心性扩散到达脑干及延髓，临床上表现变化多样，主要包括脑炎（encephalitis）、无菌性脑膜炎（asepticmeningitis）、急性迟缓性麻痹（acuteflaccidparalysis,AFP）、急性出血性结膜炎、肌肉僵直、阵挛、呕吐、共济失调、意向性震颤及情感淡漠等。其中AFP是EV71引起的多种神经系统综合征的最主要表现，包括脊髓灰质炎样前角细胞破坏（前脊髓炎），格林-巴利综合征和横贯性脊髓炎[17-18]。此外EV71感染发生肺水肿一般均有神经系统损害在先，一旦出现肺水肿，常很快进展至心肺衰竭阶段，主要表现为面色苍白、极度呼吸困难、口吐白色、粉红色或40 血性泡沫液（痰）、四肢发凉、心率增快或缓慢，脉搏浅速、血压升高或降低等休克表现。并发肺水肿的患儿90%于发病后12小时内死亡[18-19]，死亡率极高。4、诊断对于学龄前儿童（婴幼儿多见），在流行季节发病，依据典型的临床表现及体征，可以达到HFMD临床病例诊断，若加上病原学和（或）血清学（急性期与恢复期血清EV71中和抗体滴度升高4倍以上）证据即可确诊HFMD[20-22]。4.1重症早期识别EV71感染重症病例诊疗的关键在于及时准确地识别确认第2、3期。出现以下表现时需考虑为病情向重型或危重型发展：（1）体温持续（≥3天）达38.5℃或以上[15,17]；（2）神经系统症状：呕吐、嗜睡、惊跳、抖动，意识障碍严重或进行性加剧等；（3）呼吸异常：呼吸急促或呼吸困难，节律不规整等；（4）循环功能障碍：心率明显增9快、高血压或低血压、末梢循环不良等；（5）血常规白细胞明显升高（WBC≥15*10/L），血糖升高≥11.1mmol/L[23]。4.2病原学检查EV71病原学确诊主要通过在恰当的临床标本中分离出病毒或病毒特异性核酸阳性，前者为肠病毒感染诊断的金标准，但由于病毒分离培养耗时费力，在病毒流行期间无法满足同时处理大量样本的需求，较适用于实验研究。临床上，目前多采用分子生物学技术检测病毒，如逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、生物芯片技术等。由于临床标本选取会直接影响到检测结果的灵敏性、特异性及有效性，因此标本的采集需依据患儿的临床表现不同而不同。5、治疗尽管从90年代开始中国反复出现EV71导致重症HFMD的暴发流行，但目前对EV71仍没有有效的抗病毒药物可用。重症HFMD治疗关键在于：及早干预、及时救治、规范用药，根据患者所处疾病不同分期而采取不同策略。5.1抗病毒、抗炎治疗利巴韦林是一种广谱的抗病毒药物，早前Li等为评估利巴韦林抗EV71的疗效，对其进行了小鼠体内和体外实验，结果表明，利巴韦林不仅能有效减少体内病毒载量和病毒所致的细胞病变，而且能有效降低死亡率、发病率和瘫痪等后遗症的发生[24]。对于普通型手足口病患儿，利巴韦林气雾剂联合口服抗病毒药物治疗，疗效确切，用41 药剂量小、不良反应轻[25]。此外临床上利巴韦林联合中药制剂治疗在也常有被使用，可缩短发热和皮疹持续时间。对于HFMD患儿炎症反应在疾病的发生发展过程中扮演者重要角色，其可导致血脑屏障通透性增加，促进EV71透过血脑屏障进入CNS引发CNS症状。糖皮质激素不仅能降低微血管通透性、减轻炎症反应，还可促进肺泡表面活性物质的合成和分泌，降低肺泡表面张力，促进肺水肿吸收，有效防治肺水肿，阻断肺水肿、脑水肿恶性循环过程[19]。因而我国手足口病救治专家共识中也建议在重症病例病程第3期开始使用激素治疗[16]。此外对EV71感染致神经系统和心肺功能受累的危重病例常常使用静脉注射人免疫球蛋白（IVIG），其具有抑制病毒复制和抑制非特异性炎症反应的作用，有研究表明免疫球蛋白治疗后细胞因子表达水平较治疗前显著下降，特别是在有严重CNS自主功能障碍的患儿中[26]，更有研究进一步证实IVIG可以降低死亡率、减轻组织器官损伤、改善预后[27]。在中国台湾IVIG应用于治疗重症手足口患者已经引入了治疗指南。然而，因缺乏大规模的随机、安慰剂对照试验，IVIG的临床疗效依然存在不确定性。5.2机械通气随着HFMD病情的发展，患儿脑干逐渐受到影响，自主神经系统的失调愈加明显。主要表现为出冷汗、呼吸异常、持续心动过速和高血压或低血压、休克、肺水肿、肺出血和心力衰竭等。