《南方水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白的原核表达纯化及其与抗病毒剂相互作用研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：S481.1密级：公开论文编号：201701032135贵州大学2017届硕士研究生学位论文南方水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白的原核表达纯化及其与抗病毒剂相互作用研究学科专业：农药学研究方向：农药毒理学、作用机制及抗性导师：金林红教授、宋宝安院士研究生：冉龙露中国·贵州·贵阳2017年6月 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文目录摘要.........................................................................................................................................1Abstract.....................................................................................................................................2缩略词列表...............................................................................................................................4前言.........................................................................................................................................6第一章文献综述.....................................................................................................................71.1南方水稻黑条矮缩病毒的致病特征及发生危害........................................................71.2南方水稻黑条矮缩病毒的分类地位及病毒粒体特性................................................81.3南方水稻黑条矮缩病毒的基因组结构........................................................................81.4南方水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白及其相关蛋白的研究............................................91.5南方水稻黑条矮缩病毒的防控..................................................................................111.6阿魏酸衍生物抗病毒活性研究..................................................................................121.7抗南方水稻黑条矮缩病毒药剂的化学生物学研究...................................................131.8蛋白质与药物小分子相互作用的研究方法..............................................................131.8.1荧光光谱法研究蛋白质与药物小分子的相互作用...........................................141.8.2微量热涌动法研究蛋白质与药物小分子的相互作用.......................................161.8.3三维定量构效关系（3D-QSAR）分析蛋白质与化合物的相互作用...............201.9本章小结......................................................................................................................21第二章设计思想及技术路线...............................................................................................232.1研究的目的和意义......................................................................................................232.2拟解决的关键问题......................................................................................................232.3研究内容......................................................................................................................232.4技术路线.......................................................................................................................24第三章材料与方法...............................................................................................................253.1实验材料......................................................................................................................253.1.1供试材料...............................................................................................................253.1.2实验试剂...............................................................................................................253.1.3主要仪器设备.......................................................................................................253.1.4常用缓冲溶液的配制...........................................................................................26I 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文3.1.5引物设计...............................................................................................................273.2实验方法与步骤..........................................................................................................283.2.1SRBSDVWT-P10蛋白的质粒构建、表达、纯化............................................283.2.2WT-P10与WT-P9-1、TR-C23-P9-1及WT-P7-1的体外互作.........................383.2.3WT-P10蛋白与抗病毒剂的相互作用.................................................................393.2.4WT-P10蛋白与阿魏酸衍生物构效关系分析.....................................................40第四章结果与讨论...............................................................................................................424.1重组质粒的构建...........................................................................................................424.1.1目的片段的PCR扩增...........................................................................................424.1.2pGEX6p-1WT-His-GST-P10重组质粒的鉴定...................................................434.1.3.定点突变重组载体的构建....................................................................................444.2pGEX6p-1WT-His-GST-P10蛋白的表达小试..........................................................454.3pGEX6p-1WT-His-GST-P10蛋白纯化......................................................................464.4WT-P10蛋白的鉴定....................................................................................................474.4.110%SDS-PAGE鉴定WT-P10蛋白....................................................................474.4.2MS鉴定WT-P10蛋白..........................................................................................484.5WT-P10蛋白聚集状态分析........................................................................................484.6pGEX6p-1Mu-275-His-GST-P10蛋白纯化..............................................................504-7WT-P10与WT-P9-1、TR-C23-P9-1及WT-P7-1体外互作研究............................514.7.1MST研究WT-P10与WT-P9-1、TR-C23-P9-1及WT-P7-1体外互作研究...514.7.2ITC研究WT-P10与WT-P9-1、TR-C23-P9-1及WT-P7-1体外互作研究.....524.8抗病毒剂与WT-P10相互作用研究..........................................................................534.8.1荧光光谱法研究病毒剂与WT-P10相互作用研究............................................534.8.2MST研究病毒剂与WT-P10相互作用研究.......................................................564.9P10-275蛋白与抗病毒剂的相互作用研究.................................................................584.9.1荧光光谱法研究P10-275蛋白与抗病毒剂的相互作用....................................584.9.2MST研究P10-275蛋白与抗病毒剂的相互作用...............................................604.10阿魏酸衍生物与WT-P10蛋白的定量构效关系分析.............................................60第五章结论...........................................................................................................................665.1主要结论..........................................................................................................................66II 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文5.1.1SRBSDVP10蛋白的表达纯化............................................................................665.1.2WT-P10蛋白与WT-P9-1、WT-P7-1体外互作.................................................665.1.3抗病毒剂与WT-P10蛋白的相互作用分析.......................................................675.1.4抗病毒剂与WT-P10蛋白的相互作用分析.......................................................675.1.5抗病毒剂与突变体P10-275的相互作用研究....................................................685.2本文的创新点..............................................................................................................685.3本文的不足之处与展望..............................................................................................68致谢.......................................................................................................................................70参考文献.................................................................................................................................71附录.......................................................................................................................................811课题来源.........................................................................................................................812研究生期间发表论文.....................................................................................................813抗病毒剂及阿魏酸衍生物结构式.................................................................................824附图与附表.....................................................................................................................85原创性声明.....................................................................................................................97III 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文摘要近年来，南方水稻黑条矮缩病毒(Southernriceblack-streakeddwarfvirus,SRBSDV)在我国南方地区发现，并迅速在长江以南地区爆发，严重降低我国水稻产量。然而，目前田间缺乏有效的抗SRBSDV的药剂，并且对已有的抗SRBSDV药剂的作用机制尚不清楚。SRBSDV外壳蛋白(P10)是病毒传播和感染宿主所需的关键蛋白，是潜在的抗SRBSDV试剂筛选的靶标。研究发现，阿魏酸及其衍生物具有农用活性，对水稻黑条矮缩病毒、番茄病毒、马铃薯病毒、瓜类病毒和玉米矮花叶病毒等具有很好的抑制活性，是潜在的抗SRBSDV药剂。本论文通过体外克隆、表达和纯化获得SRBSDV外壳蛋白P10；利用荧光滴定和微量热泳动仪技术研究靶标蛋白SRBSDVP10与抗植物病毒剂的相互作用。以抗病毒剂与SRBSDVP10蛋白的结合力为考查指标，建立了基于SRBSDVP10为靶标的离体药物筛选模型，分析了基于阿魏酸结构骨架的一系列抗病毒化合物与WT-P10的相互作用。研究结果表明，抗植物病毒剂毒氟磷、氨基寡糖、香菇多糖、盐酸吗啉胍和病毒唑与SRBSDVP10蛋白没有相互作用；而宁南霉素（Ningnanmycin，NNM）5-1表现出与SRBSDVP10较强的结合，亲和力KA=6.17×10M，进一步通过SEC研究发现NNM可以破坏SRBSDVP10在溶液中的聚集状态。而阿魏酸及衍生物对P10存在不同强度的结合力，其中化合物F27和P10的结合力与NNM相当，5−1KA=5.75×10M。基于34个阿魏酸衍生物和SRBSDVP10蛋白的结合力KA值，2采用CoMFA和CoMSIA方法进行3D-QSAR分析，得到所构建模型的q，分别为0.544、0.692均大于0.5，认为模型具有可靠的预测能力。离体荧光滴定及3D-QSAR分析表明：保留阿魏酸的羧基结构以及在R2位置引入空间位阻小的吸电子基团有利于提高化合物与SRBSDVP10的亲和力。