急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析

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分类号R733.71密级公开UDC616编号10299Z1513013JIANGSUUNIVERSITY专业学位硕士学位论文ThesisforProfessionalMasterDegree硕士类别：全日制专业学位硕士论文题目：急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析学科专业：内科学作者姓名：汤茜指导教师：邓兆群教授答辩日期：2018年6月12日 分类号R733.71密级公开UDC616编号10299Z1513013硕士学位论文急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析EXPRESSIONSTUDYOFFUS1INACUTEANDCHRONICMYELOIDLEUKEMIAANDITSCORRELATIONWITHmiR-378作者姓名：汤茜指导教师：邓兆群教授小组成员：林江、钱军、马吉春等申请学位：硕士学科专业：内科学论文提交日期：2018年4月9日论文答辩日期：2018年6月12日学位授予单位：江苏大学学位授予日期：2018年6月20日答辩委员会主席：陈芬儿院士评阅人： 独创性声明，独立进行研宄学位论文，是本人在导师的指导下本人郑重声明：所呈交的何其他个人内容以外，本论文不包含任工作所取得的成果。除文中己注明引用的育机构或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教己的研宄做出重要贡献的个人和集体，均的学位或证书而使用过的材料？对本文识到本声明的法律结果由本人承担？在文中以明确方式标明？本人完全意Ｉ学位论文作者签名：＇＇？？？年月曰ｔｌｉ 学位论文版权使用授权书■叛）、闰笨图书馆■中国学■术明界江苏人少１中逬技术佶泡研究衔＇甩押志社有权保Ｓ本人所送交学位论文的神傅和电了文档「可以采賴印＿内容相致＞■吒印或Ｊｔ他复别予较保＂论ｔ本人屯子文档的内容和纸茨论文的论义编入｛中０允许论文被杏阅和侣阅，间时按权中？料学技末倌？研宄所将本－）ｆ杂竽位论文全文较Ｓ库｝并向柃会提供查询．授权巾国节术Ｗｆ！Ｈ光ａ．味电‘１」向社会提供査询忐社冉本论文编入ｆ丨国优秀两顼士竽位沦文全文拔描并刊登＞授权江苏大学研宄生院办理。论文的公布（包括＇本学位论文１子不保密□。Ｌ＾＾ａＩ＆年ｔ月ｕｆ＼＼Ｕ，ＬＩ 江苏大学硕士学位论文摘要目的：FUS1是一种肿瘤抑制基因，它在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，目前它已被发现在多种实体肿瘤中经常表达缺失，但是其在血液系统疾病中的表达情况以及临床意义却有待研究。本研究旨在探讨FUS1基因在急性髓系白血病（acutemyeloidleukemia，AML）以及慢性髓系白血病（chronicmyeloidleukemia，CML）中的表达状况及其临床意义。此外，有研究报道FUS1为miR-378的一个靶基因，而miR-378可以通过抑制FUS1的表达来增强神经胶质瘤细胞的存活。我们实验室曾有报道研究显示miR-378在AML中过表达且可能对AML的预后产生不利影响。因此，在此基础上我们此次又进一步探讨了AML中FUS1和miR-378表达之间的相关性。方法：我们通过实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）检测了23例正常对照、158例新诊断的AML患者、37例新诊断的CML患者的骨髓单核细胞中FUS1转录物的表达情况并分析其临床意义。然后进一步分析了FUS1和miR-378在AML中表达水平之间的相关性。结果：1.FUS1在AML中的研究结果：158例AML病例中有139例（87.97％）被发现FUS1表达下调，表达水平显著低于对照组，差异有统计学意义（P=0.012）。受试者工作特征曲线（ROC）分析显示FUS1表达水平可以有效区分AML患病组和健康对照组（ROC曲线下面积=0.663，95％的可信区间为0.528–0.797；P=0.012）。但FUS1高表达组和低表达组相比，在性别、年龄、血液学参数、FAB分型、核型危险度以及基因突变中均无显著统计学差异（P>0.05）。此外，Kaplan-Meier生存分析显示，在非M3型病例中，与FUS1高表达组相比，低表达组有着较低的总体生存时间（OS，P=0.049）和无病生存时间（LFS，P=0.051）。2.FUS1在CML中的研究结果：37例CML病例中有34例（91.89％）被发现FUS1表达下调，表达水平显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.0001）。I 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析受试者工作特征曲线（ROC）分析显示FUS1表达水平可以有效区分CML患病组和健康对照组（ROC曲线下面积=0.837，95％的可信区间为0.730–0.943；P<0.0001）。但FUS1高表达组和低表达组相比，在性别、年龄、血液学参数、核型以及临床分期中均无显著统计学差异（P>0.05）。3.FUS1和miR-378在AML中表达的相关性研究：通过研究53例新诊断的AML患者中FUS1和miR-378的表达之间的相关性，我们发现两者相关系数为-0.346，表明FUS1和miR-378在AML中的表达呈负相关（P=0.011）。结论：1.FUS1低表达在AML患者中是一种常见的分子事件，同时FUS1低表达可能预示患者预后不良。2.FUS1低表达在CML患者中也是一种常见的分子事件，它与CML的疾病进展无关。3.FUS1与miR-378的表达在AML患者中呈负相关。关键词：FUS1，miR-378，基因表达，预后，急性髓系白血病，慢性髓系白血病。II 江苏大学硕士学位论文ABSTRACTObjective:FUS1isatumorsuppressorgene,whichplaysanimportantroleinthedevelopmentoftumors.Ithasbeenfoundtobefrequentlylostinavarietyofsolidtumors.However,itsexpressionandclinicalsignificanceinhematologicaldiseasesremaintobeelucidated.Inthisstudy,weaimedtoinvestigatetheexpressionstatusandclinicalsignificanceoftheFUS1geneinacutemyeloidleukemia(AML)andchronicmyeloidleukemia(CML).Inaddition,studieshavereportedthatFUS1isatargetgeneofmiR-378,andmiR-378canenhancethesurvivalofgliomacellsbyinhibitingtheexpressionofFUS1.OurlaboratoryhadreportedthatmiR-378isover-expressedfrequentlyinAMLandmayhaveanadverseeffectontheprognosisofAML.Therefore,wefurtherexploredthecorrelationbetweentheexpressionofFUS1andmiR-378inAML.Methods:WedetectedexpressionoftheFUS1transcriptinbonemarrowmononuclearcellsfrom23controls,158newlydiagnosedAMLpatientsand37newlydiagnosedCMLpatientsbyreal-timequantitativepolymerasechainreactionandthenanalyzedtheirclinicalsignificance.WealsoanalyzedthecorrelationbetweentheexpressionofFUS1andmiR-378inAML.Results:1.ResultsofFUS1inAML:DownregulatedFUS1expressionwasfoundin139outof158(87.97%)AMLcases.Thisratewassignificantlylowerthanthatinall23controls.Thedifferencewasstatisticallysignificant(P=0.012).Receiveroperatingcharacteristiccurve(ROC)analysisrevealedthattheexpressionlevelofFUS1candistinguishAMLpatientsfromcontrolseffectively(areaundertheROCcurve=0.663,95%confidenceintervalis0.528–0.797;P=0.012).However,therewasnosignificantdifferencebetweenlowFUS1andhighFUS1expressioninregardtotheirsex,age,bloodcellparameters,FABclassification,karyotyperisks,chromosomeIII 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析groupingandgenemutations(P>0.05).Inaddition,Kaplan-Meieranalysisdemonstratedthatnon-M3-AMLpatientswithalowFUS1expressionhadashorteroverallsurvival(OS,P=0.049)andleukemia-freesurvival(LFS,P=0.051)thanthosewithahighFUS1expression.2.ResultsofFUS1inCML:DownregulatedFUS1expressionwasfoundin34outof37(91.89%)CMLcases.Thisratewassignificantlylowerthanthatinall23controls.Thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.0001).Receiveroperatingcharacteristiccurve(ROC)analysisrevealedthattheexpressionlevelofFUS1candistinguishCMLpatientsfromcontrolseffectively(areaundertheROCcurve=0.837,95%confidenceintervalis0.730–0.943;P<0.0001).However,therewasnosignificantdifferencebetweenlowFUS1andhighFUS1expressioninregardtotheirsex,age,bloodcellparameters,karyotyperisks,clinicalstage(P>0.05).3.CorrelationanalysisbetweentheexpressionofFUS1andmiR-378inAML:WestudiedthecorrelationbetweentheexpressionofFUS1andmiR-378in53newlydiagnosedAMLpatients.Wefoundthatthecorrelationcoefficientwas-0.346,whichshowedthatFUS1andmiR-378werenegativelycorrelatedinAMLpatients(P=0.011).Conclusions:1.FUS1down-regulationisacommoneventinAMLandmaypredictadverseprognosesinpatients.2.FUS1down-regulationisacommoneventinCMLandithasnothingtodowiththediseaseprogressionofCML.3.FUS1andmiR-378werenegativelycorrelatedinAMLpatients.Keywords：FUS1,miR-378,geneexpression,prognosis,acutemyeloidleukemia,chronicmyeloidleukemia.IV 