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密级：论文编号：中国农业科学院学位论文牛流行热病毒抗原捕获ＥＬＩＳＡ诊断方法的建立与应用ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎＡｎｔｉｇｅｎＣａｐｔｕｒｅＥＬＩＳＡｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＢｏｖｉｎｅＥｐｈｅｍｅｒａｌＦｅｖｅｒＶｉｒｕｓＡｎｔｉｇｅｎ硕士研究生：黄德萱指导教师：殷宏研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：兰州兽医研究所研究生院２０１７年５月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationDevelopmentandApplicationofanAntigenCaptureELISAforDetectionofBovineEphemeralFeverVirusAntigenM.S.Candidate：HuangDexuanSupervisor：ProfessorYinHongDegree：MasterofVeterinarianSpecialty：VeterinaryMay2017 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。■研宄生签名：方ｔ时间：＾．＞〇年ｒ月＞日丨７关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，ｇ卩：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研宄生签名：黃彳ｎ时间：％卩年厂月＾日导师签名时间：年幻！＜？曰＾ 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目牛流行热病毒抗原捕获ＥＬＩＳＡ诊断方法的建立与应用论文作者黄德萱专业领域兽医研究方向指导教师殷宏培养单位（研宄所、中心）兰州兽医研宄所姓名职称单位专业签名盲评评胃盲评人盲评魏锁成教授西北民族大学预防兽医学Ｉ曾巧英教授甘肃农业大学预防兽医学＾李倬教授西北民族大学预防兽医学贾万忠■员丽方兽医学辩景涛教授兰州大学医学二胡永浩教授甘肃农业大学预防兽医学孙晓林教授甘肃农业大学预防兽医学会议记录（秘书）＞Ａ、２０１７年５月１７日中ＨＩ农业科学院兰州兽医研宄所又，５辩ｉ；化时间地…、家畜疫病病原生物学国家重点实验室大楼８楼学术报告厅 摘要牛流行热（bovineephemeralfever，BEF）是一种由牛流行热病毒（bovineephemeralfevervirus，BEFV）引起的急性热性的动物疫病，多发于黄牛、奶牛和水牛，临床上主要表现为高热、食欲不振、肌肉僵硬、眼鼻分泌增多、跛行、流产和奶牛产奶量下降。该病广泛分布于非洲、大洋洲、亚洲及中东的40多个国家。在我国台湾省和大陆26省区的黄牛、水牛、奶牛、牦牛均有该病报道。在实验室诊断方面，目前已建立了病毒分离、RT-PCR和荧光定量RT-PCR等核酸检测方法以及微量中和实验、抗体ELISA等血清学诊断方法，但无BEFV抗原的检测方法或商品化试剂盒，给田间样品的病毒筛查造成了困难。本研究选取BEFV抗原G蛋白为靶点，设计特异性引物，利用RT-PCR扩增BEFVJT02L毒株G基因并克隆至pGEM-Teasy载体中。测序表明，JT02L毒株G基因开放阅读框长为1872bp，编码623个氨基酸，其G1、G2、G3、G4抗原位点与我国LYC11、Henan2012、Shandong2011等分离株抗原位点高度一致。进而将编码4个抗原位点的1482bp的G基因片段亚克隆至pPROEXHTb原核表达载体，经测序验证后转化大肠杆菌BL21（DE3），以IPTG诱导表达，Ni-NTA系统纯化获得约70Ku的目的蛋白，免疫新西兰大耳白兔制备获得了高效价的具有良好反应原性的多克隆抗体。利用制备的多克隆抗体为捕获抗体包被酶标板，以抗G1表位的单克隆抗体为检测抗体，建立抗原捕获ELISA，确定捕获抗体、检测抗体、HRP标记的山羊抗小鼠二抗最佳稀释度分别为1:1000、1:1200、1:5000，与水泡性口炎病毒、狂犬病毒灭活抗原、牛病毒性腹泻病毒抗原无交叉反应。采集甘肃省武威市天祝藏族自治县7个乡镇共计224头白牦牛的全血和抗凝血，利用建立的抗原捕获ELISA方法，结合抗体间接ELISA、荧光定量RT-PCR方法进行检测。在7个乡镇的白牦牛均检出BEFV抗体，但无BEFV抗原检出。白牦牛BEFV抗体总体阳性率为45.09%（101/224），不同乡镇白牦牛BEFV感染率存在较大差异（31.03~66.67%）。荧光定量RT-PCR结果表明BEFV核酸阳性率为37.5%（84/224）。以获得的G基因3’端420bp区段测序并构建系统发育树表明，白牦牛群BEFV流行毒株与中国大陆1976年分离的JB76H毒株亲缘关系较近，为BEFV基因亚型I。进一步分析了建立的抗原捕获ELISA在BEFV分离鉴定中的应用价值。以JT02L牛体传代病毒静脉接种感染2头实验公牛，并于牛体39.0~42.0℃发热期采集抗凝血，分离淋巴细胞并接种至MDBK细胞，盲传后收集细胞培养物，以建立的抗原捕获ELISA检测病毒抗原。在第3代培养物中检测到BEFV抗原，进而对细胞培养物中BEFV进行基因组测序表明JT02L毒株全长为14941nt，与GenBank中收录的BEFV基因组结构类似但α3和β蛋白编码区较长，并且β和γ基因间隔含38nt的AT丰富区，可能与病毒毒力相关。这些结果表明，本研究建立的抗原捕获ELISA可以用于BEFV抗原检测，为BEFV的筛查、分离鉴定奠定了基础。关键词：牛流行热病毒，抗原捕获ELISA，白牦牛，基因组测序I AbstractBovineephemeralfever(BEF),whichiscausedbyBEFV,isanacutefebrilediseasemainlyincattle,dairycattleandwaterbuffalo.Thediseaseisclinicallycharacterizedbyhighfever,anorexia,musclestiffness,ocularandnasaldischarge,lameness,abortionandreducedmilkproductionindairycattle.Thediseasedistributeswidelyinmorethan40countriesinAfrica,Oceania,AsiaandMiddleEast.InChina,thediseasehasbeenreportedinyellowcattle,buffalo,cowandyakinTaiwanProvinceand26provincesinmainland.Afewofassaysincludingvirusisolation,RT-PCRandreal-timeRT-PCRforthenucleicacid,micro-neutralizationtestandantibodydetectingELISAhavebeendevelopedforthelaboratorydiagnosisofBEF.However,noassayorcommercialkitisavailablefordetectingBEFVantigen,whichmakesthatitisdifficulttoperformvirusscreeningfromfieldsamples.Inthepresentstudy,thetargetantigenicGproteinofBEFVwasselectedanditscodingregionwasharvestedbyRT-PCRamplificationwithspecificprimers,usingRNAextractedfromBEFVJT02Lisolate.TheobtainedampliconwasclonedintopGEM-Teasyvectorforsequencing.Theopenreadingframe(ORF)ofGgenefromJT02Lisolateis1872bpinlengthandencodes623aminoacids,sharingidenticalantigenicsitesofG1,G2,G3andG4withLYC11,Henan2012andShandong2011.Subsequently,afragmentof1842bpthatencodingallthe4antigenicsiteswassub-clonedintopPROEXHTbexpressionvector,followedbyDNAsequencingandtransformationintoBL21(DE3)forproteinexpression.Atargetproteinwithamolecularweightofabout70KuwasharvestedbyinducingtherecombinantbacteriawithIPTGandpurifyingwithNi-NTAsystem.RabbitpolyclonalantibodywithhightiterandgoodreactivitywasproducedbyrepeatedimmunizationofNewZealandWhiterabbitswiththepurifiedprotein.AnantigencaptureELISAwasdevelopedbyutilizingthepolyclonalantibodycoatedtoELISAplateascapturingantibodyandthemonoclonalantibodyagainstG1siteasdetectingantibody.Theassaywasoptimizedwithcapturingantibody,detectingantibodyandgoatanti-mouseIgG-HRPintherespectivedilutionof1/1000,1/1200and1/5000.Cross-reactivitywithvesicularstomatitisvirus(VSV),inactivatedRabiesvirusantigen,andbovineviraldiarrheavirus(BVDV)wasnotobserved.Atotalof224wholebloodoranti-coagulatedbloodsamplesfromwhiteyakswerecollectedfromseventownsinTibetanAutonomousCountyofTianzhu,Wuwei,GansuProvinceandsubjectedtodetectionwiththeantigencaptureELISAassay,withcombinationofindirectELISAforantibodyagainstBEFVandreal-timeRT-PCR.TheantibodyagainstBEFVwasdetectedfromwhiteyaksfromalltheseventownswhiletheviralantigenwasnotdetected.Atotalantibodyprevalenceof45.09%(101/224)wasobserved,demonstratinghighdiscrepancyamongthatinindividualtown(31.03-66.67%).BEFVRNAwasdetectedin37.5%(84/224)ofthesamplesbyreal-timeRT-PCR.A420bpfragmentofGgene3’terminalwasamplifiedandsequencedforphylogeneticanalysis,whichshowedthattheBEFVinfectioninwhiteyaksiscloselyrelatedtoJB76HthatwasisolatefromChinamainlandin1976andbelongedtosubtypeI.II