关键词：SRBSDVP10；相互作用；阿魏酸衍生物；3D-QSAR1 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文AbstractInrecentyears，Southernriceblack-streakeddwarfvirus(SRBSDV)seriouslyreducedriceproductioninsouthernChina.However,duetothelackofeffectiveanti-SRBSDVagentsatpresentandtheexistinganti-SRBSDVagentmechanismofactvityisunclear.SRBSDVcoatprotein(P10)isthekeyproteinrequiredforviraltransmissionaswellasinfectioninhostplantandisthusapromisingtargetforanti-SRBSDVagentscreening.Itwasreportedthatferulicacidanditsderivativeshadagriculturalactivity,whichhadgoodinhibitoryactivityagainstRiceblackdwarfvirus,Tomatovirus,Potatovirus,MelonvirusandMaizedwarfmosaicvirus.Itwasapotentialanti-SRBSDVPharmacy.Inthisstudy,theSRBSDVP10proteinwasobtainedbycloning,expressionandpurification.TheinteractionbetweenSRBSDVP10andantiviralagentswasstudiedbyfluorescencespectroscopyandmicroscalethermophoresis.TheaffinitybetweenantiviraldrugsandSRBSDVP10wasselectedtoevaluatetheantiviralactivityandadrugscreeningmodelbasedonSRBSDVP10wasestablished.Aseriesofantiviralcompoundsbasedonthestructuralscaffoldofferulicacidwereanalyzed.Theresultsshowedthattherewasnointeractionbetweenantiviralagents(dufulin,aminooligosaccharides,lentinan,morpholineguanidinehydrochloride,ribavirin)andSRBSDVP10protein.NNMshowedstrongbindingtoSRBSDVP10,-1theaffinityKA=6.17×105M.AfurtherstudyofSECfoundthatNNMcoulddestroytheaggregationstateofSRBSDVP10insolution.KA,thebindingconstantofF27to-1SRBSDVP10was5.75×105M.UsingComparativemolecularfieldanalysis(CoMFA)andcomparativemolecularsimilarityindexanalysis(CoMSIA)methods,the3D-QSARmodelwasconstructedbySybylX-2.0softwarebasedontheKA2valuesof34ferulicacidderivativesbindingtoSRBSDVP10.Theqwere0.544and0.692,repectively,whichweregreaterthan0.5sothatthemodelhadareliableabilitytopredict.TheresultsoftheFTassayand3D-QSARanalysisshowedthat2 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文theaffinityofSRBSDVP10wasenhancedbytheretentionofferulicacidcarboxylstructureandtheintroductionofasmallsterichindranceattheR2position.Keywords:SRBSDVP10;Interaction;Ferulicacidderivative;3D-QSAR3 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文缩略词列表英文缩写英文名称中文名称SRBSDVSouthernriceblack-streakeddwarfvirus南方水稻黑条矮缩病毒RNAribonucleicacid核糖核酸CPcoatprotein外壳蛋白SDS-PAGEsodiumdodecylsulfate-polyacrylamide十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺胶gelelectrophoresis体电泳ddH2Odoubledistilledwater重蒸水DEPCdiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯RTreversetranscription逆转录cDNAcomplementaryDNA互补DNAbpbasepairs碱基对PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应dNTPdeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸ODopticaldensity光密度PBSphrosphate-bufferedsolution磷酸缓冲溶液Tristris(Hydroxymethryl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷DMFN,N-dimethrylformamideN,N-二甲基甲酰胺+AmpAmpicillin氨苄青霉素+KanKanamycin卡那霉素TEMEDN,N,N',N'-tetramethylethylenediamineN,N,N',N'-四甲基二乙胺NCBInationalcenterforbiotechnology美国国家生物技术信息中心informationpIisoelectricpoint等电点DTTDL-dithiothreitol二硫苏糖醇IPTGisopropyl-β-d-thiogalactoside异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷LBLuria-Bertani培养基4 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文E.coliEschrerichriacoli大肠杆菌MSMassspectrometry蛋白质谱SECSizeExclusionChromatographry空间排阻色谱法ITCIsothermaltitrationcalorimetry等温滴定量热法MSTMicroscalethermophoresis微量热泳动FTfluorescencetitration荧光滴定NNMNingnanmycin宁南霉素3D-QSARthreedimensional-quantitativestructure三维定量构效关系activityrelationshipCoMFAComparativeMolecularFieldAnalysis比较分子场分析CoMSIAComparativeMolecularSimilarityIndices比较分子相似性指数分析Analysis5 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文前言水稻是主要的粮食作物之一，近年来南方水稻黑条矮缩病毒在我国长江以南地区迅速爆发，严重降低我国南方稻区的水稻产量。然而，目前用于抗SRBSDV商品化药剂种类少、田间缺乏有效的抗SRBSDV的药剂，SRBSDV传播及复制组装机制和对已有的抗SRBSDV药剂的作用机制尚不清楚，缺少准确的抗SRBSDV药剂筛选模型等。因此，SRBSDV的研究及防治面临严重挑战。阿魏酸及其衍生物是潜在的抗植物病毒化合物，研究发现阿魏酸及其衍生物具有农用活性，对水稻黑条矮缩病毒、番茄病毒、马铃薯病毒、瓜类病毒和玉米矮花叶病毒等具有很好的抑制活性。本课题组以反式阿魏酸为先导，合成了一系列具有抗病毒活性的化合物。研究该类化合物与SRBSDV的潜在靶标蛋白的相互作用，对于合成更高活性抗SRBSDV化合物具有重要的理论指导意义。因此，基于SRBSDV的关键靶标蛋白，进行抗植物病毒药物的化学生物学研究，对于揭示病毒防控剂抑制SRBSDV活性的机制，建立基于新靶标蛋白的抗SRBSDV活性化合物离体筛选模型，设计和合成更高活性新化合物有着十分重要理论研究与应用价值。本论文通过对文献进行调研，发现SRBSDV外壳蛋白P10在SRBSDV传播及侵染寄主过程中有着至关重要的作用，是潜在的抗植物病毒剂的作用靶标。本研究通过原核表达纯化获得SRBSDVP10，并以其为靶标蛋白，利用荧光光谱法和微量热泳动法等技术研究SRBSDVP10与抗植物病毒剂的相互作用。为了进一步筛选与SRBSDVP10蛋白结合力更强的化合物，以抗病毒剂与SRBSDVP10蛋白的作用力为指标，建立了基于SRBSDVP10为靶标的药物离体筛选模型，分析了基于阿魏酸结构骨架的一系列抗病毒化合物与SRBSDVP10的相互作用，以期筛选出具有更高活性的抗SRBSDV化合物。6 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文第一章文献综述[1]2001年首次在广东省阳江市阳江县发现SRBSDV，在随后的几年，SRBSDV主要在我国长江以南地区爆发，对我国的水稻及玉米等粮食作物造成[2][3]了严重危害。2008年，周国辉等将其鉴定为呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的新种，命名为南方水稻黑条矮缩病毒。近年来对SRBSDV的研究主要集中在田间防控、分子检测和免疫诊断方面[4,5]，对SRBSDV编码蛋白的功能，病毒蛋白之间及病毒与植物寄主之间的互作机制，抗SRBSDV药剂的作用机制及寻找抗SRBSDV的高活性化合物等方面的研究是比较少的。本章主要对SRBSDV的分类地位、植株感染SRBSDV的特征、SRBSDV外壳蛋白P10的功能和抗病毒剂的作用机制等研究进行总结，旨在了解SRBSDV编码蛋白功能的研究进展及NNM等药剂抗SRBSDV作用机制。1.1南方水稻黑条矮缩病毒的致病特征及发生危害SRBSDV通过白背飞虱(White-backedplanthopper,WBPH)以持久的方式[6][7,8]传播，禾本科植物如水稻、看麦娘、野燕麦和牛筋草等均可感染SRBSDV。水稻感染SRBSDV后，表现出的典型症状有叶片颜色深绿、植株矮缩、叶背以[9]及莲秆上出现乳白色或深褐色条状瘤突、莲节部倒生须根和高位分蘖。此外，感病的水稻根系不发达、须根短且少，在水稻生长的苗期、本田初期、分蘖期及拔节期均可感病。秧苗期感染SRBSDV会引起秧苗矮缩、拔节或早枯；初期感染，植株矮缩明显、导致不抽穗或抽包颈逐；分蘖期感染的植株矮缩不明显，但[10][11]穗小、粒轻；然而拔节期感染仅出现叶片呈墨绿色。[12]2001年，我国首次在广东省发现SRBSDV时，感染面积为3-5公顷。到2009年，SRBSDV在越南北部19个省爆发，42,000公顷作物受损，在中国南部9个省迅速爆发和损坏作物面积超过30万公顷；2010年，在越南29个省份超过60,000公顷稻田感染SRBSDV，中国13个省130万公顷受感染；在许多严重的[6,13]地方，作物完全颗粒无收。7 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文1.2南方水稻黑条矮缩病毒的分类地位及病毒粒体特性SRBSDV在生物学症状、血清学关系和基因组序列等方面与马唐草矮化病毒(Pangolastuntvirus,PaSV)、玉米粗缩病毒(Maizeroughdwarfvirus,MRDV)、马德里约柯托病毒(MaldeRíoCuartovirus,MRCV)和水稻黑条矮缩病毒(Riceblackstreakeddwarf,RBSDV)较为相似，同属于呼肠孤病毒科斐济病毒属[14,15](Fijivirus)2成员。通过电镜观察发现所有的斐济病毒属病毒形态与斐济病毒(Fijidisease[16,17]virus,FDV)相似(图1-1)。FDV粒子为十二面体的球状结构、直径约66-70nm无包膜、有内外层外壳。在二十面体的顶角处有12个长和直径约11nm的“A-spike”型突起；内核直径约55nm，12个直径约12nm、长约8nm的“B-spike”[16]型突起，其外层衣壳容易脱去A突起从而形成带有B突起的内层粒子的亚病[18]毒粒子。图1-1FDV病毒粒子结构A：“A-spike”型突起；B：“B-spike”型突起；O：外壳；C：内壳。Fig.1-1StructureofFDVparticle.A:A-spike;B:B-spike;O:outershell;C:innershell.1.3南方水稻黑条矮缩病毒的基因组结构SRBSDV基因组由10条双链RNA(double-strandedRAN,dsRNA)组成，根据其大小分别命名为S1-S10，10条链的末端都有保守序列5’-AAGTTTTTCAGCTGATGTC-3’，靠近末端还存在一个反向重复序列、GC在[14]32-38%之间。研究发现SRBSDV基因组与RBSDV基因组的核酸序列同源性[19-21]为70-80%、氨基酸的同源性高达60-90%，因此推断SRBSDV至少含有6个结构蛋白和5个非结构蛋白(表1-1)。6个结构蛋白分别为RNA依赖的RNA8 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文聚合酶P1、病毒内核组分P2、P3具有鸟苷酰转移酶活性、病毒外壳的B刺突蛋[20,22,23]白P4、核心衣壳蛋白P8和主要外壳蛋白P10；5个非结构蛋白分别为：[24][25]具有沉默抑制子功能的P6、可以形成小管结构的P7-1蛋白、可以形成病毒[26]基质组分的P9-1以及未知功能的P7-2和P9-2。表1-1SRBSDV蛋白的功能预测Tab.1-1FunctionalpredictionofSRBSDVprotein基因序列长度(bp)蛋白大小(KDa)功能S14501169RNA聚合酶S23513141核心衣壳S33618135加帽酶S43571132B型刺突蛋白S53167108病毒原质24未知S6265390沉默抑制子、病毒原质S721641管状结构36未知S819286核心衣壳S9190040病毒原质24转运功能的膜蛋白S10180163外层衣壳1.4南方水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白及其相关蛋白的研究昆虫媒介传播病毒需要病毒的外壳蛋白、次要外壳蛋白和辅助成分蛋白等蛋白的参与。在植物病毒中CP是研究最早、最广泛的病毒蛋白之一，以前普遍认为病毒的外壳蛋白只有保护病毒基因组的功能，但最近研究发现病毒的外壳蛋白[27]是一个多功能的蛋白，几乎参与了病毒感染寄主的每一个阶段，CP影响RNA病毒翻译、将病毒基因组靶向其复制位点、细胞与细胞之间和/或系统性运动起作用、病毒的症状和毒力，激活抗性基因介导宿主防御，抑制RNA沉默，干扰[28]RNA沉默的抑制，以及确定通过载体传播病毒的特异性等。9 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文在斐济病毒属中水稻粗缩病毒(Ricedrawfvirus,RDV)的次要外壳蛋白P2是研究最透彻的，Tomaru和Omura等发现RDV缺失P2蛋白或P2蛋白突变，导致RDV不能侵染介体叶蝉，说明P2蛋白是RDV侵染叶蝉的关键蛋白，P2蛋白可以介导RDV与叶蝉消化道上皮细胞相互作用，从而RDV可以穿过肠道[29,30]进入血腔。此外，水稻瘤矮病毒(Ricegalldwarfvirus,RGDV)侵染其昆虫[31]寄主时同样也需要次要外壳蛋白P2的参与。[32]2004年，Zhu等根据前人研究了解到P2蛋白对于RDV侵染介体并被传播到植物上有非常重要的作用，RDV通过P2与介体细胞表面受体的相互作用而被介体昆虫细胞识别。其通过酵母双杂交和共免疫沉淀技术，发现RDV外壳蛋白P2与寄主内的ent-kaurene-氧化酶互作，ent-kaurene-氧化酶在植物合成植物生长激素赤霉素中发挥关键作用。ent-kaurene氧化酶类的表达量在感染RDV的植物内较健康植株的少。内源性GA1(赤霉素)在感染RDV植物体内的表达水平低于健康的植物，外生赤霉素GA3的喷施使感染RDV水稻恢复正常生长表型。结果表明，RDVP2蛋白是干扰细胞的功能因子，其通过直接物理作用，介导生长激素的生物合成从而导致的症状表现。P2蛋白与ent-kaurene-氧化酶相似蛋白的相互作用可能会抑制植保素的合成，从而使病毒粒子更加适合在植物宿主体内复制。[33]2007年，Zhou等通过酵母双杂交和免疫共沉淀技术发现RDV的主要外壳蛋白P8与水稻乙醇酸氧化酶(Riceglycolateoxidase,GOX)发生互作，通过共聚焦免疫荧光显微镜在植物寄主的过氧化物酶体中发现P8和GOX，对RDV靶向寄主细胞的复制位点起着关键作用。[23]2007年，Liu等通过酵母双杂交技术，并进一步通过体外far-Westernblot分析发现RBSDV外壳蛋白P10可以自身互作，且N-端的230氨基酸对其自身互作起到重要作用。通过在杆状病毒表达系统中表达P10蛋白，采用化学交联法研究其聚集状态，发现P10在溶液中主要是3聚体，突变N-230个氨基酸后P10丧失形成三聚体能力。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳还原和非还原条件下的P10蛋白，发现P10不是通过分子间二硫键形成聚集体，可能是通过其他类型的作用力，如疏水性或电荷的相互作用而形成的。10 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文[34]2013年，Sun等用live-cell成像技术研究RBSDVP10蛋白的亚细胞定位，发现P10在N端融合eGFP的蛋白后形成泡状结构存在烟草表皮细胞和在水稻原生质体内质网(ER)膜上。亚细胞分离实验验证P10是一种完整的膜蛋白，而ER膜修饰在RNA病毒复制和病毒粒子组装中发挥重要作用。RBSDVP10诱导ER压力标记基因的表达，包括ER应激相关伴侣和转录因子，这表明RBSDVP10触发ER应激和解折叠蛋白，从而影响了病毒粒子的组装。[35]2014年，孙宗涛等利用酵母双杂交技术研究发现RBSDVP10与AteIF5A-2在酵母中互作，通过农杆菌转染烟草表皮细胞瞬时表达体系研究发现P10和AteIF5A-2形成融合荧光蛋白，荧光主要形成囊泡状的结构，初步确定RBSDV外壳蛋白P10可能具有的生物学功能。1.5南方水稻黑条矮缩病毒的防控南方水稻黑条矮缩病毒病属于较严重的水稻病毒病，其突发性强，蔓延快，目前没有较好的防控措施，通过大量的田间试验，提出了“虫病共治”、“治虱防[36]矮”等防治方针。田间防控主要是以吡蚜酮、噻虫嗪等杀虫剂和病毒唑、毒[37]氟磷(Dufulin)、NNM等抗植物病毒剂在水稻生长的不同时期联合喷施为主。[38]2011年，杨海中等在田间进行药剂抗SRBSDV试验，结果发现采用25%噻虫嗪拌种，秧田后期喷施48%毒死蜱和2%氨基寡糖的处理组对SRBSDV具有较好的防治效果。[37]2011年，唐新海等对抗SRBSDV的补救药剂进行筛选试验，结果发现2%22NNM120g/667m+10%苄氨基嘌呤40g/667m、20%吗啉胍·乙酮WP37.522g/667m+10%苄氨基嘌呤AS40g/667m、31%氮苷·吗啉胍SG37.5g/667222m+10%苄氨基嘌呤AS40g/667m、2%宁南霉素AS120g/667m、20%吗啉2胍·乙酮WP37.5g/667m等药剂组合在3次喷药后对感染SRBSDV水稻的平均防效达到50%以上。[39]2011年，陈卓等将抗病毒药剂(30%毒氟磷WP)与不同的杀虫剂吡蚜·噻虫嗪联合施用于田间防治SRBSDV，结果发现不同的药剂处理组对SRBSDV都有一定的防效。11 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文[40]2014年，钟玲等在江西省进行SRBSDV田间防控，采用25%吡蚜酮拌种(20g/kg种子)后，分别在移栽前2d和移栽后15d各使用25%吡蚜酮喷雾1次2(每667m20g)的方案对SRBSDV具有较好的防效。总之，目前没有特效药剂治疗水稻SRBSDV，因此该病害的防治主要以预防为主，防治结合。1.6阿魏酸衍生物抗病毒活性研究阿魏酸(ferulicacid)是中药材阿魏、川芎、根茎、卷柏状石松、木贼等中的有效成分之一。医学研究表明，阿魏酸可抑制呼吸道合胞体病毒、感冒病毒和[41][42,43]HIV；同时对柠檬酸杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌等病菌具有杀菌活性。近年来，开始对阿魏酸及其衍生物的农业活性进行研究。2009年，汪清民[44]等通过半叶枯斑法测定阿魏酸及其衍生物的抗TMV活性，结果发现在处理浓度为500μg/mL时所有化合物在对TMV的抑制率均大于50%。此外，化合物还可抑制甘薯病毒、马铃薯病毒、瓜类病毒和玉米矮缩花叶病毒等。[45]2013年，汪清民等将反式阿魏酸微制备成乳剂进行抗烟草、水稻、番茄2病毒病的应用研究。在水稻秧田秧苗期，喷施有效成份量600g/hm的5%反式阿魏酸微乳剂对水稻黑条矮缩病的防效为77.18%，与2%宁南霉素水剂在有效22成份量100g/hm的防效(77.22%)相当；在水稻成株期，有效成份量600g/hm的5%反式阿魏酸微乳剂对水稻黑条矮缩病的病情指数防效、丛防效、株防效分别为65.29%、70.96%、54.89%，且对水稻秧苗素质、生长无不良影响。此外，5%反式阿魏酸微乳剂对番茄病毒病、烟草病毒病均有不错的防效。[46]2013年，Cui等合成了一系列氢化阿魏酸酰胺衍生物，某些化合物在500μg/mL浓度时对TMV显示出优异的保护和治疗活性。[47]2013年，Wu等合成一系列反式-3-芳基丙烯酸化合物，并对合成的化合物进行抗TMV的活性评价，大多数化合物对TMV具有良好的抗病毒活性，部分化合物抗TMV活性高于对照药剂利巴韦林，并且与利巴韦林相比，这些化合物具有较简单的结构。12 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文1.7抗南方水稻黑条矮缩病毒药剂的化学生物学研究近年来，对于抗植物病毒药物的筛选主要利用了蛋白质组学寻找差异蛋白、分子生物学寻找差异基因等技术进行研究。研究发现，抗植物病毒药剂主要是通过破坏病毒的外壳蛋白及病毒粒子的形态结构、干扰病毒核酸和运动蛋白等方式，起到干扰病毒感染寄主、复制组装等过程。目前较多的进行病毒核酸和外壳蛋白作为潜在靶标进行抗植物病毒剂与新靶标的化学生物学方面的研究，其多采用MST、ITC、SEC等技术在离体条件下[48-53]进行药物分子和靶标蛋白之间的相互作用研究。目前关于抗SRBSDV药剂的化学生物学研究比较少。2013年，本课题组Yu[54]等将SRBSDV感染水稻悬浮细胞后进行抗SRBSDV药剂的筛选，通过研究Dululin、NNM、NK007、盐酸吗啉胍等药剂对SRBSDVP7-1基因的抑制性，结果发现Dululin表现出较强的抑制SSRBSDVP7-1基因表达活性；此外，水稻中1过氧化物酶和多酚氧化酶的活性增加。[55]2015年，Li等通过原核表达SRBSDVP9-1蛋白并以其为潜在靶标，通过MST、ITC等技术研究Dufulin与SRBSDVP9-1的相互作用，发现Dufulin抑制SRBSDVP9-1基因表达，并且将175位的精氨酸突变为甘氨酸后，Dufulin与SRBSDVP9-1的亲和力降低，推测Dufulin抑制SRBSDV与175位的精氨酸形成的内部结构相关。基于本课题组前期的研究基础，我们希望能够寻找到抗SRBSDV药物的新靶标，并进行靶标与抗植物病毒药剂的相互作用研究，建立抗SRBSDV药物离体筛选模型，为进一步研究抗植物病毒药剂与SRBSDV靶标之间的作用机制及新药剂筛选提供新的基础。1.8蛋白质与药物小分子相互作用的研究方法生物体的重要组成部分为蛋白质，且很多生命活动过程都需要蛋白质的参与。其可与许多内源性和外源性小分子物质作用形成复合物，如代谢、催化作用等生[56,57]命过程大都涉及蛋白质与小分子的相互作用。目前对蛋白质与小分子的相13 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文互作用的研究应用较多的是荧光光谱法、等温滴定量热法、微量热泳动仪和三维定量构效关系研究等。1.8.1荧光光谱法研究蛋白质与药物小分子的相互作用由于蛋白质中的三中氨基酸(色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和及苯丙氨酸(Phe)能发射内源性荧光，因此荧光光谱广泛用于研究小分子与蛋白相互作用。[58]小分子和蛋白质发生相互作用导致蛋白质的内源性荧光增强或淬灭，荧光滴定导致荧光淬灭分为由于淬灭剂和荧光团之间的碰撞引起的动态淬灭；淬灭剂和[59,60]荧光团之间形成稳定的复合物的静态淬灭，两种淬灭过程都遵循[59,61-63]Stem-Volmer方程(1-1)。