江苏大学硕士学位论文目录第一章引言................................................................................................................11.1急性髓系白血病（Acutemyeloidleukaemia，AML）.......................................11.2慢性髓系白血病（Chronicmyeloidleukemia，CML）..............................21.3FUS1基因..........................................................................................................41.4miR-378基因....................................................................................................5第二章本研究的目的、方法及实验方案的设计、意义..........................................72.1研究背景及目的...............................................................................................72.2研究方法及技术...............................................................................................82.2.1实时定量PCR（RQ-PCR）...................................................................82.3实验方案...........................................................................................................82.4研究的意义.......................................................................................................9第三章AML患者中FUS1表达的临床研究.........................................................103.1实验材料.........................................................................................................103.1.1研究对象................................................................................................103.1.2主要试剂................................................................................................103.1.3主要仪器................................................................................................113.1.4引物........................................................................................................113.2实验方法.........................................................................................................113.2.1骨髓单个核细胞（BMMNCs）分离及总RNA的提取....................113.2.2逆转录合成cDNA................................................................................123.2.3RQ-PCR检测FUS1表达的水平..........................................................133.2.4PCR产物的纯化与回收........................................................................143.2.5重组载体构建........................................................................................143.2.6重组质粒转化........................................................................................153.2.7重组质粒提取及鉴定、测序................................................................153.2.8阳性模板建立........................................................................................163.2.9细胞遗传学检查....................................................................................163.2.10基因突变检测......................................................................................163.2.11统计学处理..........................................................................................173.3实验结果.........................................................................................................173.3.1对照组中FUS1转录本水平................................................................173.3.2AML患者中FUS1基因转录本水平....................................................173.3.3FUS1表达具有辅助诊断标记意义......................................................18V 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析3.3.4FUS1表达与AML患者的临床及实验室参数相关性.......................213.3.5FUS1表达与AML预后的关系...........................................................213.4讨论.................................................................................................................22第四章CML患者中FUS1表达的临床研究.........................................................254.1实验材料.........................................................................................................254.1.1研究对象................................................................................................254.1.2主要试剂................................................................................................254.1.3主要仪器................................................................................................254.1.4引物........................................................................................................254.2实验方法.........................................................................................................254.2.1单个核细胞提取和总RNA制备.........................................................254.2.2逆转录....................................................................................................254.2.3FUS1表达的RQ-PCR检测..................................................................254.2.4PCR产物纯化与回收............................................................................254.2.5重组载体构建........................................................................................254.2.6重组质粒转化........................................................................................254.2.7重组质粒提取及鉴定、测序................................................................254.2.8阳性模板建立........................................................................................264.2.9细胞遗传学检查....................................................................................264.2.10统计学处理..........................................................................