木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定

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分类号：S432.1密级：UDC：632学号：2111602022硕士学位论文（专业学位）木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定邱爱林指导教师：何红教授校外导师：罗建华申请学位类别：农业硕士领域名称：植物保护学院名称：农学院中国·湛江2018年6月I 学位论文答辩委员会组成主席：Ｉ委员Ａ败成／？那又诛，、导师：Ｉ。时间：＾以，夂＜ III 木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定摘要本文选用分离自木麻黄的较强致病力的青枯病菌株，对木麻黄不同品系对青枯病的抗性进行了室内接种测定，对部分抗（感）病木麻黄品系的室内外生长特性、根内根际土壤微生物数量及根际土壤酶活等进行了测定，以期为抗青枯病木麻黄品种选育、木麻黄青枯病的防治等提供理论与实践的依据。获得结果如下：⑴以TTC为分离培养基，采用组织分离法，从雷州半岛木麻黄主要种植区共分离到8个木麻黄青枯病菌株，其中以来自吴川的W6菌株的致病力较强。选用W6菌株为供试菌株，以小苗盆栽浸泡为接种方法，对湛江市林业科学研究所提供的77个木麻黄品系对青枯病的抗性进行室内盆栽测定，结果表明，供试木麻黄品系中8个品系(10、11、B2、B5、B8、B12、C6和江洪2)对青枯病的抗性表现中等抗病；5个品系（12、B6、B16、北海4和湛霞3）对青枯病表现中等感病；其余64个品系对青枯病表现为高等感病；未发现高抗病品系。⑵不同木麻黄品系室内外生长特性、根内根际微生物数量及根际土壤酶活测定结果表明，抗病品系的株高一般比感病品系的矮，而茎粗则相反，抗病品系的茎粗一般比感病品系的粗；抗病品系根内根际细菌数量远大于感病品系的细菌数量，而真菌数量则相反，抗病品系根内根际真菌数量明显小于感病品系的真菌数量；抗病品系根际土壤的过氧化氢酶、酸性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶等酶活一般比感病品系的高。综合各品系对青枯病的抗性、生长特性、根内根际微生物数量及根际土壤酶活测定结果发现，B2和B12两品系不仅对青枯病的抗性较好（中等抗性），且室内外株高、茎粗、树围直径等生长特性均表现良好；根内根际土壤细菌数量多、真菌数量少；根际土壤的过氧化氢酶、酸性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶等酶活较高。因此，本文认为该两个品系可能具有较好的推广应用潜力。关键词:木麻黄；青枯病；抗病性；生长特性 ResistancesanditsgrowthcharacteristicsofCasuarinaequisetifoliatobacterialwiltAbstractBacterialwiltwereisolatedfromCasuarinaequisetifoliainLeizhouPeninsula.TheresistancetobacterialwiltindifferentstrainsofC.equiseteriae,Bothindoorandoutdoorgrowthcharacteristicsofsomedisease-resistantC.equiseteriaestrainswereselected.Theamountofmicroorganismsinrootsandrhizospheresoilsaswellastherhizospheresoilenzymeactivitiesweremeasuredtoprovideatheoreticalandpracticalbasisforthings,liketheselectionandtheresistantvarietiesofC.equisetifoliabunge’sbreeding,thepreventionandcontrolofC.equisetifoliabungeewwiltandsoon.theresultsareasfollows:(1)UsedTTCastheisolationmedium,15strainsofC.equiseteriaewereisolatedfromthemainplantingareasofC.equisetifoliainLeizhouPeninsulabytissueseparationmethod.Amongthem,thepathogenicityofW6strainfromWuchuanwasstrong.W6strainwasselectedasthetestedstrain,whilepotseedlingsoakingwasusedastheinoculationmethod.Indoorpottestwasconductedontheresistancetobacterialwiltdiseaseof77C.equiseteriaestrainsprovidedbyZhanjiangForestryScienceResearchInstitute.Theresultsindicatedthateightlines(10,11,B2,B5,B8,B12,C6andJianghong2),amongtheequiseteriaestrains,exhibitedmoderateresistancetobacterialwilt,andFivelines(12,B6,B16,Beihai4andZhanXia3)reactedmoderatediseasesusceptibilitytobacterialwilt,whiletherest64strainsshowedhighsusceptibilitytobacterialwilt.(2)Theindoorandoutdoorgrowthcharacteristics,rhizospheremicroorganismsandrhizospheresoilenzymeactivitiesofdifferentCasuarinastrainsweredetermined.Theresultsofthedeterminationareasfollows：Theplantheightofthediseaseresistantstrainisgenerallyshorterthanthatofthesusceptiblestrain,whilethestemdiameteristheopposite.Thestemdiameteroftheresistantstrainisgenerallythickerthanthatofthesusceptiblestrain.Thenumberofrhizospherebacteriainrootinterrootofdiseaseresistantstrainismuchgreaterthanthatofsusceptiblestrain,butthenumberoffungiisopposite.Thenumberofrhizospherefungiinrootofresistancestrainisobviouslysmallerthanthatofsusceptiblestrain.Theactivitiesofcatalase,acidphosphatase,ureaseandsucrasein rhizospheresoilofdiseaseresistantstrainsweregenerallyhigherthanthoseofsusceptiblestrains.Theresultsofcomprehensivedeterminationoftheresistancetobacterialwilt,growthcharacteristics,rhizospheremicrobialcounts,andrhizosphericsoilenzymeactivityofvariousC.equisetifoliastrainsshowedthatB2andB12strainswerenotonlyresistanttobacterialwiltdisease(mediumresistance),butalsoexhibitedgoodindoorandoutdoorgrowthcharacteristicssuchasplantheight,stemdiameter,andtreediameter.Thereweremanybacteriaandfewfungiintherhizospheresoil.Theenzymeactivitiesofcatalase,acidphosphatase,urease,andsucraseinrhizospheresoilwerehigherthansusceptiblestrains.Therefore,thetwostrainshadbetterpotentialforpromotionandapplication.Casuarinaequisetum,bacterialwilt,resistance,growthcharacteristicsKeywords:Casuarinaequisetum,bacterialwilt,resistance,growthcharacteristics 