F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q](1-1)其中F和F0分别是在没有淬灭剂和有淬灭剂时蛋白质的荧光强度，Kq为速率常数，τ0是没有猝灭剂时荧光分子的平均荧光寿命(对大多数的生物分子τ0约-8为2×10s)，[Q]为淬灭剂的浓度，KSV为作用体系的淬灭常数。猝灭剂对生物大10-1-110分子的最大扩散猝灭常数约为2×10L·mol·S，当Kq>2×10时，作用体系[64]主要为静态淬灭。当相互作用体系为静态淬灭时可根据以下方程计算小分子和蛋白的结合常[65]数KA及结合位点数n：lg(F0−F)/F=lgKA+nlg[Q](1-2)[66]2011年，Nooshin等通过多种技术例如荧光猝灭，共振光散射(RLS)，三维荧光光谱，FT-IR和电动电位测定阿司匹林(ASA)和氨氯地平(AML)在pH=7.4的水溶液中与人血清白蛋白(HAS)的结合的点位。荧光测量给出关于配体与蛋白质的结合的重要参数，例如结合机制，结合模式，结合常数，结合位点等。利用荧光光谱研究结果显示ASA和AML可以使HAS的荧光发生淬灭，并且当ASA和AML共存时，该猝灭效应变得更显着。结果指出HSA和两种药物之间的相互作用作为三元系统降低，作为二元系统的HAS-药物复合物的结合常数和结合稳定性。14 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文[67]2015年，Wang等利用荧光滴定技术研究抗植物病毒剂Dufulin与SRBSDVP9-1蛋白的相互作用。结果发现Dufulin及其衍生物与SRBSDVP9-1基质蛋白的亲和力达到微摩尔级，且SRBSDVP9-1基质蛋白的C端23个氨基酸在Dufulin及其衍生物与SRBSDVP9-1基质蛋白相互作用中起到关键的作用，进一步通过微量热涌动仪验证了荧光滴定的结果。[68]2016年，Zhang等利用荧光滴定研究了抗病毒化合物α-氨基磷酸酯对映体与烟草花叶病毒外壳蛋白(TMVCP)之间的相互作用，结果发现R体与TMVCP的结合力大于S体与TMVCP的结合体，进一步通过分子对接发现90位的精氨酸在α-氨基磷酸酯对映体与TMVCP的相互作用中起到关键作用，将90位的精氨酸突变后，发现α-氨基磷酸酯对映体与TMVCP的结合力降低。[60]2016年，MichaeleB等用NMR光谱和细胞外x射线结晶研究晚期糖基化终产物的受体(RAGE)结构域，表明RAGE配体通过不同的电荷和依赖疏水性结合机制结合配体。其筛选了58,000个小分子文库，并鉴定了13个小分子与ctRAGE和DIAPH1的相互作用竞争性抑制剂，通过荧光滴定的方法证明了13个化合物与ctRAGE的相互作用亲和力达到纳摩尔级。[69]2017年，Jia等利用荧光光谱研究大鼠内几个高峰度蛋白：天冬氨酸氨基转移酶(AST)，苹果酸脱氢酶(MDH)，过氧化氢酶(CAT)，钙网蛋白(CRT)和白蛋白与11个铜络合物、CuCl2之间的相互作用，荧光滴定结果证明了其抑制试66-1验的结果，两种复合物与AST结合常数为3.89×10和3.73×10M，形成化学计量比例为1：1复合物。[70]2016年，D.Agudelo等研究抗癌药物阿霉素(DOX)与人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)和牛奶β-乳球蛋白(β-lg)三个模式载体蛋白的相互作用，分子建模研究显示阿霉素与HAS的亲和力强于BSA和β-乳球蛋白的亲和力，来说，结合自由能是−10.75(DOX-HSA)、9.31(DOX-BSA)和−8.12千卡4−1/摩尔(DOX-β-lg)。进一步通过英光光谱研究发现KDOX-HSA=1.1(±0.3)×10M、3−14−1KDOX-BSA=7.8(±0.7)×10M和KDOX-β-LG=1.0(±0.4)×10M，DOX-protein复合物的稳定顺序是DOX-HSA>DOX-β-LG>DOX-BSA。光谱与分子对接结果发现DOX-HSA>DOX-BSA>DOX-β-LG。15 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文1.8.2微量热涌动法研究蛋白质与药物小分子的相互作用微尺度热泳(microscalethermophoresis,MST)是最年来建立的通过温度梯度监测荧光标记分子的定向运动的无固定亲和力测量技术。MST是基于微热效应引起的移动性的测量方法，从微观尺度上来说分子的定向运动在分子大小，电[71]荷，水化层或构象等多种相互作用诱导下是高度敏的。当液体局部受热，分子开始沿着温度梯度从高温向低温移动。当分子运动达到平衡状态，液体中分子的集中分布可以由等式1-3表示：𝐶ℎ𝑜𝑡=exp[-ST(T-T0)]=exp(-ST△T)≈1-ST△T(1-3)𝐶𝑐𝑜𝑙𝑑其中Chot是分子在高温区域的浓度，Ccold是分子在低温区域的浓度，ST是索雷系数，T0初始温度，T是升高温度。尽管MST的理论是新兴的，但是大多数理论认为，各种参数可能影响ST，如分子大小、电荷、水化层和溶剂熵。索雷系数可以由方程1-4表示：𝐴𝛽𝜎2𝑒𝑓𝑓ST=(-△Shyd(T)+×λDH(1-4)𝐾𝑇4𝜀𝜀0𝑇其中A代表分子的表面积，σeff为有效电荷，Δshyd是分子-溶剂水化层的熵，λDH是Debye-Hueckel筛查长度，ε介电常数，β是ε的温度导数。图1-2MST信号采集示意图Fig.1.2MSTsignalacquisitiondiagram.图1-2是MST仪器的单个毛细管的信号采集示意图，包含荧光种类和结合的配体。通过红外(IR)激光耦合光路激发和发射荧光，使其聚焦于样品从检测16 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文到荧光发射的精确点。通过相同的光学元件激发并测量毛细管内的荧光。最初，红外激光器关闭并且在溶液中没有温度梯度，因此荧光物质均匀分布并具有稳定的荧光信号。当红外(IR)激光器开启，聚焦光斑立即被加热，温度升高，导致荧光强烈降低，这是由于荧光量子产率对温度的改变及其灵敏，因此创建了观察的温度变化。由于分子的热泳动，荧光缓慢减少直到通过质量扩散到热泳运动平衡时的稳定状态。由于温度跳跃过程的时间很短(约100ms)，因此可以区分它从以下较慢的热泳过程，当IR激光器关闭，荧光强度突然增加，因为的局部温度降低，从而导致相反的温度跳变。在短时间内荧光强度恢复后，由于荧光分子反向扩散，至达到稳定状态。通过分析Fnorm(归一化荧光)的变化来确定解离常数KD，KD定量的表示结合亲和力。Fnorm用于定量荧光分子的浓度，并由方程(1-5)进行定义，包括温度变化过程和热泳动过程。𝛿𝐹𝛿𝐹Fnorm=Fhot/Fcold=1+(-ST)△T=Chot/Ccold+△T(1-5)𝛿𝑇𝛿𝑇在上述方程中，Fhot是高温区域中的荧光，Fcold是低温区中的荧光，两者都是溶液中的所有荧光物质的总荧光强度，当荧光物质与非荧光配体结合并形成荧光复合物，结合荧光分子及未结合的荧光分子的热电泳信号是线性叠加的，可由方程(1-6)进行描述：Fnorm=(1-x)F(A)norn+xF(AT)norn(1-6)Fnorm是荧光分子的总荧光强度，Fnorm,unbound和Fnormbound分别是荧光物质未结合药物小分子以及形成复合物的归一化荧光强度，x是形成复合物的荧光分子量。通过滴定固定浓度的荧光分子与不同浓度的荧光配体，记录与不同浓度的非荧光配体的数据Fnorm，数据根据不同的数学模型拟合。根据运动的规律，结合行为的分子可以通过多种模型来描述。最简单的结合模型是与配体以1：1的比例结合的复合物，其可以表示为(1-7)：AL↔A+L(1-7)A是受体；L是滴定配体；AL是结合的复合体(A和L)，随后解离常数KD可以被定义为(1-8)：[𝐴][𝐿]KD=(1-8)[𝐴𝐿]17 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文[A]是自由配体的平衡浓度；[L]自由滴定配体的浓度；[AL]是A结合L的复合体浓度，L未知，使用A和L分析取代，分别表示为(1-9)和(1-10)：CA=[A]+[AL](1-9)CL=[L]+[AL](1-10)CA是A的分析浓度和CL是L的分析浓度。结合上述方程式(1-8)到(1-10)，解离常数KD可以表示为(1-11)：KD=(CA-[AL])(CL-[CL])/[AL](1-11)通常，通过研究A和L的结合行为来研究在微量热泳实验中滴定。A是荧光分子并且具有固定浓度；L是滴定配体，其浓度是逐渐增加。因此，结合部分的A可以描述为：CA+CL+KD−√(CA+CL+KD)2−4CACLx=[AL]/CA=(1-12)2CA结合方程(1-4)和(1-12)可以计算出解离常数KD。MST具有许多优点，包括操作简单、速度快(约1min)、样品消耗低(如，μl的体积)、可以使用的buffer种类较多，对于结合的分子没有实际限制分子大[72,73]小或重量。近几年，MST广泛应用于蛋白与离子、化合物、多糖、蛋白相互作用等方面的研究。病毒表面蛋白血凝素(haemagglutinin,HA)在病毒与宿主细胞相互作用中起着关键作用。其在结合位点与单个配体结合，且亲和力较差，但多个HA和配体相互作用时亲和力较高，使得病毒能够结合首选配体细胞。2013年，Xiong[74]等利用MST研究一种突变H5N1病毒亚型的HA与受体结合的特征，结果发现其对人类受体的亲和力略有增高，而对禽类受体的亲和力显著下降。[75]2014年，Judith等利用虚拟筛选发现儿茶素和喹喔啉两种类型能选择性抑制磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)，利用MST的方法验证了儿茶素和喹喔啉衍生物是高效和具体的C4PEPC的抑制剂，对C4PEPC有较强的亲和力，结合常数达到μM范围，认为喹喔啉化合物是潜在的选择性除C4杂草的除草剂。[76]2014年，JLParker等解析了NTR1.1的晶体结构，并在结构中发现硝酸根的存在，由于NTR1.1中存在多个跨膜螺旋、分子量很大，硝酸根埋藏于蛋白内部。因此，研究硝酸根与NTR1.1的相互作用的时候遇到困难，但使用MST18 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文技术测定硝酸根与NTR1.1的相互作用，得到解离常数KD=1mM左右，通过构建突变体蛋白并结合MST技术确定His356是结合硝酸根的关键氨基酸。[72]2015年，Mao等利用MST研究有机染料异硫氰酸荧光素(FITC)与牛血清白蛋白(BSA)之间的相互作用，将获得的结果与传统的荧光光谱进行比较。MST数据表明，作用时间短，FITC对BSA显示弱相互作用，而不是标签蛋白质。通过使用竞争结合，华法林和布洛芬作为BSA的位点标记，证明与位点1相比FITC主要是结合BSA的疏水口袋2。除了亲和力，MST也提供了额外的信息对BSA的聚合和绑定FITCBSA染料是荧光光谱所不能得到的。这项工作证明MST作为研究protein-小分子的相互作用的新方法是强大和可靠的。使用酪氨酸激酶抑制剂治疗慢性粒细胞白血病取得不错的成果，但近年来抗药性频繁发生，然而通过减少PP2A蛋白与内源性蛋白SET的结合，增强PP2A蛋白的活性以对抗酪氨酸激酶抑制剂相关的抗药性是一种有效方法。2015年，[77]Wang等通过研究发现化合物TGI1002能够干扰SET与PP2A的结合。通过MST研究得出TGI1002直接结合到SET蛋白并抑制SET-PP2A相互作用，得到TGI1002与SET的解离常数KD=1.66±0.45nM.[78]2015年，Dugassa等针对拟南芥basic-helix-loop-helix转录因子GLABRA3(GL3)和增强子GLABRA3(EGL3)可以正调节花青素生物合成，并与各种R2R3MYB转录因子和WD40GLABROUS1(TTG1)形成蛋白质复合体(MBW复合物)，在以前的研究中，GL3与EGL3相比，其表现为在响应氮消耗中对花青素的积累是必须的的问题。使用非同源性表达的蛋白，并通过MST进行GL3及EGL3对PAP2和MYBL2两个蛋白的亲和力实验，得到GL3结合常数KD分别是3.5±1.7和22.7±3.7μM，而EGL3结合常数KD分别是7.5±2.3和8.9±1.4μM。这意味着MYBL2不会抑制MBW复合体包含GL3，一样容易的证明复合体包含EGL3。[79]2016年，Fayad等为了研究人类嗜性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)的抑制性，但由于五环三萜烯在其中发生酶反应的水性介质中的溶解度有限，因此需要DMSO和乙醇溶解化合物，使用微热法(MST)研究DMSO和乙醇对HNE的影响。酶的聚集状态是通过了将抑制剂溶解在5%(v/v)DMSO溶液进行揭示的，而乙醇的存在时这种现象没有发生。因此，乙醇作为抑制剂的溶解剂，最高的比19 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文例为20%(v/v)。MST技术用于评估HNE与乌索酸的相互作用，HNE-乌索酸的解常数是KD是2.72±0.66μM(n=3)，CE分析酶抑制的研究(KD=2.81μM)，证明了MST该方法的可靠性。1.8.3三维定量构效关系（3D-QSAR）分析蛋白质与化合物的相互作用3D-QSAR是一种借助分子的理化性质参数(包括疏水参数、电性参数、立体参数、几何参数等)，运用数学模型在空间上描述分子的结构与其某种生物活性的关系，间接的反应了药物小分子与生物大分子相互作用的非键特征，广泛应[80]用于农药、医药、化学毒剂等很多领域。目前，研究最多的是CoMFA和CoMSIA模型。3D-QSAR分析中一个至关重要的环节为建模，其以结构类似、理化性质相似和活性相似的化合物作为研究的理论基础，其外在活性由分子内部结构特征决定。因此，可以通过该联系建立化合物结构和活性之间的联系，进而对化合物的活性进行评估。[81]2011年，Huang等据文献报道热休克蛋白90(Hsp90)参与几种癌症的感染。新生霉素是一个典型的Hsp90C-末端抑制剂，是一种潜在的抗癌药物。设计新的新生霉素衍生物并进行CoMFA和CoMSIA模型分析，统计结果表明两个模型具有高预测能力。结果表明苯甲酰胺对于细胞毒性活性及其重要，而大体积的香豆素环影响活性。香豆素环的R4-CH3增加对Hsp90抑制性。诺维糖的羟基是H-键受体，诺维糖大体积的新生基团取代基将降低活性。基于模型获得的几个重要影响因素，设计六种新的新生霉素衍生物具有较高的抑制活性分子，并用构建的模型进行验证发现新设计的化合物具有更高的抑制活性。研究表明，3D-QSAR模型可以提供有效的建议用于进一步修饰药物分子。[82]2012年，VarnavasD等结合分子对接和3D-QSAR-CoMSIA技术寻找潜在的TNF-α嘧啶-尿素抑制剂。基于p38α的晶体结构，发现所有的化合物都与酶的活性位点结合，将每种化合物的结合模型用于基于受体的比对以产生CoMSIA场，构建CoMSIA模型可以准确估计化合物的IC50值。发现这些结构影响化合20 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文物与靶标的结合，对p38αMAP激酶有抑制活性，并且可以扩展到其他类别的小分子抑制剂中。[83]2014年，Wu等将181个喹啉/喹唑啉衍生物作为黑色素浓集激素受体1(MCHR1)的拮抗剂，并进行CoMFA和CoMSIA分析，构建基于配体和受体的223D-QSAR模型。显示最佳可预测的CoMSIA模型Q=0.509，Rncv=0.841和2Rpred=0.745。此外，分子对接结果结合分子动力学计算分析，证明了CoMSIA模型的可靠性。[84]2016年，Chang等对一系列基于4-苯甲酰基-5-氨基吡唑结构的p38α抑制剂使用分子建模技术进行分析，化合物39氨基上的两个氢原子作为氢键供体，羰基氧原子和两个羟基氧原子作为氢键受体与p38α的Thr106，His107，Met109和Gly31发生相互作用；Lys53表现出与抑制剂的阳离子-π和脂肪族-πN-苯基环的相互作用；苯甲酰基环和芳族于Tyr35残基之间观察到的范德华相互作用。CoMFA和CoMSIA模型与MD模拟得到的结果相符合，将有助于新型p38αMAPK抑制剂的合理设计。[85]2016年，Yang等将H1受体作为潜在靶标寻找高活性的治疗失眠药剂。对129分子与H1受体进行3D-QSAR分析，得到了具有较好预测能力的CoMSIA222模型，其Q=0.525，Rncv=0.891，Rpred=0.807。根据获得的轮廓图评价所研究的化合物亲和力趋势，对新型抗失眠药的设计合成具有理论指导意义。分子对接研究配体和受体的活性位点之间的相互作用，分子动力学分析拮抗剂在H1受体结合口袋中的对接构象，提供对结构变化的洞察。所有的结果将有助于更好地解释H1抗组胺药结构与活性的关系，和设计有效的化合物。1.9本章小结近年来研究发现，病毒的外壳蛋白是多功能的蛋白，可以协调病毒基因组的复制、翻译、病毒的转播，调制寄主的响应以利于病毒感染寄主等。在呼肠孤病毒科中研究最多的是RDV的外壳蛋白，发现外壳蛋白P2在病毒感染昆虫寄主中有着关键的作用，P2蛋白是干扰细胞的功能因子，其通过直接物理作用，介导生长激素的生物合成从而导致的矮缩症状发生。此外，P2蛋白与ent-kaurene-21 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文氧化酶相似蛋白互作，可能会抑制植保素的合成，从而使病毒粒子更加适合在植物宿主体内复制。RBSDVP10与真核转录因子AteIF5A-2互作，且亚细胞定位在RNA病毒复制和病毒粒子组装中发挥重要作用的ER上，验证P10是一种完整的膜蛋白，RBSDVP10诱导ER压力标记基因的表达，从而影响了病毒粒子的组装。综上所述，推测SRBSDVP10在病毒的传播及侵染寄主过程起着重要的作用，是潜在的抗SRBSDV药剂的靶标。以上对SRBSDV的研究主要集中在生物学功能上，并没有将外壳蛋白作为潜在靶标与抗病毒剂进行离体相互作用研究。文献报道的研究蛋白与药物相互作用的方法主要有紫外光谱法、荧光光谱法、ITC和MST等。本论文通过原核表达技术获得SRBSDVP10靶标蛋白，以抗植物病毒药剂NNM及潜在的抗病毒化合物阿魏酸衍生物为配体小分子，用MST、荧光光谱等研究抗植物病毒剂与SRBSDVP10的相互作用。期望从药物和蛋白之间的相互作用层面，阐明药物的抗病毒机制，对设计和开发更高活性的化合物提供理论指导。22 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文第二章设计思想及技术路线2.1研究的目的和意义2001年，首次在广东省阳江市阳江县发现SRBSDV，在随后的几年其主要在我国长江以南地区爆发，SRBSDV对我国的水稻及玉米等作物造成了严重危害。研究抗植物病毒剂抗SRBSDV的作用机理，对建立抗SRBSDV化合物离体筛选模型和筛选更高活性抗SRBSDV的化合物具有重要指导意义。斐济病毒属的外壳蛋白在病毒感染寄主的过程中扮演着及其重要的角色，文献报道关于SRBSDVP10的研究主要集中在生物学功能上没有对其进行离体研究。本研究通过原核、表达和纯化获得SRBSDVP10蛋白，使用FT和MST开展抗病毒剂NNM等与P10靶标之间的相互作用研究。目的是揭示NNM抗SRBSDV的机制，并建立基于P10结构蛋白的化合物筛选模型，用于指导高活性化合物的合成，以期获得防控SRBSDV的高活性化合物。2.2拟解决的关键问题通过RT-PCR技术体外扩增SRBSDVP10基因，构建SRBSDVP10–pGEX6p-1原核表达载体。摸索SRBSDVP10诱导表达的条件，如菌液的D600、诱导剂(IPTG)的浓度、纯化蛋白所用的buffer盐浓度、pH值，利用蛋白纯化系统(GE)成功纯化SRBSDVP10蛋白。ppase酶将融合蛋白GST-SRBSDVP10中的GST-Tag切除，分离酶切蛋白溶液中的目的蛋白P10和GST-Tag，得到纯度较高的SRBSDVP10蛋白。2.3研究内容本研究是以SRBSDVP10蛋白为新靶标，进行抗植物病毒剂与靶标蛋白之间的相互作用研究。因此，需要提取感染SRBSDV的水稻总RNA，通过RT-PCR技术扩增得到编码P10蛋白的基因序列，构建pGEX6p-1-His-GST-SRBSDVP10原核表达载体。基于生物信息学研究结果，构建突变型新靶标P10蛋白的原核表23 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文达载体，用GEAKTA蛋白纯化系统纯化SRBSDVP10蛋白，利用质谱及10%SDS-PAGE验证SRBSDVP10蛋白。通过FT、MST技术研究抗植物病毒剂宁南霉素等与P10蛋白的相互作用，分析药剂与P10蛋白之间的作用力强弱，推断已有的抗病毒剂是否作用于SRBSDVP10。建立基于新靶标P10结构蛋白的抗SRBSDV化合物筛选的模型，研究阿魏酸及其衍生物与P10之间的相互作用，以期筛选出具有高亲和活性化合物。根据实验结果，构建3D-QSAR模型对阿魏酸衍生物进行结构和活性关系的评价。2.4技术路线图2-1论文研究的技术路线Fig.2-1Thetechnicalrouteofthepaper24 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文第三章材料与方法3.1实验材料3.1.1供试材料感染SRBSDV的水稻样品来自云南省陇川县；宁南霉素由四川成都生物所陈家任老师馈赠；阿魏酸衍生物由本实验室甘秀海博士生合成；SRBSDVWT-P9-1(WT-P9-1)、SRBSDVTR-C23-P9-1(TR-C23-P9-1)、SRBSDVWT-P7-1(WT-P7-1)蛋白的原核表达质粒由本实验室构建保存。SRBSDV野生型蛋白pGEX6p-1WT-His-GST-P10(WT-P10)和突变型蛋白pGEX6p-1Mu-275-His-GST-P10(P10-275)由本实验室体外克隆、表达及纯化。3.1.2实验试剂RNAisoplus总RNA提取试剂盒、ReverseTranscriptaseM-MLV试剂盒、DNA回收试剂盒、DpnI酶、T4aseDNA连接试剂盒、限制性内切酶BamHΙ和SmaΙ、预染蛋白Marker、Randomprimer(9mer)、DEPC、考马斯亮蓝R-250、DNAMarker、®TEMED、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺和PrimeSTARHSDNAPolymerase均购自TaKaRa(Dalian,China)，质粒小量提取试剂盒、DNA回收试剂盒为Tiangen公司产品，IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、DMSO购于Fisher公司，Tris、DTT、SDS、Glycine、氨苄霉素等抗生素购于上海生工生物公司。、YeastExtract(酵母提取物）、TryptonePowder(胰蛋白酶）、还原性谷胱甘肽来自BeijingscienceTechnologyco公司。巯基乙醇、氯化钠及其它所用试剂均为分析纯。