TheutilityofthedevelopedantigencaptureELISAinidentifyingBEFVduringvirusisolationwasfurtherevaluated.TheJT02LBEFV,whichwaspassagedincattle,wasusedtoexperimentallyinfecttwobullsbyintravenousinoculation.Anti-coagulatedbloodwascollectedduringfebrileperiodwhenthebullsdisplayedrectaltemperaturefrom39.0to42.0°C,andusedforlymphocyteseparation,followedbyinoculationintoMDBKcells,blindpassagesanddetectionbyantigencaptureELISA.TheBEFVantigenwasdetectedinthe3rdpassagedcellculture.Theresultwasconfirmedbydetectingthefull-genomeofBEFVinthecellculture.Thefull-genomeofJT02Lwasshowntohave14941ntinlengthandsharesimilargenomestructurewiththatavailablefromGenBank.However,distinctfeaturesincludinglongercodingregionsofα3andβ,anda38AT-richsequenceintheintergenicregionofβ-γ,whichmayhaveimplicationsforviralvirulence,wereobservedinJT02Lstrain.TheseresultsindicatedthattheantigencaptureassayhadproperutilityforBEFVantigendetection,whichmaybehelpfulfoundationforfurtherBEFVscreenandidentification.Keyword:Bovineephemeralfevervirus(BEFV),AntigencaptureELISA,Whiteyaks,GenomesequencingIII 目录第一章引言....................................................................................................................11.1病原学..........................................................................................................................11.2BEFV的流行病学.......................................................................................................21.2.1宿主.......................................................................................................................21.2.2传播途径................................................................................................................21.2.3地理分布................................................................................................................21.3BEFV的临床症状.......................................................................................................41.4BEFV的诊断方法.......................................................................................................41.4.1血清学诊断............................................................................................................41.4.2分子生物学检测...................................................................................................41.5BEFV疫苗研究进展...................................................................................................41.6研究背景、目的和意义..............................................................................................5第二章BEFVG蛋白的原核表达与多克隆抗体的制备...................................................72.1材料.............................................................................................................................72.1.1实验毒株及实验动物...........................................................................................72.1.2试剂.......................................................................................................................72.1.3仪器设备...............................................................................................................72.2方法.............................................................................................................................82.2.1目的基因的RT-PCR扩增...................................................................................82.2.2目的片段胶回收...................................................................................................92.2.3目的片段的连接、转化和测序...........................................................................92.2.4原核表达载体的构建.........................................................................................102.2.5重组质粒的的原核表达.....................................................................................122.2.6重组蛋白的纯化.................................................................................................122.2.7BEFVG蛋白的鉴定...........................................................................................12IV 2.2.8兔源多克隆抗体的制备和鉴定.........................................................................132.3结果...........................................................................................................................132.3.1BEFVG基因的克隆和序列测定.......................................................................132.3.2原核表达载体的构建..........................................................................................142.3.3重组蛋白的表达及纯化.....................................................................................142.3.4重组蛋白的免疫原性分析.................................................................................152.3.5兔源多克隆抗体的制备和鉴定..........................................................................152.4讨论...........................................................................................................................16第三章BEFV抗原捕获ELISA诊断方法的建立.........................................................173.1实验材料....................................................................................................................173.1.1病毒和样品..........................................................................................................173.1.2主要试剂.............................................................................................................173.1.3主要仪器.............................................................................................................173.2实验方法....................................................................................................................173.2.1捕获抗体与单抗最佳结合浓度的选择..............................................................173.2.2酶标抗体工作浓度的确定..................................................................................183.2.3封闭液的选择......................