................264.3实验结果.........................................................................................................264.3.1对照组中FUS1基因转录本水平........................................................264.3.2CML患者中FUS1基因转录本水平....................................................264.3.3FUS1表达具有辅助诊断标记意义......................................................274.3.4FUS1表达与CML患者的临床及实验室参数相关性........................284.4讨论.................................................................................................................29第五章AML患者中FUS1表达与miR-378表达的相关性...................................315.1研究对象.........................................................................................................315.2研究方法.........................................................................................................315.3研究结果.........................................................................................................315.4讨论.................................................................................................................32第六章结论和展望....................................................................................................346.1主要结论..........................................................................................................346.2展望.................................................................................................................34VI 江苏大学硕士学位论文参考文献......................................................................................................................36致谢............................................................................................................................51攻读硕士学位期间发表的学术论文及其他科研成果..............................................52VII 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析英文缩略词英文缩写英文全称中文全称TUSC2tumorsuppressorcandidate2肿瘤抑制因子候选基因2miRNAmicroRNA微小RNAAMLacutemyeloidleukemia急性粒系白血病CMLchronicmyeloidleukemia慢性粒系白血病APacceleratephase加速期CPchronicphase慢性期BCblastcrisis急变期PhPhiladelphia费城染色体BMbonemarrow骨髓TKIstyrosinekinaseinhibitors酪氨酸激酶抑制剂全色组蛋白-赖氨酸N-甲基EHMT1euchromatichistone-lysineN-methyltransferase1转移酶1全色组蛋白-赖氨酸N-甲基EHMT2euchromatichistone-lysineN-methyltransferase2转移酶2retinoblastomaprotein-interactingzincfingerRIZ1Rb结合锌指蛋白protein1PRDM2PRdomainzincfingerprotein2PR域锌指蛋白2NSCLCsnon-small-celllungcancer非小细胞肺癌SCLCssmall-celllungcancer小细胞肺癌IL-15interleukin-15白细胞介素-15NKnaturalkillercell自然杀伤细胞TSGtumorsuppressorgene肿瘤抑制基因PD1programmedcelldeathprotein1程序性死亡受体1VIII 江苏大学硕士学位论文Nuclearfactorkappa-light-chain-enhancerof核因子活化B细胞κ轻链增NF-κBactivatedBcells强子NFATnuclearfactorofactivatedTcells活化T细胞核因子FUS1-KOFUS1-Knockout基因敲除NPM1nucleophosmin核仁磷酸化蛋白CEBPACCAAT/enhancer-bindingproteinalphaCCAAT/增强子结合蛋白-αFLT3-ITDFms-liketyrosinekinase3FMS样的酪氨酸激酶3PMLpromyelocyticleukemia早幼粒细胞性白血病RARAretinoicacidreceptorα维A酸受体基因WHOWorldHealthOrganization世界卫生组织FABFranch-American-Britain法国-美国-英国PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应RQ-PCRreal-timequantitativePCR实时定量PCRCTcyclethreshold循环阈值BMMNCsbonemarrowmononuclearcell骨髓单个核细胞HRMAHighResolutionMeltinganalysis高分辨率熔解曲线分析ROCreceiveroperatingcharacteristic受试者工作特征曲线AUCareaunderthecurve曲线下面积CRcompleteremission完全缓解OSoverallsurvival整体生存时间LFSleukemia-freesurvival无白血病生存时间allo-HSCTallogeneichematopoieticstemcelltransplantation异基因造血干细胞移植GVLgraftversusleukemia移植物抗白血病IX 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析RRrecurrentrisk复发的风险DLIdonorlymphocyteinfusion供体淋巴细胞输注X 江苏大学硕士学位论文第一章引言1.1急性髓系白血病（Acutemyeloidleukaemia，AML）急性髓系白血病（AML）是一组由于造血干细胞异常分化和增殖引起的造血系统的恶性克隆性疾病[1]。它是一种罕见的侵袭性血液疾病，每100,000人中约有3-4人受到影响[2,3]。2017年在美国的21,830例AML新发病例中估计约有10,590例与死亡相关[4]。研究表明，随着年龄的增加，AML的患病风险也随之增加，最近的监测流行病学和最终结果数据（SEER）表明，超过70％的新发AML病例都是在大于55岁的成年人中诊断的，诊断的中位年龄为67岁[2,5]。而与年轻患者相比，60岁以上的患者其预后更差，这两者都是由于不耐受化疗和对化疗的耐药性所致[6-10]。多项研究表明白血病细胞的增殖和存活与染色体异常和基因突变有关[11]。同时细胞遗传学和分子生物学的变化在AML的发病和发展中也起着重要作用[12,13]。例如，急性早幼粒细胞白血病（APL）中常见的细胞遗传学异常通常涉及11号染色体长臂（11q）以及15号染色体和17号染色体之间的平衡易位（t15;17），除此之外还有8号染色体和21号染色体之间的平衡易位t（8；21）。近年来，基因异常表达以及获得性的基因突变也被证明与白血病的发生发展有关[14]。现阶段，AML最常用的分类方法包括旧的FAB分型和新的世界卫生组织（WHO）分型。WHO分型标准规定骨髓有核细胞中白血病原始细胞超过20％则可诊断为AML，除外具有复发性遗传异常的三种最佳预后形式的急性髓性白血病[t（8;21），inv（16）和t（15;17）]，其中遗传异常的存在与原始细胞的百分比无关[15]。FAB分型则要求骨髓有核细胞中白血病原始细胞超过30％[16]。除此之外，AML的诊断必须严格区分于“白血病前”状况，例如骨髓增生综合征或骨髓发育不良等，因为它们的治疗方案不同。例如，急性早幼粒细胞白血病（APL）具有最高的可固化性并且有其独特的治疗形式，所以快速建立或排除这种亚型的白血病的诊断很重要。通常在血液或骨髓上进行的荧光原位杂交能鉴定表征为APL的染色体易位[t（15;17）（q22;q12）]。同时还需要通过分子检测PML/RARA融合蛋白的存在，其是该易位的致癌产物[17]。1 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析根据白血病的亚型和潜在的遗传缺陷，对于初治AML，目前的标准治疗方案仍然是以化疗为主，且在过去的几十年中一直使用[18-20]。但AML的治疗效果并不理想，完全缓解（CR）率在年轻患者中很少达到70％，在老年患者中达到50％[21]，整体5年生存率仅为27％[4]。从1977年到2006年的三十年中，64岁至75岁的患者的总体生存率略有改善，但75岁及以上患者的总生存率并未有所改善[22]。原发复发或难治性（R/R）AML的预后特别差[23,24]。首次复发后，1年和5年生存率分别为29％和11％[24]。这些不良结果需要新的治疗方案来应对，同时包括那些可以克服耐药性的方法。目前对于AML的治疗，无论是使用细胞毒性药物还是骨髓移植，主要针对的是大量白血病细胞，这些又因AML的类型，细胞遗传学分析和患者的个人状况而有所不同。标准化治疗虽然改善了某些特殊类型AML的反应，但并未显著改变大多数患者的预后。包括靶向免疫治疗在内的多种新试验已经在临床实践中开发和测试，但这些观念中的每一个都有其独特的优点和固有的问题，而且它们都没有显著改变AML的预后结果[25]。因此，探索新的AML诊断、预后和治疗工具是必要的。1.2慢性髓系白血病（Chronicmyeloidleukaemia，CML）慢性髓系白血病（CML）是一种通常在成人群体中诊断出的骨髓增殖性肿瘤，儿童发病率相对较少，每年大概0.6-1.2百万左右人发病[26]。CML是由于在分子水平上的费城染色体（Ph）t（9;22）平衡易位而形成BCR-ABL融合基因的一种造血祖细胞克隆性疾病。由融合基因编码的BCR-ABL蛋白显示酪氨酸激酶活性并可促进骨髓（BM）中多能干细胞的不受控的增殖。CML有三阶段进程：慢性期（CML-CP）、加速期（CML-AP）和急变期（CML-BC）。慢性粒细胞性白血病最常见于CML-CP，仅在约10％的晚期病例中被诊断出CML-AP或CML-BC[27]。研究数据显示CML中的表观遗传调控正在逐渐增加。有报告显示，在CML细胞系中，赖氨酸甲基转移酶EHMT1和EHMT2的表达水平与I型干扰素应答性之间呈负相关。该观察结果导致EHMT1和EHMT2特异性抑制剂的使用使得几种CML细胞系对干扰素和伊马替尼的处理变得敏感[28]。