3.1.3主要仪器设备美国，MilliporeMill-Q，超纯水制备仪；25 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文Bio-Rad，GelDoc2000电泳凝胶成像系统；上海博讯实业有限公司，GZX-9146MBE高温烘箱；上海博讯，YXQ-LS-50A高压灭菌锅；德国Sartorius，BS124S分析天平；德国(Eppendorf)，0.1-2.5μL、0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL移液器；上海雷磁，PHSJ-4A精密pH计，；青岛海尔集团，SC-316冷藏柜；苏坤，SKY-211C型摇床，；BIO-RAD，SDS-PAGE凝胶电泳仪；日本Hitachi，HITACHICR10MX高速冷冻离心机；美国GE，GEhealthpurifier10AKTApurifier蛋白纯化系统；宁波新芝生物科技股份有限公司，JY92-IIDN超声波细胞粉碎机；美国GE，GEhealthEGeneQuant-100紫外可见分光光度计；HORIBA，FluoroMax-4荧光光谱仪；美国GE，GEhealthITC200等温滴定量热仪；德国ThermoNanoTemper，MonolithNT.115微量热泳动仪；3.1.4常用缓冲溶液的配制(1)琼脂糖凝胶电泳液的配制(25×TAE)：Tris：60.5g、Na2EDTA.2H2O，9.3g、醋酸14.26ml，最后用ddH2O定容到500ml。使用时用ddH2O稀释为1×TAE。(2)1L的LB液体培养基含TryptonePowder10g、eastExtrac5g、NaCl10g、pH=7.0，在121°C条件下灭菌20min。26 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文(3)200ml的LB固体培养基含TryptonePowder2g、eastExtrac1g、NaCl2g、pH=7.0、琼脂糖粉3g，在121°C条件下灭菌20min。(4)1MTris-HCl：Tris121.14g，用ddH2O溶解，调节pH=8.0，并在室温下稳定30min后再次测量，最后用ddH2O定容到1L。(5)细胞裂解buffer：20mMTris、150mMNaCl、20mMimidazole、10%glycerin、5mM巯基乙醇，pH=8.0。(6)Ni-BufferA：20mMTris、150mMNaCl、20mMimidazole、10%glycerin、pH=8.0。(7)Ni-BufferB：20mMTris、150mMNaCl、350mMimidazole、10%glycerin、pH=8.0。(8)SECBuffer:20mMTris、150mMNaCl、pH=8.0。(9)5×loadingbuffer：250mMTris–HCl(pH=6.8)，10%(m/v)SDS、0.5%溴酚蓝(w/v)、50%甘油(v/v)，5%巯基乙醇(v/v)。(10)1×TGB电泳液含15.1gTris，94gglycine，5.0gSDS，使用时用ddH2O稀释到1×TGB。3.1.5引物设计根据NCBI中提交的序列(JQ034357.1)设计扩增SRBSDVP10所需引物，并送到上海生工生物进行合成，如表3-1所示。表3-1扩增SRBSDVP10基因序列使用的引物Tab.3-1PrimersusedtoamplifytheSRBSDVP10genesequence引物序列(5′→3′)SRBSDV-S10-FCGGGATCCATGGCTGACATAAGACTTGACATASRBSDV-S10-RTCCCCCGGGTCATCTGGTGACTTTATTTAACACAMu-275-GST-P10TTTGAGAAAGAACTAGGCGCTTTAGATGCTGACMu-275-GST-P10GTCAGCATCTAAAGCGCCTAGTTCTTTCTCAAA27 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文3.2实验方法与步骤3.2.1SRBSDVWT-P10蛋白的质粒构建、表达、纯化3.21.1水稻总RNA提取(1)取0.10g感染SEBSDV水稻组织，液氮下充分研磨至粉末状后转入1.5mLRNAasefreeEP管中，加入1.0mLRNAisoPlus振荡混匀；(2)提取液在4℃、12,000rpm条件下离心5min，尽可能多的吸取上清到1.5mLRNAasefreeEP管中；(3)加入1/5的上清总体积的体积氯仿，振荡使充分乳化、室温下静置5min到液体明显分层；(4)混合液在4℃、12,000rpm条件下离心15min，用移液器吸取上清到1.5mLRNAasefreeEP管中(不要吸到中间白色的蛋白层，影响提取的RNA纯度)；(5)加入与上清液等体积的异丙醇并混匀，使RNA能更好的沉淀需在-20℃静置20min；(6)混合液在4℃、12,000rpm条件下离心10min后倒掉上清液，并向EP管中加入75%乙醇1mL(DEPC水配制)对沉淀进行洗涤；(7)在4℃、12,000rpm条件下离心5min，倒掉上清液，移液器吸净残留的上清(尽量不要碰到管壁)室温放置数分钟以吹干其中的乙醇；(8)用DEPC水溶解提取的RNA，并检测分析RNA浓度和纯度。3.2.1.2SRBSDVWT-P10基因序列扩增(1)反转录反应将提取水稻总RNA根据ReverseTranscriptaseM-MLV试剂盒说明进行反转录实验，Randomprimer(9mer)、dNTPMixture均来自宝生物公司，取2µLRNA为模板，加入2µLRandomprimer，9.5µLDEPCH2O，充分混匀后，70℃水浴10min，冰浴2~3min后加入下如表3-2所示的各组分：28 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文表3-2反转录体系Tab.3-2Reversetranscriptionsystem组分×1(µL)5×MLV-Buffer4.00dNTP(10mM)1RNaseInhibitor(40u/µL)0.5M-MLVReverseTranscriptase(40u/µL)1充分混匀各组分，瞬时离心2-3s后用Bio-Rad基因扩增仪进行反RT反应。RT程序：30℃保温10min，42℃保温60min；70℃继续保温15min，即得1stcDNA，冻存至-20℃冰箱中备用。(2)PCR扩增®将反转录得到的1stcDNA根据PrimeSTARHSDNAPolymerase聚合酶说明书进行体外PCR扩增，根据表3-3的比例加入各反应组分，离心2-3s后用BIO-RAD型基因扩增仪进行PCR反应。PCR程序：98℃10min；35个循环进行98℃10s，58℃15s，72℃2min；72℃10min，取出反应产物于-20℃保存备用。表3-3PCR体系Tab.3-3PCRsystem组分×1(µL)5×primestarBuffer5dNTP(各2.5mM)2up0.5down0.5primestar0.251stcDNA1.0ddH2O15.75Total2529 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文(3)1.0%Agarose电泳1.0g的琼脂糖粉加入到100mL的1×TAE溶液，微波间隔加热到琼脂完全溶解，将溶解液降温至60℃后倒入50mL的琼脂糖板中，加入5µL的核酸染料(gelred)混合均匀，自然冷却20min。PCR产物上样到1.0%的琼脂糖凝胶上，120V的电压下电泳30min，1.0%Agarose在BIO-RAD成像仪下成像。(4)PCR产物的纯化回收1)切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，通过称量胶块重量计算溶解胶块所需溶胶液(BufferGM)体积。2)向胶块中加入所需BufferGM，室温下使胶块完全溶解，观察BufferGM颜色是否变化。3)将试剂盒中的SpinColume安置于CollectionTube上，吸取溶解目的DNABufferGM到SpinColume中并在室温12,000rpm离心1min，弃滤液。4)吸取600µL的漂洗溶液到SpinColume中，室温12,000rpm离心0.5min后弃滤液，再重复洗涤一次。5)将SpinColume安置于收集管上室温12,000rpm空离1min以去除残留的漂洗液。6)将含目的DNA的SpinColume安置于新的收集管上，在SpinColume膜的中央处加入30µL60℃预热的ElutionBuffer，室温静置2min，室温12,000rpm离心2min，洗脱目的DNA。7)将纯化回收的SRBSDVP10基因用GEGeneQuant-100进行浓度的测量。3.2.1.3SRBSDVP10原核表达载体的构建(1)双酶切SRBSDVP10基因和pGEX6p-1质粒pGEX6p-1质粒及回收的SRBSDVP10目的基因进行双酶切，所用的BamHΙ、BamHΙ酶均购于宝生物公司，根据表3-4加入各个反应体系后，于30℃条件下酶切3h后，再60℃灭活20min。30 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文表3-4双酶切SRBSDVP10基因和pGEX6p-1质粒Tab3-4DoubledigestionofSRBSDVP10geneandpGEX6p-1plasmid组分×1(µL)(DNA)×1(µL)(质粒)BamHΙ11SmaΙ1110×TBuffer11BSA22DNA/6P-1810ddH2O75(2)T4ase酶连SRBSDVP10基因和pGEX6p-1质粒将双酶切的SRBSDVP10基因和pGEX6p-1质粒用T4ase酶进行酶连，同时进行载体自连对照组(表3-5)。表3-5SRBSDVP10基因和pGEX6p-1质粒酶连体系Tab.3-5ConnectionsystemofSRBSDVP10andpGEX6p-1组分×1(µL)×1(µL)载体自连T4链接酶11T4Buffer22P10DNA3-6P-11.51.5ddH2O2.54.53.2.1.4重组质粒的转化、鉴定和测序(1)感受态细胞的制备1)将-80℃条件下保存的DH5ɑ及BL21(DE3)RIL菌液接种到无抗的LB固体平板，并于37℃下倒扣培养14-16h。2)分别挑取LB平板上DH5ɑ、BL21(DE3)RIL的单菌落接种于10mL新鲜LB液体培养基中(无抗性)，并在37℃、200rpm条件下培养至菌液的OD600nm=0.3~0.5A。3)将细菌培养液于冰上放置10min，4℃，4000rpm，离心5min，小心倒掉上清而不要将沉淀悬浮起。31 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文4)向收集的菌体中加入1/10细胞培养液体积(约1.5mL)灭菌、4℃预冷的0.1M的CaCl2溶液，使用移液器轻轻的重悬沉淀，切勿用力晃动，冰上静置5min。5)将上一个操作步骤所得的液体在4℃、4000rpm，离心5min后轻轻的尽可能多倒掉上清，并用移液器将沉淀轻轻的再一次重悬于1mL灭菌、4℃预冷的0.1M的CaCl2溶液中，所得细胞即为感受态细胞。6)在感受态细胞溶液中加入灭菌的终浓度为15-20%的甘油，轻轻的混合均匀后分装于1.5mL的离心管，100µL/支，液氮速冻后冻存至-80℃冰箱。(2)pGEX6p-1WT-His-GST-P10重组质粒的转化1)取出DH5ɑ感受态细胞冰上静置10min，加入重组的pGEX6p-1质粒并混匀，冰上静置30min后42℃热激90s，迅速冰浴2~3min。2)向每只试管中加入900µLLB新鲜培养基，37℃，培养50min，以使细菌复苏。3)室温下12,000rpm，离心1min，将细菌沉淀重悬100µL上清液中并涂+布于含有Amp抗性的LB平板上，37℃下倒扣过夜培养。(3)pGEX6p-1WT-His-GST-P10重组质粒的PCR验证+对Amp抗性的板上长出的单菌落(含重组SRBSDVP10基因)进行编号，用灭菌的枪头挑去少量的菌液于10µL的ddH2O中煮沸变性10min，作为模板进行菌液PCR验证，同时将确认感染SRBSDV的水稻总RNA反转录得到的cDNA做阳性对照，PCR体系如表3-6所示。表3-6RBSDVP10菌落PCR验证体系Tab3-6RBSDVP10colonyPCRvalidationsystem组分×1(µL)5×primestarBuffer5dNTP(各2.5mM)2up0.5down0.5primestar0.2532 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文续表3-61stcDNA1.0ddH2O15.75Total25PCR程序：98℃10min；35个循环进行98℃10s，58℃15s，72℃2min；72℃10min，取出反应产物于-20℃保存备用。(4)提取pGEX6p-1WT-His-GST-P10重组质粒+挑取菌液PCR验证条带亮度和阳性对照相当的单菌落接种到含Amp抗性(100µg/mL)的LB液体中，37℃、200rpm培养14-16h，使用Tiangen质粒提取试剂盒对重组质粒进行提取。1)500μLBLbuffer加入吸附柱CP3中并将CP3放入收集管内，室温下12,000rpm离心1mim后倒掉滤液，将CP3柱重新放回收集管中(请使用当天处理过的柱子)。2)室温，12,000rpm条件下离心收集1-5mL细菌培养液，倒掉上清液；加入250μL溶液P1(使用前加入RNaseA)对菌体沉淀进行充分的重悬。4)将250μL溶液P2加入到上一步所得的液体中并温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解(此时菌液应变得清亮粘稠)。为了避免质粒的DNA序列紊乱，不要剧烈震荡菌体裂解液，且所用时间不应超过5min。5)菌体裂解液中加入350μL溶液P3后立即温和地上下翻转6-8次，此时溶液中有白色絮状沉淀出现，室温、12,000rpm条件下离心10min。6)吸取上一步所得上清液(不要吸到沉淀)加入CP3柱中，在室温、12,000rpm离心0.5-1min后倒掉滤液，将CP3柱放入收集管中。7)600μL漂洗液PW加入CP3柱中(使用前加入无水乙醇)对质粒进行洗涤，在室温、12,000rpm条件下离心0.5-1min后倒掉滤液。再一次将CP3柱放入收集管中，并重复洗涤一次。8)CP3柱放入收集管中，由于残留的乙醇会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)。因此，室温、12,000rpm空离2min，处理CP3柱中残留的PWbuffer，并将CP3柱的盖子打开，室温放置20min，彻底晾干CP3柱中残余的PWbuffer。33 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文9)CP3柱放入新的EP管中，并向其中加入70μL左右的ddH2O后室温静置2min，12,000rpm离心2min收集质粒。10)GEGeneQuant-100测量质粒浓度。(5)双酶切验证pGEX6p-1-WT-His-GST-P10重组质粒将提取的重组质粒进行BamHΙ、SmaΙ双酶切及单酶切验证，同时进行空白pGEX6p-1质粒的单酶切及双酶切对照，酶切体系如表3-7所示，将酶切产物进行琼脂糖胶电泳。表3-7重组质粒P10和pGEX6p-1质粒双酶切验证Tab.3-7DoubleenzymecutreactionsystemofplasmidpGEX6p-1andrecombinantplasmidP10组分×1(µL)(PGEX×1(µL)(pGEX6p-16P-1)WT-His-GST-P10)BamHΙ11SmaΙ1110×TBuffer11BSA22质粒96ddH2O693.2.1.5Mu-275-His-GST-P10定点突变质粒的构建(1)Mu-275-His-GST-P10定点突变在NCBI中共下载了48条SRBSDVP10的氨基酸全序列，通过GeneDoc分析发现48条P10氨基酸全序列都较保守，但275、304、315这3个位置的氨基酸基本上只有两种组合方式，既是甘氨酸Gly、缬氨酸Val、丙氨酸Ala(GVA)或是丝氨酸Ser、丙氨酸Ala、苏氨酸Thr(SAT)，然而本论文构建得到的P10原核表达载体的这三位的氨基酸组合方式为SAV。因此选择将275位S突变为G。我们以pGEX6p-1-WT-His-GST-P10的质粒为模板，按照表3-8所示的体系构建pGEX6p-1-Mu-275-His-GST-P10载体。34 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文表3-8P10蛋白定点突变反应体系Tab.3-8P10proteinsite-directedmutagenesisreactionsystem组分×1(µL)5×primestarBuffer5dNTP(各2.5mM)2Up0.5down0.5primestar0.25Template1.0ddH2O15.75Total25PCR程序：98℃10min；35个循环进行98℃10s，58℃15s，72℃7min；72℃10min，取出反应产物于-20℃保存备用。(2)DpnI酶处理在PCR产物中加入酶处理，体系如下(表3-9)：表3-9DpnI酶消化反应体系Tab.3-9DpnIenzymedigestionreactionsystem组分×1(µL)DpnI1PCR产物210×CutSmart5bufferddH2O42总体积50程序为：37℃，30min；80℃，20min，反应结束后，将处理产物转化到DH5ɑ感受态细胞中，挑取阳性克隆进行测序验证。35 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文3.2.1.6SRBSDVWT-P10蛋白的诱导表达纯化(1)重组载体转化表达菌将构建的重组的衍生型pGEX6p-1WT-His-GST-P10和突变型质粒Mu-275-His-GST-P10分别转化至表达菌E.coliBL21(DE3)RIL和E.coliBL21(DE3)Rosetta感受态细胞中，操作参照3.2.3.2。(2)蛋白的诱导表达分别挑取pGEX6p-1WT-His-GST-P10E.coliBL21(DE3)RIL(WT-P10)单菌+落和Mu-275-His-GST-P10E.coliBL21(DE3)Rosetta单菌落到含Amp(0.1mg/ml)抗性50mLLB培养液中在，37℃、200rpm条件培养10-12h，取1ml菌液与60%的甘油按1:1的比例混合，菌种用液氮速冻后于-80℃冰箱中保存。+剩下菌液转接到1LLB(Amp0.1mg/ml)培养液37℃摇菌，到菌液的OD600为0.6-0.8左右，降温到16℃，1LLB中加入0.6mL(1MIPTG)诱导剂诱导表达14-16h。诱导表达的菌液在4℃、6,500rpm下离心10min后进行收集，液氮速冻存放于-80℃冰箱。(3)WT-His-GST-P10蛋白的纯化向2L菌体中加入80ml的裂解buffer重悬菌体，超声波细胞破碎机破碎30min(超声功率为35%、超声时间设定为5s、暂停时间设定为5s)。细胞破碎液在4℃、12,000rpm离心25min将上清和沉淀进行分离。用蠕动泵(GE)将上TM清液载样到5mlNi-NTAHisTrap亲和层析住，将载有目的蛋白Ni-NTAHisTMTrap柱接到AKTApurifier蛋白纯化系统上，60mlNi-BufferA冲洗掉非特异性结合的蛋白及其它细胞破碎物，再使用Ni-BufferB对蛋白进行线性洗脱。收集目的蛋白P10溶液，加入过量PreScission蛋白酶在4℃过夜酶切GST标签。120mLSECbuffer平衡HiLoadSuperdex200prepgrade柱子，将4℃过夜酶切GST标签的P10蛋白浓缩到2ml，过0.22μm滤膜后上样到AKTApurifier蛋白纯化系统上，分离目的蛋白WT-His-GST-P10和GST标签。36 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文3.2.1.710%SDS-PAGE鉴定WT-His-GST-P10目的蛋白10%SDS-PAGE分离胶按表3-10的比例加入各组分混合均匀后，将胶液灌入0.75mm厚的胶板内，并加入ddH2O液封，室温下自然凝结30min。按3-11的比例进行浓缩胶的配制，混合均匀后灌入分离胶上，立即插入对应型号的梳子，室温下自然冷却30min。表3-1010%SDS-PAGE分离胶的配制Tab3-10Preparationof10%SDS-PAGESeparationGel组分mLddH2O4.030%Acrylamide3.31.5MTris-HCL(Ph=2.58.8)10%过硫酸铵0.1TEMED0.0510%SDS0.1表3-11SDS-PAGE浓缩胶的配制Tab3-11PreparationofSDS-PAGEConcentratedGel组分mLddH2O2.130%Acrylamide0.51.0MTris-HCL(Ph=6.8)0.3810%过硫酸铵0.03TEMED0.00310%SDS0.03取每一步纯化过程中的样品20μL与5μL5×loadingbuffer混合后进行煮沸10min变性，取10μL变性样品加入到10%SDS-PAGE泳道中，使用1×SDS-PAGE缓冲液在60V下进行电泳20min将所有的样品压缩到分离胶，再37 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文将电压加到120v电泳60min对样品进行电泳分离。考马斯亮蓝染色凝胶以鉴定蛋白质，考马斯亮蓝漂白液对凝胶进行脱色。3.2.1.8高分辨质谱仪鉴定WT-P10目的蛋白将目的蛋白WT-P10脱盐并溶解在储存缓冲液[1M尿素，10mM二硫苏糖醇(DTT)]中，将100μL1mg/mlWT-P10加入到100μL55mM碘乙酰胺和50mMNH4HCO3(pH=8.0)混合物中，并在室温下黑暗孵育1h。将5μg(20:1,w/w)胰蛋白酶(promega,USA)加入到WT-P10蛋白质溶液中并在37℃下过夜酶解，酶解蛋白液在冷冻干燥机内冻干2h后用1%甲酸水溶解蛋白固体。对于质谱(MS)分析，根据文献报道的方法，用5600TripleTOFMS(FosterCity,USA)进[86,87]行蛋白多肽的鉴定和分析。3.2.2WT-P10与WT-P9-1、TR-C23-P9-1及WT-P7-1的体外互作3.2.2.1MST研究WT-P10与WT-P9-1、TR-C23-P9-1及WT-P7-1的体外互作样品准备：酶切GST标签后的WT-P10蛋白溶解在SECbuffer中(含有Tris)，需要用desaltingcolumn(GE)将buffer交换成MSTbuffer(40mMNa2HPO4,10mMNaH2PO4,300mMNaCl,0.05%Tween-20,pH=8.0)。根据MonolithNT™ProteinLabelingKitRED-NHS试剂盒说明书对WT-P10蛋白进行荧光标记。取100μL浓度为10μM的WT-P10蛋白与6μL荧光染料NT-647-NHS(470μM)在室温(25℃)黑暗条件下反应30min，用GravityFlowColumnB将未标记的蛋白和染料分开。MST的检测条件：ExcitationPower:20%、MSTPower:80%、temperature:26℃。对标记好的WT-P10蛋白进行荧光强度扫描，最终确定WT-P10蛋白的荧光强度在300-600counts范围内，属于最佳的检测范围。