目录摘要.......................................................................................................................IAbstract..................................................................................................................II1文献综述............................................................................................................11.1木麻黄青枯病.........................................................................................11.1.1木麻黄青枯病发生条件...............................................................11.1.2青枯病致病机理...........................................................................21.2木麻黄抗青枯病及其测定方法.............................................................21.2.1木麻黄青枯病的抗性..................................................................21.2.2木麻黄青枯病抗性测定方法.......................................................31.3木麻黄青枯病的防控技术.....................................................................31.3.1化学防治.......................................................................................31.3.2生物防治.......................................................................................31.3.3抗病品系选育...............................................................................41.3.4其他方法.......................................................................................41.4植物内生菌和根际土壤酶活对植物生长作用影响研究.....................51.4.1植物内生菌对植物生长作用的影响..........................................51.4.2植物根际土壤酶活对植物生长作用的影响..............................51.5本研究的目的和意义.............................................................................52.材料与方法.........................................................................................................62.1供试材料.................................................................................................62.1.1供试木麻黄品系..........................................................................62.1.2供试培养基...................................................................................62.2.1标本采集......................................................................................62.2.2病原菌的分离...............................................................................62.2.3青枯病菌特异性引物鉴定..........................................................62.2.4病原菌致病力测定......................................................................72.3木麻黄品系对青枯病的抗（感）病性室内测定..................................82.3.1试验材料.......................................................................................82.3.2抗性测定方法...............................................................................82.4木麻黄部分抗（感）品系室内与室外生长特性等调查测定.............82.4.1木麻黄室内生长特性测定..........................................................82.4.2木麻黄室外生长特性调查..........................................................8 2.5木麻黄根内、根际土壤细菌和真菌的测定.........................................92.5.1室内移栽木麻黄根内、根际土壤细菌和真菌的测定..............92.5.2室外木麻黄根内、根际土壤细菌和真菌的测定......................92.6根际土壤酶活的测定.............................................................................93结果与分析......................................................................................................103.1病原菌分离鉴定...................................................................................103.1.1菌株分离结果............................................................................103.1.2青枯病菌特异性引物鉴定结果................................................103.1.3菌株致病力测定与接种方法比较.............................................113.2不同木麻黄品系抗性评价...................................................................123.2.1不同木麻黄品系室内抗性评价................................................123.2.2不同木麻黄品系田间死亡率调查............................................143.3木麻黄抗（感）病品系生长特性测定................................................143.3.1木麻黄抗（感）病品系生长特性室内测定.............................143.3.2木麻黄抗（感）病品系生长特性室外测定.............................153.4木麻黄抗（感）病品系根内与根际土壤微生物数量测定................163.4.1室内微生物数量测定结果.........................................................163.4.2室外微生物数量测定结果.........................................................183.5木麻黄抗（感）病品系根际土壤酶活性室内、室外测定................193.5.1室内根际土壤酶活性测定结果.................................................193.5.2室外根际土壤酶活性测定结果.................................................204.结论与讨论.......................................................................................................214.1主要研究成果........................................................................................214.2讨论........................................................................................................214.3有待进一步研究的问题........................................................................23参考文献..............................................................................................................24致谢..............................................................................................................30附录A室内测定与室外调查图片..........................................................31附录BW6菌株特异性片段序列............................................................32作者简介..............................................................................................................33导师简介..............................................................................................................34 广东海洋大学硕士学位论文1文献综述木麻黄（Casuarinaequisetifolia）属于被子植物门、双子叶植物纲、轮生目、木麻黄科、木麻黄属，为常绿乔木。