另一份报告显示甲2 江苏大学硕士学位论文基转移酶RIZ1（PRDM2）在CML进展为急变期间表达减少。RIZ1表达的丧失阻断了细胞凋亡和分化途径，导致造成CML进展的骨髓母细胞群增加[29]。此外，另一个甲基转移酶PRDM12被定位于一组CML预后不良患者的基因ABL和BCR的最小缺失区域，被认为是一种强有力的候选肿瘤抑制基因[30]。由此可见表观遗传调节因子的调控可以影响白血病细胞存活和增殖的途径。尽管蛋白质甲基转移酶参与某些血液恶性肿瘤的情况逐渐清晰，如弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、急性骨髓性白血病和多发性骨髓瘤等，但关于CML的信息却很少[31,32]。近年来研究表明，CML细胞诱导造血微环境的显著改变，这可能有利于CML起始细胞相对于正常造血细胞的存活、增殖和分化[33-35]。BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）可以控制慢性期CML细胞的大量增加，但CML起始细胞本身对TKIs存在抗性[36,37]，并且可能持续存在最小残留病灶[38,39]。2001年5月，美国食品和药物管理局批准甲磺酸伊马替尼（STI-571，Gleevec，Glivec）作为BCR-ABLTK的选择性抑制剂，用于CML患者的一线治疗[40]。伊马替尼是一种2-苯基氨基嘧啶，是一种具有抗BCR-ABL活性的TK抑制剂（TKI）。TK的所有活性位点均有ATP结合位点。甲磺酸伊马替尼通过与ATP位点紧密结合起作用，将其锁定在封闭或自我抑制构象中，从而抑制蛋白质的酶活性[41]。伊马替尼通过抑制BCR-ABL激酶活性来参与控制细胞周期、细胞粘附和细胞骨架组织的基因的转录调节[42]。伊马替尼通过抑制BCR-ABL自磷酸化和底物磷酸化从而阻断BCR-ABL癌蛋白的作用，从而阻断增殖并诱导凋亡[43]。尽管如此，在某些患者中，可能会发生对伊马替尼的耐药性。除甲磺酸伊马替尼外，市场上还出现了各种TKI，包括波舒替尼、达沙替尼、尼罗替尼和普那替尼[44]。当伊马替尼治疗因耐药、疾病进展或不耐受、治疗失败后再使用上述这些药物[44]。BCR-ABL的激酶结构域（KD）内的点突变、克隆染色体进化、BCR-ABL扩增、药物基因组变异或信号捷径的激活都与甲磺酸伊马替尼耐药有关[45]。以前的研究报道约20％的患者由于BCR/ABLKD内的点突变导致甲磺酸伊马替尼治疗失败[46]。BCR-ABLKD点突变的出现是CML患者对伊马替尼耐药的主要原因，报道已有>90种类型的KD突变，特别是在加速期和急变期[47,43,48]。这些突变可能会改变BCR-ABLKD结构并损害伊马替尼结合亲和力[47,48]。3 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析现如今，尽管我们对CML的了解有一定进展，并且鉴定出一些与疾病进展相关的突变[49]，也研发出不同的可用于治疗的TKIs，但仍缺乏可以预测遗传进展和治疗耐药性发展的早期和强大的标志物。1.3FUS1基因肿瘤抑制基因（TSGs）在人类肺癌和其他癌症的发病机制中起主要作用。肺癌细胞在多种已知的致癌基因和TSGs中具有突变和缺失，然而，3号染色体短臂上的遗传改变和等位基因缺失是肺癌发病机制中检测到的最常见和最早的癌症异常之一，并且已经显示出现在96％的非小细胞肺癌（NSCLCs）和78％的肺癌前病变中[50]。在肺癌和乳腺癌的3p21.3区域观察到的频繁且早期的杂合性丢失和重叠的纯合缺失，表明一个或多个的3p21.3基因在这些癌症的分子发病机制中起着“看门人”的重要作用[51,52]。FUS1，又被称为TUSC2(tumorsuppressorcandidate2)是位于染色体3p21.3区域的一种新的肿瘤抑制基因[53]。FUS1基因产物是一种多功能蛋白，在各种细胞发展过程中起着重要作用，包括转录、信号转导、细胞周期进程和细胞凋亡[54]。通过使用多组织Northern印迹在各种健康人体组织（如心脏、脑、胎盘和肺）中检测到高水平FUS1mRNA的表达[51]。与其他肿瘤抑制基因不同，FUS1基因的突变在大多数肺癌中罕见[51]。但相反，FUS1蛋白的表达在原发性肺癌中却经常丢失或减少，并且与肺癌的发展和更差的生存率有关[55]。有报道称FUS1蛋白在82％的非小细胞肺癌（NSCLCs）和100％的小细胞肺癌（SCLCs）中表达频繁丢失或蛋白翻译后修饰缺失[55]。多项研究已经证明FUS1通过阻止细胞生长和诱导细胞凋亡来抑制人体外和体内的肺癌细胞[56,57]。FUS1基因中的功能突变缺失、启动子和编码区中的高甲基化的表观遗传性失活在人类肺癌和其他癌症中都是罕见事件[51,52,58]。因此，遗传突变和表观遗传沉默以外的机制可能对调控正常和肿瘤细胞中FUS1基因和蛋白表达的转录，转录后，翻译和翻译后水平分别或集体起作用。特别是，通过FUS1mRNA的异常翻译可能导致FUS1的失活发生。也有报道表明，FUS1是一种豆蔻酰化蛋白，其氨基端的豆蔻酰化是FUS14 江苏大学硕士学位论文介导的肿瘤抑制活性所必需的[59]。FUS1基因产物是一种小的、碱性的、可溶的、球状、高度保守的蛋白质，并在多种细胞类型中表达。研究已经证明FUS1蛋白主要存在于线粒体中[60]。FUS1可以参与线粒体中的钙调节[61]。由于FUS1具有假定的钙结合域和肉豆蔻酰结合域，因此有人发现FUS1可以调节线粒体钙处理和钙耦合过程。FUS1损失导致钙负载上皮细胞、脾细胞和活化的CD4（+）T细胞中线粒体钙摄取减少。活化的CD4（+）T细胞的体外分析显示钙调节过程中的FUS1存在依赖性变化，例如CD4和PD1/PD-L1的表面表达、增殖和Th极化。FUS1敲除T细胞后显示钙依赖性NF-κB和NFAT靶标增加，但在刺激后无法完全激活这些途径[61]。由于线粒体钙稳态是过早老化和老化相关病状的一个重要的促成因素，研究观察到，FUS1-KO小鼠表现出多种早期老化症状，如驼背、缺乏活力、不能积累脂肪、耐受压力的能力降低、过早死亡以及精子数量减低、成体干细胞重新组织的能力受损以及慢性炎症[62]。除了改变线粒体钙稳态外，FUS1-KO细胞的储备呼吸能力低，表明能量稳态也受FUS1控制[62]。也有研究表明，FUS1在通过影响IL-15产生来调节NK细胞的成熟上也发挥着重要作用[60]。进一步的研究表明，FUS1调节了与抗原加工、免疫反应和补体激活有关的许多免疫基因[63]，并支持FUS1通过调节线粒体内稳态来建立其免疫和肿瘤抑制活性[64]。鉴于其肿瘤抑制作用，FUS1的恢复对于抑制肿瘤生长和发展来说是一种有吸引力的策略。研究显示FUS1的过表达在肺癌、成胶质细胞瘤、食管癌和甲状腺癌中都存在着抗肿瘤的作用[65-69]。然而，FUS1在AML中的表达研究却几乎没有。1.4miR-378基因微小RNA(miRNAs)是一类序列长度大约为22—24个核苷酸，属于内源性单链非编码蛋白的小RNA，研究表明miRNAs在调控转录后靶基因的表达水平方面发挥重要作用[70,71]。直至目前为止，研究人员已经发现了1000多种不同的miRNAs，其中大约有2/3人类基因的表达受其调控。重要的是，miRNAs在细胞的生理功能和病理过程中也发挥着不可忽视的作用[72-77]。microRNA基因通常由聚合酶II或III[78]转录以产生初级miRNAs（pri-miRNAs）。这些大的RNA转录本通常含有数百个碱基对，并编码多个5 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析miRNA基因的序列。在由expertin-5输出细胞核之前，需要通过Drosha核酸酶切割pri-miRNAs以形成约60-70个核苷酸（nt）的发夹形状的茎环结构，即前体-miRNA（pre-miRNAs）。在细胞质中，pre-miRNAs被另一个名为Dicer的RNaseIII核酸内切酶进一步加工成miRNA-miRNA⁎双链体。作为“引导”链的双链中的一条链被载入miRNP，一种大型多蛋白miRNA核糖核蛋白复合物，并用于调节靶基因表达。双链体的另一条链，即miRNA⁎，被排除并降解[79]。当pre-miRNA的两条链在分布上更加平等时，相反的链则被命名为miRNA-3p而不是miRNA⁎。反过来，该指导链则被称为miRNA-5p，这取决于目标miRNA分子的5'或3'的位置。两条链都可能有潜在的生物效应[80]。microRNA基因中的miR-378也被认为是可以用来诊断癌症的生物标志物，包括肾细胞癌[81]和结直肠癌[82]。miR-378可能是表征非小细胞肺癌脑转移的潜在生物标志物[83]。miR-378过表达通过靶向半胱天冬酶3以及激活磷酸肌醇3-激酶/Akt信号通路来减弱高葡萄糖抑制的成骨细胞分化[84]。miR-378在循环系统方面可以预测主动脉瓣狭窄患者的左室肥厚[85]。miR-378控制经典的棕色脂肪扩张来减轻肥胖[86]。有研究报道，构建FUS1基因在miR-378转染的神经胶质瘤细胞，结果显示携带FUS1中靶位点的荧光素酶构建体被miR-378抑制。细胞存活实验显示FUS1构建体的转染逆转了miR-378的功能并降低了miR-378介导的细胞存活增强作用。一系列的实验结果表明，miR-378可以通过抑制FUS1的表达来增强细胞存活[87]。一系列的研究表明，癌基因或者抑癌基因的表达也受到微小RNA的调控，而这一点在白血病的发病机制中也很重要，并且会影响到白血病的预后。除此之外，一些肿瘤特异性的miRNA也可以作为新型的分子标志物来辅助诊断一些白血病[88-91]。而我们实验组曾首次报道过miR-378在急性髓系白血病中表达上调，并且表达高的患者预后通常较差，表明miR-378对AML的诊断及预后判断具有重要意义[92]。鉴于之前在神经胶质瘤细胞中miR-378与FUS1研究结果的关系[87]，此次我们又进一步研究了miR-378及FUS1在AML中表达的相关性。6 江苏大学硕士学位论文第二章本研究的目的、方法及实验方案的设计、意义2.1研究背景及目的AML及CML是一类髓系祖细胞起源的恶性疾病，主要表现为造血干细胞的异常分化和增殖，同时白血病细胞具有分化障碍、增殖失控、自我更新增强、凋亡受阻的特点，这些都会导致不同阶段的细胞发育的停滞。大量增生并累积的白血病细胞干扰并抑制正常骨髓和其他造血组织中的正常造血，同时浸润其他的器官和组织。目前，关于人类白血病的病因尚没有完全清楚的报道，病毒感染、免疫功能异常、电离辐射、化学物质接触、遗传因素等都可能导致疾病的发生。而目前认为至少有两类分子事件共同参与了白血病的发病。其一，造血细胞内的一些基因受到各种不同原因的影响发生决定性突变，导致某种信号通路的激活，造成克隆性异常造血细胞的生成；其二，与某些转录因子有关的一些遗传学改变可能会造成造血细胞的分化阻滞或分化紊乱。所以，目前除了细胞免疫表型检测、细胞形态、染色体检查外，分子生物学在临床诊断和治疗监测方面也发挥着越来越重要的作用。FLT3-ITD、NPM1、CEBPA等多种基因突变在白血病的预后分层中起到重要作用，而我们所熟知的BCR-ABL1融合基因的检测现如今也已广泛运用到了CML的诊断和治疗中。目前白血病的治疗方法主要包括放化疗﹑免疫治疗、靶向治疗以及骨髓移植等。抗白血病治疗主要包括诱导缓解治疗及缓解后治疗。但目前看来，患者的生存率都暂未得到较好的提高，不管是通过改变化疗方案抑或是各种治疗方法的进展。特别是化疗耐药、缓解后复发已经成为现治疗阶段的主要障碍。长期研究表明白血病通常都伴有特异的基因和染色体的改变。通常95%以上的M3中出现t（15;17）（q22;q12），15号染色体上的PML基因（早幼粒白血病基因）易位至17号染色体上的RARA区（维A酸受体基因），从而形成PML-RARA融合基因。这是M3发病的分子基础，同时也为我们运用砷剂及全反式维A酸来治疗M3提供了有效的基础。由此可见染色体及一些分子标志能提供独立预后信息。因此，能够寻找到并且通过研究与髓系肿瘤致病相关、预后相关的染色体或其他分子标志的作用机理及调控方式，这对于更好地研究血液系统肿瘤的发病机制来说无疑是非常有利的，并为血液肿瘤患者的治疗方案提供新的7 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析思路。研究表明白血病的发生是多种不同的因素共同作用的结果。已知的多种致癌基因及肿瘤抑制基因也分别或共同参与到该病的发生发展之中。此次我们所研究的FUS1基因也是人体中一种重要的肿瘤抑制基因。