MST检测：WT-P9-1蛋白的最大滴定浓度为75μM、TR-C23-P9-1蛋白的最大滴定浓度为100μM、WT-P7-1蛋白的最大滴定浓度为80μM，分别将其依次进行1：1的梯度稀释，后加入等浓度等体积标记WT-P10蛋白于室温下孵育1038 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文min后，开始进行MST检测。最后用AffinityAnalysissoftware对数据进行处理分析。3.2.2.2ITC研究WT-P10与WT-P9-1、TR-C23-P9-1及WT-P7-1的体外互作样品准备：由于ITC要求滴定分子和被滴定的分子应溶解在同样的buffer中，所以将滴定所需蛋白全部溶解在40mMNa2HPO4、10mMNaH2PO4、300mMNaCl、pH8.0的PBSbuffer中。WT-P10蛋白浓度为40μM，滴定蛋白WT-P9-1浓度为75μM、TR-C23-P9-1为100μM、WT-P7-1P9-1为80μM。ITC的条件为：TitalInjections：20；CellTemperature：298K；ReferencePower(μcal/s)(0-12.65)：5InitialDelay(sec)：StirringSpeed(rpm)：750。ITC操作：(1)打开操作软件MICROCALITC200；(2)用水和溶解蛋白的buffer清洗Pipette及Cell；(3)用注射器吸取350μLP10蛋白，注入cell中，注意不要产生气泡；(4)以同样的步骤在参照池内加入ddH2O；(5)取60μL滴定分子吸入到上样针中；(6)将连接头旋出，放回指定的位置，把Pipette插入样品池中，开始进行ITC检测。3.2.3WT-P10蛋白与抗病毒剂的相互作用3.2.3.1荧光光谱法研究WT-P10蛋白与抗病毒剂的相互作用样品准备：WT-P10蛋白溶解在SECBuffer中，浓度5μM。抗病毒小分子用DMF溶解为40mM的母液后使用SECBuffer进行稀释到2mM(含5%DMF,V/V)。光谱条件：使用FluoroMax®-4P(HORIBAScientific,Paris,France)进行荧光光谱研究。激发波长：275nm，激发和发射狭缝：5nm，温度：298K，扫描范围：290nm-450nm。实验操作：取500μLWT-P10蛋白于荧光皿中，每次运行时，抗病毒剂(NNM和阿魏酸衍生物)的浓度设定为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,20.0μM。使用323nm处的荧光强度计算结合常数KA。39 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文3.2.3.2MST研究WT-P10蛋白与抗病毒剂的相互作用样品准备：WT-P10蛋白标记参照3.2.2.1。抗病毒小分子用DMF溶解为40mM的母液，使用MSTBuffer进行稀释到2mM(含5%DMF,V/V).MST的检测条件：ExcitationPower:20%、MSTPower:80%、temperature:25℃。将标记好的P10蛋白进行荧光强度的扫描，最终确定P10蛋白的荧光强度在300-600counts范围内，属于最佳的检测范围。实验操作：取16个PCR管，对抗病毒剂进行1:1梯度稀释后与等体积等浓度的标记的蛋白混合于室温下反应5min(小分子浓度：500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49及0.24μM)。3.2.4WT-P10蛋白与阿魏酸衍生物构效关系分析3.2.4.1分子的构建、能量优化和叠合34个阿魏酸衍生物的分子结构均在Sybyl-X2.0绘制。在未知受体的情况下，常取分子的低能构想为其活性构想。因此需要将所有的小分子进行能量优化，利用局部低能构象(Minimize)搜索方法，选用Powell，Gradient减低到0.005Kcal/(mol*A)，迭代次数为1000次，ForceField选用Tripos场优化，加载Gasteiger-Hückel电荷，最终得到能量最低的化合物组成的F34.mdb分子库。选取34个阿魏酸衍生物中与P10亲和力最强的F27作为叠合的模板分子并采用AligamentDatabase进行叠合(如图3-1)。40 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图3-1阿魏酸衍生物叠合图；(A)叠合骨架；(B)选择化合物F27作为分子叠合模板Fig.3-1Alignmentanalysis.(A)Alignmentcore.(B)CompoundF27chosenasthetemplateforAlignments3.2.4.2CoMFA和CoMSIA模型建立将34个阿魏酸衍生物对WT-P10的亲和力KA作为研究的对象，并构建相应的分子表单。在表格第2列，点击CalculateProperties择CoMFA或CoMSIA，Calculate；此时Training表格中新添加了CoMFA列和CoMSIA列。在建立相应的模型的过程中，先应用交叉验证抽一法运行得到得到最佳组分数和较差验证系22数q，通常认为q>0.5，模型具有可信的预报能力；然后再进行非交叉验证的分析，即得到相应的3D-QSAR模型，运行ViewQSAR可以得到相应场的等势图。41 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文第四章结果与讨论4.1重组质粒的构建4.1.1目的片段的PCR扩增根据提取感染SRBSDV的水稻组织的总RNA，并对RNA进行RNA胶电泳分析RNA的纯度，结果如图4-1所示，由图可知提取的RNA较完整，清楚的看到28S、18S、5S条带。图4-1RNA电泳图Fig.4-1RNAagarosegelelectrophoresis根据设计的特异性引物将RNA进行RT-PCR实验，并将RT-PCR得到的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。结果如图4-2，由图可以看出PCR产物的条带与目的条带大小一致(SP10=1,797bp)且无非特异性条带。图4-2SRBSDVP10全基因扩增结果。注：M：DNAmarker；泳道1-：SRBSDVP10基因Fig.4-2PCRamplificationresultsofSRBSDVP10.LineM,DNAMarkers;Line1-2,SRBSDVP10genes42 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文4.1.2pGEX6p-1WT-His-GST-P10重组质粒的鉴定4.1.2.1菌液PCR验证pGEX6p-1WT-His-GST-P10重组载体将BamHΙ和SmaΙ双酶切的SRBSDVP10基因及pGEX6p-1载体用T4ase进行链接，并转化进DH5α感受态细胞中。对氨苄抗性的LB平板上长出的单菌落进行菌液PCR验证，并用确定感染SRBSDV的水稻总RNA反转录得到的cDNA作为阳性对照，验证结果如图4-3所示，由图可知，所有的PCR产物的条带都在1,000-2,000bp的范围内，符合SRBSDVP10基因的大小，且泳道1和2的PCR产物亮度与阳性对照相当，初步判断重组质粒构建成功。图4-3重组质粒菌液PCR验证结果注：M：DNAmarker；泳道+：阳性对照；泳道1-6：1-6号重组质粒的单菌落Fig4-3TheresultsoftherecombinantplasmidwereverifiedbyPCRLineM,DNAMarkers;Line+:Positivecontrol;Line1-6,SinglecoloniesofrecombinantplasmidNo.1-6.4.1.2.2双酶切验证pGEX6p-1WT-His-GST-P10重组载体将菌液PCR验证得到的1-2号单克隆进行培养并提取重组质粒，对质粒进行BamHΙ和SmaΙ双酶切及SmaΙ单酶切验证，并进行pGEX6p-1空载体的酶切阴性对照，将所得到的酶切产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，结果如图4-4所示。由图4-4中的泳道6和9可以看出双酶切后均产生了与SRBSDVP10大小相当的条带及空质粒条带，然而泳道5和7是对重组质粒进行单酶切，并没有得到与SRBSDVP10大小相当的条带且条带位置较泳道6和9高，而又低于泳道2对pGEX6p-1进行单酶切的条带，说明pGEX6p-1WT-His-GST-P10重组载体构建成功。43 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图4-4pGEX6p-1WT-His-GST-P10重组载体的酶切验证结果注：M：DNAmarker；泳道1：pGEX6p-1质粒；泳道2：pGEX6p-1单酶切；泳道3：pGEX6p-1双酶切；泳道4、7：pGEX6p-1WT-His-GST-P10重组载体；泳道5、8：pGEX6p-1WT-His-GST-P10重组载体单酶切；泳道6、9：pGEX6p-1WT-His-GST-P10重组载体双酶切Fig.4-4pGEX6p-1WT-His-GST-P10recombinantvectordigestionresultsLineM,DNAMarkers;Line1,pGEX6p-1vectorsnegativecontrol;Line2,pGEX6p-1vectorsweredigestedbySmaΙ;Line3,pGEX6p-1vectorsweredigestedbySmaΙandBamHΙ;Line4,7,pGEX6p-1-SRBSDVP10plasmids;Line5,8,pGEX6p-1-SRBSDVP10plasmidsweredigestedbySmaΙ;Line6,9,pGEX6p-1-SRBSDVP10plasmidsweredigestedbySmaΙandBamHΙ.4.1.2.3pGEX6p-1WT-His-GST-P10重组载体的测序结果将双酶切验证为阳性的质粒送到上海生工生物公司进行基因序列测定，测序结果与NCBI中提交的序列进行比对分析。序列分析表明，SRBSDVP10的扩增子与其它公开的基因序列(GenBank登录号JF803426.1)有99-100％的基因相似性(图4-5)。所有结果表明成功构建了pGEX6p-1WT-His-GST-P10质粒。图4-5SRBSDVP10序列比对结果Fig4-5SRBSDVP10sequencealignmentresults4.1.3.定点突变重组载体的构建根据设计的特异性引物，以pGEX6p-1WT-His-GST-P10质粒为模板进行定点突变质粒pGEX6p-1-Mu-275-His-GST-P10的构建，PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4-6所示。44 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图4-6构建pGEX6p-1-Mu-275-His-GST-P10重组质粒。注：M：DNAmarker，泳道1~2：pGEX6p-1-Mu-275-His-GST-P10Fig.4-6ConstructionofpGEX6p-1-Mu-275-His-GST-P10recombinantplasmid.M:DNAmarker;lane1and2representpGEX6p-1-Mu-275-His-GST-P10.将定点突变的PCR产物用DnpΙ酶消化后转化到DH5α感受态细胞后，对单菌落进行培养后将菌液送到上海生工生物进行基因测序，测序得到的碱基序列进行翻译后得到氨基酸序列，将突变的氨基酸序列与pGEX6p-1WT-His-GST-P10的氨基酸序列进行比对，结果如图4-7所示，由此确定pGEX6p-1-Mu-275-His-GST-P10的原核表达载体构建成功。图4-7pGEX6p-1-Mu-275-His-GST-P10氨基酸序列比对结果Fig.4-7SequencealignmentresultsofpGEX6p-1-Mu-275-His-GST-P104.2pGEX6p-1WT-His-GST-P10蛋白的表达小试将pGEX6p-1WT-His-GST-P10质粒转入BL21(DE3)RIL、BL21(DE3)gold、BL21(DE3)star表达菌进行诱导表达小试，分别挑取单菌落进行培养后进行诱导表达，并进行未加IPTG的阴性对照。实验组和阴性对照组表达菌进行破碎裂解，取其全细胞裂解后上清液、重悬沉淀后用10%SDS-PAGE电泳鉴定，结果如图4-8所示。SRBSDVP10蛋白大小为62.6KDa、GST标签大小为26KDa，融合45 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文表达后大小为88.6KDa左右，由图可知三个宿主菌表达的上清液中均有特异性表达的条带，位置位于100KDa和70KDa之间。因此，pGEX6p-1WT-His-GST-P10蛋白表达成功，且为可溶表达。图4-8pGEX6p-1WT-His-GST-P10蛋白诱导表达小试注：M：蛋白Marker；1-2：BL21(DE3)RIL表达菌上清、沉淀；3-4：BL21(DE3)RIL阴性对照上清液、沉淀；5-6：BL21(DE3)gold表达菌上清、沉淀；7-8：BL21(DE3)gold阴性对照上清液、沉淀；9-10：BL21(DE3)star表达菌上清、沉淀；11-12：BL21(DE3)star阴性对照上清液、沉淀。Fig.4-8TheexpressionresultofpGEX6p-1WT-His-GST-P10MrepresentsProteinMarker;lane1:BL21(DE3)RILhostexpressionsupernatant;lane2:BL21(DE3)RILhostexpressionprecipitate;lane3:BL21(DE3)RILhostexpressionnegativecontrolsupernatant;lane4:BL21(DE3)RILhostexpressionnegativecontrolprecipitate;lane5:BL21(DE3)goldhostexpressionsupernatant;lane6:BL21(DE3)goldhostexpressionsupernatant;;lane7:BL21(DE3)goldhostexpressionnegativecontrolsupernatant;lane8:BL21(DE3)goldhostexpressionnegativecontrolprecipitate;lane9:BL21(DE3)starhostexpressionsupernatant;lane10:BL21(DE3)starhostexpressionsupernatant;;lane11:BL21(DE3)starhostexpressionnegativecontrolsupernatant;lane12:BL21(DE3)starhostexpressionnegativecontrolprecipitate.4.3pGEX6p-1WT-His-GST-P10蛋白纯化选择将BL21(DE3)RIL作为表达pGEX6p-1WT-His-GST-P10蛋白的宿主菌，并进行扩大诱导表达和纯化实验，纯化结果如图4-9所示。由图4-9A可知，在使用Ni-NTA进行亲和纯化时，在A280nm下出现了单一的吸收峰；图4-9B可知在酶切掉GST标签后，使用SEC对目的蛋白P10和GST标签进行分离，结果发现P10蛋白在溶液中为混聚体，分别在45,50及70ml处出峰，而GST标签在80ml处出峰。46 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图4-9P10蛋白纯化(A)Ni-NTA柱对大肠杆菌BL21(DE3)RIL表达的WT-P10蛋白进行纯化；(B)GF200分离WT-P10蛋白和GST-TagFig.4-9.TargetproteinP10purificationresultanalysis.(A)PurifiedP10byNi-NTAcolumn.(B)SeparatingthetargetproteinP10andGST-TagsbySEC.4.4WT-P10蛋白的鉴定4.4.110%SDS-PAGE鉴定WT-P10蛋白取纯化过程中的每一步样品进行煮沸变性后用于10%SDS-PAGE电泳，结果如图4-10所示。由图4-10中泳道2可以看出经过Ni-NAT亲和柱纯化得到较单一的条带，其大小符合融合蛋白的大小88.6KDa，泳道3为加入过量的酶切酶PreScission蛋白酶过夜酶切后的蛋白混合液，其中含有符合目的蛋白P10大小在70-55KDa之间的条带，以及GST标签26KDa条带，泳道4为SEC分离目的蛋白WT-P10和GST标签后的目的蛋白条带单一，确定WT-P10蛋白纯化成功。图4-10蛋白SDS-PAGE凝胶电泳M.Maker；1.菌液上清；2.NI-NTA纯化P10蛋白；3.酶切GST-Tag；4.P10蛋白。Fig.4-10IdentificationtheP10proteinusing10%SDS–PAGE.M:marker.Lane1:supernatants.Lane2:PurificationP10byNi-NTAcolumn.Lane3:removedGST-tagbyPreScissionprotease.Lane4:PurificationP10bySEC.47 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文4.4.2MS鉴定WT-P10蛋白为了进一步确定酶切后的蛋白是否为目的蛋白WT-P10，采用MS对蛋白进行鉴定。通过对肽段进行比对分析，结果确定纯化的蛋白为目的蛋白WT-P10，肽段与已经报道的WT-P10蛋白覆盖率高达98.9%。4.5WT-P10蛋白聚集状态分析酶切掉融合蛋白pGEX6p-1WT-His-GST-P10上的GST标签后，发现目的蛋白P10在溶液中呈现混聚体。为了阐明WT-P10形成混聚体与SECbuffer的pH值及盐浓度、有无还原剂(β-Me)存在是否相关。利用分子筛GF200研究了P10在不同SECbuffer(表4-1)及有无还原剂溶液中的聚集状态，结果如图4-11和图4-12所示。由4-11和图4-12可以看出WT-P10在不同的SECBufer溶液中为多聚体与SECbuffer的pH值、盐浓度和还原剂(β-Me)无关，由此推断WT-P10形成多聚体不是通过形成分之间二硫键，可能是通过分子间其他作用力，如氢键、静电等。表4-1SECbuffer的组成Tab4-1ThecompositionoftheSECbufferNO.组成120mMTris,pH7.5220mMTris,pH8.0320mMTris,150mMNaCl,pH8.0420mMTris,500mMNaCl,pH8.0520mMPBS,pH8.0620mMPBS,150mMNaCl,pH8.048 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图4-11P10在不同SECbuffer中的聚集状态(A)20mMTris,pH7.5；(B)20mMTris,pH8.0;(C)20mMTris,150mMNaCl,pH8.0;(D)20mMTris,500mMNaCl,pH8.0;(E)20mMPBS,pH8.0;(F)20mMPBS,150mMNaCl,pH8.0Fig.4-11.P10stateofaggregationanalysisindifferentSECbuffer.(A)20mMTris,pH7.5;(B)20mMTris,pH8.0;(C)20mMTris,150mMNaCl,pH8.0;(D)20mMTris,500mMNaCl,pH8.0;(E)20mMPBS,pH8.0;(F)20mMPBS,150mMNaCl,pH8.0.图4-12有无还原剂(β-Me)存在时WT-P10在20mMTris,150mMNaCl,pH8.0中的聚集状态(A)纯在还原剂(β-Me);(B)不存在还原剂(β-Me)Fig.4-10.Theinfluenceofreducingagents(β-mercaptoethanol)onWT-P10aggregationinsolution(20mMTris,150mMNaCl,pH8.0).(A)Absenceβ-mercaptoethanol.(B)Presenceβ-mercaptoethanol.49 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文4.6pGEX6p-1Mu-275-His-GST-P10蛋白纯化根据诱导表达纯化pGEX6p-1WT-His-GST-P10蛋白的条件对pGEX6p-1-Mu-275-His-GST-P10蛋白进行诱导纯化，结果如图4-13和图4-14所示。由图4-13和图4-14可知，纯化的P10-275蛋白与WT-P10大小一致，且在溶液中也为混聚体。图4-13Mu-275-GST-P10纯化结果(A)Mu-275-GST-P10Ni-NTA柱纯化图;(B)GF200分析纯化Mu-275-GST-P10Fig.4-13.Mu-275-GST-P10proteinpurificationresultanalysis.(A)PurifiedP10-275byNi-NTAcolumn.(B)SeparatingthetargetproteinP10-275andGST-TagsbySEC.图4-14Mu-275-GST-P10SDS-PAGE电泳结果注：M.Marker;1.上清液;2.NI-NTA纯化Mu-275-GST-P10蛋白;3.ppase酶切GST-Tag;4.Mu-275-GST-P10蛋白Fig.4-14IdentificationtheP10-275proteinusing10%SDS–PAGE.M:marker.Lane1:supernatants.Lane2:PurificationP10-275byNi-NTAcolumn.Lane3:removedGST-tagbyPreScissionprotease.Lane4:PurificationP10-275bySEC.50 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文4.7WT-P10与WT-P9-1、TR-C23-P9-1及WT-P7-1体外互作研究4.7.1MST研究WT-P10与WT-P9-1、TR-C23-P9-1及WT-P7-1体外互作研究在WT-P9-1蛋白的最大滴定浓度为75μM时，用AffinityAnalysissoftware对数据进行分析，结果如图4-13所示，发现WT-P9-1与WT-P10的体外互作结合常数KD=11.6μΜ(图4-15A)。将WT-P9-1蛋白的C端23个氨基酸截掉，构建TR-C23-P9-1蛋白原核表达载体，MST研究TR-C23-P9-1的最大滴定浓度为100μM，TR-C23-P9-1与WT-P10在体外没有互作，结果如图4-15B所示。结果表明P9-1蛋白的C端23个氨基酸在P9-1与WT-P10这两个蛋白的互作中发挥着重要的作用。