................................................................................183.2.4底物显色时间的确定..........................................................................................183.2.5交叉试验..............................................................................................................183.3结果............................................................................................................................183.3.1捕获抗体与单抗最佳结合浓度的选择..............................................................183.3.2酶标抗体工作浓度的确定.................................................................................193.3.3封闭液的选择......................................................................................................203.3.4底物显色时间的确定..........................................................................................203.3.5交叉试验..............................................................................................................213.4讨论...........................................................................................................................21第四章天祝白牦牛牛流行热的调查..............................................................................224.1实验材料.................................................................................................................22V 4.1.1样品...................................................................................................................224.1.2试剂...................................................................................................................224.2方法...........................................................................................................................224.2.1引物设计与合成.................................................................................................224.2.2BEFV抗体检测................................................................................................234.2.3BEFV抗原捕获ELISA检测..........................................................................234.2.4BEFV实时荧光定量RT-PCR检测................................................................234.2.5BEFVG基因3’片段的扩增及进化分析..........................................................234.3结果.........................................................................................................................254.3.1检测结果.............................................................................................................254.3.2BEFVG基因的扩增及进化分析....................................................................254.4讨论............................................................................................................................26第五章BEFV病毒的分离及全基因组的测定.................................................................275.1实验材料....................................................................................................................275.1.1细胞与毒株..........................................................................................................275.1.2实验动物..............................................................................................................275.1.3实验试剂..............................................................................................................275.2实验方法....................................................................................................................275.2.1实验感染模型的建立.........................................................................................275.2.2RT-PCR测病毒血症...........................................................................................275.2.3病毒的分离.........................................................................................................275.2.4RT-PCR方法鉴定分离毒株...............................................................................285.2.5抗原捕获ELISA检测.......................................................................................285.2.6BEFVJT02L毒株全基因组测序.......................................................................285.3实验结果...................................................................................................................295.3.1临床症状.............................................................................................................295.3.2RT-PCR检测病毒血症病毒检测.......................................................................305.3.3病毒的分离及鉴定..............................................................................................30VI 5.3.4抗原捕获ELISA诊断BEFV............................................................................305.3.5BEFVJT02L毒株全基因组测序.......................................................................315.4讨论...........................................................................................................................31第六章全文结论..............................................................................................................32参考文献..............................................................................................................................33附录..................................................................................................................................38致谢..................................................................................................................................44作者简历..............................................................................................................................45VII 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称AmpAmpicillin氨苄青霉素APAlkalinephosphatase碱性磷酸酶bpBasepair碱基对dDay天DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸hHour小时HRPHorseradishPeroxidase辣根过氧化物酶minMinute分钟mLMilliliter毫升NCNitrocellulosefiltermembrane硝酸纤维素膜ngnanogram纳克ntnucleotide核苷酸ODOpticaldensity光密度ORFOpenreadingframe开放阅读框PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应qPCRReal-timepolymerasechainreaction实时定量聚合酶链式反应RNARibonucleicacid核糖核酸sSecond秒μgMicrogramme微克μLMicroliter微升VIII 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言牛流行热(BovineEphemeralFever，BEF)也称为三日热、牛地方性流行热、牛流感或僵硬病，是由牛流行热病毒(BovineEphemeralFevervirus，BEFV)引起的一种家畜传染病。