研究显示FUS1的过表达在肺癌、成胶质细胞瘤、食管癌和甲状腺癌中都存在着抗肿瘤的作用[65-69]。然而，到目前为止，还没有研究报道FUS1在AML或CML中的表达情况及预后意义。鉴于FUS1异常表达可能对AML或CML的早期筛查、诊断、预后评估、疗效评价以及复发监测等方面存在临床价值，本次研究拟分析AML及CML患者中FUS1的表达情况及临床意义。2.2研究方法及技术2.2.1实时定量PCR（RQ-PCR）聚合酶链式反应简称PCR(PolymeraseChainReaction)(又称:多聚酶链式反应)，它是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。体外95℃的高温会使得DNA变性为单链，而通常在60°C左右时，引物与单链又会按照碱基互补配对的原则进行结合，当把温度调整至72°C左右时，DNA聚合酶又会沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链，按这种半保留复制的机制沿模板链延伸直至完成新的DNA合成。PCR主要按照高温变性、低温退火(复性)、适温延伸三个基本反应步骤进行循环，最终使得目的DNA迅速扩增。该技术对标本的纯度要求较低。它除了可以运用于一些基础研究如基因分离、克隆和核酸序列分析等,而且还可帮助疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方。此次研究中所用的RQ-PCR技术，即实时荧光定量PCR，通常将荧光基团加入PCR反应体系中，然后通过荧光信号的不断累积来监测整个PCR的进程，当PCR结束后就可以得到所需的CT值以及标准曲线，然后通过计算被扩增的起始模板DNA或cDNA来进行定量分析。扩增产物所经历的循环数被称为CT值（cyclethreshold）。2.3实验方案2.3.1临床标本收集：收集确诊为初始AML、CML患者及正常对照组的骨髓标8 江苏大学硕士学位论文本，包括158例AML患者、37例CML患者及23例正常对照，及其相关的临床资料，如年龄、性别、血液学参数、FAB分型、核型危险度以及各种基因突变等；2.3.2样本制备：提取全部患者及正常对照组中的骨髓单个核细胞（bonemarrowmononuclearcells，BMMNCs)，制备基因组总RNA；2.3.3将RNA逆转率为cDNA，保存备用；2.3.4设计FUS1基因进行RQ-PCR的引物，并摸索出最佳的PCR反应条件；2.3.5运用RQ-PCR法检测FUS1基因在AML、CML患者及正常对照组中的表达情况；2.3.6整理数据并统计分析结果，判断FUS1的表达状况是否与AML及CML患者各临床参数之间存在关联性，同时进一步分析AML患者中FUS1与miR-378表达的相关性。2.4研究的意义研究表明，白血病的形成是一个多因素共同参与的过程，而基因突变、染色体异常及其他的分子改变（尤其是基因表达异常）等可用于恶性血液系统疾病的预后分层、疗效观察及病情监控。而FUS1作为一种新的肿瘤抑制基因，已被研究发现在多种实体肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。然而，尚未有研究报道FUS1表达异常在髓系血液肿瘤患者中的致病机制及其对患者预后的影响。本研究中，通过运用RQ-PCR方法检测AML及CML患者中FUS1的表达状况并分析其表达水平与临床资料的相关性。同时进一步分析AML患者中FUS1与miR-378表达的相关性。通过该项实验研究，我们可以了解FUS1在这两种髓系肿瘤的发生、发展中的作用，并且该基因也可能作为一种潜在的分子标志物，为血液系统肿瘤的诊断、治疗、及预后评估等方面提供重要的临床参考价值。9 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析第三章AML患者中FUS1表达的临床研究3.1实验材料3.1.1研究对象此次用于研究的对照组标本主要来自于健康的骨髓捐赠者，而AML标本主要来自于门诊及住院部患者，这一部分主要由江苏大学附属人民医院提供。其中包括23例正常对照，158例AML患者。以上患者对本次研究具有知情权，所有书面知情同意书都已签署并提交。对于患者的诊断和分型标准均按照法-美-英（FAB）分型标准和2008年修订版世界卫生组织（WHO）分型标准[93,94]。其中，我们根据FAB分型将158例初诊AML患者分为如下：M0型2例、M1型7例、M2型65例、M3型31例、M4型31例、M5型17例及M6型5例。3.1.2主要试剂(1)TRIZOL试剂（供应商：LifeTechnologiesCorporation公司，美国）；(2)淋巴细胞分离液（供应商：TBDSciences，中国）；(3)逆转录酶（供应商：Thermo公司，美国）；(4)定量PCR试剂（供应商：Vazyme公司，中国；TaKaRa公司，日本）；(5)RegularAgaroseG-10琼脂糖（供应商：Biowest公司，西班牙）；(6)100bpDNAladder、Loadingbuffuer（供应商：Vazyme公司，中国；TaKaRa公司，日本）；(7)GeneRuler100bp（Marker）（供应商：Thermo公司，美国）；(8)Epitect®BisulfiteKit（供应商：Qiagen公司，德国）；(9)质粒DNA提取试剂盒、DNA凝胶纯化回收（供应商：Axygen公司，美国）；(10)pMD®19-T克隆载体、DNA连接酶（供应商：TaKaRa公司，日本）；(11)DH5α感受态细胞（供应商：Vazyme公司，中国）；(12)氨苄青霉素（供应商：哈药集团，中国）；(13)IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）、X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）（供应商：TaKaRa公司，日本）；(14)EP管、枪头、PCR八连管（供应商：Axygen公司，美国）；(15)FUS1引物（供应商：华大基因上海股份有限公司）。10 江苏大学硕士学位论文3.1.3主要仪器（1）梯度PCR仪（供应商：Eppendorf公司，德国）；（2）荧光定量PCR仪7500（供应商：ABI公司，美国）；（3）-80℃、-20℃、4℃低温冰箱（供应商：SANYO公司，日本）；（4）台式高速冷冻离心机（供应商：Eppendorf公司，德国）；（5）低温离心机（供应商：Thermo公司，美国）；（6）移液器（供应商：Eppendorf公司，德国）；（7）凝胶电泳槽（供应商：Syngene公司，英国）；（8）紫外分光光度仪（供应商：Eppendorf公司，德国）；（9）全自动图像分析系统/凝胶成像仪（供应商：Proteinsimple公司，美国）；（10）XW-80A型旋涡混合器（供应商：中国医大公司）。3.1.4引物本研究所用引物序列见下表3.1。表3.1FUS1、ABLRQ-PCR引物序列Table3.1TheprimersequencesofFUS1、ABLforRQ-PCR3.2实验方法3.2.1骨髓单个核细胞（BMMNCs）的分离及总RNA的提取（1）加大约5ml的淋巴细胞分离液Ficoll至我们所收集到的骨髓标本中，调2000转/分离心机，离心5分钟，结束后提取出待使用的骨髓单个核细胞；（2）在提取得到的BMNCs样本中加入红细胞裂解液5ml，盖紧盖子，上下颠倒或用枪头吹打混匀，当观察到管中液体变清亮后即可，放于室温下面静置1分钟；（3）离心机2000转/分离心5分钟，弃去多余的上清液后，加入1ml的生理盐11 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析水，用枪头充分混匀后转移至EP管中；（4）13000转/分，离心1分钟，弃去上清；（5）在EP管中加入1000μL的细胞裂解液TRIozl，然后用枪头充分吹打混匀，直至液体变得不粘稠；（6）再向上述EP管中加入200μL的三氯甲烷，随后将EP管放置于旋涡振荡器上充分振荡30秒，颠倒混匀约4分钟，在室温下静置约5分钟至10分钟；（7）4℃环境维持下使用离心机13000转/分，离心10分钟；（8）取上层清液，加入600μL异丙醇，上下颠倒混匀约50次，室温静置10分钟（底部胶状为RNA）；（9）4℃环境维持下使用离心机12000转/分，离心5分钟后小心弃去上清液，留下底部的沉淀物，沉淀就是我们所要提取的RNA；（10）向RNA中加入70％的乙醇1ml，轻弹或颠倒混匀沉淀，室温静置5分钟；（11）4℃环境维持下使用离心机13000转/分，离心5分钟，弃上清；（12）再将1ml100％的无水乙醇加入EP管中，轻弹或颠倒混匀以漂洗沉淀，室温下静置1分钟；（13）13000转/分，离心5分钟，小心弃去上清后并于洁净纸上扣干，将沉淀RNA置于37℃烤箱中，干燥5分钟至10分钟后，再加入适量DNA溶解液将沉淀溶解；（14）冰上溶解1小时左右，其中每隔10分钟至15分钟轻弹混匀一次；（15）1：50稀释后进行比色，记下结果（确保每次提取的RNA调整为一致浓度）；（16）通过紫外分光光度仪对所提取的RNA样本检测其吸光度（A260/280）值，并调整至同一浓度，记录对应的浓度、纯度；（17）分装后，将RNA放置于-80℃冰箱冷冻保存，备用。3.2.2逆转录合成cDNA（1）在准备好的0.2mlEP管中分别加入4μg的总RNA、4μL的随机六聚体、14μL的DEPC水，混匀后在定性PCR仪上37℃逆转录5分钟；（2）再向其中加入4μL的miScriptRTbuffer(5×)、4μLdNTP、3μLDEPC水、1μLRiboLockRNaseinhibitor，继续在定性PCR仪上25℃逆转录5分钟；12 江苏大学硕士学位论文（3）最后向其中加入2μLRevertAidRT逆转录酶，在PCR仪上60℃逆转录60分钟；（4）反应结束后将产物cDNA保存至-20℃冰箱中备用。3.2.3RQ-PCR检测FUS1表达的水平本研究通过RQ-PCR法分别检测FUS1及内参基因ABL的表达。FUS1基因表达水平的计算公式如下：N△CTFUS1（对照-实验）△CTABL（对FUS1=（EFUS1）÷(EABL）照-实验）。实验中包含阳性质控及阴性质控，前者为目的基因质粒，后者为水。我们通过凝胶电泳条带来观察PCR扩增产物，据此判断引物的特异性好坏，同时确定适宜的退火温度。（1）FUS1反应体系及条件：总反应体系：20μLddH2O6.0μLFUS1表达上游引物0.8μLFUS1表达下游引物0.8μLAceQqPCRSYBRGreenMasterMix（Vazyme）10.0μL50×ROXReferenceDye2（Vazyme）0.4μLcDNA模板2.0μLFUS1反应条件：第一步：预变性：95℃、5分钟；第二步：扩增：95℃、10秒（变性）；63℃、30秒（退火）；72℃、32秒（延伸）；80℃、32秒（收集荧光）；设置循环数46循环。（2）ABL反应体系及条件：总反应体系：25μL10×Buffer（Thermo）2.5μLABL表达上游引物0.5μLABL表达下游引物0.5μLMgCl24.0μL50×ROX0.5μL20×EvaGreen1.2μLcDNA模板2.0μL13 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析TaqDNA酶（Thermo）1.0μLdNTP0.5μLddH2012.3μLABL反应条件：第一步：预变性：95℃、5分钟；第二步：扩增：95℃、30秒（变性）；60℃、30秒（退火）；72℃、30秒（延伸）；75℃、30秒（收集荧光）；循环数为40循环。（3）跑胶：取各个样本中7uL的扩增产物，然后各加入1uL的Loadingbuffer，用枪头混匀后打入琼脂糖凝胶板孔内，设置电压为100V后进行电泳，约40分钟后跑胶完成，使用凝胶成像仪RED观察跑胶结果。3.2.4PCR产物的纯化与回收（1）电泳方法同上；（2）用电子天平对在紫外光下切取下来的目的DNA凝胶片段进行称重，按照100mg=100μL的换算公式计算出凝胶体积；（3）将DNA凝胶与3倍凝胶体积的BufferDE-A融化剂融合混匀，置于75℃的金属浴中；（4）待凝胶融化成透明后，再将1倍凝胶体积的异丙醇与0.5倍凝胶体积的BufferDE-B的混合液加入其中，盖紧盖子，上下颠倒充分混匀50次左右；（5）准备好1.5ml的DNA制备管，用移液器将上述混合液转至其中，4℃环境维持下使用离心机12000转/分离心1分钟，弃去滤液；再在上述DNA制备管中加入500μL的BufferW1洗涤液洗涤DNA，4℃环境维持下使用离心机12000转/分离心1分钟，弃去滤液；（6）再加入700μL的BufferW2去盐液至上述DNA制备管中，4℃环境维持下使用离心机12000转/分，离心1分钟后弃去滤液，再重复上述操作一次；（7）将上述DNA制备管转移至1.5ml的新EP管中，再将提前预热好的25μL的Eluent去离子水小心加至制备膜中央，4℃环境维持下12000转/分离心机离心1分钟后洗脱DNA，再将上述制备膜去除，保存于4℃冰箱中。