原产地是在澳大利亚和太平洋群岛，后陆续在美洲和亚洲沿海地区开始大面积种植。台湾在1897年首先引进木麻黄（杨政川等，1995），目前我国主要在广西、广东、福建等临海地带建造木麻黄人工林（仲崇禄，2000）。由于木麻黄萌芽力强，生长较快，对种植的环境要求较低，而且其根系可深入地面，木麻黄因耐旱、抗沙和耐盐碱成为了热带海岸防风固砂不二选择，这对生态环境的修复和土壤的改良方面具有十分重要的意义，尤其在沿海前缘沙质地带的生态系统恢复、土壤改良等是其它树种所无可替代的，是我国重要的生态林、防护林和能源林。目前在我国木麻黄的栽培面积已超过30万hm2（石文华，2010）。但近年来，木麻黄青枯病严重暴发，造成木麻黄大面积枯死，造成防护林带断带，严重影响海防地区的生态安全。1.1木麻黄青枯病木麻黄青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起的一种毁灭性的土传维管束病害。该病于1951年在毛里求斯最先发现，导致当地木麻黄大面积死亡（Orian，1961）；1984年，在印度的喀拉拉木麻黄上也发现了该病害（Alietal.，1991）；2002年，在西太平洋的关岛发现青枯病引起的木麻黄生长衰退（Ayinetal.，2015）。我国最早于1964年在广东省阳江县海陵岛发现木麻黄青枯病的病例（梁子超，王祖太，1982），随后在广西（梁子超和岑炳沾，1982）浙江、海南（林斯明和王乃全，1984）、福建（高雅等1987）等临海地带也发现病例；近年来，木麻黄青枯病在广东省西部沿海地区大面积发生，并迅速蔓延，大片林木因病害枯死而被迫砍伐销毁，造成沿海地区的防护林断带、残缺不全、功能衰退，严重影响沿海生态环境。1.1.1木麻黄青枯病发生条件木麻黄青枯病通过土壤传播，从木麻黄青枯病病区流出的雨水或其他水流容易携带青枯菌传播。积水容易导致病害发生，地势低洼或地下水位较高的地方容易发生青枯病。一般来说，土地疏松，排水良好的地区，很少发病或不发病；而地势低洼，土壤板结积水较多的地方发病严重（林斯明，1984）。台风暴雨后，对木麻黄造成许多伤口，增加病菌侵染机会，病害随之流行，造成大量木麻黄死亡。病株死亡主要发生在干旱季节，“台风旱”往往使木麻黄生长势更为衰弱，加速死亡进程。台风过后，干旱的地区是病情最重的地方。据历年观察，干旱使病情发展较快，相反，如连续降雨，则病株死亡较慢，病情发展较慢。梁子超等1 木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定报道，木麻黄青枯病的发病高峰在8月中旬高温季节，4月以前和12月以后都极少发病（梁子超等，1984）。1.1.2青枯病致病机理1896年Smith将植物青枯菌定名为Bacillussolanacearum；1914年Smith将青枯菌转入Pseadomonas中，1995年Yabuuchi等通过生理生化和分子鉴定结果分析，建立了Ralstonia属并将青枯菌收入该属中,定命名为Ralstoniasolanacearum。在前人的研究中证明了木麻黄青枯菌属于青枯菌小种1，分属于Hayward的生化型Ⅲ和Ⅵ，并将其划分为SC－1，SC－2和SC－33个菌系(梁子超，1982)。王军等通过用病原菌悬浮液及培养滤液等对木麻黄进行接种处理，发现滤液中毒性物质诱导植物产生填充体堵塞导管导致木麻黄枯萎（王军等，1997）。罗焕亮等对木麻黄青枯菌产生的胞外酶活性测定结果显示，纤维素酶活性差别较明显，与致病性正相关（罗焕亮等，1998）。罗焕亮等研究发现，青枯菌对木麻黄的致病性与根内的增殖量呈正相关，与寄主根表的吸附量呈负相关，得出青枯菌致病性的重要因子为脂多糖和胞外多糖（罗焕亮等，2002）。1.2木麻黄抗青枯病及其测定方法1.2.1木麻黄青枯病的抗性研究结果表明，不同木麻黄的品种（或品系）对青枯病的抗性不同，短枝木麻黄（Casuarinaequisetifolia）更易感染青枯病病原菌，而粗枝木麻黄（C.glauca）却对青枯病表现出一定的抗性，但是这两个品系在田间的生长特性与其抗病性成负相关性。郑惠成等通过对201个无性系的木麻黄品系抗性测定试验，筛选获得了8个强抗病品系（郑惠成等，1991）。陈炳铨等通过对不同致病性的青枯菌菌株接种不同木麻黄品系（无性系）试验结果表明，木麻黄（无性系）对青枯病的抗性存在水平抗性和垂直抗性（陈炳铨等，1995）。王军等的试验结果与陈炳铨的研究结果一致。有研究表明木麻黄的抗病差异与一些氧化酶活性的变化密切相关（王军等，1997）。谢卿楣等在研究抗病细枝木麻黄和粗枝木麻黄与多酚氧化酶活性的变化关系结果表明，两者体内的多酚氧化酶分别比对照高148%和153%，抗病木麻黄体内的水分含量也明显比对照高(谢卿楣等，1991)。抗性品系的植株固氮活性和结瘤量比感病品系的植株高1倍，抗病品系的生物量和含氮量明显高于感病品系（郑惠成，1996）。说明木麻黄的抗病性与木麻黄生长的一些生理特性有关（马海宾等，2011）。郑惠成等指出无性系木麻黄体内的多酚类物质从抗病到感病逐渐降低（郑惠成等，1992）。还有研究指出木麻黄的总黄酮溶液对青枯菌具有抑制效果（王翠颖等，2012）。2 广东海洋大学硕士学位论文1.2.2木麻黄青枯病抗性测定方法在早期木麻黄抗性测定的接种方法中，大多采用伤根灌菌法，将木麻黄苗的主根和须根进行伤根处理，然后以青枯菌的菌液浸泡，重新移栽到花盆内，最后统计发病率。王军等采用水培水浴法在烧杯内接种（王军等，1996），将有根苗（剪断部分须根和侧根）或剪枝的根或基部直接浸入盛有50mL青枯菌菌液的烧杯内接种。许玉秀设计8种木麻黄青枯菌人工接种方法，系统探讨水培生根苗、嫩枝、绿梗小枝、褐梗小枝、青枯菌粗毒素及盆栽小苗伤根接种、盆栽小苗无伤接种等接种方法对木麻黄青枯病抗性鉴定的影响。结果表明褐梗小枝室内水培接种法接种效果较好，将试验材料置入盛有200mL青枯菌悬浮液瓶内，在恒温培养箱中培养（温度30℃，湿度85％），光照13h（光照强度8000lx）（许玉秀，2017）。1.3木麻黄青枯病的防控技术青枯病是在全世界范围内都有发生，而且侵染范围广，青枯病的防治问题一直没有得以解决（易有金等，2007;王大海等，2017;番华彩等，2008;陈勇，金晨钟，2009;黄真池等，2008)，严重的阻碍了农业和林业的发展。对于青枯病的防治方法主要有化学药剂防治、生物防治和抗病品种的选育等，但由于木麻黄青枯病发生严重，应该采取以推广抗病品系为主的综合防治措施（孙思，2013）。1.3.1化学防治前人对化学药剂（制剂）防治木麻黄青枯病进行了一些探索，如植株施石灰水、采用漂白粉或福尔马林进行土壤消毒（林斯明，1984）等，其中有报道认为，施石灰水对病害发生虽有一定的抑制作用，但若石灰使用量不当，极易容易造成土壤肥力减退和土壤板结等问题。另外，有报道认为，三氯硝基甲烷（即氯化苦）、ATW（用阿魏树脂，姜黄，水按1：5：10配制成的溶液）、MB-C67（三溴硝基甲烷）、C-17（二氯丙烯与氯化苦的合剂）、威百亩、棉隆（孙思等，2004）等化学药剂，土壤消毒有一定的减轻病害的效果。但到目前为止，还没有发现能有效防治青枯病的化学药剂(杜根平等，2011），普遍认为化学药剂对青枯病难于防治，再者化学药剂的长期使用容易造成品种抗药性、土壤中药剂残留，对环境造成污染等不良影响。1.3.2生物防治生物防治是一个极具吸引力的防治方法，因为生物防治可以减少化学药剂的使用，生防菌不仅可以对病害进行防控，还能对土壤环境进行改良等。研究结果表明，青枯病菌寄生在植物的维管束，故利用土壤生防菌效果不甚理想，最高防效不到60%（孙茜，2012;熊汉琴，2016;许大凤等，2016），内生生防菌防治青枯病菌比土壤生防菌效果理想。例如，G.A.Achari等首次报道证实了（AchariG，3 木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定RameshR，2015），从茄子和辣椒中分离出的5种内生细菌具有降解3-羟基棕榈酸甲酯（3-hydroxy）的能力，可使青枯细菌毒力因子的表达减少。木麻黄提取物对青枯病也有抑制效果，木麻黄根瘤浸提液和弗兰克氏菌可以抑制青枯菌生长，苗圃试验结果表明，木麻黄根瘤量越高，抗青枯病的能力越强。还发现了粗枝木麻黄的根瘤浸提液抑菌效果比山地木麻黄和普通木麻黄的抑菌效果好（康丽华，1999）。木麻黄组织的乙醇抽提物能抑制青枯菌生长，抗病品系粗提物的抑菌活性均比感病品系粗提物的抑菌活性高。初步化学分析表明粗提物成分包括有机酸、酚类、丹宁、还原糖、黄酮类等物质，其中黄酮类是主要抑菌成分（郭权，1985）。多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂对木麻黄青枯病有一定的防治效果，而且品系本身越感病，防效越高（李波等，2012）。用大孔吸附树脂对木麻黄提取物进行纯化，再用液相色谱对木麻黄中的单宁含量进行定性分析，结果表明，木麻黄中提取的单宁对青枯菌具有抑制效果（王翠颖等，2014）。添加生防菌的生物复合有机肥可以影响根部土壤中青枯菌和主要微生物类群数量，使青枯菌数量明显下降（MengeshaWK,etal.，2017）。但是目前应用生防菌防治青枯菌处于一个试验阶段，大多以室内筛选为主，能正真应用于田间的生防菌较少，在田间受到诸多因素的影响，比如温度、湿度、生防菌对生态环境的适应性、生防菌于寄主植物间的相互作用等，。所以对于生物防治青枯菌的研究还有很多问题需要解决。1.3.3抗病品系选育抗病品种选育是目前普遍认为比较经济、安全、有效的防治青枯病的方法。通过广大研究者的努力筛选出很多优良的抗病无性系并进行了推广（林继强等，1995；刘清浪等，1998）。郑惠成等采用室内盆栽人工接种筛选的方法，初步筛选出P7-35、P10-1、等8个抗病性较强的木麻黄优良无性系（郑惠成等，1991）。在彭国强等的抗病无性系选育试验中，筛选获得了两个显著抗青枯病性的品系701和601，这对于广东阳江地区临海沙滩防护林的改造提供了更多的选择（彭国强等，2000）。许秀玉通过盆栽试验筛选，获得X1、45、平5、30、W6、杂交、501、G1、503、41、A1及A1-312份高抗材料（许秀玉，2017）。1.3.4其他方法栽培管理主要是加强田间苗木的管理，包括种植不带菌苗、壮苗、及时清除病株等。虽然能控制种植区青枯病的发生程度，但是不能从根本上解决青枯菌的侵染，只能作为一个辅助性的防治手段。营建混交林对青枯病有一定的防治作用，木麻黄与窿缘桉混交造林可以减轻青枯病的发生危害，混交林中木麻黄青枯病死亡率为5%，而木麻黄纯林死亡率为8%（郭坚城，1986）。木麻黄与大叶相思混交试验林也可以降低木麻黄青枯病的死亡率，其中混交林青枯病致死率为8.4%，而木麻黄林青枯病致死率为17.2%（黄锋，1991）。