通常情况下，这种疾病的特点为发病快、病程短，持续1~3天。该病主要发生于黄牛、奶牛和水牛，临床上表现主要有双相热、流涎、眼鼻分泌物增多、肌肉僵硬、跛足或厌食，动物在急性感染期可能出现持续瘫痪和共济失调。该病还可造成泌乳奶牛停止泌乳，影响肉牛牛肉品质，导致役用牛丧失使役能力，严重时甚至导致动物死亡，造成重大的经济损失。1.1病原学BEFV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）、暂时热病毒属（Ephemerovirus）成员。BEFV的基因组为单股负链RNA，比其它弹状病毒更为复杂。其长度约为14.9knt，编码5个结构蛋白，分别为核蛋白（necleoprotein，N）、聚合酶交联蛋白（polymeraseassociateprotein，P）、基质蛋白（matricprotein，M）、糖蛋白（glycoprotein，G）和聚合酶相关蛋白（largeRNA-dependentRNAploymerase，L）(Walkeretal.,1991)。在BEFV的G蛋白和L蛋白基因之间还存在5个开放阅读框（Openreadingframe，ORF），这些开放ORF所编码的蛋白是暂时热病毒所特有的。因此，BEFV基因组总共包含10个开放阅读框（Openreadingframe，ORF），并按照3’-N-P-M-G-[GNS-α1-α2-β-γ]-L-5’（负链上）顺序进行排列(Walkeretal.,1992)，另外，α2ORF由于读码顺序不同还可编码α3非结构蛋白(Mcwilliametal.,1997)。成熟的BEFV具有弹状病毒典型的子弹形态，病毒粒子大小约为185nm×75nm，由单链负股RNA与核蛋白（N）紧密结合连同磷蛋白（P）及多功能酶（L）形成的核糖核蛋白复合物共同组成螺旋形。病毒粒子被基质蛋白（M）包裹，并且有一个I型跨膜糖蛋白G蛋白形成的表面凸起(Murphyetal.,1972)。在BEFV的5个结构蛋白中，G蛋白是病毒中和抗体的靶蛋白(Urenetal.,1994)。该蛋白有四个抗原位点，其中G1、G2、G3三个表位是最主要的抗原位点。三个表位中G1表位的氨基酸残基定位于487-503，是位于G蛋白C端的一个线性的中和表位，该表位只与抗BEFV的抗体反应，与暂时热病毒属的其它病毒无交叉反应。G2表位是一个构象表位，由G蛋白第172位和第182位氨基酸残基通过二硫键形成的一个环状结构。G3位点是BEFVG蛋白的主要构象表位(Cybinskietal.,1990;Kongsuwanetal.,1998)。GNS是与G蛋白结构相似的I型跨膜蛋白，其基因来源可能与G基因重复有关，但其功能目前未知。GNS蛋白在感染的细胞中表达但并不组装到病毒颗粒子中。并且与G蛋白不同，在低pH时不会发生膜融合(Hertigetal.,1996;Johaletal.,2008;Joubertetal.,2014)。α1基因在感染的细胞内编码一个10.5kDa的跨膜蛋白，具有外膜孔道蛋白的结构和功能(Joubertetal.,2014)。BEFV的α1蛋白定位到高尔基复合体并且能够与核质转运受体蛋白β1及核质转运受体蛋白结合，表明它可能在调节病毒核酸的运输过程中发挥作用(Joubertetal.,2014)。目前尚不清楚α2、β及γ三个开放阅读框编码蛋白的功能。目前认为，在世界范围内BEFV只存在1个血清型(Inabaetal.,1970)。以澳大利亚、中国、日本、肯尼亚、尼日利亚和南非的BEFV分离株进行中和实验，结果表明这些不同毒株具有很强1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言的抗原交叉性(Kempetal.,1973;Snowdon,1970;Tianetal.,1987)。在一些国家，使用40多年前分离的毒株制备的疫苗进行动物接种可较好地用于对正在流行的BEFV的防控，而且以来源于不同地域的BEFV分离株制备疫苗对世界其它地区流行毒株也具有防控效果，但由于分离时间和地理分布不同，亲缘关系较近的毒株产生的中和抗体较高(Inabaetal.,1970;Tianetal.,1987)。1.2BEFV的流行病学1.2.1宿主目前，在临床上BEF的病例多报道于黄牛、水牛和奶牛，在中国也有牦牛感染BEF的报道(Baietal.,1989;Lietal.,2014;Tonbaketal.,2013)。血清学研究表明，野生的蹄类动物体内也广泛存在BEFV抗体。流行病学资料表明，在肯尼亚、坦桑尼亚、津巴布韦和南非的水牛，大羚羊、羚羊、牛羚、跳羚、黑斑羚、貂羚和长颈鹿的体内也存在BEFV的中和抗体(Andersonetal.,1998;Barnard,1997;Daviesetal.,1975;Hamblinetal.,1990)。在非洲的其它国家也有关于驴羚、大象、疣猪、大羚羊、河马及瞪羚感染BEFV的报道(Hamblinetal.,1990)。在韩国的猪体内(Inetal.,2007)，澳大利亚的一些鹿中也检测到BEFV抗体(Mckenzieetal.,1985)。这些动物可能是BEFV的天然贮藏宿主，在BEF周期性爆发中发挥着重要的作用1.2.2传播途径BEFV主要分布在热带、亚热带及温带地区，并且具有明显的季节性，以春末至秋初为主。病毒主要经蚊子和库蠓等吸血昆虫进行传播(Walker,2005)。在澳大利亚，已经从班氏按蚊（Anophelesbancroftii）及库蚊（Culex）、蓝带蚊（Uranotaenia）和伊蚊（Aedesspp.）中分离得到BEFV(Cybinskietal.,1990;Stetal.,1976)。在澳大利亚BEFV的地理分布与Cx.annulirostris的地理分布具有相似性(Kirklandetal.,1993)，并且BEFV的传播也与地理、环境和气象因素密切相关。在澳大利亚，对BEFV的传播路径研究表明其在不同地域之间传播与气流运动如季风密切相关，例如1968-1969年间由于季风和气压的影响导致BEFV进入澳大利亚内陆昆士兰(Newtonetal.,1970a)。另外，降雨充沛造成传播媒介的大量繁殖也会影响BEFV传播，因此降雨量的多少也可影响BEFV在流行区域的蔓延(Georgeetal.,1977;Murray,1970)。这些研究表明能对传播媒介产生影响的因素都能间接地影响BEFV的流行。除此之外，随着全球贸易和经济的发展，动物的流动也可导致BEFV的跨地域传播。例如，埃及2005年和土耳其2012年BEFV分离株在进化关系上与东亚分支具有更高的相似性(Aziz-Boaronetal.,2012;TCetal.,2013;Trinidadetal.,2014)，这一发现与之前的活畜贸易记录吻合。1.2.3地理分布BEF广泛分布于大洋洲、非洲和亚洲，跨越38°N至36°S之间的热带、亚热带及温带，且其流行方向主要是从低纬度向高纬度进行扩散传播(Walkeretal.,2015)。在非洲BEF的流行流行区域较为广泛，非洲许多国家均有报道，其中津巴布韦、尼日利亚、肯尼亚及南非关于BEF的流行的记载较早(Bevan,1907;Davies,1993;Kempetal.,1973)。另外，在苏丹、尼日利亚、肯尼亚、2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言乌干达、坦桑尼亚、纳米比亚、乍得、毛里塔尼亚、几内亚、中非共和国、埃塞俄比亚、卢旺达、布隆迪、刚果民主共和国、赞比亚、马拉维、安哥拉、博茨瓦纳、莱索托、斯威士兰和马达加斯加等其它非洲国家也有BEF流行的报道(Walkeretal.,2015)。在大洋洲，该病主要流行于澳大利亚，最早在1936年就有关于BEF的报道(Seddon,2010)。此后至在20世纪七十年代末，BEF成为澳大利亚的一种重要动物传染病，并不断向南扩散传播，进入亚热带和温带地区。在1936~1937、1955~1956、1967~1968年间均有该病流行，随后在1970~1971、1972~1974和1974~1976连续发生该病流行(Georgeetal.,1977;Murray,1970;Newtonetal.,b)。BEF在澳大利亚的流行模式在不同的时期有不同的特点，在20世纪70年代以前，主要表现为向低纬度扩散流行。此后，变成夏秋季节在局部地区爆发，呈现地方性流行(Urenetal.,1987)。在亚洲，BEFV的流行范围非常广泛，几乎覆盖整个亚洲。在南亚和东南亚地区均有BEF流行的报道，1924年印度东南部的泰米尔纳德邦报道了该病，随后印度中央邦(Malviyaetal.,1977)、西部的古吉拉特邦(Pateletal.,1993)和北部的喜马偕尔邦(Prasadetal.,1997)的黄牛和水牛也报道感染BEF。1919年在印度尼西亚的西爪哇省的奶牛群中首次爆发了BEF。此后，在1928年到1931年东海岸的苏门答腊岛也报道了牛流行热的流行。1987年到1990年期间苏门答腊岛、爪哇岛、巴厘岛、帝汶岛、加里曼丹、苏拉威西和西巴布亚等一些群岛的牛群中也发现具有较高的BEFV抗体阳性率(Solehaetal.,1993)。1936年在菲律宾报道了一例牛流行热疑似病例。1975年至1976年菲律宾报道了牛流行热在黄牛和水牛群体中爆发，范围涉及12个地区44个省份，并且水牛的病死率达5%(Dumag,1977)。此后，在菲律宾也有局部地区小范围BEF的流行。血清学调查显示，泰国南部1982年11个省份的黄牛中BEFV特异性抗体阳性率高达70%、来自4个省份的水牛的BEFV特异性抗体阳性检出率为47.5%(Wongwatcharadumrongetal.,1984)。在斯里兰卡、巴基斯坦等地也有BEF流行的报道。目前还未分离得到南亚和东南亚地区的BEFV。在中东的埃及、以色列、土耳其和沙特阿拉伯也有关于BEF的报道。在1909年埃及首次报道该病，始于阿斯旺，沿尼罗河流域传播至开罗并蔓延至整个三角洲沿岸(Rabagliati,1924)。此外，在1915年及1919-1920年及随后年间具有该病爆发和流行的记载(Zaheretal.,2011)。在以色列自上世纪末至今发生多次发生BEF流行（1990~1991年，1999~2001年，2004年，2008年，2009年及2010年），且频率越来越高(Yeruhametal.,2002;Yeruhametal.,2010)。在土耳其，该病在主要流行于南部及安纳托利亚(TCetal.,2013)。1980年在沙特阿拉伯首次报道牛流行热(Lane,1983)，随后血清学数据表明在1990~1991年及1996年爆发过牛流行热(AbuElzeinetal.,1999;Faragetal.,1999)，但是在1993年到1995年对全国6个地点共910头牛进行定点监测时未检测到BEFV抗体(Abuelzeinetal.,2007)，表明自1990~1991年疾病爆发以来病毒并未持续存在，但在1996年期间又再次发生BEF流行。通过病毒分离及血清学诊断表明该病毒可能由气流运动引入媒介并导致病毒传播(Elzeinetal.,1997)。此外约旦、伊朗、科威特、也门、伊拉克和叙利亚也有BEFV流行的记载(Walkeretal.,2015)。在中国，综合历史研究，发现BEFV流行范围非常广泛。在西至新疆、青海，北至黑龙江，南至海南几乎所有省份均有牛流行热流行(Lietal.,2014;Zhengetal.,2012)。