3.2.5重组载体构建连接体系如下所示：总体系：10μL14 江苏大学硕士学位论文pMD®19-T克隆载体1μLddH2O1μLPCR纯化产物3μLsolution15μL置于4℃冰箱约13小时过夜，后置于-20℃冰箱中冷冻储藏。3.2.6重组质粒转化（1）取出冰箱中贮存的DH5α感受态细胞（-80℃冰箱中），于冰盒上融化约15分钟，再将10μL连接体系加入上述感受态细胞中，轻弹混匀后冰浴半小时；（2）将上述感受态细胞激发：置于42℃恒温金属模块中预激约90秒，然后冰浴3至5分钟；（3）再加入提前预热好的900μL的LB液，将混合液放置于摇床上，37℃，160×rpm，匀速震荡1小时；（4）配置LB固体/液体培养基：（5）高压灭菌配制完成后的LB培养基，将实验所需的氨苄青霉素（100μg/ml）加入到培养基中（50℃时），将培养基倒入培养皿中等待凝固；（6）涂板：用37℃的孵箱预热上述含氨苄青霉素的培养皿约10分钟左右，然后将30μLX-Gal贮存液（20mg/ml）、30μLIPTG（24mg/ml）、10μL的灭菌水按比例配置后混匀，然后均匀涂在LB平板上，再将LB平板放于室温下或者37℃下3-4小时，促进液体被吸收；（7）涂菌：将DH5α感受态细胞充分混匀，吸取100μL液体加入到上述步骤(5)中LB平板上用无菌玻璃棒均匀涂抹，室温下干燥至液体完全吸收，再将LB平板倒置，于37℃继续培养16-18小时。3.2.7重组质粒提取及鉴定、测序15 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析（1）挑菌及摇菌：用10μL枪头挑取出LB培养板上转化成功的单个白色菌落，然后加入至3ml的LB培养液中，再另外将8μL氨苄青霉素加入LB培养液中，置于水平摇床上，37℃震荡培养3小时，匀速150转/分，接着补充LB液6ml继续震摇过夜；（2）取5ml过夜的细菌培养液分至各个离心管中，12000转/分，离心1分钟，弃去上清，用滤纸吸干净管壁上的液体；（3）加入含有RnaseA的细菌悬浮液BufferS1约250μL，再加入250μL的细胞裂解液BufferS2，盖紧EP管盖，轻柔并充分颠倒混匀5-8次使悬液变得透亮；继续加入350μL的中和液BufferS3，再次充分颠倒混匀8次，4℃低温环境维持下使用12000转/分的离心机离心10分钟；（4）缓慢将上清液移至新的1.5mlDNA制备管中（试剂盒内提供的），4℃低温环境维持下使用12000转/分的离心机离心1分钟，弃去滤液；（5）加入500μL的BufferW1洗涤液，4℃低温环境维持下使用12000转/分的离心机离心1分钟，弃去滤液；（6）再向管中加入700μL的BufferW2去盐液，4℃低温环境维持下使用12000转/分的离心机离心1分钟，弃去滤液，然后重复相同的洗涤步骤一次；（7）将制备管转移到新的1.5ml的EP管中，在制备管中央膜上加入提前预热好的60μL的Eluent水，4℃低温环境维持下12000转/分的离心机离心1分钟，将制备膜去除，得到的产物即为质粒；（8）质粒鉴定：将2μL经提取得到的质粒加入到配好的FUS1基因的PCR反应体系中，在PCR仪中按照相应的反应条件对体系扩增，将扩增完后的产物进行琼脂凝胶电泳，验证目的产物条带；（9）质粒测序：将提取的质粒送往华大基因上海股份有限公司进行测序，比对结果。3.2.8阳性模板建立取FUS1表达和ABL表达的重组质粒，经紫外分光光度仪比色测定其浓度，8计算其拷贝浓度（即PCR产物含量），根据PCR结果，将质粒浓度从10拷贝2/μL按照1：10的浓度进行稀释，直至10拷贝/μL浓度，再重新进行扩增检测。3.2.9细胞遗传学检查采用直接法和24小时短期培养法两种方法将收集的初诊AML患者的骨髓16 江苏大学硕士学位论文细胞制成染色体样本，通过R显带后再对患者进行核型分析，其分析主要依据指南《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN）》。将所有AML患者分为以下3组：预后良好组、预后中等组以及预后不良组，其主要依据为患者染色体和预后的关系不同。3.2.10基因突变检测我们采用了不同的方法来检测不同的基因突变。例如，关于DNMT3A、IDH1/2、U2AF1和N/K-RAS基因突变的检测，我们运用的是之前报道过的文献中的方法[95-98]。而c-KIT和NPM1基因突变则是通过PCR和高分辨率熔解分析（HRMA）来检测的。所有阳性样品均利用DNA直接测序确认。而C/EBPA和FLT3-ITD基因突变则通过直接DNA测序法和PCR来检测[99-101]。3.2.11统计学处理我们运用SPSS20.0（SPSS，Chicago，IL）软件包对所有统计进行分析。而各组之间分类变量的差异则通过运用Pearson卡方检验或Fisher精确检验来比较。组间连续变量的差异通过Mann-WhitneyU检验来比较。FUS1表达对于区分AML患者和正常对照的诊断价值则通过受试者工作特征曲线（ROC）和ROC曲线下面积（AUC）来评价。应用Kaplan-Meier生存分析以及Cox回归分析来分析FUS1水平对AML病例生存预测的影响。对于所有分析，P<0.05（双侧）时差异具有统计学意义。3.3实验结果3.3.1对照组中FUS1转录本水平所有标本中FUS1的表达水平，其标准化的比率（NFUS1）按公式1来计算。而扩增效率E则按公式2来计算。△CT指的是每个检测样本中的目的基因FUS1与内参基因ABL之间CT值的差值。23例对照组标本的FUS1转录水平范围为0.000--4.271，中位水平为0.290。NΔCTFUS1（control-sample）ΔCTABL（control-sample）FUS1=（EFUS1）÷（EABL）（公式1）E=10（-1/slope）（公式2）3.3.2AML患者中FUS1基因转录本水平我们从实验中所得，158例AML患者中FUS1转录水平范围为0.000--7.705，17 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析中位水平为0.025。与正常对照组相比，AML患者中FUS1转录本水平显著下调（P=0.012，见图3.1）。图3.1AML患者以及对照组中FUS1的相对表达含量Fig3.1RelativeexpressionlevelsofFUS1inwholeAMLandcontrolgroups.3.3.3FUS1表达具有辅助诊断标记意义采用受试者工作特征曲线（ROC）来分析评估FUS1在AML的诊断方面是否具有辅助价值。ROC结果显示FUS1表达水平可以有效区分AML患病组和健康对照组（AUC=0.663，95％CI：0.528-0.797，P=0.012）（见图3.2）。18 江苏大学硕士学位论文图3.2FUS1表达用于鉴别AML患者和正常对照组的ROC曲线Fig3.2FUS1expressionwasusedbyROCcurveanalysisfordiscriminatingwholeAMLpatientsfromcontrolgroups.3.3.4FUS1表达与AML患者的临床及实验室参数相关性根据设定的FUS1表达水平的临界值，将158例AML患者分为两组：低FUS1表达组和高FUS1表达组。然而研究表明，性别、年龄、白细胞（WBC）、血小板（PLT）、血红蛋白（HB）、骨髓中原始细胞百分比、FAB分类以及核型风险等方面在FUS1高低表达组之间未见明显的统计学差异。同时我们进一步研究了FUS1的表达水平是否与患者的基因突变有关，但研究表明，以下如C/EBPA、NPM1、FLT3ITD、IDH1/2、C-KIT、U2AF1、N/K-RAS和DNMT3A这些基因突变在AML患者中并未表现出与FUS1表达具有显著的相关性（P>0.05，见表3.2）。表3.2AML患者中FUS1高低表达组临床及实验室参数相关性比较Table3.2ComparisonofclinicalmanifestationsandlaboratoryfeaturesbetweenAMLpatientswithlowandhighexpressionofFUS119 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析FUS1表达水平病人参数低表达(n=139)高表达(n=19)P值性别（男/女）87/5211/80.692年龄（岁）∆57(10-93)54(24-72)0.155白细胞（×109/L）∆12.9(0.3-528.0)10.4(0.8-140.2)0.567血红蛋白（g/L）∆78(34-142)75(32-138)0.690血小板计数（×109/L）∆39(3-447)30(4-140)0.768原始细胞百分比（%）∆44.5(1-99)43(5.5-91)0.513CR(-/+)76/5310/80.786FAB分型0.541M02(2%)0(0%)M15(4%)2(10%)M259(42%)6(32%)M328(20%)3(16%)M425(18%)6(32%)M515(10%)2(10%)M65(4%)0(0%)染色体危险分级0.813低危41(29%)4(21%)中危77(56%)13(68%)高危17(12%)2(11%)无信息4(3%)0(0%)染色体分组0.980正常核型58(42%)10(53%)t(8;21)11(8%)1(5%)t(16;16)1（1%）0(0%)t(15;17)27(19%)3(16%)11q230(0%)0(0%)+86(4%)0(0%)-5/5q-3(2%)0(0%)t(9;22)1(1%)0(0%)其他14(10%)2(10%)复杂核型13(9%)3(16%)无信息4(3%)0(0%)-7/7q-1(1%)0(0%)基因突变CEBPA(+/-)14/1022/161.0NPM1(+/-)13/1033/150.452FLT3-ITD(+/-)16/1002/161.0c-KIT(+/-)5/1110/181.0N/K-RAS(+/-)8/1082/160.624IDH1/2(+/-)5/1110/181.0DNMT3A(+/-)9/1070/180.608U2AF1(+/-)5/1110/181.020 江苏大学硕士学位论文注：∆中位数（范围），CR：完全缓解。3.3.5FUS1表达与AML预后的关系为了研究FUS1表达对AML预后的影响，我们运用Kaplan-Meier生存分析对147名具有随访数据的患者进行了预后情况的分析。分析结果显示，在非M3型的AML患者中，低FUS1表达患者与高FUS1表达患者相对比，总体生存时间（OS）明显要更短（中位生存时间分别为5个月和10个月，P=0.049），差异具有统计学意义（见图3.3A）。同样在非M3型的AML患者中，低FUS1表达患者的无白血病生存时间（LFS）也显著短于高FUS1表达的患者（中位生存时间分别为12个月和36个月，P=0.051），差异具有统计学意义（见图3.3B）。为了进一步研究FUS1低表达是否为影响患者预后的独立因素，我们采用了Cox单、多因素分析来证明。多因素分析中变量有：FUS1的表达（高表达及低表达）、WBC（≥30×109/L和<30×109/L）、染色体危险程度分级（低危，中危和高危组）以及常见的基因突变（野生型和突变型）。然而多因素分析结果显示FUS1低表达在非M3型的AML患者中并不能成为影响患者预后不良的独立因素（HR=0.731；95％CI：0.370-1.444，P=0.367，见表3.3）。AB图3.3FUS1表达对非M3型的AML患者生存率的影响A：总体生存时间;B：无白血病生存时间Fig3.3ImpactofFUS1expressiononCumsurvivalrateofnon-M3-AMLpatients.A.non-M3-AMLonoverallsurvival;B.non-M3-AMLonleukemia-freesurvival21 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析表3.3单因素和多因素分析非M3型AML患者总生存的预后Table3.3Univariateandmultivariateanalysesforoverallsurvivalinnon-M3-AMLpatients.