4 广东海洋大学硕士学位论文1.4植物内生菌和根际土壤酶活对植物生长作用影响研究1.4.1植物内生菌对植物生长作用的影响研究表明，植物体内有益微生物有促进宿主植物生长发育的作用，据相关报道内生菌有促进植物生长的作用(王洪梅，2013)，对宿主植物生物量、种子数量、种子品质都有促进作用（陈龙等，2015），还可促进幼苗存活和分蘖生长等(江曙等，2008)。同时植物内生菌能够提高宿主植物对生态环境的适应性，增强宿主植物对干旱、高温、病虫害等环境的抗性（尚菲等，2016）。如内生菌代谢产生的化合物（lolines、peramines、ergot和lolitrem），发挥了抗虫作用，对昆虫产生抗性。再者，土壤微生物群落结构不同，土壤有益微生物种群不同，抑制病害能力不同和土壤生态系统稳定性也不同(SheS,etal.，2017)，有益微生物数量成为优势种群对植物的抗逆和抗病性有关（周俊萍等，2016），可以抑制病原菌和其他有害微生物的繁殖和生长(姚领爱等，2010)，如有些内生菌可以产生抗生素以杀死病原菌，如Muscodoralbus（VasseJ,etal.，1995）和Paenibacillussp.（SenthikumarM,etal.，2007）。木霉菌属(Trichodermasp.)的许多内生菌可以分泌胞外酶来降解致病性真菌的细胞壁，从而保护宿主植物体（ViterboA,etal，2002）。可见，植物体内微生物的数量和种群等与植物的生长发育和抗病性之间存在有着密切的关联性，是目前研究的热点之一。1.4.2植物根际土壤酶活对植物生长作用的影响目前已经证实了土壤酶活性对植物生长的生长有很大的影响，两者息息相关，植物不同生长时期其土壤酶活也存在差异，在植物萌发、开花、抽穗等生长旺盛时期其土壤酶活的变化较大。在菜园地土壤中，黄瓜的产量与磷酸酶、转化酶和过氧化氢酶呈正相关性（王慧敏等，2005）。测定不同季节土壤酶活和植物生长研究表明,水解酶类在不同的季节在土壤中的含量存在显著的差异性，在冬天处于一个较低水平，开春后逐渐上升，到了夏天和秋天达到顶峰，酶活含量最高，同时指出该酶的含量还与土壤采集的深浅有关，有土壤采集深度呈负相关性（滕晓慧等，2006）。1.5本研究的目的和意义木麻黄青枯病是木麻黄的一种毁灭性病害，是影响木麻黄生产健康稳定发展的主要因素之一，关于该病害的防治，目前主要以选育抗病品种为主（米兴旺等，2014）。本文通过室内盆栽和田间试验，测定木麻黄不同品系对青枯病的抗病性，并对部分抗（感）病品系的室内外生长特性、微生物数量及根际酶活等进行测定，以期筛选出抗病性强、生长特性好的优良木麻黄抗性品系，为木麻黄抗青枯病品系（种）选育及优良木麻黄抗性品系（种）的推广应用等提供理论与实践的依据。5 木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定2.材料与方法2.1供试材料2.1.1供试木麻黄品系供试木麻黄各品系植株均由湛江市林业科学研究所提供。2.1.2供试培养基TTC培养基：蛋白胨10g，酪朊水解物1g，葡萄糖5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值调节到约7.5左右，分装，121℃灭菌20min。灭菌后当冷却至55℃左右加入已灭菌的1%的TTC（2，3，5–氯化三苯基四氮唑）水溶液其浓度为0.005%，最终pH值为7.0左右。用于青枯病菌分离。改良Kelman培养基：葡萄糖10.0g，蛋白胨10.0g，水解酪蛋白5.0g琼脂12.0g，水1000ml。用于细菌培养。NA培养基：牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml。用于细菌培养。CPG培养基:蛋白胨10g，水解酪蛋白1g，葡萄糖5g，蒸馏水1000ml用于细菌培养。PDA培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL。用于真菌分离。2.2木麻黄青枯病菌的分离与鉴定2.2.1标本采集分别从吴川、东海岛、徐闻、五一农场等雷州半岛木麻黄主要种植区采集发病植株，挖取木质部呈黑褐色或水渍状根系，记录时间和地点，并立即带回实验室进行分离。2.2.2病原菌的分离采用组织分离法分离：切取根作分离材料,先清洗干净，70％的酒精消毒10s，置于0.1％升汞溶液中消毒30s,无菌水清洗3次，再将清洗好的病组织剪成5mm×5mm组织块，倒入适量无菌水，浸泡15min～20min，用接种环沾取细菌悬浊液在TTC培养基上划线。30℃条件下2d后观察。挑取单菌落进行纯化，菌株经斜面NA培养基生长后,置于4℃冰箱中或挑取单菌落菌株放入装有6ml灭菌水的试管中,室温保存备用。2.2.3青枯病菌特异性引物鉴定病原菌DNA提取:取1.5ML离心管，加入200μl双蒸水，加入1μl1MNaOH和2.5μlSDS（2%）在无菌操作台内用接种环刮取已活化的青枯菌单菌落于管中混匀，100℃煮沸15min。6 广东海洋大学硕士学位论文病原菌特异性引物分析：以青枯菌特异性引物（Sealetal.1993）进行PCR扩增，引物序列为：OLI1:(5’GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC3’)/Y2:(5’CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT3’)，引物由上海生工生物技术有限公司合成。PCR反应体系：25μl体系，18.7μl，ddH2O；2.5μl10×Buffer；0.5μl2mmol/LdNTPs；1μl10μmol/L特异性引物；0.3μl2.5UTaq酶；1μl模板DNA。PCR反应条件：PCR循环参数为，96℃，预变性1min；进入96℃30s，70℃30s，72℃1min，共2个循环；然后进入94℃30s，70℃30s，72℃1min，共33个循环；最后72℃延伸5min。以DLMarker2000为标准分子量，PCR扩增产物采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，在Bio-Rad凝胶成像系统下观察并记录结果。将扩增产物送至上海生工生物技术有限公司进行测序，将获得的序列经BLAST与GenBank的核酸序列库中已知青枯菌16SrRNA序列进行同源性比较，以判断所分离得到的菌株是否为青枯菌。2.2.4病原菌致病力测定2.2.4.1试验材料选用健康、生长势一致（30mm左右）的木麻黄A8无性系为供试苗木，对分离鉴定的木麻黄菌株进行致病性评价。2.2.4.2菌液的制备各菌株在TTC固体培养基上活化24h，挑取单菌落接种于CPG培养基，在30℃，180r/min的条件下摇床培养32h。用无菌水配成浓度2.7×109cfu/ml（平板计数法）的菌悬液。2.2.4.3致病力测定方法接种方法分别采用浸泡法和切根法，在室内盆栽条件下，对分离的病原菌于盆栽接种进行致病力测定。小苗盆栽浸泡法：根据移栽浸根法（尹贤贵等,2005）加以改进，抖落苗木土壤，洗净根部，除去基部黄化叶片，剪去1/3根系，浸入细菌悬浮液中30min，后种植到花盆中。每个处理6盆，每盆种植5株，无菌水作对照。种植后每天浇水保持盆内湿润，昼夜温度为28-35℃，相对湿度80%以上。小苗盆栽切根法：不拔出苗，在花盆中伤根，每株/15ml菌液，每个处理6盆，每盆种植5株，无菌水作对照。种植后每天浇水保持盆内湿润，昼夜温度为28-35℃，相对湿度80%以上。接种后每天观察并记录症状。每天观察记录植株发病情况，第14天进行数据统计分析,以株为单位调查，记录病株数和病情指数。病情指数=100×∑（病级株数×各级代表值）/(株数总和×最高级代表值)。7 木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定2.3木麻黄品系对青枯病的抗（感）病性室内测定2.3.1试验材料选用2.2中较强致病力青枯菌株W6为供试菌株，对广东省湛江市林科所提供的75个供试木麻黄无性系品系（表3-2）进行室内抗（感）病性评价。2.3.2抗性测定方法2.3.2.1菌液的制备W6菌株在TTC培养基上活化培养48h后，挑选单菌落接种到CPG液体培养基中30℃、180r/min摇床32h。培养液用无菌水配成浓度2.7×109cfu/ml（平板计数法）菌悬液用于盆栽接种。2.3.2.2抗性测定方法采用小苗盆栽浸泡法（见2.2.4.3）进行测定。2.3.2.3木麻黄青枯病病情严重度分级标准木麻黄青枯病植株病情严重度分级标准（根据Yamazaki（2001），有所以改进）：0级：接种后木麻黄正常生长，无发病症状；1级：接种后木麻黄植株生长缓慢但保持绿色，植株萎蔫；2级：接种后的木麻黄1/3小枝发黄症状，并伴有部分小枝脱落；3级：接种后的木麻黄2/3小枝发黄,根部、茎部发黑，小枝大部分脱落；4级：植株死亡。2.3.2.4木麻黄对青枯病抗性分级标准木麻黄青枯病植株病情严重度分级标准（许秀玉（2017）；有所改进）：高抗HR：病情指数0-30中抗MR：病情指数30-50中感MS：病情指数50-70高感HS：病情指数70-1002.4木麻黄部分抗（感）品系室内与室外生长特性等调查测定2.4.1木麻黄室内生长特性测定根据2.3结果，选择对青枯病抗性较强的木麻黄品系11、10、B2、B8和感病品系A8、5等分别移栽于室内试验田，分别于移栽后30、120天记录上述植株的株高、茎粗、围宽等，并计算生长速率。2.4.2木麻黄室外生长特性调查室外小区测试在东海岛种植示范区进行，每品系2个重复（小区），每小区植木麻黄100株，种植行距为50cm×120cm。采用随机取样方法，每小区取样5株，对木麻黄各品系生长状况（株高、茎粗等）等进行田间实地现场调查，同时8 广东海洋大学硕士学位论文取样品植株根际土壤，带回实验室，用于微生物含量及土壤酶活测定。2.5木麻黄根内、根际土壤细菌和真菌的测定2.5.1室内移栽木麻黄根内、根际土壤细菌和真菌的测定2.5.1.1样品采集方法分别于移栽后90d选取生长基本相同的植株，每个品种随机选取5株将其挖出,轻轻抖动根际土于自封袋,并将5株木麻黄的样品土混匀。将土壤分成两份，一份鲜土测微生物菌量，一份测土壤酶活。2.5.1.2稀释方法土样稀释方法：称取10g鲜土置于己灭过菌的装有90ml无菌水三角瓶中，然后置于摇床中30℃、180rpm恒温振荡10min，取菌液lml按10-1-10-3梯度进行稀释，待用。样品稀释方法：取5g样品，洗净，3％的次氯酸钾浸泡5min，用无菌水冲洗三次，剪碎，置于己灭过菌的碾钵，加入定量的无菌水研磨，共加入45ml，静置20min，将取菌液混匀，取lml按10-1-10-3梯度进行稀释，待用。2.5.1.3细菌与真菌培养根际土壤细菌、真菌分别采用牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基，计数均采用稀释涂抹平板法。