在南方几乎每两年就会有一次大规模的爆发，尤其在广东几乎每年都有该病流行(吴清明等,2016)。通常该病自6、7月份开始流行并一直持续到11月(Baietal.,1993)。1991年在吉林省爆发的牛流行热，是迄今为3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言止关于该病爆发的最高纬度(44°N)的记载。动物抗体阳性率可表现出地域差异，例如2012年山西省的黄牛的牛流行热抗体阳性率最高为81%(Lietal.,2014)。在我国由BEF引起的牛的死亡率通常较低(<2%)，但是2004、2005和2011年在河南省爆发的牛流行导致牛死亡率达5%(Zhengetal.,2012)。在我国台湾地区，1967年在高雄地区爆发BEF，首次证实了该病在台湾省存在。此后，台湾省又多次发生BEF流行。自1967年以来该病在台湾发生频率加快，感染率降低但死亡率增加(Hsiehetal.,2005;Tingetal.,2014)。在日本BEF是目前已知的重要动物传染病之一，在20世纪五六十年代该病频繁的流行，直至1973年由于疫苗免疫使疫情得以控制(Shirakawaetal.,1994)，目前也仅在日本南端的冲绳县散发(Niwaetal.,2015)。韩国于2009年至2012期间在除仁川和釜山外所有地区进行定点监控并检测到BEFV抗体转阳(Kimetal.,2014)。以G基因序列建立系统发育分析表明BEFV中国分离株和其它东亚地域分离株处于同一个进化分支，但与澳大利亚及中东的毒株具有较远的亲缘关系(Walkeretal.,2015)，表明BEFV传播的区域相对固定流行。1.3BEFV的临床症状BEFV感染后主要临床症状表现为发热、厌食、肌肉僵硬、眼鼻分泌物增多，瘤胃积食和依胸斜卧(邱基洪,2016)。在一些急性感染的病例报道中，动物可预后不良，出现共济失调及长时间瘫痪的症状。在实验感染中潜伏期通常为2~4天，病毒血症及临床症状持续时间一般较短在1~3天(Mackerrasetal.,1940;Urenetal.,1989;Urenetal.,1992)。研究表明，动物感染BEFV后在白细胞和血浆中可最早检测到病毒BEFV(StGeorgeetal.,1993;Youngetal.,1980)。病毒主要侵袭机体动脉、静脉及毛细血管的内皮细胞，造成内皮细胞损伤。血液中会出现白细胞减少，中性粒细胞增多，血清血浆纤维蛋白原增多，低血钙、细胞因子增加可造成生化失衡。临床症状主要是由于血管损伤引起的炎症反应所致。BEFV感染后一般不造成广泛的组织损伤，但是能够造成起血管炎症并引起小血管内皮、腱鞘、肌肉和皮肤及筋膜的损伤(Bassonetal.,1970;Kirkland,2002)。1.4BEFV的诊断方法1.4.1血清学诊断在BEFV的血清学诊断方面，研究人员在特异性的血清学的诊断方面进行了较为深入的研究。在澳大利亚、日本、南非和我国，半微量补体结合反应、微量血清细胞中和试验、免疫荧光技术、ELISA等血清学检测方法已较早用于BEFV中和抗体的筛查。1.4.2分子生物学检测随着分子生物学的不断发展，BEFV的分子检测技术也日趋成熟，根据近期的研究，各国的科研人员建立了一系列的实验室快速检测BEFV核酸的方法，如RT-PCR、荧光定量RT-PCR、RT-LAMP等。1.5BEFV疫苗研究进展迄今为止共研发了4种牛流行热的疫苗：(1)弱毒活疫苗；(2)灭活疫苗；(3)基于G蛋白的亚4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言单位疫苗；(4)重组疫苗。弱毒活疫苗、灭活疫苗及亚单位疫苗已经都应用于实际中。在澳大利亚、南非、纳米比亚、日本、韩国、中国大陆及台湾地区、菲律宾、土耳其、以色列、科威特、阿曼、巴林、沙特阿拉伯和埃及都对部分易感牛群进行了疫苗接种。弱毒疫苗的制备可以通过在乳鼠或者细胞上连续传代进行制备。选用的佐剂有氢氧化铝或者弗氏不完全佐剂，使用这两种佐剂进行免疫时，免疫的剂量较大。目前在南非已经进行了弱毒株辅以弗氏不完全佐剂疫苗的商业化生产(Erasmus,1986)。另外，还可用提纯的皂苷的衍生物QuilA作为佐剂制备弱毒疫苗，病毒和佐剂以1:1的比例混合，2mL每头/份进行免疫，动物产生的抗体滴度高于以氢氧化铝或者硫酸葡聚糖佐剂疫苗，可使90%动物得到有效保护(Vanselowetal.,1995)，但是这种疫苗在使用前病毒粒子会形成多聚物造成疫苗保质期较短的问题(Vanselowetal.,1985)。目前使用弱毒株辅以QuilA的疫苗已经在澳大利亚进行商业化生产并使用。目前主要使用福尔马林、β-丙内酯、二乙烯亚胺及紫外光进行BEFV灭活。灭活的病毒直接作为疫苗不能够诱导机体产生中和抗体(Tziporietal.,1973)。在佐剂的选择上，最早使用铝凝胶或者弗氏不完全佐剂与灭活病毒制备灭活疫苗(Inabaetal.,1973)。日本研制的使用福尔马林灭活病毒及磷酸铝胶吸附的疫苗进行双倍剂量接种时能够引起很强的免疫反应，但是随后抗体水平又很快下降，到四个月后绝大部分免疫动物检测不到抗体存在(Inabaetal.,1973)。在我国的台湾地区使用水/油/水的乳剂制备的疫苗进行实验时，接种疫苗一个月后能够达到100%的保护效果(Hsiehetal.,2006)。近来以色列使用了一种灭活疫苗辅以水/油/水的佐剂的疫苗。这种疫苗在二次免疫后能够诱导很强的免疫反应并且持续维持很高的抗体水平，在二次免疫后可以有效地维持9个月，但是至少要进行三次接种才可达到有效保护。在接种的动物中也没有关于影响牛奶产量的报道(Aziz-Boaronetal.,2014)。此外，基于G蛋白的亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗也用于BEF的防控。在中国大陆，使用非离子型洗涤剂对G蛋白进行分离纯化，辅以液体石蜡佐剂制备疫苗，在三个周内进行两次免疫接种能够诱导免疫反应产生中和抗体(Baietal.,1993)。在澳大利亚研制了一种以QuilA为佐剂的G蛋白亚单位疫苗。在第0天和第21天分别进行一次免疫，在免疫后46天能够产生免疫保护作用，并且这种免疫保护至少持续12个月(Urenetal.,1994)。Wallace以牛结节性疹病毒Neethling株为表达载体表达牛流行热病毒G蛋白，制备疫苗在第0、3、6、12周天分别进行一次免疫，可诱导接种动物产生体液免疫和细胞免疫，但在小规模的动物实验中，该疫苗未能产生有效保护(Wallaceetal.,2005)。在澳大利亚，使用NYBH病毒中表达牛流行热的G蛋白制备的重组疫苗进行免疫接种时也能诱导动物产生特异性的中和抗体(Hertigetal.,1996)。虽然目前已报道了多种剂型的BEF疫苗，但在接种后都存在产生的抗体持续时间较短、免疫效果不理想的问题，成为BEF疫苗免疫防控中亟待解决的问题。1.6研究背景、目的和意义目前在牛流行热病的实验室诊断方面，已建立了病毒分离、RT-PCR和荧光定量RT-PCR等核酸检测方法以及微量中和实验、半微量补体结合反应、抗体ELISA等血清学的诊断方法，但无BEFV抗原的检测方法或商品化试剂盒，给田间样品的病毒筛查和培养物的鉴定等造成了困难。因此，本研究选取BEFV抗原G蛋白为靶点，通过基因克隆获得JT02L毒株的G基因编码区，5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言进而利用原核表达系统表达并纯化获得了抗原信息完整的目的蛋白，并以此制备高效价的兔源多克隆抗体，结合前期制备的抗G1表位的单克隆抗体，初步建立了特异的BEFV抗原捕获ELISA，并以田间样品和病毒分离培养验证了抗原捕获ELISA的实用性。在建立抗原捕获ELISA的基础上，进一步证实了天祝白牦牛在自然状态下可感染BEFV，增加了人们关于BEFV宿主的认识；通过检测病毒分离培养物中的BEFV抗原证实了病毒的分离并进而通过测序测定，揭示了东亚亚型BEFV的基因组特征。本论文研究不仅可为BEFV的筛查、鉴定提供一定技术支撑，还可为我国BEFV的分子进化、流行病学和防控提供有价值的信息。6 中国农业科学院硕士学位论文第二章BEFVG蛋白的原核表达与多克隆抗体的制备第二章BEFVG蛋白的原核表达与多克隆抗体的制备目前在牛流行热病的实验室诊断方面，已建立了病毒分离、RT-PCR和荧光定量RT-PCR等核酸检测方法以及微量中和实验、半微量补体结合反应、抗体ELISA等血清学的诊断方法，但无BEFV抗原的检测方法或商品化试剂盒，给田间样品的病毒筛查和培养物的鉴定等造成了困难。BEFV编码的5个结构蛋白中，G蛋白是主要的免疫原性蛋白，因此本研究表达了BEFVG蛋白，并制备了兔源多克隆抗体，所制备的多克隆抗体具有良好的反应性，能够识别天然的BEFVG蛋白。2.1材料2.1.1实验毒株及实验动物BEFV毒株JT02L牛体传代病毒及其早期细胞分离物，由中国农业科学院兰州兽医研究国家重点实验室保存。新西兰大白兔购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心。2.1.2试剂TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5、TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.4.0、RNase-freewater、PrimeScript™OneStepRT-PCRKitVer.2、ExTaq、胶回收试剂盒、大肠杆菌DH5a和BL21(DE3)感受态细胞；弗式完全佐剂、弗氏不完全佐剂佐剂、辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗牛IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG（Sigma）；小鼠抗His单克隆抗体、碱性磷酸酶（AP）标记的山羊抗兔IgG、AP标记的山羊抗鼠IgG，为购自艾博抗（上海）贸易有限公司。BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒，购自碧云天生物技术。pGEM-TeasyVector(Promega)；本实验室保存的pPROEXHTb表达质粒。2.1.3仪器设备核酸、蛋白测定仪：ThermoScientific恒温培养箱：ThermoScientific常温高速离心机（Centrifuge5424）：Eppendorf公司冷冻离心机（Centrifuge5417R）：Eppendorf公司移液枪：Eppendorf公司普通PCR仪：BIO-RAD水浴锅：LKBSysteeVE-40高压锅：德国赛斯泰克公司核酸电泳仪（DYY-12型）：北京市六一仪器厂紫外凝胶成像仪（SKL-4-01-018）：上海培青科技有限公司生物安全柜（BHC1300）：苏州净化设备有限公司通风柜（SW-TFG12）：苏州净化设备有限公司7 中国农业科学院硕士学位论文第二章BEFVG蛋白的原核表达与多克隆抗体的制备恒温振荡仪：杭州奥盛仪器有限公司普通电子天平：常熟梦兰百灵天平仪器有限公司微波炉：广东格兰仕集团有限公司2.2方法2.2.1目的基因的RT-PCR扩增2.2.1.1病毒RNA的提取使用TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0试剂盒提取血液中BEFV的RNA，操作步骤如下：1.取200µL的血浆、200µL的BufferVGB、20µL的ProteinaseK及1µL的CarrierRNA，充分混匀后置于56℃水浴温浴裂解10分钟，水浴后加入200µL无水乙醇，充分混匀。2.将SpinColumn安置于CollectionTube上，并将溶液移至SpinColumn中，13000g离心2分钟，弃滤液。3.加500µL的BufferRWA至SpinColumn中，13000g离心1分钟，弃滤液。4.加700µL的BufferRWB至SpinColumn中，13000g离心1分钟，弃滤液。5.重复操作步骤4。6.将SpinColumn安置于CollectionTube上，13000g离心2分钟。7.将SpinColumn安置于新的1.5mLRNasefree离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入30µL的RNasefreedH2O，室温静置5分钟。13000g离心2分钟洗脱RNA。2.2.1.2G基因扩增参考GenBank上公布的BEFVG基因序列，设计一对引物，扩增BEFVG基因。引物序列为：BEFVG基因-F：5’-ATGTTCAAGGTCCTCATAATTACC-3’；BEFVG基因-R：5’-TAATGATCAAAGAACCTATCATCA-3’；引物由南京金斯瑞有限公司合成。