单因素分析多因素分析危险比(95%CI)P值危险比(95%CI)P值白细胞1.676(1.122-2.502)0.0121.398(0.900-2.171)0.136染色体危险程度分级1.679(1.247-2.259)0.0011.832(1.325-2.532)<0.001FUS1表达0.535(0.277-1.035)0.0630.731(0.370-1.444)0.367FLT3-ITD突变1.117(0.588-2.122)0.735--NPM1突变1.200(0.635-2.266)0.575--CEBPA突变0.802(0.414-1.554)0.513--c-KIT突变0.559(0.137-2.276)0.417--N/K-RAS突变1.508(0.751-3.029)0.248--IDH1/2突变5.895(2.221-15.650)<0.0016.817(2.547-18.245)<0.001DNMT3A突变1.236(0.569-2.684)0.592--3.4讨论FUS1作为一种新型的肿瘤抑制基因候选基因，已被在多种正常健康的人体组织（如心脏，脑，胎盘和肺）中检测到高水平的表达[51]。而除了正常组织之外，肿瘤中关于FUS1的研究也很热门，多项研究显示FUS1在肺癌、乳腺癌[51，52]、成胶质细胞瘤[67]、食管癌[68]、甲状腺癌[69]中都存在着低表达的现象。特别是在肺癌中，FUS1基因的频繁缺失是其发病机制中检测到的最常见和最早的癌症异常之一。然而，FUS1在AML中的表达情况却还未被研究报道过。我们此次主要研究了FUS1基因在AML中的表达情况及其对患者预后的影响。研究结果表明，FUS1基因在AML患者中表达显著降低，ROC结果显示FUS1的表达水平可以有效区分AML患病组和健康对照组。这表明FUS1低表达在AML患者中是一种常见的分子事件，且它可以作为AML诊断的一种潜在的分子标志物。此外，我们还研究了FUS1基因低表达与AML患者预后的关系。Kaplan-Meier生存分析显示，在非M3型的AML病例中，与FUS1高表达组相比，低表达组的总体生存时间以及无病生存时间明显更短。这表明FUS1低表达可能是与AML预后不良有关的重要因素。研究证明FUS1蛋白主要存在于线粒体中，同时它可以参与线粒体中钙的调节[60，61]。线粒体中的钙稳态与FUS1相关，而FUS1的缺失则会导致过早衰老，出现与衰老相关的病理改变，同时导致生存能力下降[62]。因此，这也更好22 江苏大学硕士学位论文地解释了我们得出的研究结果，低FUS1表达的非M3型的AML患者与高FUS1表达的患者相比，具有更短的总体生存期及无白血病生存期。此外，我们还分析了FUS1表达情况与临床参数间的关系。但遗憾的是，FUS1高表达组和低表达组相比，在性别、年龄、血液学参数、FAB分型、核型危险度以及基因突变方面均无显著统计学差异。众所周知，AML是造血系统的恶性克隆性疾病，与疾病相关的白细胞、血红蛋白、血小板等血液参数本身就存在大部分的异常，因此它们的高低可能与白血病本身相关，而FUS1低表达的机制可能不足以区分这些临床参数。当然，我们没有观察到核型和基因突变与FUS1表达之间的相关性，这也可能是由于患者样本基数较小的原因，这些还需要通过进一步的扩大研究来证明。目前AML的治疗方案仍然是以化疗为主，但治疗效果却不甚理想，完全缓解（CR）率及5年生存率均不高[4]，同时由于患者不耐受化疗以及对化疗存在耐药性都容易导致疾病复发。现在异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）已经成为用来治疗成人急性髓细胞性白血病（AML）的一种越来越重要的手段。虽然干细胞移植可以通过增强剂量以及拥有有效的移植物抗白血病（GVL）作用来提供强效的抗白血病疗法，但仍然有30％至70％的患者会复发，并且这也是治疗失败的主要原因[102，103]。因此，针对这样的形式，我们迫切需要新的治疗策略来减少疾病的复发。研究表明，已知许多疾病和移植特异性因素，如表观核型、移植时的疾病状态以及预处理方案的强度可以用来预测复发的风险（RR）[104-106]。虽然FLT3和NPM1的突变均可以预测移植后的结局，但关于移植后其他AML相关基因突变的预后影响的分析还非常有限[107]。我们此次的研究中也暂时未观察到DNMT3A、IDH1/2、U2AF1和N/K-RAS等几个基因突变与FUS1表达之间的相关性。同样，尚未有关于诊断、移植前和复发时纵向样本克隆结构变化的研究。这阻碍了新型治疗策略的合理开发来减少移植后的复发。移植后应用细胞或药物治疗是降低疾病复发的关键手段。这种疗法可以增强移植物抗白血病的能力（例如，供体淋巴细胞输注[DLI][108]或检查点抑制剂[109]）或者操纵疾病复发动力学（例如FLT3抑制剂或阿扎胞苷[110-113]）。重要的是，合理部署移植后干预措施将有助于更好地理解可行的AML突变在复发性移植后疾病中的作用，虽然目前部署这种干预措施仍受到限制。为了解决这些23 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析缺陷，我们进行干细胞移植后预后的基因预测并研究诊断和疾病复发时的克隆结构。而我们可以继续将FUS1基因的研究应用于AML复发或移植后的预后影响分析。同时，关于细胞或药物治疗方面的研究也可以进一步与FUS1基因研究相结合，这可能会对于未来提供AML的不同治疗方案开辟新的思路。综上所述，我们的研究表明FUS1低表达在AML患者中是一种常见的分子事件，它可以作为AML诊断的一种潜在的分子标志物。同时FUS1低表达可能是预示AML患者预后不良的重要因素。24 江苏大学硕士学位论文第四章CML患者中FUS1表达的临床研究4.1实验材料4.1.1研究对象此次的研究对象主要包括23例正常对照以及37例CML患者。其中对照组标本主要来自于健康的骨髓捐赠者，而CML标本主要来自于门诊及住院部患者，这一部分主要由江苏大学附属人民医院提供。所有患者均已提供书面知情同意书。此次研究已获得江苏大学附属人民医院的支持与批准。4.1.2主要试剂参前3.1.2。4.1.3主要仪器参前3.1.3。4.1.4引物参前3.1.4。4.2实验方法4.2.1单个核细胞提取和总RNA制备参前3.2.1。4.2.2逆转录参前3.2.2。4.2.3FUS1表达的RQ-PCR检测参前3.2.3。4.2.4PCR产物纯化与回收参前3.2.4。4.2.5重组载体构建参前3.2.5。4.2.6重组质粒转化参前3.2.6。4.2.7重组质粒提取及鉴定、测序25 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析参前3.2.7。4.2.8阳性模板建立参前3.2.8。4.2.9细胞遗传学检查将收集到的CML患者的骨髓细胞运用直接法或24小时短期培养法制备成染色体标本，通过R显带后再对患者进行核型分析，其分析主要依据指南《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN）》。依据核型不同将所有患者分为以下3组：t（9；22）组、t（9；22）合并其他染色体异常组、正常核型组。4.2.10统计学处理我们运用SPSS20.0（SPSS，Chicago，IL）软件包对所有统计进行分析。而各组之间分类变量的差异则通过运用Pearson卡方检验或Fisher精确检验来比较。组间连续变量的差异通过Mann-WhitneyU检验来比较。FUS1表达对于区分CML患者和正常对照的诊断价值则通过受试者工作特征曲线（ROC）和ROC曲线下面积（AUC）来评价。对于所有分析，P<0.05（双侧）时差异具有统计学意义。4.3实验结果4.3.1对照组中FUS1转录本水平所有标本中FUS1的表达水平，其标准化的比率（NFUS1）按公式1（同前3.3.1）来计算。而扩增效率E则按公式2（同前3.3.1）来计算。△CT指的是每个检测样本中的目的基因FUS1与内参基因ABL之间CT值的差值。23例对照组标本的FUS1转录水平范围为0.000--4.271，中位水平为0.290。4.3.2CML患者中FUS1基因转录本水平我们从实验中所得，37例CML患者中FUS1转录水平范围为0.000--0.441，中位水平为0.001。与正常对照组相比，CML患者中FUS1转录本的水平显著下调（P<0.0001，见图4.1）。26 江苏大学硕士学位论文图4.1CML患者以及对照组中FUS1的相对表达含量Fig4.1RelativeexpressionlevelsofFUS1inwholeCMLandcontrolgroups.4.3.3FUS1表达具有辅助诊断标记意义采用受试者工作特征曲线（ROC）来分析评估FUS1在CML的诊断方面是否具有辅助价值。ROC结果显示FUS1表达水平可以有效区分CML患病组和健康对照组（AUC=0.837，95％CI：0.730-0.943，P<0.001）（见图4.2）。27 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析图4.2FUS1表达用于鉴别CML患者和正常对照组的ROC曲线Fig4.2FUS1expressionwasusedbyROCcurveanalysisfordiscriminatingwholeCMLpatientsfromcontrolgroups.4.3.4FUS1表达与CML患者的临床及实验室参数相关性根据设定的FUS1表达水平的临界值，将37例CML患者分为两组：低FUS1表达组和高FUS1表达组。然而研究表明，低FUS1表达患者和高FUS1表达患者在性别、年龄、白细胞（WBC）、血小板计数（PLT）、血红蛋白（HB）、核型、临床分期等方面并未发现有显著的统计学差异（P>0.05，见表4.1）。表4.1CML患者中FUS1高低表达组临床及实验室参数相关性比较Table4.1ComparisonofclinicalmanifestationsandlaboratoryfeaturesbetweenCMLpatientswithlowandhighexpressionofFUS1病人参数低表达(n=34)高表达(n=3)P值性别（男性/女性）22/122/11.0年龄（岁）∆53(15-78)48(22-65)0.834白细胞（×109/L）∆60.150(25.1-372.0)170.6(24.5-183.8)0.920血红蛋白（g/L）∆95(50-145)91(80-116)0.957血小板（×109/L）∆383(16-939)250(179-963)0.861核型1.0t(9;22)25(73.5%)3(100%)t(9;22)合并其他染色体异常4(11.7%)0(0%)28 江苏大学硕士学位论文正常核型3(8.8%)0(0%)无数据2(6.0%)0(0%)临床分期0.477CP28(82.4%)2(66.7%)AP3(8.8%)0(0%)BC3(8.8%)1(33.3%)ΔBCR-ABL1转录本141.155(13.81-14464.68)411(275.26-490.67)0.550注：∆中位数（范围）。4.4讨论慢性粒细胞白血病（CML）是由骨髓（BM）中的骨髓CD34+/CD38-/CD90+祖细胞产生的一种骨髓增殖性疾病[114]。CML起源于造血干细胞向成体细胞的不完全分化，并通过其未成熟的形式积累到骨髓和外周血中。CML疾病的特征在于Abelson（ABL）基因从染色体9号位易位到22号染色体长臂的断点簇区（BCR）[t（9;22）（q34;q11）]，产生所谓的“费城染色体”。这种易位允许融合蛋白BCR-ABL（酪氨酸激酶（TK）激活不同的信号传导途径）的组成型激活。BCR-ABL癌蛋白是CML的主要驱动因素[115,116]。小分子抑制剂如伊马替尼对激酶活性的抑制导致携带该易位的CML患者产生强烈的抗肿瘤反应[116,117]。这一重要发现帮助开创了个性化精准药物治疗的时代，旨在抑制维持癌细胞增殖和生存所需的突变激活酶，如激酶。然而，在实体瘤中，ABL激酶在肿瘤发生中的作用是相对未开发的。我们此次主要研究了FUS1基因在CML患者中的表达情况及其与一些临床参数间的关系。研究结果表明，FUS1基因在CML患者中的表达显著降低，ROC结果显示FUS1的表达水平可以有效区分CML患病组和健康对照组。这表明FUS1低表达在CML患者中是一种常见的分子事件，且它可以作为CML诊断的一种潜在的分子标志物。但它在CML中的调控机制却尚不明确。