由于土样为沙土，微生物较少，稀释浓度相对较高，从10-1和10-3稀释梯度中分别吸取200ul土壤悬液打在细菌的牛肉膏蛋白胨培养基上用涂布器均匀涂布，置于30℃恒温培养箱中培养3d后计数。从10-3稀释梯度中吸取200ul土壤悬液打在PDA培养基上用涂布器均匀涂布，其中，培养基高温灭菌后，待温度降到50～60℃时，每200ml培养基中加入浓度为1%的链霉素60ul，以抑制细菌的生长，置于28℃恒温培养箱中培养4d后计数。进而得出每克干土中的微生物数量。2.5.2室外木麻黄根内、根际土壤细菌和真菌的测定参见2.5.1.3细菌与真菌培养。2.6根际土壤酶活的测定参考徐文静（2014）的土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶和过氧化氢酶酶活测定方法。9 木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定3结果与分析3.1病原菌分离鉴定3.1.1菌株分离结果从木麻黄病株体内共分离获得71个分离物（见表3-1），其中吴川34株、东海岛13株、徐闻15株、五一农场5株、林科所和遂溪各2株。表3-1雷州半岛不同种植区木麻黄青枯病菌分离结果Table3-1TheresultsoftheisolationofthepathogenofCasuarinaequisereaindifferentgrowingareasofLeizhouPeninsula菌株号来源菌株号来源菌株号来源菌株号来源W1吴川W4-2吴川D3东海岛XW8徐闻林场W1-1吴川W4-3吴川D4东海岛XW9徐闻林场W1-2吴川W4-4吴川D5东海岛XW10徐闻林场W1-3吴川W5吴川DH1东海岛XH1徐闻黄塘W1-4吴川W6吴川DH2东海岛XH2徐闻黄塘W1-5吴川W7吴川DH3东海岛XH3徐闻黄塘W2吴川W8吴川DH4东海岛XH4徐闻黄塘W2-1吴川W9吴川DH5东海岛XH5徐闻黄塘W2-2吴川W10吴川DH6东海岛五—1五一农场W2-3吴川W11吴川DH7东海岛五—2五一农场W2-4吴川W12吴川DH8东海岛五—3五一农场W3吴川W13吴川XW1徐闻林场五—4五一农场W3-1吴川W14吴川XW2徐闻林场五—5五一农场W3-2吴川W15吴川XW3徐闻林场MP-1林科所W3-3吴川W16吴川XW4徐闻林场MP-2林科所W3-4吴川W17吴川XW5徐闻林场S1遂溪W4吴川D1东海岛XW6徐闻林场S2遂溪W4-1吴川D2东海岛XW7徐闻林场3.1.2青枯病菌特异性引物鉴定结果以引物OLI1/Y2为特异性引物，对71个菌株进行PCR扩增，结果表明,只有DH8、W1、W3、W6、W11、W12、W14、W17等8个菌株扩增出了大小为260bp左右的青枯病菌特异性条带，说明这8菌株可能为青枯病的致病病原菌,电泳结果如图3-1。结合致病力测定结果，W6菌株与数据库中Ralstoniasolanacearum菌株（登录号为KM253164.1）的同源性达95%，结合菌落培养特征，确定W6菌株为青枯菌。10 广东海洋大学硕士学位论文图3-1部分青枯菌特异性PCR扩增结果Fig.3-1Partialbacterialwilt-specificPCRamplificationresults3.1.3菌株致病力测定与接种方法比较为验证上述8个菌株对木麻黄的致病力，以木麻黄A8品系为供试植株，对其致病性进行了室内测定，结果表明（表3-2），8个菌株对木麻黄A8品系均有致病性，但不同接种方法及不同菌株对A8品系的致病力有所不同，其中以来自吴川的W6菌株的致病力最强，浸泡和切根法接种后发病株率和病情指数均为100%和100；以来自东海岛的D5菌株的致病力最弱。表3-2木麻黄青枯病菌对A8品系致病力室内测定结果Table3-2TheresultsofindoorpathogenicitytestofCausaleriaequisetumagainstA8strain菌株号来源接种方法发病率（%）病情指数浸泡100100W6吴川切根100100浸泡100100W14吴川切根10097.2浸泡10097.2W17吴川切根66.758.3浸泡10091.7W3吴川切根66.758.3浸泡10097.2W12吴川切根66.761.1浸泡10094.4W11吴川切根33.321.2浸泡77.875.0W1吴川切根55.652.8浸泡10097.2DH8东海岛切根88.975.0由表3-2可以看出，上述8个菌株中，7个菌株来源于吴川，这与吴川地区的木麻黄青枯病发病情况严重相符；来源于吴川的菌株有7个，分别表现为不同11 木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定程度的致病性，说明不同地区来源、甚至是同一地区来源于不同地块的青枯病菌株在致病性上存在较大差异。另外，由表3-2还可以看出，接种方法不同，菌株的致病力也有所差异，同一品系用切根法接种多表现为致病力相对较弱，而浸泡法接种表现致病力相对较强。因此，本文认为在品系抗病性测定时，以浸泡法接种法效果较好，本文在以下品系抗性测定中均采用该接种方法进行。3.2不同木麻黄品系抗性评价3.2.1不同木麻黄品系室内抗性评价根据3.1.3结果，采用木麻黄小苗盆栽浸泡法，以W6菌株对广东省湛江市林科所提供的木麻黄种质资源开展青枯病的抗性测定与评价，结果表明（表3-3），不同木麻黄品系对青枯病的抗（感）病性存在明显差异，在供试的77个木麻黄品系中,无高抗青枯病品系，中抗品系8个(10、11、B2、B5、B8、B12、C6和江洪2)，中感品系5个（12、B6、B16、北海4和湛霞3），其余64份为高感品系。表3-3不同木麻黄品系对青枯病抗病性室内测定结果Table3-3ResultsofindoordeterminationresultsofresistanceagainstbacterialwiltindifferentCasuarinaequisetumstrains品系来源病情指数抗性分级B5广西北海银滩42.4MR10广西北海银滩44.4MRB8广西北海银滩44.6MR11广西北海银滩45MRB2广西北海银滩47.6MRB12广西北海银滩47.8MRC6广西北海银滩48.7MR北海4广西北海银滩53.8MS江洪2湛江遂溪江洪镇54MSB6广西北海银滩62.5MSB16海南文昌市62.5MS12广西北海银滩63MS湛霞3湛江霞山区68.8MS北海6广西北海银滩71.3HSB21海南文昌市71.9HS24广西北海银滩73HSB1广西北海银滩74.2HS北海8广西北海银滩76.7HS12 广东海洋大学硕士学位论文续表3-3品系来源病情指数抗性分级C2海南文昌77.5HS2广西北海银滩79.2HS19广西北海银滩79.3HS北海7广西北海银滩79.7HSB18海南文昌市80.3HS湛霞1湛江霞山区80.8HSB13广西北海银滩82.1HS20广西北海银滩82.3HSB14海南文昌市82.5HS6广西北海银滩82.8HSC3海南文昌83HS涠洲1广西北海涠洲岛83.3HS涠洲2广西北海涠洲岛84.1HS601湛江林科所92.2HS9广西北海银滩92.2HS涠洲3广西北海涠洲岛93HS21广西北海银滩93HS湛霞5湛江霞山区93.2HSC1海南文昌93.2HS江洪4湛江遂溪江洪镇94HS湛霞4湛江霞山区94.2HSC10广西北海银滩94.2HS701湛江林科所94.4HS江洪5湛江遂溪江洪镇94.7HS东里6湛江雷州95.2HS14广西北海银滩95.2HSB9广西北海银滩95.7HS13广西北海银滩95.7HS江洪6湛江遂溪江洪镇95.8HSC5广西北海银滩95.8HS涠洲4广西北海涠洲岛96.2HS江洪3湛江遂溪江洪镇97.4HS江洪1湛江遂溪江洪镇97.4HSB7广西北海银滩97.6HS23广西北海银滩98HSC9广西北海银滩98.1HS涠洲7广西北海涠洲岛99HSB19海南文昌市100HSB17海南文昌市100HS13 木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定3.2.2不同木麻黄品系田间死亡率调查东海岛田间示范小区现有木麻黄品系死亡率调查结果表明(表3-4)，不同木麻黄品系其田间死亡率具有较明显的差异，北海1死亡率较高，最高达65％，北海2次之，最高死亡率为54％，B2、B8、B12和B14相对死亡率较低，B2最低死亡率仅有4％。说明在同一环境下，各品系生存能力大有不同，B2、B8、B12和B14生存能力较强。本文的死亡率调查是指木麻黄品系在自然条件下的死亡率，木麻黄死亡原因可能是青枯病，也有可能是干旱。结合表3-2结果结果可以看出，表现为抗病的品系其田间死亡率相对较低，而感病的品系其田间死亡率相对较高，说明品系的抗病性与其抗逆性可能有一定的相关性。抗性品系B2、B8和B12测定结果较好，其中B2的病情指数和室外死亡率分别为48.6和10.9%，B8的病情指数和室外死亡率分别为44.6和13%和B12的病情指数和室外死亡率分别为47.8和14%，从病情指数和室外死亡率来看，抗性品系B2、B8和B12室外生存能力较强。表3-4东海岛不同木麻黄品系死亡率室外调查结果Table3-4OutdoorsurveyresultsofresistanceofdifferentCasuarinaequisetumspeciesinDonghaiIsland品系抗性分级死亡率%品系抗性分级死亡率%北海2HS36.8B12MR14.0北海1HS36.7B14HS14.0北海3HS29.0B8MR13.0A8-24.0北海4MS12.0银海10-22.3B2MR10.9银海8-17.83.3木麻黄抗（感）病品系生长特性测定3.3.1木麻黄抗（感）病品系生长特性室内测定室内不同木麻黄品系的株高、茎粗和树围等生长特性测定结果见表3-5和表3-6，在测定的6个品系中，120天的株高由高到低为A8﹥B2﹥B12﹥5﹥10﹥11，生长速率由高到低为A8﹥B2﹥B12﹥5=10﹥11，品系A8的株高和生长速率最高（快），分别为29.26cm、0.20cm/d，其次为B2和B12品系，其株高和生长速率分别为26.52cm、0.17cm/d和24.75cm、0.15cm/d；结合品系的抗病性表现可以看出，B2和B12品系的抗病性较强，其株高和生长速率也表现较好。茎粗由大到小为10﹥B2﹥B12﹥5﹥11﹥A8，生长速率由高到低为10﹥B2=B12﹥5﹥11﹥A8，其中以10的茎粗和生长速率最大（快），分别为2.69mm和0.015mm/d，品系B2和B12次于品系10，茎粗分别为2.58mm、2.56mm，生长速率均为0.014mm/d；结合品系的抗病性表现可以得出，B2和B1214 广东海洋大学硕士学位论文品系的抗病性较强，其茎粗和生长速率也表现较好。