WT-P7-1蛋白的最大滴定浓度为80μM，用AffinityAnalysissoftware对数据进行处理，结果如图4-15C所示，分析得到WT-P7-1与WT-P10两个蛋白在体外无互作发生。图4-15MST分析WT-P10与其他蛋白体外互作(A)MST分析WT-P9-1与WT-P10的体外互作；(B)MST分析TR-C23-P9-1与WT-P10的体外互作；(C)MST分析WT-P7-1与WT-P10的体外互作Fig4-15MSTanalysisofWT-P10interactionwithotherproteinsinvitro(A)MSTanalysisofWT-P9-1interactionwithWT-P10invitro;(B)MSTanalysisofTR-C23-P9-1interactionwithWT-P10invitro;(C)MSTanalysisofWT-P7-1interactionwithWT-P10invitro51 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文4.7.2ITC研究WT-P10与WT-P9-1、TR-C23-P9-1及WT-P7-1体外互作研究MST研究发现WT-P9-1与WT-P10在体外存在互作，通过ITC进一步研究了两者之间的互作关系。WT-P10蛋白浓度为40μM，P9-1浓度为75μM时进行ITC滴定分析，结果如图4-16A所示。对数据进行分析处理得到结合常数4-1KA=2.0×10M，与MST结果相符合，得出WT-P9-1与WT-P10之间的亲和力为μM。此外，ITC研究发现TR-C23-P9-1蛋白与WT-P10(图4-16B)、WT-P7-1(图4-16C)在体外无互作。所有的ITC分析结果与MST研究结果相统一。图4-16ITC分析WT-P10与其他蛋白体外互作(A)ITC分析WT-P9-1与WT-P10的体外互作；(B)ITC分析TR-C23-P9-1与WT-P10的体外互作；(C)ITC分析WT-P7-1与WT-P10的体外互作Fig4-16ITCanalysisofWT-P10interactionwithotherproteinsinvitro(A)ITCanalysisofWT-P9-1interactionwithWT-P10invitro;(B)ITCanalysisofTR-C23-P9-1interactionwithWT-P10invitro;(C)ITCanalysisofWT-P7-1interactionwithWT-P10invitro文献报道SRBSDVP9-1是病毒的基质蛋白对于病毒颗粒的形成具有很重要的作用，采用透射电镜和激光共聚焦显微镜细胞对昆虫寄主细胞表达的P9-1蛋白进行观察，发现病毒复制的过程中包含SRBSDVP9-1蛋白、病毒RNA、[88]SRBSDVP10蛋白及病毒的其他粒子成分。利用MST、ITC技术在离体的条件下对WT-P9-1蛋白及WT-P10蛋白之间的亲和力进行分析，发现这两个蛋白在体外存在互作，亲和力为μM，证明了SRBSDVP10外壳蛋白在SRBSDV的复制及传播过程中具有重要的作用，且P9-1的C端23个氨基酸在这两个蛋白的互作中发挥着重要的作用，但WT-P9-1蛋白及WT-P10蛋白具体的互作机制我们目前尚未研究清楚。52 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文4.8抗病毒剂与WT-P10相互作用研究4.8.1荧光光谱法研究病毒剂与WT-P10相互作用研究利用荧光光谱法研究抗病毒剂毒氟磷、氨基寡糖、香菇多糖、盐酸吗啉胍、病毒唑、宁南霉素与WT-P10互作，荧光滴定结果如图4-17所示。由图4-17可以看出，毒氟磷、氨基寡糖、香菇多糖、盐酸吗啉胍、病毒唑对WT-P10蛋白不存在荧光猝灭的作用。图4-17P10与抗病毒剂的荧光光谱图(A)毒氟磷滴定WT-P10；(B)氨基寡糖滴定WT-P10；(C)香菇多糖滴定WT-P10；(D)盐酸吗啉胍滴定WT-P10；(E)病毒唑滴定WT-P10；(F)5%DMFBuffer滴定WT-P10(阴性对照)Fig4-17FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofantiviralagents(A)DFLTitrationWT-P10;(B)Amino-oligosaccharidetitrationWT-P10;(C)LentinanpolysaccharidetitrationWT-P10;(D)MorpholineguanidinehydrochloridetitrationWT-P10;(E)RibavirintitrationWT-P10;(F)5%DMFBuffertitratedWT-P10(negativecontrol)研究发现，抗病毒剂NNM能使WT-P10的内源性荧光发生淬灭，通过计算5-1,得到亲和力KA=6.17×10M，结合位点约为n=1.20(图4-18A)。以NNM为对照药剂建立了以WT-P10为新靶标的抗SRBSDV药剂的离体筛选模型，通过荧光光谱分析发现阿魏酸FA(图4-18C)及其衍生物F27(图4-18B)对WT-P10也存5-15-1在荧光淬灭，亲和力与NNM相当，KA=1.45×10M和KA=5.75×10M，结合位点约为n=1.22和n=1.33，相互作用数据列于表4-2。53 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图4-18P10与抗病毒剂的荧光光谱图(A)NNM滴定WT-P10;(B)F27滴定WT-P10；(C)FA滴定WT-P10Fig4-18FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofantiviralagents(A)NNMtitrationWT-P10;(B)CompoundF27titrationWT-P10;(C)CompoundFAtitrationWT-P10;表4-2WT-P10与抗病毒剂结合常数Tab4-2BindingconstantofWT-P10andantiviralagentsStern–VolmerquenchingconstantsBindingparametersNO.−1−1−1−1KKq(M·S)KSV(M)RKA(M)nRD(μM)1245WT-P10+NNM5.92×105.92×100.996.17×101.200.994.271245WT-P10+F271.56×101.56×100.985.75×101.330.997.811245WT-P10+FA1.05×101.05×100.991.45×101.220.989.05荧光滴定研究发现阿魏酸及其衍生物与WT-P10存在较强的亲和力，研究其他33个阿魏酸衍生物与WT-P10的相互作用，对数据进行分析后列于表4-3。对数据进行分析，发现在R2取代基为芳香环上引入吸电子基团有利于提高化合物与P10的亲和力，如F1(4-F-Ph)>F5(4-OCH3-Ph)，空间位阻小的吸电子基团较空间位阻大的基团结合常数大，如F1(4-F-Ph)>F2(4-Cl-Ph)，F27(4-F-Ph)>F28(4-Cl-Ph)；同一取代基在不同位置其结合常数也有差异，如含F取代的有对位>邻位>间位，如F27(4-F-Ph)>F28(2-F-Ph)>F26(3-F-Ph)。总之，在保留阿魏酸的羧基结构和引入空间位阻较小的基团有利于增加化合物与P10的亲和力。54 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文表4-3阿魏酸衍生物与WT-P10的结合常数KATab4-3ThebindingconstantofferulicacidderivativeandWT-P10compoundStern-VolmerquenchingconstantsBindingparameters−1−1−12−12KSV(M·S)Kq(M)RKA(M)Rn4124F10.86×100.86×100.991.95×100.991.074124F21.15×101.15×100.991.55×100.991.034124F31.19×101.19×100.991.78×100.991.034123F40.98×100.98×100.992.82×100.990.884123F50.91×100.91×100.980.78×100.990.774124F60.83×100.83×100.991.05×100.991.014123F71.09×101.09×100.996.61×100.990.954123F81.14×101.14×100.989.33×100.990.984123F90.64×100.64×100.991.35×100.990.854123F100.69×100.69×100.990.65×100.990.784123F110.63×100.63×100.995.13×100.9914123F121.04×101.04×100.995.62×100.990.934123F131.10×101.10×100.996.03×100.990.994123F140.80×100.80×100.991.07×100.990.814123F151.00×101.00×100.992.00×100.990.854123F160.91×100.91×100.995.75×100.990.964123F170.90×100.90×100.994.68×100.990.944123F180.78×100.78×100.993.39×100.990.924124F191.11×101.11×100.991.02×100.990.994123F200.93×100.93×100.994.79×100.990.944123F210.97×100.97×100.992.69×100.990.8955 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文续表4-34123F230.98×100.98×100.991.07×100.990.794123F241.07×101.07×100.983.55×100.990.904123F251.23×101.23×100.994.57×100.990.914124F261.06×101.06×100.981.29×100.991.01445F282.45×102.45×100.991.55×100.991.174125F292.27×102.27×100.991.58×100.991.174125F302.05×102.05×100.991.32×100.991.164123F311.10×101.10×100.992.51×100.990.864123F320.76×100.76×100.992.88×100.990.914123F330.98×100.98×100.993.89×100.990.914123F341.13×101.13×100.981.95×100.990.834123F351.11×101.11×100.993.16×100.990.894.8.2MST研究病毒剂与WT-P10相互作用研究基于荧光光谱的研究结果，用MST技术验证NNM等抗病毒剂和FA、F1、F27、F34化合物与WT-P10之间的相互作用。通过MST研究发现抗病毒剂毒氟磷、氨基寡糖、香菇多糖、盐酸吗啉胍、病毒唑对WT-P10蛋白没有相互作用(图4-19)。NNM、FA、F1、F27、F34与WT-P10之间的结合力分别是KD=4.27,9.05、46.67、7.81、457.12μM，结果如图4-20所示。56 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图4-19WT-P10与抗病毒剂MST分析结果(A)毒氟磷滴定WT-P10；(B)氨基寡糖滴定WT-P10；(C)香菇多糖滴定WT-P10；(D)盐酸吗啉胍滴定WT-P10；(E)病毒唑滴定WT-P10；(F)5%DMFBuffer滴定WT-P10(阴性对照)Fig4-19WT-P10andantiviralMSTanalysisresults(A)DFLtitrationWT-P10;(B)Amino-oligosaccharidetitrationWT-P10;(C)LentinanpolysaccharidetitrationWT-P10;(D)MorpholineguanidinehydrochloridetitrationWT-P10;(E)RibavirintitrationWT-P10;(F)5%DMFBuffertitratedWT-P10(negativecontrol)图4-20MST分析WT-P10与抗病毒剂之间的相互作用(A)NNM滴定WT-P10；(B)F27滴定WT-P10；(C)FA滴定WT-P10；(D)F1滴定WT-P10；(E)F34滴定WT-P10Fig4-20MSTanalysisoftheinteractionbetweenWT-P10andantiviralagents(A)NNMtitrationWT-P10;(B)F27titrationWT-P10;(C)FAtitrationWT-P10;(D)F1titrationWT-P10;(E)F34titrationWT-P10.57 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文通过MST和荧光光谱研究发现NNM和F27与P10的亲和力达到μM级，属于强结合。为了研究NNM及F27与WT-P10的作用机制，利用分子筛对NNM和F27处理的WT-P10蛋白进行聚集状态分析。2mL60μM的WT-P10与NNM/F27混合(终浓度为1mM)于4℃下孵育1h，SEC分析结果如图4-21所示。由图4-21可以看出，NNM及F27可以改变WT-P10在溶液(20mMTris,150mMNaCl,pH8.0)中的聚集状态，使WT-P10在溶液中呈现较单一的峰。而进行的DMSO的对照组及buffer处理组(阴性对照)中的P10的聚集状态并没有发生改变，由此推断说明NNM可能通过改变WT-P10的聚集状态从而影响其在病毒复制及传播中的功能而起到抗SRBSDV的作用。图4-21NNM级F27对WT-P10聚集状态的影响(A)NNM+WT-P10处理组；(B)F27+WT-P10处理组；(C)5%DMSO+P10处理组；(D)buffer+P10处理组。Fig.4-21.InfluenceofF27andNNMonP10proteinaggregation.(A)InfluenceofNNMonP10proteinaggregation.(B)InfluenceofF27onP10proteinaggregation.(C)DMSOtreatmentcontrolexperiment.(D)Negativecontrol.4.9P10-275蛋白与抗病毒剂的相互作用研究4.9.1荧光光谱法研究P10-275蛋白与抗病毒剂的相互作用基于WT-P10与NNM及阿魏酸衍生物的研究结果，选取NNM及荧光光谱研究得出与与WT-P10亲和力为强、中等、弱的F1、F27、F34进行抗病毒剂与P10-275蛋白的相互作用研究。小分子的浓度依次为0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、58 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文12.0、14.0、16.0、18.0和20.0μM，P10-275蛋白浓度依旧设置为5μM。荧光滴定结果如图4-22所示，亲和力KA列在表4-4。图4-22抗病毒化合物与P10-275的荧光光谱图(A)NNM滴定P10-275；(B)F27滴定P10-275；(C)F1滴定P10-275；(D)F34滴定P10-275；Fig4-20FluorescencequenchingspectraofP10-275inthepresenceofantiviralagents(A)NNMtitrationP10-275;(B)F27titrationP10-275;(C)F1titrationP10-275;(D)F34titrationP10-275.表4-4抗病毒剂与P10-275的结合力Tab4-4ThebindingconstantofferulicacidderivativeandP10-275Stern–VolmerquenchingconstantsBindingparametersNO.−1−1−1−1KKq(M·S)KSV(M)RKA(M)nRD(μM)412511.81×1011.81×100.998.32×101.160.99P10-275+NNM5.1041240.77×100.77×100.991.86×101.070.99P10-275+F151.8941258.4×108.4×100.996.61×101.180.99P10-275+F278.4141230.86×100.86×100.991.62×100.840.99P10-275+F34426.97由表4-4可知，阿魏酸衍生物F1、F27、F34和NNM与P10-275的亲和力与WT-P10的亲和力相比并没有变化，说明在275、304及315位氨基酸的组合方法对抗病毒剂与P10蛋白相互作用没有影响。59 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文4.9.2MST研究P10-275蛋白与抗病毒剂的相互作用根据荧光光谱法研究P10-275蛋白与抗病毒剂的相互作用结果，利用MST对其进行验证，结果如图4-23所示。由图4-23可以看出F1、F27、F34和NNM与P10-275的亲和力分别为5.10、51.89、8.41、426.97μM，其与WT-P10的结合力相当。图4-23MST分析抗病毒化合物与P10-275相互作用(A)NNM滴定P10-275；(B)F27滴定P10-275；(C)F1滴定P10-275；(D)F34滴定P10-275。Fig4-23MSTanalysisofantiviralcompoundsinteractingwithP10-275(A)NNMtitrationP10-275;(B)F27titrationP10-275;(C)F1titrationP10-275;(D)F34titrationP10-275.4.10阿魏酸衍生物与WT-P10蛋白的定量构效关系分析根据表4-3中33个阿魏酸衍生物与WT-P10的亲和力KA，采用SybylX-2.0软件进行基于受体与配体的3D-QSAR的CoMFA和CoMSIA的研究。为了进一步探索影响这些阿魏酸衍生物的活性的结构决定因素，以及开发更有效的化合物，将结合常数KA转化为Pka(logKA)来构建3D-QSAR模型，最小二乘法(PLS)分析以及抽一法(LOO)交叉验证法来评估3D-QSAR模型的预22测能力。获得了交叉验证的相关系数(q)，非交叉验证的相关系数(r)，估计的标准误差(SEE)，最优组件数(OPN)的几个重要参数，产生最小SEE和F值。22[78,89]其中，q>0.5和r>0.8是评估一个好的3D-QSAR模型的重要参数。CoMFA和CoMSIA模型的统计参数总结在表4-5中。由表4-5可知，CoMFA2和CoMSIA模型的q分别为0.544、0.692均大于0.5，认为模型具有可信的预60 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文测能力，ONC都为5，表明CoMFA和CoMSIA模型可进行非交叉验证，将得2到的最佳组分数进行非交叉验证回归，得到r分别为0.902、0.888，标准误差为0.243、0.260；F值分别是40.000、34.800。在CoMFA模型分析中，立体场和静电场对亲和力的的贡献分别为57.8%及42.2%，由此说明立体场对活性的贡献略大于静电场。CoMSIA模型中各个场对活性的贡献如下：立体场贡献为8.3%、静电场贡献为22.5%、疏水场贡献为12.7%、氢键供体体场贡献为16.9%和氢键受体场贡献为39.6%。利用建立的CoMFA和CoMSIA模型预测training.mdb和test.mdb化合物的亲和力，将实验测定值的和模型预测值进行残差分析，结果如表4-6所示，将所得的实验测定的和模型预测值进行相应的线性回归分析，结果如图4-22所示。表4-5CoMFA和CoMSIA的统计学参数Tab.4-5.StatisticalresultsoftheCoMFAandCoMSIAmodelsStatisticalparameterCoMFACoMSIA2q0.5440.692ONC552r0.9020.888SEE0.2430.260F-value40.00034.800FractionoffieldcontributionsSteric0.5780.083Electrostatic0.4220.225Hydrophobic–0.127H-bondacceptor–0.396H-bonddonor–0.16961 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文表4-6CoMFA和CoMSIA的实验和预测pKA值Tab4-6pKAvaluesofcompoundsandexperimentalandpredictedresultsofpKACoMFACoMSIA-1CompoundKA(M)Experimental(pKA)PredictedResidualPredictedResidual4F11.95×104.2894.0270.2623.9240.3654F21.55×104.1883.980.2084.0470.1414F31.78×104.2543.9440.313.8810.3733F42.82×103.4534.093−0.643.885−0.4323F5*0.78×102.93.35−0.453.61−0.714F61.05×104.0223.8180.2043.7630.2593F76.61×103.8263.7150.1113.875−0.0493F89.33×103.9713.8220.1493.7720.1993F9*1.35×103.133.281−0.1513.566−0.4363F100.65×102.8113.15−0.3393.313−0.5023F11*5.13×103.7084.395−0.6873.802−0.0943F12*5.62×103.7473.6430.1043.6470.13F136.03×103.7843.3140.4703.4610.3233F141.07×103.0273.322−0.2953.387−0.363F152.00×103.34.427−1.1273.781−0.4813F165.75×103.763.77−0.013.7380.0223F17*4.68×103.6733.3060.3673.6170.0563F183.39×103.5343.658−0.1243.693−0.1594F191.02×104.0094.033−0.0243.9130.0963F204.79×103.6793.891−0.2123.902−0.2233F212.69×103.4273.56−0.1333.488−0.0613F231.07×103.0322.9640.0682.9820.053F243.55×103.553.4930.0573.4260.1243F254.57×103.6613.843−0.1823.749−0.0884F261.29×104.1074.239−0.1323.8650.24262 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文续表4-65F275.75×105.7565.7470.0095.936−0.185F281.55×105.1935.222−0.0295.31−0.1175F291.58×105.1985.1470.0515.308−0.115F301.32×105.1235.0920.0314.7670.3563F312.51×103.343.344−0.0043.477−0.1373F322.88×103.4613.473−0.0123.462−0.0013F33*3.89×103.5863.833−0.2473.702−0.1163F341.95×103.2873.376−0.0893.43−0.1433F353.16×103.4983.3650.1333.643−0.145*Testsetmolecules.