使用提取的BEFV病毒RNA为模板，扩增部分BEFVG基因片段，程序如下反应体系：PrimeScript1StepEnzymeMix1µL2×1StepBuffer12.5µLBEFVGF(10pM/µL)1µLBEFVGR(10pM/µL)1µL灭菌去离子水5.5µLRNA4µL总体积25µL8 中国农业科学院硕士学位论文第二章BEFVG蛋白的原核表达与多克隆抗体的制备扩增程序：50℃30min94℃4min94℃30s55℃30s×3572℃2min72℃10min12℃保存取5µLRT-PCR反应产物加入1µL6×loadingbuffer，用1%的琼脂糖凝胶电泳，在照胶仪器上查看目的条带。2.2.2目的片段胶回收剩余的RT-PCR产物使用1.2%琼脂糖进行凝胶电泳，使用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0试剂盒回收目的片段，回收步骤如下：1.称量胶块重量，计算胶块体积；2.以1mg=1µL进行计算，加入4个凝胶体积量的BufferGM至胶块中；3.振荡，充分溶解胶块；4.当凝胶完全溶解后，向溶液内加入3M醋酸钠溶液（pH5.2）10µL，均匀混合至溶液恢复黄色；5.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上；6.将溶液转移至SpinColumn中，13000g离心1分钟，弃滤液；7.加入700µL含有乙醇的BufferWB至SpinColumn中，室温13000g离心30秒钟，弃滤液；8.重复操作步骤7；9.将SpinColumn放置于CollectionTube上，室温13000g离心1分钟；10.将SpinColumn放置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入30μLElutionBuffer，室温静置1分钟；11.室温13000g离心1分钟洗脱DNA。2.2.3目的片段的连接、转化和测序2.2.3.1胶回收产物的连接将目的基因片段与pGEM-TeasyVector连接，反应体系如下：2×Rapidligationbuffer5µL胶回收产物（BEFVG基因全长）3µLpGEM-TeasyVector1µLT4DNA连接酶1µL总体积10µL9 中国农业科学院硕士学位论文第二章BEFVG蛋白的原核表达与多克隆抗体的制备将连接物置于16℃恒温水浴锅中，过夜连接。2.2.3.2连接产物的转化1.加入30µLDH5a感受态细胞到10µL连接产物中，轻轻混匀，冰上放置30min；42℃热激90s，冰浴2min；2.加入800µL无抗性的LB培养基，37℃，220转/分钟，振荡1h；3.1500g离心2min，弃掉上清液，适量保留，混匀；4.加入16µLX-gal、4µLIPTG，混匀，使用玻璃棒均匀地将菌液涂抹在含有Amp的LB固体培养基上，37℃恒温培养10~12h。2.2.3.3阳性菌的检测挑取大小均一的白色单菌落使用氨苄LB培养基（含60µg/mLAmp）摇菌扩大培养，并使用PCR检测，将检测的阳性菌液送南京金斯瑞生物公司测序。2.2.4原核表达载体的构建2.2.4.1引物的设计和合成根据测序结果，设计表达引物，F：5’-ATGGGATCCGAAATCAAATGTCCGCAACG-3’（BamHI）；R：5’-AGTCTCGAGTTACCAACCTACAACAGCAGATA-3’(XhoI)；由南京金斯瑞有限公司合成。2.2.4.2质粒的提取使用TaKaRa质粒提取试剂盒提取测序正确的重组质粒，步骤如下：1.取2mL的过夜培养菌液，13000g离心2分钟，弃上清；2.加250μL的SolutionⅠ（含RNaseA）充分悬浮细菌沉淀；3.加入250μL的SolutionⅡ轻轻翻转混合，充分裂解菌液；4.加入350μL的的SolutionⅢ（使用前4℃预冷），轻轻上下翻转混合5~6次，室温静置2分钟；5.室温13000g离心10分钟，取上清；6.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上；7.离心的上清液转移至SpinColumn，13000g离心1分钟，弃滤液；8.将500μL的BufferWA加入SpinColumn中，13000g离心30秒钟，弃滤液；9.加入700μL含有乙醇的BufferWB至SpinColumn中，13000g离心30秒，弃滤液；10.重复操作步骤9；11.重新将SpinColumn安置于CollectionTube，13000g离心1分钟，除尽残留洗液；12.将SpinColumn安置于新的1.5mL的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入30μL10 中国农业科学院硕士学位论文第二章BEFVG蛋白的原核表达与多克隆抗体的制备的ElutionBuffer，室温静置1分钟；13.13000g离心1分钟洗脱DNA；2.2.4.3基因片段的扩增以重组的BEFVG-pGEM-T质粒模板，扩增目的片段，反应体系和反应程序如下：反应体系：ExTaq12.5µLPrimerF1µLPrimerR1µLcDNA2µLRNase-freewater8.5µL总体积25µL扩增程序如下：94℃4min94℃30s55℃30s×3572℃2min72℃10min12℃保存取出5µLRT-PCR反应产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳，在照胶仪器上查看目的条带。2.2.4.4目的基因与表达载体的双酶切参照2.2.3中的方法进行胶回收1482bp的目的片段，并将获得的基因片段进行双酶切，体系如下：10×Kbuffer4µLBEFVG基因30µLBamHI3µLXhoI3µL总体积40µL将以上反应体系置于37℃水浴中酶切3h；然后进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳，将含有目的片段的胶进行回收。利用同样的体系对pPROEXHTb载体进行酶切并回收目的片段。2.2.4.5目的片段和表达载体的连接将胶回收产物进行连接，体系如下：11 中国农业科学院硕士学位论文第二章BEFVG蛋白的原核表达与多克隆抗体的制备2×Rapidligationbuffer5µLBEFVG基因酶切后回收产物3µLpPROEXHTb酶切后回收产物1µLT4DNA连接酶1µL总体积10µL将连接体系置于恒温水浴锅中，16℃过夜(12~16h)。2.2.4.6转化、挑斑和摇菌参照2.2.4中的方法转化、挑取单个克隆摇菌并提取质粒，利用PCR进行鉴定并将阳性质粒送生物公司进行序列测定。2.2.5重组质粒的的原核表达将测序正确的阳性质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取单个克隆置于氨苄LB培养基摇菌扩大培养，之后将菌液按1:100的比例接种到氨苄LB培养基中，37℃，200rpm摇3h左右测菌液OD600nm值达到0.6~1.0时，取出1mL未诱导的菌液作为诱导前对照，加入IPTG诱导剂进行诱导，IPTG终浓度为1.0mM/L，在加入诱导剂的第2、3、4、5、6、7h各取出1mL菌液。将不同时间点收集的菌液离心，使用50µL的PBS重悬，并加入等量的2×SDS蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10min，冷却加样进行SDS-PAGE。待电泳结束后进行考马斯亮蓝R250染色并脱色。2.2.6重组蛋白的纯化表达BEFVG蛋白的菌液使用Ni-NTAPurificationSystem操作方法进行目的蛋白的纯化，纯化步骤如下：1.将菌液离心，弃上清，用20mL的DenaturingBindingBuffer(pH7.8)进行重悬，超声破碎，超声后离心取上清。2.将4mL混匀的Resin加入Ni-NTAColumn中，使液体流出；3.每次加入10mL的DenaturingBindingBuffer(pH7.8)平衡Ni-NTAColumn。重复3次4.在Ni-NTAColumn中加入8mL的制备好的样品，在室温下，与Resin低速混匀1h；5.将Ni-NTAColumn垂直固定，流出液体；6.加入5mL的DenaturingBindingBuffer(pH7.8)至Ni-NTAColumn中，冲洗3次；7.加入5mL的DenaturingWashingBuffer(pH6.0)至Ni-NTAColumn中，重复3次；8.加入4mL的DenaturingWashingBuffer(pH5.3)至Ni-NTAColumn中，冲洗3次，；9.加入10mL的DenaturingElutionBuffer(pH4.0)洗脱，用1.5mL离心管收集洗脱液体，每管收集1mL，共洗脱7mL，并分别制备样品进行蛋白电泳分析；2.2.7BEFVG蛋白的鉴定以重组表达的BEFVG蛋白制样进行SDS-PAGE，分别使用小鼠抗His单克隆抗体、BEFV阳性牛血清、BEFV阴性牛血清为一抗，AP标记的山羊抗鼠IgG、HRP标记的兔抗牛IgG为二12 中国农业科学院硕士学位论文第二章BEFVG蛋白的原核表达与多克隆抗体的制备抗进行免疫印迹鉴定BEFVG重组蛋白。2.2.8兔源多克隆抗体的制备和鉴定免疫前通过兔耳缘静脉采集免疫前血液制备阴性血清。使用纯化的BEFV重组G蛋白与弗氏佐剂乳化后，采取腹股沟淋巴结附近皮下多点注射的方式进行免疫，程序如下（表2.1）：表2.1兔体免疫程序Table2.1Immunizationprocedureofrabbit时间间隔免疫次数免疫方法（天）1重组蛋白+等量弗式完全佐剂142重组蛋白+等量弗式不完全佐剂143重组蛋白+等量弗式不完全佐剂7待三免后第7天，通过心脏采血收集免疫后兔子的血清。利用重组G蛋白抗原包被酶标板，以免疫前阴性血清为对照，以HRP标记的山羊抗兔IgG（1:5000）进行倍比稀释对多克隆抗血清进行效价分析。同时分别以重组表达的BEFVG蛋白和BEFV细胞毒制样进行SDS-PAGE，以1:100倍稀释的抗BEFVG蛋白多克隆抗体及免疫前的血清为一抗，1:5000倍稀释的AP标记山羊抗兔IgG为二抗，进行免疫印迹鉴定制备的抗BEFVG蛋白多克隆抗体。2.3结果2.3.1BEFVG基因的克隆和序列测定以BEFV的RNA模板反转录目的基因，扩增的基因片段约为1872bp（图2.1），与预期大小一致。将其克隆至pGEM-Teasy载体并测序分析，该基因与GenBank中收录的早期测定的序列（序列号为JX564639）较为一致，核苷酸的一致性为99.8%，在G基因ORF1676位置出现一个C-T转换，由此推导的氨基酸序列在559位由原来的苏氨酸转变为甲硫氨酸（T-M），但在已知的4个抗原位点没有出现变异（附录1），说明JT02L在牛体传代的过程中具有抗原稳定性。图2.1BEFVG基因的PCR扩增Fig.2.1PCRamplificationofBEFVGgeneM:DNA分子质量标准；1：BEFVG基因的扩增产物M:DNAMarker2000;1:PCRproductsofBEFVGgene13 中国农业科学院硕士学位论文第二章BEFVG蛋白的原核表达与多克隆抗体的制备2.3.2原核表达载体的构建将G基因编码全部抗原位点的1482bp的片段克隆至原核表达载体pPROEXHTb中，利用PCR对4个克隆进行鉴定，结果表明4个克隆全部阳性（图2.2）。将获得的克隆进行序列测定，结果表明4个克隆完全一致，插入序列具有正确的读码框。M12345620001000750500200100图2.2重组质粒的PCR鉴定Fig.2.2PCRidentificationoftherecombinantplasmidsM:DNA分子质量标准DL2000；1-4：重组质粒PCR产物；P：阳性对照；N：阴性对照M1:DNAMarkerDL2000;1-4:PCRproductoftherecombinantplasmids;P:Postivecontrol;N:Negativecontrol.2.3.3重组蛋白的表达及纯化SDS-PAGE结果显示，在37℃，诱导7h的条件下，重组菌表达的蛋白量最高，结果显示在70ku附近条带明显且符合预期大小（图2.3）；蛋白纯化后条带较单一（图2.4）：图2.3重组菌表达产物的SDS-PAGE分析Fig.2.3SDS-PAGEanalysisofexpressionproductofrecombinantbacteriaM：蛋白质分子质量标准；1：未诱导的重组菌；2-7：重组菌诱导2h、3h、4h、5h、6h、7h的表达产物M:ProteinLadder;1:Uninducedbacteria;2-7:Theexpressionproductofinducedbacteriaat2h,3h,4h,5h,6hand7h.14 中国农业科学院硕士学位论文第二章BEFVG蛋白的原核表达与多克隆抗体的制备图2.4重组BEFVG蛋白的纯化Fig.2.4PurificationofrecombinantBEFVGproteinM：蛋白质Marker；1-7：纯化的BEFVG蛋白M:ProteinLadder，1-7：PurifiedrecombinantBEFVGprotein2.3.4重组蛋白的免疫原性分析以抗His标签的小鼠单克隆抗体为对照，利用BEFV阳性牛血清和阴性血清对纯化的G蛋白进行鉴定，结果表明BEFV阳性牛血清可与G蛋白发生反应，在70Ku处出现特异的条带，与对照的抗His标签抗体一致，而BEFV阴性牛血清与G蛋白无反应条带出现(图2.5)。