表3-5木麻黄抗（感）病品系株高、茎粗室内测定结果Table3-5IndoortestresultsofplantheightandstemdiameterofdifferentCasuarinaequisetumstrains株高cm茎粗mm抗病性品系表现生长速生长速30d120d30d120d率cm/d率mm/d10中抗11.65±0.42a22.50±0.87b0.121.32±0.04a2.69±0.14a0.01511中抗11.91±0.35a19.86±0.66c0.091.31±0.08a1.93±0.09c0.007B2中抗11.30±0.23b26.52±0.680.171.30±0.05a2.58±0.13b0.014B12中抗11.20±0.38b24.75±0.48b0.151.30±0.03a2.56±0.12b0.014A8高感11.40±0.46b29.26±1.02a0.201.30±0.04a1.84±0.09c0.0065高感11.70±0.62a22.51±0.54b0.121.30±0.05a2.13±0.09b0.009树围直径为树围东西向和南北向直径，取其均值，测定结果说明（表3-6）树围直径由大到小为10﹥B12﹥5﹥B2﹥A8﹥11，生长速率由高到低为10﹥B12﹥5﹥B2﹥A8﹥11，品系10的树围直径和生长速率最大（快），分别为28.10cm、0.31cm/d，品系B12仅次于品系10；其树围直径和生长速率分别为27.69cm和0.23cm/d；结合品系的抗病性表现可以看出，B12品系的抗病性较强，其树围直径和生长速率也表现较好。表3-6木麻黄抗（感）病品系树围室内测定结果Table3-6IndoortestresultsoftreegirthofdifferentCasuarinaequisetumstrains树围直径cm抗病性品系表现30d120d生长速率cm/d10中抗8.96(7.24-9.91)±0..78a28.10(24.70-31.50)±1.96a0.3111中抗7.76(7.21-7.88)±0.21a19.66(17.52-24.8)±2.16bc0.12B2中抗7.40(4.54-10.20)±1.63a25.05(20.52-29.54)±2.61ab0.19B12中抗8.86(6.17-9.64)±0.99a27.69(24.73-28.65)±1.19ab0.23A8高感7.05(6.42-9.36)±0.89a17.43(15.20-21.65)±1.89c0.105高感8.06(7.28-8.40)±0.33a25.77(20.78-30.14)±2.703ab0.213.3.2木麻黄抗（感）病品系生长特性室外测定东海岛不同木麻黄品系田间生长特性（株高、茎粗和树围）调查结果表明(表3-7)，在调查的9个品系中，株高由高到低为A8﹥B14﹥B12﹥北海4﹥北海315 木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定﹥B2﹥B8﹥北海2﹥北海1。品系A8、B14株高较高，分别为90.87cm、90.80cm；品系B12株高为68.62cm，虽然低于感病品系B14，但在抗病品系中，其株高表现较好。茎粗由大到小为B14﹥B8﹥B2﹥A8﹥B12﹥北海3﹥北海2﹥北海4﹥北海1，品系B14茎粗最粗，达10.79mm；品系B8和B2次于B14，其茎粗分别为7.67mm、7.54mm；结合品系的抗病性表现可以得出，B8和B2品系的抗病性较强，其茎粗表现较好。树围直径由大到小为B14﹥B2﹥B8﹥B12﹥北海4﹥北海2﹥北海1﹥北海3﹥A8。品系B14树围直径最大，为51.55cm；品系B2、B8和B12的树围直径小于B14的树围直径，其品系树围直径分别为42.90cm、40.18cm和33.32cm；结合品系的抗病性表现可以得出，B2、B8和B12品系的抗病性较强，其茎粗表现较好，其中B2茎粗在抗性品系表现最好。表3-7东海岛不同木麻黄品系生长特性室外测定结果Table3-7OutdoortestresultsofgrowthcharacteristicsofdifferentCasuarinaequisetumstrainsinDonghaiIsland.抗病性品系株高cm茎粗mm树围直径cm表现B2中抗59.78±1.68c7.54±0.55b42.90(41.00-43.80)±2.77aB8中抗56.73±1.42cd7.67±0.23b40.18(35.60-42.75)±1.81bB12中抗68.62±1.20b6.95±0.47bc33.32(31.64-37.80)±2.24abA8高感90.87±2.45a7.14±0.49b23.88(22.76-24.6)±1.78bB14高感90.80±2.47a10.79±0.66a51.55(45.80-58.30)±2.91a北海1高感50.22±1.39e5.53±0.33bc27.77(24.48-30.06)±1.27c北海2高感56.71±1.55cd6.18±0.36bc27.82(24.08-31.55)±1.99b北海4高感66.24±2.4b5.65±0.13bc28.99(26.33-31.64-)±1.14c北海3高感61.41±1.23c6.33±0.28bc25.21(24.37-27.95-)±1.08c综合品系室内外生长特性及抗病性测定结果，可以看出，B2和B12两品系不仅对青枯病的抗性较好（中等抗性），且室内外生长特性也表现良好，显示出该2个品系具有较好的推广应用潜力。3.4木麻黄抗（感）病品系根内与根际土壤微生物数量测定3.4.1室内微生物数量测定结果3.4.1.1室内细菌数量测定结果木麻黄抗（感）病品系细菌数量室内测定结果表明（表3-8），不同木麻黄品系其根内细菌菌量存在较大差异，其细菌菌量为B2﹥11﹥10﹥B12﹥A8﹥5，其中以抗病品系B2的根内细菌数量最大，达26.40×105cfu/g，抗病品系11、1016 广东海洋大学硕士学位论文和B12次之，感病品系A8和5的根内细菌数量较小。可见抗性品系根内细菌菌量明显大于感性品系。根际土壤细菌菌量测定结果（表3-8）为10﹥11﹥B2﹥B12﹥A8﹥5，其中以抗病品系10根际土壤细菌数量最大，达30.33×105cfu/g，其次为抗性品系11、B2、B12，而感病品系A8和5的根际土壤细菌数量较小。可见，抗感病品系根际细菌数量的表现与根内数量测定结果基本相似。表3-8木麻黄根内、根际土壤微生物数量室内测定结果Table3-8IndoortestresultsoflaboratorymeasurementsofmicrobialnumberinrootsandrhizospheresoilsofCasuarinaequisetum根内微生物数量根际土壤微生物数量抗病性品种表现细菌×105cfu/g真菌×103cfu/g细菌×105cfu/g真菌×103cfu/g10中抗25.99±0.76a9.67±0.06de30.33±0.38a14.67±0.39d11中抗26.37±0.50a10.50±0.65cd29.67±0.38a13.67±1.35dB2中抗26.40±1.19a8.83±0.13e29.00±1.21ab14.53±0.47dB12中抗24.95±0.34a11.57±0.63c26.00±1.16b16.97±0.69aA8高感16.62±0.49b25.27±0.24a17.67±1.16c30.70±0.42a5高感14.67±0.04b16.1±0.13b14.67±1.36c23.63±0.54b对比根内、根际土壤细菌数量测定结果，根际土壤细菌数量大于根内细菌数量。无论根内细菌还是根际土壤细菌，均表现为抗病品系的细菌菌量大于感病品系的细菌菌量。说明木麻黄品系的抗（感）病性对其根内、根际土壤细菌的菌量有较大的影响，品系抗病性强其细菌含量则大，反之则小。3.4.1.2室内真菌数量测定结果木麻黄抗（感）病品系根内真菌数量室内测定结果表明（表3-8），不同木麻黄品系其根内真菌菌量有所差异。测定结果表明，根内真菌菌量为A8﹥5﹥B12﹥11﹥10﹥B2。感病品系A8的根内真菌数量最大，为25.27×103个/g；感病品系5的根内真菌数量仅次于感病品系A8，其余抗病品系的根内真菌数量较小；抗病品系B2的根内真菌数量最小，为8.83×103个/g。根内真菌菌量与根内细菌菌量结果相反，感病品系的菌量大于抗病品系的菌量。根际土壤真菌菌量为A8﹥5﹥B12﹥10﹥B2﹥11。感病品系A8的根际土壤真菌数量最大，高达30.70×103个/g；感病品系5的根际土壤真菌数量仅次于感病品系A8，其余抗病品系的根际土壤真菌数量较小；抗病品系11的根际土壤真菌数量最小，为13.67×103个/g。感病品系的菌量大于抗病品系的菌量。根际土壤真菌大于根内真菌。无论根内真菌还是根际土壤真菌，均表现为抗病品系的细菌菌量大于感病品系的细菌菌量，说明木麻黄品系的抗（感）病性对17 木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定其根内、根际土壤真菌的菌量也有较大的影响，品系抗病性强其真菌含量则小，反之则大。3.4.2室外微生物数量测定结果3.4.2.1室外细菌数量测定结果东海岛木麻黄抗（感）病品系根内、根际土壤细菌数量室外测定结果表明（表3-9），与室内测定结果基本相似，结果表明，内生细菌菌量表现为B8﹥B12﹥601﹥B2﹥A8，抗病品系B8的根内细菌数量最大，达到了28.00×103cfu/g；抗病品系B12的根内细菌数量低于B8，高于601和B2；感病品系A8的根内细菌数量最小。抗病品系的细菌菌量大于感病品系的细菌菌量。根际土壤细菌菌量为B8﹥B2﹥B12﹥601﹥A8，感病品系B8的根际土壤细菌数量最大，达到了189.67×103cfu/g；抗病品系B2的根际土壤细菌数量低于B8，高于B12；感病品系601和A8的根际土壤细菌数量较小，各品系间的根际土壤细菌数量差距较大。抗病品系的细菌菌量大于感病品系的细菌菌量。对比室外根内、根际土壤细菌数量，其趋势与室内测定结果基本相似，均表现为抗病品系的细菌菌量大于感病品系的细菌菌量。进一步证明木麻黄品系的抗（感）病性对其根内和根际土壤细菌菌量有较大的影响，品系抗病性强其细菌含量则大，反之则小。表3-9东海岛木麻黄根内、根际土壤微生物数量测定结果Table3-9OutdoortestresultsoflaboratorymeasurementsofmicrobialnumberinrootsandrhizospheresoilsofCasuarinaequisetumninDonghaiIsland根内微生物根际土壤微生物抗病性品种表现细菌×103cfu/g真菌×104cfu/g细菌×103cfu/g真菌×104cfu/gB2中抗19.67±0.52c47.47±0.59c133.67±0.58b52.93±0.46cB8中抗28.00±0.39a45.47±0.27cd189.67±2.31a40.13±0.27eB12中抗26.34±0.96a44.67±0.39d116.33±0.58c43.07±1.69dA8高感14.00±0.58d77.74±1.17a91.67±0.77e90.93±1.50a601高感22.00±0.70b52.27±1.1b103.00±0.39d69.33±0.38b3.4.2.2室外真菌数量测定结果东海岛木麻黄抗（感）病品系根内、根际土壤真菌数量室外测定结果表明（表3-9），与室内测定结果基本相似。