图4-24CoMFA(A)和CoMSIA(B)模型预测活性与实验活性的线性回归分析Fig.4-24CoMFA(A)andCoMSIA(B)predictionsforthetraining(bluesquaredots)andtest(redcircledots)setsagainstSRBSDVP10.Thesolidlineistheregressionlineforthetrainingsetpredictions.由表4-6和图4-24中可知，所有化合物的活性实验值与模型预测值之间的2残差为-1.127~0.470，R值分别为0.9046及0.8877，说明所建的CoMFA和CoMSIA模型可靠，具有较好的预测能力，可用于阿魏酸衍生物与WT-P10亲和力的预测。63 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文运行CoMFA和CoMSIA命令即得到相应的立体场、静电场、疏水场及氢键受体场等势图。结果如图4-25和图4-26所示。图4-25化合物27的CoMFA分析获得的标准系数等值线图。(A)空间场：绿色轮廓表示大基团增强亲和力的区域，而黄色轮廓表示大体积基团降低亲和力的区域。(B)静电场：蓝色轮廓表示供电子基团增加活性的区域，而红色轮廓表示吸电子基团增加活性的区域。Fig.4-25.StandardcoefficientcontourmapsobtainedfromCoMFAanalysisofcompound27.(A)Stericfields:greencontoursindicateregionswherebulkygroupsenhanceaffinity,whereasyellowcontoursindicateregionswherebulkygroupsreduceaffinity.(B)Electrostaticfields:bluecontoursrepresentregionswhereelectron-donatinggroupsincreaseactivity,whereasredcontoursrepresentregionswhereelectron-withdrawinggroupsincreaseactivity.图4-26CoMSIA与化合物27的轮廓图。(A)空间场：绿色和黄色轮廓表示空间体积增加并降低活性的区域。(B)静电场：蓝色和红色轮廓表示正电荷和负电荷增强活性的区域。(C)疏水场：黄色和灰色轮廓表示疏水性和亲水性增强活性的区域。(D)H-键受体场：品红色轮廓表示H-键受体基团增强活性的区域。Fig.4-26.ContourmapsofCoMSIAcombinedwithcompound27.(A)Stericfields:greenandyellowcontoursindicateregionswherestericbulkenhancesandreducesactivity.(B)Electrostaticfields:blueandredcontoursrepresentregionswherepositiveandnegativechargesenhanceactivity.(C)Hydrophobicfields:yellowandgraycontoursdenoteregionswherehydrophobicityandhydrophilicityenhanceactivity.(D)H-bondacceptorfields:magentacontoursindicateregionswhereH-bondacceptorgroupsenhanceactivity.为了解释CoMFA和CoMSIA模型，分析得到的系数×标准偏差(coeff×stddev)轮廓图。从阿魏酸衍生物中选择化合物F27(pKA=5.75)作为参考结构。将该化合物与轮廓图叠加进行分析。图4-25描绘了CoFMA的立体场场和静电轮廓图。64 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文-1如图4-25A所示，R2上的黄色轮廓表明大的基团，例如化合物F5(KA<1×103M)中的4-OCH3-Ph基团，其可以降低亲和力。相比之下，右上角的绿色轮廓改善了亲和力。在静电场中，如图4-25B所示，蓝色轮廓表明吸电子基团可以增加活性。图4-26A示出投影到F27上的CoMSIA立体场轮廓图。黄色和绿色多面体分别表明在空间相互作用的有利增加活性和降低活性。在R1和R2中观察到黄色轮廓，这表明R1和R2是具有降低活性大体积基团。这可以解释化合物F1的亲和力明显降低，其中氢在R1位置被甲基取代，R2与F27相比保持不变。此外，与F28和F30相比，R1保持不变，R2中的4-Cl-Ph变为2-Cl-Ph，导致F28与P10的亲和力略高于F30。图4-26B显示映射到F27上的CoMSIA静电轮廓，其中蓝色轮廓表示吸电子基团将增加亲和力的区域，红色轮廓表示供电子基团将增强亲和力的区域。可能在靠近R2取代基位置的区域中发现了蓝色多面体。此外，F的吸电子效应比Cl的吸电子效应更强，因此F27与P10的亲和力高于F28。另外，-OCH3属于给电子基团，因此F1的亲和力高于F4，F27的亲和力明显高于F4和F1亲和力。图4-26C显示映射到F27上的CoMSIA疏水场轮廓图。黄色和灰色轮廓表示分别有利于疏水基团和亲水基团的区域。在R1和R2取代基周围发现大的灰色轮廓。其证明，在该位置的亲水基团倾向于导致化合物更具抗病毒活性，这解释了化合物F27、F28、F29和F30与F1、F2和F3具有甲基取代基的具有更高活性。图4-26D为叠加在F27上的CoMSIAH-键受体场。两个洋红色轮廓表明，两个羰基周围的H键受体对抗病毒活性是重要的。65 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文第五章结论5.1主要结论本论文通过构建、诱导表达、纯化SRBSDVP10蛋白，以SRBSDVP10为潜在的抗病毒靶标，采用荧光光谱法和微量热涌动法分析已有的抗植物病毒剂NNM、毒氟磷等与SRBSDVP10蛋白的相互作用，建立了基于SRBSDVP10靶标蛋白的离体抗SRBSDV的药物筛选平台，得到论文的主要结论、创新之处和不足之处如下。5.1.1SRBSDVP10蛋白的表达纯化RT-PCR技术获得SRBSDVP10基因，双酶切将目的基因构建到pGEX6p-1上转化进BL21(DE3)RIL进行表达，采用Ni-NTA柱对大肠杆菌BL21(DE3)RIL表达的WT-P10蛋白进行纯化，并用ppase酶切GST-Tag，利用分子筛GF200对WT-P10蛋白和GST-TagJ进行分离，最后采用SDS-PAGE凝胶电泳及MS对纯化后的蛋白进行验证，确定已经成功构纯化了WT-P10蛋白。且发现WT-P10在溶液中为混聚体，推断WT-P10形成混聚体不是通过形成分之间二硫键，可能是通过分子间其他作用力，如氢键等。5.1.2WT-P10蛋白与WT-P9-1、WT-P7-1体外互作通过MST和ITC研究发现WT-P10和WT-P9-1在体外存在互作亲和力达到微摩尔级，而与WT-P7-1在体外没有互作。进一步研究发现WT-P9-1的C端23个氨基酸在WT-P10和WT-P9-1在体外互作中发挥着至关重要的作用，但WT-P9-1蛋白及WT-P10蛋白具体的互作机制我们目前尚未研究清楚。66 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文5.1.3抗病毒剂与WT-P10蛋白的相互作用分析采用荧光光谱法研究抗植物病毒剂毒氟磷、氨基寡糖、香菇多糖、盐酸吗啉胍、病毒唑和宁南霉素对WT-P10蛋白的相互作用，结果表明毒氟磷、氨基寡糖、香菇多糖、盐酸吗啉胍、病毒唑都对WT-P10蛋白没有荧光猝灭的作用；而宁南5霉素能使WT-P10的内源性荧光发生淬灭，通过计算得到亲和力KA=6.17×10-1,M，结合位点约为n=1.20。通过MST验证了毒氟磷、氨基寡糖、香菇多糖、盐酸吗啉胍、病毒唑都对WT-P10没有相互作用，宁南霉素滴定WT-P10得到的解离常数KD=4.17μM，结果与荧光滴定分析相符合，证明了荧光滴定的准确性。进一步通过SEC研究表明NNM可以改变WT-P10在溶液中的聚集状态，推断NNM可能通过改变外壳蛋白的聚集状态从而影响病毒的传播及复制。5.1.4抗病毒剂与WT-P10蛋白的相互作用分析以NNM为对照药剂建立了以WT-P10为潜在靶标的抗SRBSDV药剂的离体筛选模型，通过英光光谱分析发现阿魏酸FA及其衍生物对WT-P10蛋白具有不同等级的亲和力，其中FA和F27与WT-P10的亲和力与NNM相当KA分别为5-15-143-11.45×10M、5.75×10M，F1和F34KA分别为1.95×10和1.95×10M。为了进一步验证验证英光光谱结果，选取与WT-P10亲和力高、中等、低的三个化合物F1、F27、F34进行验证，通过MST研究发现其与WT-P10的解离常数KD分别为46.67、7.81、457.12μM，与荧光滴定结果相统一。使用3D-QSAR分析阿魏酸衍生物与WT-P10蛋白结构和活性之间的关系，通过构建的COFMA和COMSIA模型发现，发现在R2取代基为芳香环上引入吸电子基团有利于提高化合物与P10的亲和力，如F1(4-F-Ph)>F5(4-OCH3-Ph)，空间位阻小的吸电子基团较空间位阻大的基团结合常数大，如F1(4-F-Ph)>F2(4-Cl-Ph)，F27(4-F-Ph)>F28(4-Cl-Ph)；同一取代基在不同位置其结合常数也有差异，如含F取代的有对位>邻位>间位，如F27(4-F-Ph)>F28(2-F-Ph)>F26(3-F-Ph)。总之，在保留阿魏酸的羧基结构和引入空间位阻较小的基团有利于增加化合物与P10的亲和力。67 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文5.1.5抗病毒剂与突变体P10-275的相互作用研究通过生物信息学分析发现，275、304、315这3个位置的氨基酸只有两种组合方式，既是GVA或是SAT，然而我们构建的P10原核表达载体的这三位的氨基酸组合方式为SAV，因此将275位S突变为G的突变体，通过体外研究这三位氨基酸的组合方式是否与病毒的抗药性相关。通过研究阿魏酸衍生物F1、F27、F34和NNM与P10-275的亲和力与WT-P10相比并没有明显变化，说明在275、304及315位氨基酸的组合方法对抗病毒剂与其亲和力并没有关系。5.2本文的创新点本论文首次在体外对SRBSDV的外壳蛋白P10及其突变体进行克隆、诱导表达和纯化。并以其为靶标通过英光光谱和MST研究了抗病毒剂宁南霉素、毒氟磷等与WT-P10的相互作用，通过对数据进行处理分析发现NNM与WT-P10的结合属于强结合。此外，进一步研究发现，NNM可以改变WT-P10在溶液中的聚集状态，推断其可能是NNM具有高抗SRBSDV的重要原因。以NNM为对照药剂，建立了基于WT-P10靶标蛋白的离体筛选模型，探索了一系列阿魏酸衍生物与WT-P10的相互作用，筛选到了亲和活性与NNM相当的化合物F27。通过3D-QSAR分析得出保留阿魏酸中的羧基有利于增强化合物与WT-P10的亲和力。本研究对进一步指导合成抗SRBSDV高活性的化合物具有理论指导意义。5.3本文的不足之处与展望通过MST和ITC研究发现WT-P10蛋白和WT-P9-1蛋白在体外存在互作，但是还未研究清楚这两个蛋白存在互作的机制及没有在活体上验证WT-P10蛋白和WT-P9-1蛋白是否存在互作；未了解WT-P10蛋白和WT-P9-1蛋白互作在SRBSDV传播、侵染、复制、组装等过程中起到什么作用。后续可以利用酵母双杂交和荧光双分子荧光互补技术研究在酵母和水稻细胞中WT-P10和WT-P9-1蛋白之间的互作。68 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文本论文利用荧光滴定和MST方法研究了NNM、阿魏酸及其衍生物与P10WT的相互作用研究。但是没有阐明NNM、阿魏酸及其衍生物与P10相互作用的机制和关键的氨基酸位点。以NNM为对照药剂，WT-P10为潜在的靶标对一系列阿魏酸衍生物进行筛选，得到阿魏酸衍生物与WT-P10蛋白有不同程度的亲和力，但未在活体上验证阿魏酸衍生物抗SRBSDV活性。后续可进行NNM和阿魏酸衍生物抗SRBSDV的活体研究，确定阿魏酸衍生物的抗SRBSDV的活性。此外，可以通过同源模建得到WT-P10的晶体结构，利用分子对接找出阿魏酸衍生物与WT-P10蛋白的结合位点；进一步通过构建突变体蛋白在离体条件下进行阿魏酸衍生物与突变体蛋白的相互作用，找出阿魏酸衍生物与WT-P10相互作用的位点。69 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文致谢本论文是在导师宋宝安院士和金林红教授的精心指导下完成的，从开始的选题、论文的设计思想及研究的主要内容导师都给予了很多帮助。导师严谨的治学态度、渊博的知识、对科学孜孜不倦的追求、对工作的热情都使我受益终身。在论文完成之际，我向我的导师由衷的说声谢谢您！在本论文实践过程中感谢本实验室甘秀海师兄提供的一系列阿魏酸衍生物，感谢丁燕师兄和李向阳老师在实验上给予的帮助和支持！在攻读研究生期间，我在贵州大学绿色农药与农业生物工程教育部重点实验室里学到了很多，也成长了很多，这离不开实验全体老师的热情指导和谆谆教诲！感谢课题组俞露、张伟莹、王文丽师姐、同窗的罗亮指、赵晓珍、杨安明、石晶等同学的对我实验及生活上的无私帮助！感谢父母、弟弟以及所有的亲人朋友对我攻读硕士期间的理解、支持和帮助！最后，衷心感谢在百忙之中抽出宝贵时间评审论文的专家们，谢谢各位专家、评委老师的悉心指导和宝贵意见!70 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文参考文献[1]周国辉,许东林,李华平.广东发生水稻黑条矮缩病病原分子鉴定[C].中国植物病理学会2004年学术年会,2004.[2]Cheng,Z.B.;Li,S.;Gao,R.Z.;Sun,F.;Liu,W.C.;Zhou,G.H.;Wu,J.X.;Zhou,X.P.;Zhou,Y.J.Distributionandgeneticdiversityofsouthernriceblack-streakeddwarfvirusinchina[J].VirologyJournal,2013,10(1):307-314.[3]Zhou,G.H.;Wen,J.J.;Cai,D.J.;Li,P.;Xu,D.L.;Zhang,S.G.Southernriceblack-streakeddwarfvirus:Anewproposedfijivirusspeciesinthefamilyreoviridae[J].ChineseScienceBulletin,2008,53(23):3677-3685.[4]Chen,Z.;Yin,C.J.;Liu,J.J.;Zeng,M.J.;Wang,Z.C.;Yu,D.D.;Bi,L.;Jin,L.H.;Yang,S.;Song,B.A.Methodologyforantibodypreparationanddetectionofsouthernriceblack-streakeddwarfvirus[J].ArchivesofVirology,2012,157(12):2327-2333.[5]Chen,Z.;Liu,J.J.;Zeng,M.J.;Wang,Z.C.;Yu,D.D.;Yin,C.J.;Jin,L.H.;Yang,S.;Song,B.A.Dotimmunobindingassaymethodwithchlorophyllremovalforthedetectionofsouthernriceblack-streakeddwarfvirus[J].Molecules,2012,17:6886-9000.[6]Zhou,G.H.;Xu,D.L.;Xu,D.G.;Zhang,M.X.Southernriceblack-streakeddwarfvirus:awhite-backedplanthopper-transmittedfijivirusthreateningriceproductioninasia[J].FrontiersinMicrobiology,2013,4:270-279.[7]朱俊子,周倩,崔亚,高必达.南方水稻黑条矮缩病毒的新的自然寄主[J].湖南农业大学学报(自科版),2012,38(1):58-60.[8]Li,Y.Z;Cao,Y;Zhou,Q;Guo,H.M;Ou,G.C.Theefficiencyofsouthernriceblack-streakeddwarfvirustransmissionbythevectorsogatellafurciferatodifferenthostplantspecies[J].JournalofIntegrativeAgriculture,2012,11(4):621-627.[9]王贞超.南方水稻黑条矮缩病毒基因序列特征及基质蛋白与病毒防控药剂相互作用研究[D].贵阳,贵州大学,2015.[10]李小一,肖媛,陈南康,张小平,陈海球,刘贵芳,邓勇男,胡细贵.南方水稻黑条矮缩病的诊断与防控[J].科技信息,2011,(2):371-371.71 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贵州大学2017届硕士研究生毕业论文novel1,4-pentadien-3-onederivativescontainingthe1,3,4-oxadiazolemoiety[J].PestManagementScience,2015,72:534-543.80 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文附录1课题来源国家自然科学基金重点项目：重大病毒病导向的绿色农药化学研究(21132003)。2研究生期间发表论文[1]Ran,L.L.;Ding,Y.;Luo,L.Z.;Gan,X.H.;Li,X.Y.;Chen,Y.Z.;Hu,D.Y.;Song,B.A.InteractionResearchonanAntiviralMoleculethatTargetstheCoatProteinofSouthernriceblack-streakeddwarfvirus[J].Int.J.Biol.Macromol,https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.05.059.[2]Zhang,W.Y.;Li,X.Y.;Zhang,G.P.;Ding,Y.;Ran,L.L.;Luo,L.L.;Wu,J.;Song,B.A.Interactionoftheenantiomericα-aminophosphonatederivativeswithtobaccomosaicviruscoatprotein(TMVCP)[J].Int.J.Biol.Macromol,2016,94,603-610.[3]Wang,Z.C.;Yu,L.;Jin,L.H.;Wang,W.L.;Zhao,Q.;Ran,L.L.;Li,X.Y.;Chen,Z.;Guo,R.;Wei,Y.T.;Yang,Z.C.;Liu,E.L.;Hu,D.Y.;Song,B.A.EvaluationofRiceResistancetoSouthernRiceBlack-StreakedDwarfVirusandRiceRaggedStuntVirusthroughCombinedFieldTests,QuantitativeReal-TimePCR,andProteomeAnalysis[J].Viruses,2017,9,37.81 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文3抗病毒剂及阿魏酸衍生物结构式抗植物病毒剂结构式名称结构式毒氟磷宁南霉素病毒唑盐酸吗啉胍香菇多糖氨基寡糖82 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文阿魏酸衍生物结构式列表编结构式编结构式号号F1F2F3F4F5F6F7F8F9F10F11F12F13F14F15F16F17F1883 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文F19F20F21F23F24F25F26F27F28F29F30F31F32F33F34F35FA84 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文4附图与附表阿魏酸衍生物对WT-P10荧光淬灭光谱图S1F1对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F1的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S1.FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF1.(1)FreeWT-P10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF1was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S2F2对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F2的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S2.FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF2.