有研究表明FUS1是一种豆蔻酰化蛋白，且研究显示它的半衰期增加[54]，所以氨基端的FUS1的肉豆蔻酰化对于FUS1的肿瘤抑制功能是必需的[59]。而在原发性非小细胞肺癌中发现FUS1豆蔻酰化缺乏[54]。巧合的是，c-Abl（异构体1b）的氨基末端也含有肉豆蔻脂肪酸残基，且被认为与c-Abl的自动抑制有关[118]。c-Abl蛋白在所有组织中都有广泛表达，并且Abl的致癌基因活化形式被认为局限于造血系统29 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析恶性肿瘤（例如涉及BCR-ABL融合的费城染色体+慢性粒细胞白血病）。因此我们推断，FUS1在CML中表达下调可能与c-Abl的激活状态有关。LinJ等通过实验表明伊马替尼可以强烈抑制非小细胞肺癌细胞株的克隆生成,证明了非小细胞肺癌细胞株中有酪氨酸激酶活性的c-Abl表达。因此，这些发现将c-Abl鉴定为TSGs产物FUS1的可能靶标，并且表明c-Abl可能与某些形式的非小细胞肺癌的致癌性有显著相关，特别是那些FUS1表达缺陷的患者[119]。此外，我们进一步分析了FUS1表达情况与CML患者的临床参数间的关系。但遗憾的是，FUS1高表达组和低表达组相比，在性别、年龄、血液学参数、核型以及临床分期等方面均无显著的统计学差异。这可能是由于目前所研究的患者的样本量较少的缘故。由于缺少随访数据，我们并未对CML患者的预后进行进一步分析。最近的一项研究表明，使用伊马替尼可以在一定程度上改善慢性粒细胞白血病（CML-BC）急变的结局，但患者的中位生存时间仍然很短（6.5-10个月）[120]。使用第二代酪氨酸激酶抑制剂（第二代TKIs）如达沙替尼和尼罗替尼治疗CML-MBC也可以改善预后[121-125]。此外，目前正在研究与常规化疗和TKI的联合治疗，并预期会产生更好的结果[126-128]。综上所述，我们的研究表明FUS1表达下调在CML患者中是一种常见的分子事件，它与CML的疾病进展无关。30 江苏大学硕士学位论文第五章AML患者中FUS1表达与miR-378表达的相关性5.1研究对象此次的研究对象为53例新诊断的来自于江苏大学附属人民医院的门诊以及住院部的AML患者。所有患者均已提供书面知情同意书。此次研究已获得江苏大学附属人民医院的支持与批准。5.2研究方法本次研究主要采用Pearson相关分析法进行AML患者中FUS1表达和miR-378表达之间的相关性分析。P<0.05（双侧）被认为具有统计学意义。5.3研究结果Pearson相关分析表明：FUS1表达水平与miR-378表达水平呈负相关（r=-0.346，P=0.011，见图5.1）。图5.1AML中FUS1表达水平及miR-378表达水平的相关性Fig5.1RelationshipbetweenFUS1expressionandmiR-378expressioninAMLpatients31 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析5.4讨论微小RNA（miRNA）是一类大的非编码小RNA，在转录后调节水平作为基因表达的抑制剂起作用。单个miRNA经常涉及几个基因调控网络，并作为不同信号通路的检查点[129-131]。研究证明miRNA参与几乎所有的代谢过程[132]。而现在有越来越多的实验研究集中在成骨/血管生成和miRNA的功能上。据报道，miR-214通过成骨细胞特异性转录因子osterix和有丝分裂有关的不同下游途径来抑制成骨和血管生成分化[133-136]。然而，负调节很少用于促进组织再生。一些研究人员发现miR-566可以通过靶向VonHippel-Lindau肿瘤抑制因子来调控血管的生成[137]。并且miR-29b被证明能够通过靶向几种体外骨形成抑制剂来促进成骨细胞的分化[138,139]。据报道miR-17负向调节骨组织形成的骨生成[140,141]。此外，miR-26a被鉴定为可以调节成骨和血管生成以用于骨再生[142,143]。据报道，miR-378也是参与各种细胞和有机代谢过程的关键因素。据报道，miR-378过表达通过靶向CASP3和激活PI3K/Akt信号通路来减弱高葡萄糖抑制的成骨分化[84]。因此，miR-378被认为是可以通过同时增加血管生成和骨生成来促进骨的预期影响因子[144]。此外miR-378显示在不同的癌症中过表达，似乎作为致癌基因发挥功能[87,145-148]。先前的研究表明，miR-378可以促进胶质母细胞瘤细胞的存活、肿瘤生长和血管生成[87]。miR-378调节成骨细胞分化并参与肿瘤细胞自我更新和化疗耐药[147,148]。我们实验室曾经有报道过miR-378在AML患者中的表达情况，结果显示，miR-378在AML中过表达频繁且可能对AML的预后产生不利影响[92]。因此，我们此次在研究了FUS1在AML中的表达情况的基础上又进一步研究了FUS1表达与miR-378表达的相关性。结果显示，FUS1表达水平与miR-378表达水平呈负相关。FUS1蛋白已被确定为一种线粒体肿瘤抑制剂，免疫调节剂和抗氧化蛋白的肿瘤抑制剂。FUS1的缺失可以导致伴有慢性炎症的自身免疫样综合征以及血管性肿瘤和淋巴瘤的自发形成。FUS1的3'UTR端包含核苷酸748-770中miR-378的潜在靶序列。FUS1可以在体外和体内显著抑制肿瘤细胞生长。实验证明miR-378可以通过抑制FUS1的表达来增强细胞存活[87]。此外，还有研究表明miR-378通过下调FUS1表达可以促进肝癌细胞的转移[149]。由此可见，以上结32 江苏大学硕士学位论文果都表明miR-378与FUS1基因之间存在着相关性。综上所述，我们的研究表明FUS1表达水平与miR-378表达水平在AML患者中呈负相关。33 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析第六章结论和展望6.1主要结论（1）FUS1低表达在AML患者中是一种常见的分子事件，同时FUS1低表达可能与患者预后不良有关。（2）FUS1低表达在CML患者中也是一种常见的分子事件，它与CML的疾病进展无关。（3）FUS1与miR-378的表达在AML患者中呈负相关。6.2展望FUS1已被发现在多种实体肿瘤，如肺癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、食管癌、甲状腺癌等中表达降低，但其在血液系统肿瘤中的表达情况却尚未有研究报导。我们本次研究发现，与正常对照组相比，FUS1基因在AML患者及CML患者中的表达明显下调，提示FUS1低表达在AML及CML中是一种常见的分子事件。同时我们还发现，在非M3型的AML患者中，低FUS1表达患者的总体生存期以及无白血病生存时间均显著短于高FUS1表达的患者，提示患者预后不良。我们进一步研究了FUS1与miR-378在AML患者中表达的相关性，发现两者表达呈负相关，说明FUS1对AML预后的影响可能与miR-378有关。条件允许的话，下一步我们将继续扩大样本量，继续研究FUS1与AML患者的总体预后关系，并且进行其表达情况与临床参数间的进一步探讨。此外，我们也会展开CML的随访追踪，以便进一步进行FUS1表达与CML患者预后间的研究。同时，关于其他血液系统恶性肿瘤的研究也在我们的计划之内。研究表明，FUS1不仅与miR-378具有相关性，miR-93，miR-98和miR-197等也可以调节FUS1的表达，因此我们也可以进一步研究其他miRNA与FUS1的关系，不仅仅是在血液系统疾病中，其他实体肿瘤也可以成为我们研究的一个方向。目前AML的治疗方案仍然是以化疗为主，但治疗效果却不甚理想。现在异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）已经成为用来治疗成人急性髓细胞性白血病（AML）的一种越来越重要的手段，但也仍然存在复发的风险，因此，我们迫切需要新的治疗策略来减少疾病的复发。除了已知的几种基因突变可以用来预测移34 江苏大学硕士学位论文植后的结局外，我们猜测是否可以继续将FUS1基因的研究应用于AML复发或移植后的预后影响分析。同时，关于细胞或药物治疗方面的研究也可以进一步与FUS1基因研究相结合，这可能会对于未来提供AML的不同治疗方案开辟新的思路。35 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江苏大学硕士学位论文致谢时光荏苒，我的硕士生涯已接进尾声。这三年的时光既漫长又短暂，其中充满了酸甜苦辣，更有收获和成长。感谢陪我一起度过美好时光的每位尊敬的老师和亲爱的同学，正是你们的帮助，我才能克服困难，正是你们的指导，我才能解决疑惑，直到学业的顺利完成。本人的学位论文是在我的恩师邓兆群教授的殷切关怀和耐心指导下进行并完成的，衷心感谢我的恩师对我的淳淳教诲和悉心关怀。从选题、开题、数据的选择、研究方法的运用，直至论文的最终完成，邓教授都始终给予我耐心的指导和支持，我取得的每一点成绩都凝聚着恩师的汗水和心血。恩师开阔的视野、严谨的治学态度、精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我，在此谨向邓教授致以衷心的感谢和崇高的敬意。感谢钱军主任、林江主任。钱军主任认真严谨，求真务实，在科研与工作中都对我们指导良多。林江主任平易近人，待人和蔼可亲，平时对我们关爱有加，为我们营造了一个非常温馨的学习环境。同时要感谢课题组的全体成员：感谢姚冬明、马吉春、陈芹、肖高飞、闻向梅、袁倩等老师对于我的帮助，使我的课题得以顺利的完成；感谢周静东、张婷娟、周凌宇、翟玲玲、王语欣、杨东琴等师兄师姐们热情无私地传授科研知识与经验；感谢与我并肩作战的同届张静、周娇、李希茜、何品芳、张志辉、连欣悦同学，在实验室里我们相互学习、一起奋斗、共同进步，给我留下了难忘和美好的回忆；感谢易云云、易晶、杨兰、徐子浚等师弟师妹们在平时开展相关工作中的支持和帮助。感谢我的家人常年对我的支持和关怀，他们是最爱我的人，也是我最坚强的后盾，他们默默的奉献是我求学三年来的支持和动力。最后，我要向百忙之中参与审阅、评议本论文的各位老师、向参与本人论文答辩的各位老师表示由衷的感谢!人生的每个阶段都值得好好珍惜，这段美好岁月，因为有你们的关心和帮助，我很幸福。我会更加勤奋学习、认真研究，我会努力做得更好。最后，希望这篇论文不会是我学术思考的终点，希望能继续在以后的工作生活中发挥求实创新的精神。51 急性与慢性髓系白血病中FUS1的表达研究及其与miR-378的相关性分析攻读硕士学位期间发表的学术论文及其他科研成果一、发表论文1.TangX,ZhouJ,ZhangJ,ZhouLY,ZhaiLL,VanessaMD,YiJ,YiYY,LinJ,DengZQ.LowExpressionofFUS1isNegativelyCorrelatedwithmiR-378andmaypredictadverseprognosesinacutemyeloidleukemia.ActaHaematol.2018;139(2):89-95.2.ZhangJ,ZhouJ,TangX,etal.Reducedexpressionofchemerinisassociatedwithpoorclinicaloutcomeinacutemyeloidleukemia.Oncotarget.2017;8:92536-92544.3.ZhaiLL,ZhouJ,ZhangJ,TangX,ZhouLY,YinJY,VanessaMD,PengW,LinJ,DengZQ.Down-regulationofpseudogeneVimentin2pisassociatedwithpooroutcomeindenovoacutemyeloidleukemia.CancerBiomark.2017.4.ZhouLY,ZhaiLL,YinJY,VanessaME,ZhouJ,ZhangJ,TangX,LinJ,QianJ,DengZQ.PseudogeneBMI1P1expressionasanovelpredictorforacutemyeloidleukemiadevelopmentandprognosis.Oncotarget.2016;7(30):47376-47386.二、获奖情况1.2016年获校三等奖学金；2.2017年获校三等奖学金。三、参与课题工作情况1.国家自然科学基金项目（81270630）；2.国家自然科学基金项目（81172592）；3.江苏省“333工程”资助项目（BRA2011085）；4.江苏省自然科学基金（BK200926）52