测定结果表明，根内真菌菌量表现为A8﹥601﹥B2﹥B12﹥B8，感病品系A8的根内真菌数量最大，为77.74×104个/g；其次为感病品系601；其余抗性品系根内真菌数量较小，其中抗病品系B12的根内真菌数量最小，为44.67×103个/g。抗病品系的真菌数量小于感病品系的真菌数量。根际土壤真菌菌量为A8﹥601﹥B2﹥B8﹥B12。感病品系A8的根际土壤真18 广东海洋大学硕士学位论文菌数量最大，达90.93×104个/g；其次为感病品系601；其余抗性品系根内、根际土壤真菌数量较小，其中抗病品系B8的根际土壤真菌数量最小，为40.13×104个/g。抗病品系的真菌菌量小于感病品系的真菌菌量。对比室外根内、根际土壤真菌数量，其趋势与室内测定结果基本相似，均表现为抗病品系的真菌菌量小于感病品系的真菌菌量。进一步证明木麻黄品系的抗（感）病性对其根内和根际土壤真菌菌量有较大的影响，品系抗病性强其真菌含量则小，反之则大。3.5木麻黄抗（感）病品系根际土壤酶活性室内、室外测定3.5.1室内根际土壤酶活性测定结果木麻黄抗（感）病品系根际土壤酶活室内测定结果见表3-10，不同木麻黄品系其根际土壤不同酶的酶活不同。脲酶活性为11>B12>10>B2>5>A8。抗病品系11的脲酶活性最高，为0.0933mg·g-1；其次为抗病品系B12、10和B2；感病品系5和A8的脲酶活性较低。蔗糖酶活性为11>10>B2>B12>5>A8。抗病品系11的蔗糖酶活性最高，为1.6873mg·g-1；其次为抗病品系10、B2和B12；感病品系5和A8的蔗糖酶活性较低。表3-10木麻黄抗（感）病品系根际土壤酶活性室内测定结果Table3-10IndoortestresultsofenzymeactivitiesinrhizosphereofdifferentCasuarinaequisetumstrains脲酶蔗糖酶酸性磷酸酶过氧化氢酶品抗病性UraseInvertaseAcidphosphataseCatalase系表现(mg·g-1)(mg·g-1)(mg·g-1)(ml·g-1)10中抗0.0933±0.0006bc1.6873±0.0006a1.5573±0.0046a3.3577±0.0041a11中抗0.0977±0.0012a1.6877±0.0012a1.5543±0.0173a3.3553±0.0151aB2中抗0.0897±0.0006c1.6867±0.0030a1.5487±0.0006a3.3453±0.0092aB12中抗0.0957±0.0014ab1.6837±0.0046a1.5617±0.0004a3.3497±0.0029aA8高感0.0773±0.0013d1.6793±0.0017a1.5117±0.0012b3.2697±0.0023b5高感0.0787±0.0023d1.6827±0.0046a1.5230±0.0017b3.2830±0.0103b酸性磷酸酶活性为B12>10>11>B2>5>A8。抗病品系B12的酸性磷酸酶活性最高，为1.5617mg·g-1；抗病品系10、11和B2的酸性磷酸酶活性低于11；感病品系5和A8的酸性磷酸酶活性较低。过氧化氢酶活性为10>11>B12>>5>A8。抗病品系10的过氧化氢酶活性最高，为3.3577mg·g-1；其次为抗病品系11、B12、B2；感病品系5和A8的过氧化氢19 木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定酶活性较低。由表3-10可以看出，抗病品系的脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶等土壤酶活均大于感病品系的相对应酶活。说明木麻黄品系的抗（感）病性对其根际土壤酶活性有较大的影响，品系抗病性强其酶活性较高，反之则较低。3.5.2室外根际土壤酶活性测定结果对东海岛木麻黄抗（感）病品系根际土壤酶活室外测定结果见表3-11，不同木麻黄品系其根际土壤不同酶的酶活不同。脲酶活性为B8>B2>B12>601>A8，抗病品系B8脲酶活性最高，为0.0647mg·g-1；其次为抗病品系B2、B12，感病品系601和A8的过氧化氢酶活性较低。蔗糖酶活性为B8>B2>B12>601>A8，抗病品系B8蔗糖酶活性最高，为1.4513mg·g-1；抗病品系B2、B2的蔗糖酶活性低于B8，感病品系601和A8的过氧化氢酶活性较低。表3-11东海岛木麻黄抗（感）病品系根际土壤酶活性测定结果Table3-11OutdoortestresultsofenzymeactivitiesinrhizosphereofdifferentCasuarinaequisetumstrainsinDonghaiIsland脲酶蔗糖酶酸性磷酸酶过氧化氢酶品抗病性UraseInvertaseAcidphosphataseCatalase系表现(mg·g-1)(mg·g-1)(mg·g-1)(ml·g-1)B2中抗0.0623±0.0028a1.4500±0.0034a1.0057±0.0064a2.5510±0.0050aB8中抗0.0647±0.0034a1.4513±0.0026a0.9863±0.0058a2.5603±0.0042aB12中抗0.0620±0.0019a1.3810±0.0023a0.9849±0.0042a2.4733±0.0068aA8高感0.0457±0.0020b1.1343±0.0032b0.9729±0.0062b2.2870±0.0026b601高感0.0593±0.0023b1.3413±0.0037b0.9566±0.0065b2.2550±0.0036b酸性磷酸酶活性为B2>B8>B12>A8>601。抗病品系B2酸性磷酸酶最高，为1.0057mg·g-1；其次为抗性品系B8、B12，感病品系A8和601的过氧化氢酶活性较低。过氧化氢酶活性为B8>B2>B12>A8>601，抗病品系B8过氧化氢酶活性最高，为2.5603ml·g-1；抗病品系B2、B12的过氧化氢酶活性低于B8；感病品系A8和601的过氧化氢酶活性较低。由表3-11可以看出，抗病品系的脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶等土壤酶活均大于感病品系的相对应酶活。说明木麻黄品系的抗（感）病性对其根际土壤酶活性有较大的影响，品系抗病性强，酶活性高，品系抗病性低，酶活性低。20 广东海洋大学硕士学位论文4.结论与讨论4.1主要研究成果通过对木麻黄不同品系抗病性测定及抗（感）病品系生长特征、根内与根际微生物数量和土壤酶活等测定，主要获得如下结果：⑴木麻黄青枯病菌分离与致病性测定结果表明，雷州半岛不同木麻黄种植区其青枯病菌的致病性存在较大差异，同一种植区不同地块木麻黄青枯病菌的致病性也有所不同。其中以来自吴川木麻黄青枯病菌W6菌株的致病性强，来自东海岛的D5菌株的致病力最弱。⑵室内抗青枯病测定结果表明，供试的77个木麻黄品系中，未发现高抗青枯病品系，中抗品系8个(10、11、B2、B5、B8、B12、C6和江洪2)，中感品系5个(12、B6、B16、北海4和湛霞3)，其余64份为高感品系。⑶不同抗（感）青枯病木麻黄品系室内外生长特性、根内、根际微生物数量和土壤酶活等结果表明：抗病品系的株高一般比感病品系的矮，而茎粗则相反，抗病品系的茎粗一般比感病品系的粗；抗病品系根内根际细菌数量远大于感病品系的细菌数量，而真菌数量则相反，抗病品系根内根际真菌数量明显小于感病品系的真菌数量；抗病品系的根际土壤过氧化氢酶、酸性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶等酶活一般比感病品系的高。综合各品系对青枯病的抗性、生长特性、根内根际微生物数量及根际土壤酶活测定结果发现，B2和B12两品系不仅对青枯病的抗性较好（中等抗性），且室内外株高、茎粗、树围直径等生长特性均表现良好；根内根际土壤细菌数量多、真菌数量少；根际土壤的过氧化氢酶、酸性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶等酶活较高。因此，本文认为该两个品系可能具有较好的推广应用潜力。4.2讨论⑴关于木麻黄抗性品系对广东省湛江市林科所现有木麻黄种质资源开展青枯病的抗性鉴定与评价，得到中抗品系8个(10、11、B2、B5、B8、B12、C6和江洪2)。没有获得高抗品系，且感病品系数量较多，这与室外木麻黄青枯病病情严重的现状相符。郑惠成等采用室内盆栽人工接种筛选的方法，初步筛选出P7-35、P10-1等8个抗病性较强的木麻黄优良无性系（郑惠成等，1991）。彭国强等的在抗病无性系选育试验中，筛选获得了601和701对青枯病具有显著抗性的品系（彭国强等，2000）。许秀玉通过盆栽试验筛选，获得X1、45、平5、30、W6、杂交、501、G1、503、41、A1及A1-312份高抗材料（许秀玉，2017）。不同木麻黄品系经抗性测定证明是存在高抗品系是存在的，但本文只测定出8个中抗品系，没有获得高抗品21 木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定系。经鉴定，木麻黄抗病无性系601和701为感病品系，许秀玉（2017）用Rs-Gl-2菌株对木麻黄品系进行抗性测定，601和701也表现为感病品系，这与桉树抗病性存在衰退的结论相一致（Coutinho,2000）。601和701抗性明显降低的原因，一方面可能与无性系退化有关，另一方面可能与青枯菌具有与植物、环境协同进化，发生变异有关，也可能可能存在W6菌株致病力较强的原因。对木麻黄种质资源进行初步抗性测定，有利于保护我国木麻黄资源，为木麻黄抗青枯病品系（种）的选育提供理论基础。⑵关于木麻黄抗（感）病品系微生物数量发现木麻黄根内、根际土壤微生物种类和数量随着木麻黄生长时间木麻黄和品种的不同而变化，室内木麻黄根内、根际土壤中微生物数量为细菌＞真菌，室外为真菌＞细菌；抗性木麻黄品系的微生物数量大于感病品系微生物数量；对青枯病具有抗性的木麻黄品系根际细菌数量均明显大于感病品种，真菌则相反。李洪连等（1998）和郑倩等（2012）研究的不同黄萎病抗性棉花品种和土壤微生物数量关系的研究结果也表现为细菌数量>真菌数量，与本文木麻黄根内、根际土壤中微生物数量为细菌>真菌的结果一致；通过室外调查，微生物数量为真菌>细菌，可能与土壤相关，室外调查地区土壤为沙土，土壤透气性较好，利于真菌生长，但有机质较少，不利于细菌的繁殖。