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF2was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S3F3对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F3的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S3FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF3.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF3was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.85 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图S4F4对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F4的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S4FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF4.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF4was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S5F5对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F5的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S5FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF5.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF5was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S6F6对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F6的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S6FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF6.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF6was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.86 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图S7F7对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F7的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S7FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF7.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF7was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S8F8对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F8的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S8FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF8.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF8was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S9F9对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F9的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S9FluorescencequenchingspectraofP10inthepresenceofF9.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF9was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.87 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图S10F10对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F10的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S10FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF10.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF10was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S11F11对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F1的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S11FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF11.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF1was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S12F12对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F12的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S12FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF12.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF12was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.88 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图S13F13对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F1的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S13FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF13.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF13was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S14F14对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F14的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S14FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF14.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF14was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S15F15对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F15的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S15FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF15.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF15was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.89 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图S16F16对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F16的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.16FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF16.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF16was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S17F17对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F1的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S17FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF17.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF17was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S18F18对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F1的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S18FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF18.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF18was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.90 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图S19F19对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F19的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S19FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF19.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF19was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S20F20对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F20的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S20FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF20.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF20was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S21F21对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F21的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S21FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF21.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF21was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.91 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图S22F23对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F23的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S22FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF23.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF23was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S23F24对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F24的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S23FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF24.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF24was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S24F25对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F25的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S24FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF25.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF25was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.92 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图S25F26对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F26的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S25FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF26.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF26was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S26F27对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F27的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S26FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF27.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF27was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S27F28对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F28的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S27FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF28.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF28was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.93 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图S28F29对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F29的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S28FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF29.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF29was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S29F30对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F30的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S29FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF30.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF30was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S30F31对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F1的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S30FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF31.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF31was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.94 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图S31F32对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F1的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S31FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF32.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF32was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S32F33对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F33的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S32FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF33.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF33was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.图S33F34对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F34的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S33FluorescencequenchingspectraofWTP10inthepresenceofF34.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF34was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.95 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文图S34F35对WT-P10的荧光猝灭光谱。(1)WT-P10浓度(5μM)；(1-11)F35的药物浓度为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0和20.0μM。Fig.S34FluorescencequenchingspectraofWT-P10inthepresenceofF35.(1)FreeP10(5μM);(1–11)thedrugconcentrationsofF35was0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,and20.0μM.96 贵州大学2017届硕士研究生毕业论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属贵州大学。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：日期：年月日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本学位论文属于：保密()，在年解密后适用授权。不保密()(请在以上相应方框内打“√”)论文作者签名：导师签名：日期：年月日97
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