图2.5重组蛋白的Western-blot分析Fig.2.5Western-blotanalysisofrecombinantproteinM：蛋白质Marker；1：抗His标签抗体；2：BEFV阳性血清；3：BEFV阴性血清M:Proteinmarker;1:Anti-Histagantibody;2:PositiveserumofBEFV；3:Negativeserum2.3.5兔源多克隆抗体的制备和鉴定利用重组G蛋白抗原建立间接ELISA测定表明获得兔源多克隆抗体的效价高于1:215。15 中国农业科学院硕士学位论文第二章BEFVG蛋白的原核表达与多克隆抗体的制备Western-blot结果显示，获得的多克隆抗体与重组蛋白可发生反应，在约70ku处有明显条带，而对照阴性兔血清未出现该条带（图2.6），制备的多克隆抗体与BEFV天然抗原也可发生特异的反应（图2.6）。M12M34图2.6多克隆抗体Wester-blot鉴定Fig.2.6IdentificationofthepolyclonalantibodybyWestern-blotM：蛋白质Marker；1：重组G蛋白与多克隆抗体的反应性；2：重组G蛋白与兔阴性血清反应性；3：病毒抗原与多克隆抗体的反应性；4：病毒抗原与兔阴性血清反应性M:ProteinMarker;1:RecombinantGproteinprobedwithmonoclonalantibody;2:RecombinantGproteinprobedwithrabbitnegativeserum;3:Viralantigenprobedwithmonoclonalantibody;4:Viralantigenprobedwithrabbitnegativeserum.2.4讨论BEFV为弹状病毒科，暂时热病毒属的成员。在其编码的5个结构蛋白中，G蛋白是主要的免疫原性蛋白。该蛋白有四个抗原位点，其中G1、G2、G3三个表位是最主要的抗原位点。三个表位中G1是位于G蛋白C端的一个线性的中和表位，该表位只与抗BEFV的抗体反应，与暂时热病毒属的其它病毒无交叉反应。本实验室之前利用原核表达的G蛋白C端表位区制备了单克隆抗体，有望作为捕获抗体或检测抗体用于BEFV抗原的检测。鉴于该区段只有一个表位，如果以其制备多克隆抗体，在理论上多克隆抗体与前期制备的单克隆抗体针对的表位相同，不利于后续的病毒抗原检测。前期研究表明，JT02L毒株与我国流行的LYC11、LS11等毒株具有完全相同的G蛋白表位，因此成为本研究选用的靶基因。克隆和测序结果表明JT02L毒株在牛体传代的过程中，抗原位点并未发生任何变异，证实该毒株具有抗原稳定性。利用原核表达系统成功获得BEFVG蛋白，使用抗His的小鼠单抗进行免疫印迹实验证明纯化获得的G蛋白大约70ku，这是由于只表达了1482bp的BEFVG基因，所以略小于BEFV的天然蛋白。利用BEFV抗体阳性牛血清验证表明了获得的重组G蛋白具有良好的反应原性，进而本研究利用该重组蛋白制备了高效、特异的兔源多克隆抗体，并以Western-blot证实制备的多克隆抗体能够有效识别BEFV的天然蛋白抗原。该多克隆抗体的获得，为后续的BEFV抗原检测奠定了坚实的基础。16 中国农业科学院硕士学位论文第三章BEFV抗原捕获ELISA诊断方法的建立第三章BEFV抗原捕获ELISA诊断方法的建立以制备的兔抗BEFVG蛋白多克隆抗体为捕获抗体，抗BEFVG蛋白G1表位的单克隆抗体为检测抗体，使用HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗，建立抗原捕获ELISA。通过方阵滴定，最终确定捕获抗体的最佳包被浓度为1:1000，检测抗体的最佳稀释比例1:1200。最佳的封闭剂为5%的明胶，酶标二抗的最佳稀释度为1:5000，底物的最佳显示时间是10min。建立的抗原捕获ELISA可以较好的检测传代细胞中的BEFV抗原。交叉性试验表明，使用制备的兔源多克隆抗体和单抗建立的BEFV抗原捕获ELISA具有较好的特异性。初步的建立的建立了以兔源多克隆抗体为捕获抗体，抗BEFVG蛋白G1位点的单抗为检测抗体的BEFV抗原捕获ELISA。3.1实验材料3.1.1病毒和样品BEFV细胞早期细胞分离物、水泡口炎病毒(vesicularstomatitisvirus，VSV)、牛病毒性腹泻病毒(bovineviraldiarrheavirus，BVDV)由本实验室保存。狂犬病毒(rabiesvirus，RV)灭活疫苗，购自英特威。3.1.2主要试剂抗BEFVG蛋白G1表位的单克隆抗体、兔抗BEFVG蛋白多克隆抗体，由本实验室保存；TMB、HRP标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；血清稀释液购自济南百迪泰生物公司；其他试剂均为国产分析纯。3.1.3主要仪器酶标仪：Model680MicroplateReader(BIO-RAD)；洗板机：Model1575ImmunoWash(BIO-RAD)；37°C恒温孵育箱；量筒；移液枪(Eppdorf)；微波炉(Galanz)；生物安全柜(AIRTECH苏净安泰)。3.2实验方法3.2.1捕获抗体与单抗最佳结合浓度的选择将捕获抗体（兔抗BEFVG蛋白多克隆抗体）做1:1000、1:2000、1:4000、1:8000稀释包板，100µL/孔，4℃过夜。PBST洗涤3次后，加入5%的明胶封闭液，200µL/孔，37℃封闭1h后用PBST洗涤3次，加入纯化的BEFVG蛋白作为阳性样品，100µL/孔，37℃温育1h后用PBST洗涤3次，将检测抗体（抗BEFVG蛋白G1表位的单克隆抗体）以1:300、1:600、1:1200、1:2400，加入孔内，100µL/孔，37℃温育1h，PBST洗涤3次后加酶标抗体（1:5000），100µL/孔，37℃温育1h，PBST洗涤3次后，加入TMB底物溶液，100µL/孔，37℃避光显色10min，随后每孔加入100µL的2M的H2SO4终止反应，测定OD450nm值。确定出捕获抗体与单抗的最佳稀释度。17 中国农业科学院硕士学位论文第三章BEFV抗原捕获ELISA诊断方法的建立3.2.2酶标抗体工作浓度的确定将捕获抗体以最佳稀释度包被酶标板，100µL/孔，4℃过夜。参照3.2.1方法操作，在加入酶标二抗时将HRP标记的山羊抗鼠IgG以1:2000、1:5000、1:10000、1:20000，稀释，100µL/孔，37℃孵育1h。洗涤后，加入TMB底物溶液，100µL/孔，37℃避光显色10min，随后加入终止液终止反应，测定OD450nm值。计算P/N，确定酶标抗体二者最佳的稀释度。3.2.3封闭液的选择用最佳稀释度的捕获抗体包被酶标板，4℃过夜。洗涤后，分别使用含5%明胶，5%BSA，5%脱脂奶粉的PBS进行封闭，并在37℃封闭1h；随后参照3.2.1操作步骤依次添加标准抗原，一抗，二抗，底物溶液及终止液。测定OD450nm值。以P/N值最大为最适封闭液和封闭时间。3.2.4底物显色时间的确定在其它确定的最佳工作条件下，加入TMB后，37℃温育5min、10min、15min、20min。加入终止液，测定OD450nm值。以P/N值最大为最适封闭液和封闭时间。3.2.5交叉试验为了评估抗原捕获ELISA方法的特异性，利用抗原捕获ELISA对狂犬病毒疫苗灭活抗原；VSV细胞抗原和BVDV细胞抗原进行特异性的测定。当P/N＞2时判定为阳性。3.3结果3.3.1捕获抗体与单抗最佳结合浓度的选择方阵滴定结果显示，当捕获抗体以1:1000包被，检测抗体以1:1200稀释时OD值接近1.0，且该稀释比例的组合P/N值最大（表3.1）。所以，确定捕获抗体和检测抗体的最佳工作最佳稀释度分别为1:1000和1:1200。18 中国农业科学院硕士学位论文第三章BEFV抗原捕获ELISA诊断方法的建立表3.1捕获抗体与检测抗体最佳使用浓度的确定Table3.1Determinationofthedilutionofcaptureantibodyanddetectingantibody捕获抗体检测抗体1:10001:20001:40001:8000阳性OD450nm1.8491.6901.4921.1811:300阴性OD450nm0.2020.1890.1870.178P/N值9.1538.9427.9796.635阳性OD450nm1.7081.5521.2920.9101:600阴性OD450nm0.1980.1850.1720.170P/N值8.6268.3897.5125.353阳性OD450nm1.4771.1510.8260.6601:1200阴性OD450nm0.1710.1720.1660.167P/N值8.4616.6924.9763.952阳性OD450nm1.2020.7310.5280.4111:2400阴性OD450nm0.1650.1630.1640.164P/N值7.2854.4853.222.5063.3.2酶标抗体工作浓度的确定将HRP标记的山羊抗小鼠IgG以1:2000、1:5000、1:10000、1:20000倍稀释时，当HRP标记的山羊抗小鼠IgG以1:5000稀释时P/N最大（图3.1），因此选择1：5000为酶标二抗的最佳工作浓度。图3.1HRP标记山羊抗小鼠IgG的稀释度优化Fig3.1OptimizationofthedilutionofHRP-goatanti-mouseIgG19 中国农业科学院硕士学位论文第三章BEFV抗原捕获ELISA诊断方法的建立3.3.3封闭液的选择如下图所示（图3.2）以5%的明胶、5%BSA，5%脱脂奶粉为封闭液，ELISA结果表明：当以5%的明胶封闭时，P/N最大；因此选择5%的明胶为封闭液。图3.2不同封闭液的P/N值测定Fig.3.2DeterminationofP/Nvalueofindividualblockingbuffer3.3.4底物显色时间的确定如图所示（图3.3），在底物反应时间为10min时，P/N值最大，因此确定最佳的反应时间为10min。图3.3P/N值与底物反应时间的相关性Fig.3.3CorrelationsbetweenP/Nvalueandincubationtimeofthesubstrate20 中国农业科学院硕士学位论文第三章BEFV抗原捕获ELISA诊断方法的建立3.3.5交叉试验利用抗原捕获ELISA对狂犬病毒(RV)灭活抗原、水泡口炎病毒（VSV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、BEFV细胞毒样品以及空白对照(未接毒细胞)进行测定，结果如下表3.2。结果表明，只有BEFV的细胞培养物判为阳性。表3.2交叉反应结果Table3.2Theresultofcross-reaction病毒OD450nm值P/NP/N值判定结果BEFV1.1256.466+RV0.2811.615-VSV0.3011.730-BVDV0.2961.701-Control0.1741-3.4讨论暂时热病毒属还包括贝里墨病毒（BRMV）、金伯利病毒（KIMV）、阿德莱德里弗病毒（ARV）、马拉科病毒（MALV）、奥博第安病毒（OBOV）、科汤卡恩病毒（KOYV）、雅塔病毒（YATV）、科通考讷病毒（KOOLV）等其它成员，主要流行于澳大利亚、尼日利亚和马来西亚等地而在我国从未报道。我们无法验证所建立的抗原捕获ELISA与这些病毒是否存在交叉反应，但前期研究表明基于BEFVG蛋白G1表位建立的间接ELISA与上述阳性血清无交叉反应，说明G1是BEFV特异的表位。在本研究中选用了抗BEFVG1表位的单克隆抗体，从而避免了同属病毒可能带来的交叉反应。在田间样品，BVDV存在比较普遍，同时弹状病毒科其它的动物病毒狂犬病毒（RV）、水泡性口炎（VSV）也可能对抗原检测造成干扰。因此，本研究通过进一步的特异性验证，排除在田间样品检测过程中这些病毒可能造成的假阳性。