烤烟根系微生物对黑胫病抗性关系也表现为品系抗性与真菌数量呈负相关（王戈，2012），与本文品系抗病性强其真菌含量则小的结果相似。抗性品种根际土壤微生物多样性总体优于感病品种，以往对小麦（Nealetal,1970）、水稻（Sunetal,2000）、大豆（Chenetal,2005）、棉（Lietal，1998）、西瓜（Yaoetal,2010）、黄瓜（Zhuetal,2001）甘蔗（谭燕华，2010）山核桃（生静雅，2017）等作物抗感品种间根际微生物群落结构存在差异，且抗性品种根际土壤微生物多样性总体优于感病品种，这与本文研究结果相似。研究表明，对木麻黄内生真菌的研究，发现其对宿主存在促生作用（林燕青，2015），这也解释了抗病品系比感病品系矮的原因。对不同木麻黄品系进行微生物数量测定，从微生物学角度来探索木麻黄青枯病抗性的机理，可以了解微生物菌量与木麻黄品系抗性的关系，为探索木麻黄抗性提供线索。⑶关于木麻黄抗（感）病品系根际土壤酶活对木麻黄根际土壤酶活性测定，测定结果发现室内木麻黄根际土壤酶活性高于室外木麻黄根际土壤酶活性，由于室内与田间的土壤环境不同，导致了室内外的土壤酶活性不同。不同木麻黄品系的根际土壤酶活性也存在差异，室内外抗病品系根际土壤酶活高于感病品系根际土壤酶活，品系的抗性强，土壤酶活性高，22 广东海洋大学硕士学位论文反之品系的抗性弱，土壤酶活性低。嫁接辣椒比未嫁接的辣椒的酶活性更高，其根腐病抗性更强（姜飞，2010）；赵娜等研究表明土壤蔗糖酶活性提高，可增强番茄植株对青枯病的抗病性（赵娜，2010）也侧面反映了品系的抗性强，土壤酶活性高。从酶活学角度来探索木麻黄青枯病抗性的机理，可以了解根际土壤酶活与木麻黄品系抗性的关系，为探索木麻黄抗性提供资料。4.3有待进一步研究的问题⑴本研究对不同木麻黄品系进行了抗青枯病测定，初步筛选出了8个表现中抗品系，是否具有推广价值，需进一步研究。⑵在对抗病品系抗病机制的研究中，本文只初步探索了木麻黄品系的根内、根际土壤微生物数量和根际土壤酶活与木麻黄抗病机制的关系，关于其他抗病机制还需进一步研究。23 木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定参考文献[1]AchariG,RameshR.CharacterizationofBacteriaDegrading3‐hydroxyPalmiticAcidMethylEster(3oh‐pame),aQuorumSensingMoleculeofRalstoniaSolanacearum[J].LettersinAppliedMicrobiology,2015,60(5):0-455.[2]AliMIM,AnurathaCS,SharmaJK.BacterialwiltofCasuarinaequisetifoliainIndia．EurJForestPathol,1991,21(4):234-238.[3]AyinCM,SchlubRL,Yasuhara-BellJ,etal．Identificationandcharacterizationofbacteriaassociatedwithdeclineofironwood(Casuarinaequisetifolia)inGuam.AustralasianPlantPathol,2015,44(2):225-234.[4]CoutinhoTA,RouxJ,RiedelKH,etal.FirstreportofbacterialwiltcausedbyRalstoniasolanacearumoneucalyptsinSouthAfrica.[J].ForestPathology,2010,30(4):205-210.[5]YaoH,WuF.Soilmicrobialcommunitystructureincucumberrhizosphereofdifferentresistancecultivarstofusariumwilt[J].FemsMicrobiologyEcology,2010,72(3):456-463.[6]LeiJL.ComparisonofRhizosphereBacteriaDiversityBetweenFusariumWiltResistantandSusceptibleWatermelon[J].Microbiology,2008.[7]JrNJ,AtkinsonTG,LarsonRI.Changesintherhizospheremicrofloraofspringwheatinducedbydisomicsubstitutionofachromosome.[J].CanadianJournalofMicrobiology,1970,16(3):153-8.[8]CarmonaPS.[Effectofnitrogenlevelsandplantpopulationongrainyieldandyieldcomponentsoftwoirrigatedricecultivars[Oryzasativa;Brazil]].[Portuguese][J].1976.[9]ChenH,LiX,WangJ.ChangeofmicrofloraintherhizoplaneandrhizosphereofdifferentdiseaseresistancesoybeancultivarsⅠ.Changeofmicrofioraintherhizoplaneandrhizosphereofsoybeanundernormalrotationcroppingcondition[J].PlantNutrition&FertilizerScience,2006,35(1):39-53.[10]LiH,YuanH.StudyontherelationshipbetweendiversityofmicrobesinrhizosphereandresistanceofcottoncultivarstoVerticillumdahliaeI.ThepopulationofmicrobesincottonrhizosphereandcultivarsresistanttoV.dehliae[J].ActaPhytopathologicaSinica,1998.[11]MengeshaWK,PowellSM,EvansKJ,etal.DiverseMicrobialCommunitiesinNon-aeratedCompostTeasSuppressBacterialWilt[J].WorldJournalof24 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广东海洋大学硕士学位论文微生物功能多样性的影响[J]．生态学报，2010,30(19):5327-5337.[77]周俊萍,杨本寿,代娇.植物内生菌的生物学作用及应用前景[J].曲靖师范学院学报,2016,35(3):35-40.[78]仲崇禄.木麻黄遗传变异规律的研究[D].中国林业科学研究院热带林业研究所,2000.[79]仲崇禄,白嘉雨,张勇.我国木麻黄种质资源引种与保存[J].林业科学研究,2005,18(3):345-350.[80]郑惠成.普通木麻黄抗感青枯病无性系与根瘤固氮活性及生物量关系的研究.[J].福建林业科技,1996,23(2):44-47.[81]郑惠成,林继强,高雅,等.普通木麻黄对青枯病的抗性及其生理生化机制的初步研究[J].福建林业科技,1992,(1):9-13.[82]郑惠成,林继强,高稚.普通木麻黄抗青枯病无性系的初步筛选[J].福建林业科技,1991,18(4):70-74.[83]郑倩,李俊华,危常州,等.不同黄萎病抗性棉花品种对土壤微生物数量的影响[J].新疆农业科学,2012,49(3):502-507.29 木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定致谢白驹过隙，两年的研究生学习生涯即将落下帷幕。回首这两年的求学历程，收获颇多，太多的人需要感谢。首先我要感谢老师何红教授在我学业上的指导和生活上的关心。两年来，从论文的选题、试验设计、结果分析直至撰写、定稿，导师都给予了我诸多指导和帮助。老师严谨的科研思路、实事求是的治学态度、渊博的学识和敬业精神都是我学习的楷模。在此，向他表示崇高的敬意和衷心的感谢，祝愿老师及家人永远健康快乐！其次，在论文研究过程中，特别感谢湛江市林业科学研究所的陈所长和罗副所长给与的支持，林科所黄良宙师兄和吴章丽师兄在试验样品采集和田间调查给予的帮助。衷心感谢农学院胡汉桥教授和易润华副教授对试验方案设计提出的宝贵意见。还感谢农学院林巧玲老师在试剂方面上的帮忙和支持。最后感谢孙兴涛师姐、杨定祥师兄、阳彬师兄、郭文燕同学、李光辉同学及14级的师妹们对学习和生活上的帮助。使试验能够顺利进行、结题，再次对他们表示衷心的感谢。在论文完成之际，特别向我的父母和朋友献上最崇高的谢意，是他们在我迷茫时，鼓励我，给我信心，让我坚持走下去，再次对他们表示衷心的感谢！感谢湛江市林科所对本研究的经费资助。最后，向参加本论文评阅和答辩的专家、教授、老师们致以诚挚的谢意！邱爱林2014年6月于广东海洋大学30 广东海洋大学硕士学位论文附录A室内测定与室外调查图片菌株采集剪根泡根移栽室外调查31 木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定附录BW6菌株特异性片段序列特异性引物OLI1/Y2对W6菌株扩增的基因序列（261bp）32 广东海洋大学硕士学位论文作者简介邱爱林，女，1992年生，汉族，四川内江人。2016年毕业于绵阳师范学院园林专业，获得农学学士学位；2016年9月至今，与广东海洋大学农学院攻读植物保护硕士学位。硕士期间发表论文:AilinQiu*,Yue.YUAN*,Qiaolin.LIN,Hong.HeandLili.Liu.FirstReportofLeafSpotCausedbyNeofusicoccummangiferaeonSonneratiaapetalainChina.(待见刊)33 木麻黄抗青枯病品系筛选及其生长特性测定导师简介何红，男，博士，植物病理学专业教授，硕士生导师，广东省第四批高校“千百十工程”省级重点培养教师，兼任中国农业微生物学会微生物生物技术分会理事、广东省植物保护学会理事、广东省植物病理学会理事。主要研究方向：植物病害生物防治、海洋微生物资源与活性物质、海洋环境生物修复等。主持广东省自然科学基金、广东省科技攻关，参加完成86”计划、国家自然科学基金等科研项目多项，获国家发明专利1项，获省部级科技进步奖2项，通过鉴定成果2项，发表论文50多篇，其中SCI收录6篇。34