此时患儿需进行急救护理管理、持续机械通气和重症监视血液动力学状态（心率、动脉压、血气、超声心动图等）。依据血流动力学变化指导补液，以避免过度液体复苏加剧肺水肿或出血。使用呼吸机辅助通气时，需根据血气、胸片结果随时调整呼吸机参数。如有肺水肿或出血表现，应增加呼气末正压（PEEP），控制肺泡渗出[28]。6、预防EV7l具有高度传染性，病毒在呼吸道和粪便中持续存在近4~5周，常常在幼儿园、学校及家庭内部传播。对父母、老师进行病毒感染和预防策略教育是预防的关键。勤洗澡、勤消毒，对已发病儿童严密隔离，可减少疾病的发生与传播。此外，EV71反复爆发流行使得疫苗的研发变得非常迫切并备受关注，目前国内外很多研究机构正在致力于EV7l疫苗的研发。中国大陆已有三家生物公司完成了灭活42 EV71全病毒疫苗的III期临床试验，而另外来自台湾和新加坡两家公司已也均已完成了I期临床试验。这些临床试验的结果均表明EV71疫苗具有较高的安全性和持久的免疫原性。EV71相关手足口病的有效保护率超过90％，而EV71其他相关疾病的保护率也超过了80％[29-30]。EV71疫苗作为我国具有独立知识产权的新疫苗，如能成功注册上市，可为疾病提供更好的预防。7、总结EV71感染手足口病近年来已成为全球关注的疾病，尽管EV71感染多数患儿预后较好，但其致神经系统损害后遗症乃至死亡的病例也仍然存在。由于EV71在环境中的高度稳定性、高度遗传性及高频率的基因重组，使得疫情在很长时间内难以得到缓解，至今疾病的预防与控制仍为一大难题。因此，提高防范意识，及早甄别危重征象，及早采取治疗措施，阻断中枢神经系统损害，阻止肺水肿和循环衰竭的发生，是降低发病率、减少病死率、改善疾病预后的关键。43 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硕士期间发表论文1.陈程,彭忠田.肠道病毒71型感染致重症手足口病研究进展[J].现代医药卫生,2016年32卷6期.2.陈程,刘映霞,杨桂林,等.基于转录组测序技术的重症手足口病相关基因研究[J].中华实验和临床感染病杂志(电子版),2016年2月第10卷第1期.3.邓永,赵方,陈程,等.HIV/TB合并感染者ART期间发生结核相关免疫重建炎性反应综合征的相关细胞因子研究[J].中华实验和临床病毒学杂志,2016,30(06)硕士期间参与的研究课题1.深圳市科创委基础项目研究课题：儿童重症手足口病患者全转录组相关易感因子研究（项目编号：JCYJ20150402111430623）48 49 致谢成长是无尽的阶梯。一步一步地攀登，回望来时路，会心一笑；转过头，面对前方，无言而努力地继续攀登。时光飞逝，三年已过。清晰记得三年前不情不愿的调剂到一个未曾留意过的科室——感染科，三年后的我常常大声骄傲地说出：“我是感染科的学生”。这要感谢我的导师——彭忠田主任，也要感谢南华附一感染科所有的医护人员，是他（她）们给了我一个温馨、和谐以及极为轻松愉悦的科室氛围，并不厌其烦的指导我、鼓励我，让我从三年前的一无所知到今天的初露头角，从此我热爱上了医学，热爱上了感染科。研二期间有幸去到深圳市第三人民医院实习，感谢刘映霞教授的细心、耐心教导，正是老师不断地鞭策与谆谆教导，使我顺利完成了试验课题和论文的书写。感谢肝四科戴炜主任临床带教，由衷感谢戴主任常常带着我到深圳市各大医院进行英语学习，使我的视野得以开阔、阅历得以丰富。衷心感谢麻锦敏、李利强博士、利建东实验员等在实验设计、技术操作、文章写作过程中的指导。您们一丝不苟的工作作风、诲人不倦的师者风范、敏锐的科研洞察力深深感染了我，这将是我未来学习、工作道路中最宝贵的财富！衷心感谢研究生期间所有的同学、朋友及师兄弟姐妹们的热情帮助，让我的硕士生活成为人生中一段美好的回忆!对以上提及和未提及的曾给予关心、支持和帮助的老师和同学一并表示最诚挚的感谢，感谢各位良师益友！成长亦是一次次的蜕皮。蜕皮是痛苦，是流血，有风险，有失败，但也是对未来的憧憬和期待，变得成熟与美丽。在不久的将来，无论我是挺拔的白杨，还是低矮的小草，都会以生命的翠绿向医学事业致敬！本论文研究由南华大学深圳市第三人民医院感染性疾病国家重点学科及深圳华大基因研究院共同协作完成。并得到了“深圳市科创委基础项目研究（项目编号：JCYJ20150402111430623）”的资助，特此致谢！50