本研究选用BEFVG蛋白制备的兔源多克隆抗体作为捕获抗体，选用特异性的基于G1表位制备的单抗，使用方阵试验方法确定了捕获抗体、检测抗体以及酶标抗体的最佳稀释度，优化了封闭液和底物溶液的最佳反应时间，初步建立了BEFV抗原捕获ELISA。该方法的建立，有望为BEFV田间样品的筛查提供一定的支撑作用。21 中国农业科学院硕士学位论文第四章天祝白牦牛牛流行热的调查第四章天祝白牦牛牛流行热的调查利用建立的抗原捕获ELISA方法，结合抗体间接ELISA、荧光定量RT-PCR方法对甘肃省武威市天祝藏族自治县7个乡镇共计224头白牦牛的全血和抗凝血进行检测。在7个乡镇的白牦牛均检出BEFV抗体，但无BEFV抗原检出。白牦牛BEFV抗体总体阳性率为45.09%（101/224），不同乡镇白牦牛BEFV感染率存在较大差异（31.03~66.67%）。荧光定量RT-PCR结果表明BEFV核酸阳性率为37.5%（84/224）。以获得的G基因3’端420bp区段测序并构建系统发育树表明，白牦牛群BEFV流行毒株与中国大陆1976年分离的JB76H毒株亲缘关系较近，为BEFV基因亚型I。4.1实验材料4.1.1样品天祝藏族自治县采集一周岁以上白牦牛的全血和抗凝血各一份，共采集224头。将全血1500g离心15min，分离血清，-20℃保存；抗凝血分成两份，一份以1200g离心30min，分离血浆及白细胞，另一半于4℃保存。4.1.2试剂E.coliDH5α感受态细胞、PrimeScript™OneStepRT-PCRKitVer.2、荧光定量RT-PCR试剂盒OneStepPrimeScript™RT-PCRKit(PerfectRealTime)、核酸提取试剂盒TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5、质粒提取试剂盒TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.4.0、核酸marker：DL2000DNAMarker，购自大连宝生物工程有限公司。克隆载体pGEM-TeasyVectorsysternI，购自Promega公司。牛流行热病毒间接ELISA抗体检测试剂盒（中试产品）由中国农业科学院兰州兽医研究所诊断中心提供。4.2方法4.2.1引物设计与合成参照文献中(Strametal.,2005)的real-timeRT-PCR方法，结合我国流行BEFV毒株的G基因序列，对引物和探针进行优化。合成引物用于RNA的荧光定量RT-PCR检测的引物和探针。引物F：5’-GAAATCAAATGTCCGCAACGTTTGA-3’；引物R：5’-AATGTTCATCTTTTGCGAGATTATGA-3’；探针P：5’-FAM-AATTGTCACTTCAGGCCC-TAMRA-3’；根据参考文献(Zhengetal.,2012)中的RT-PCR方法，合成引物如下：420F：5’-AGAGCTTGGTGTGAATAC-3’；420R：5’-CCAACCTACAACAGCAGATA-3’，用于扩增BEFVG基因3’端420bp的片段，引物由南京金斯瑞公司合成。22 中国农业科学院硕士学位论文第四章天祝白牦牛牛流行热的调查4.2.2BEFV抗体检测根据牛流行热病毒间接ELISA抗体检测试剂盒按说明书说明检测血清样本，主要程序包括：将10µL待检血清与90µL血清稀释液混合后，加入到包被好抗原的ELISA反应板中，37℃孵育30min；用PBST洗涤3次后，按1:100的比例稀释试剂盒中辣根过氧化物酶标记的兔抗牛的酶标二抗，经37℃孵育30min；再用PBST洗涤3次后，加入底物TMB并于37℃避光10min；加入终止液，在BIO-RADModel680MICROPLATEREADER中读取OD450吸光值。根据公式：效价=（OD450nm样品－OD450nm阴性对照）/（OD450nm阳性对照－OD450nm阴性对照），计算样品效价，根据说明书说明，效价≥0.3的样品判为阳性，效价<0.22的样品判为阴性，效价在0.22~0.3之间判定为可疑，对于可疑样品应进行重复检测，重复后效价<0.3判定为阴性，效价≥0.3的样品判为阳性。4.2.3BEFV抗原捕获ELISA检测将分离的血浆和白细胞分别反复冻融三次，加样前混匀，作为检测样品。根据确定的抗原捕获ELISA的最佳反应条件，进行BEFV抗原检测。4.2.4BEFV实时荧光定量RT-PCR检测将采集的224头耗牛的抗凝血各取200µL，分别利用核酸提取试剂盒TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5提取病毒RNA；参考OneStepPrimeScript™RT-PCRKit(PerfectRealTime)试剂盒说明书，配制实时荧光定量RT-PCR反应体系，混匀后置于MX3000Preal-timePCR仪器中进行一步法RT-PCR检测。检测程序为：42℃，5min；95℃，10s进行反转录反应；95℃5s，60℃30s，进行40个循环，进行扩增，在每一循环结束时采集FAM通道的荧光信号。在反应完成后，根据扩增Ct值进行判定。当Ct值<36的判定为阳性，Ct值≥36的判定为阴性。4.2.5BEFVG基因3’片段的扩增及进化分析4.2.5.1BEFVG基因3’片段的扩增随机挑选实时荧光定量RT-PCR检测阳性的RNA样品22个，根据PrimeScript™OneStepRT-PCRKitVer.2试剂盒说明书，进行RT-PCR，反应体系为：2×1stepBuffer12.5µLRNaseFreedH2o7.5µLPrimerF1µLPrimerR1µLRNA2µLPrimeScript1stepEnzymeMix1µL总体积25µL23 中国农业科学院硕士学位论文第四章天祝白牦牛牛流行热的调查扩增程序如下：50℃30min94℃2min94℃30s55℃30s×3572℃1min72℃10min4℃保存将RT-PCR扩增产物用1%琼脂糖电泳检测并并回收目的条带。4.2.5.2目的片段的连接、转化和测序参考2.2.4方法4.2.5.3BEFVG基因3’片段的进化分析以PCR的方法鉴定克隆阳性，并将初步鉴定正确阳性的克隆提取质粒并送南京金斯瑞公司进行测序分析。用DNAstar、BioEdit进行序列分析，参考NCBI相关序列以MEGA6.06软件构建进化树（参数为model:maximumcompositelike-lihood;substitution,transitionsplustransversions;Uniformrates）。参考基因的信息见表4.1表4.1用于G基因序列比较的BEFV参考毒株Table4.1ReferenceBEFVstrainsforGgenecomparison毒株序列号来源年份YHLAB462028日本山口1966Hirado-6AB462029日本长崎1988Amakusa-1AB462031日本熊本1988ON-BEF-88-1AB462034日本冲绳1988ON-BEF-88-4AB462036日本冲绳1988ON-BEF-89-2AB462038日本冲绳1989ON-BEF-89-3AB462039日本冲绳1989ON-BEF-01-1AB462041日本冲绳2001ON-BEF-01-2AB462042日本冲绳2001ON-BEF-01-3AB462043日本冲绳2001CS1647AF058322澳大利亚昆士兰1984UL-1-2001AY062166中国台湾20011984/TW/TN1AY935239中国台湾19841996/TW/TN1AY935240中国台湾19962001/TW/TN1AY935241中国台湾2001LS11JX564637中国大陆2011JT02LJX564639中国大陆2002JB76HJX564640中国大陆1976BB7721KF679404澳大利亚查特斯堡1968CS1818KF679408澳大利亚上巴伦1970Henan1/2012KM276084中国大陆201224 中国农业科学院硕士学位论文第四章天祝白牦牛牛流行热的调查4.3结果4.3.1检测结果从下表可见（表4.2）用牛流行热病毒间接ELISA抗体检测试剂盒、抗原捕获ELISA及荧光定量RT-PCR对对天祝7个乡镇的224头白牦牛分别进行抗体、抗原及核酸进行检测。结果显示BEFV抗体阳性率为45.09%，抗原的检出率为0，荧光定量RT-PCR的核酸检出率为37.5%。表4.2白牦牛BEFV检测结果Table4.2PrevalenceofBEFVinwhiteyaks检测方法阳性阴性阳性率间接ELISA12310145.1%AC-ELISA02240%qRT-PCR8414037.5%4.3.2BEFVG基因的扩增及进化分析选取22份荧光定量RT-PCR检测阳性的RNA样品进行RT-PCR并克隆测序得到BEFVG基因3’端420bp区段的序列，测序表明来源于不同样品的BEFVG基因3’端420bp片段序列一致。使用该片段构建系统发育树。结果表明天祝白牦牛群BEFV流行毒株与我国1976年BEFV的JB76H毒株亲缘关系较近，处同一分支，为BEFV基因亚型I（见图4.1）。100whiteyakJX564640JB76HJX564639JT02LAY9352412001/TW/TN1995453AY062166UL-1-200167AB462042ON-BEF-01-2I9778AB462041ON-BEF-01-1AB462043ON-BEF-01-378AY9352401996/TW/TN1JX564637LS1183100KM276084China/Henan1/201265AY9352391984/TW/TN1AB462034Azuma29AB462036ON-BEF-88-482AB462031Amakusa-1II64AB462029Hirado-6AB462038ON-BEF-89-2100AB462039ON-BEF-89-3AB462028YHLIII52AF058322CS1647KF679408CS1818IV100KF679404BB7721图4.1白牦牛BEFVG基因系统发育分析0.01▲白牦牛BEFVG基因序列Fig4.1PhylogenetictreebasedonnucleotidesequencesofBEFVGgene▲BEFVGgenesequenceofwhiteyak25 中国农业科学院硕士学位论文第四章天祝白牦牛牛流行热的调查4.4讨论最近的流行病学资料表明，在我国大陆地区26个省区的黄牛、水牛、奶牛、牦牛均存在BEFV抗体，但是关于西北地区特有的白牦牛是否对BEFV具有易感性，知之甚少。白牦牛主产于甘肃省天祝藏族自治县，是我国乃至世界稀有而宝贵的畜禽种质资源，也是天祝县的重要畜牧资源。本研究利用BEFV抗原、抗体和核酸的检测方法，首次证实在天祝白牦牛中存在BEFV流行，进一步选用BEFVG基因3’端420bp保守片段进行扩增和测序发现天祝白牦牛群BEFV流行毒株与我国从北京、浙江、河南等地分离的BEFV毒株JB76H、JT02L、LS11、Henan1/2012均属于BEFV基因亚型I。白牦牛生活在海拔3000m左右高寒少氧的高山草原特殊环境，为地方品种，流动性小，不存在异地感染后产生抗体后转入当地的可能。因此，在自然状态下白牦牛可能对BEFV具有一定的易感性。利用抗原捕获ELISA未能在白牦牛筛查获得BEFV抗原，其原因可能在于BEFV感染的病程较短，本研究多次尝试但未能扩增获得样品中BEFV完整的G基因编码区，说明在样品中，中和抗体已经将大部分病毒中和，可能只有非常微量的病毒抗原残存，由于所建立的BEFV抗原捕获ELISA方法敏感性的限制，不足以获得阳性信号。因此，在后续的研究中，还需进一步提高抗原捕获ELISA的敏感性。26 中国农业科学院硕士学位论文第五章BEFV病毒的分离及全基因组的测定第五章BEFV病毒的分离及全基因组的测定以JT02L牛体传代病毒静脉接种感染实验公牛，并于牛体39.0~42.0℃发热期采集抗凝血，分离淋巴细胞并接种至MDBK细胞，盲传后收集细胞培养物，以建立的抗原捕获ELISA检测病毒抗原。在第3代培养物中检测到BEFV抗原，进而对细胞培养物中BEFV进行基因组测序表明JT02L毒株全长为14941nt，与GenBank中收录的BEFV基因组结构类似但α3和β蛋白编码区较长，并且β和γ基因间隔含38nt的AT丰富区，可能与病毒毒力相关。这些结果表明，本研究建立的抗原捕获ELISA可以较好的用于BEFV抗原检测，为BEFV的筛查、分离鉴定奠定了基础。5.1实验材料5.1.1细胞与毒株MDBK细胞、BEFVJT02L牛体传代病毒（保存于-80℃），为本实验室保存。5.1.2实验动物无BEFV抗体及病毒感染的2头公黄牛，约18月龄，购自甘肃武威某牛场。5.1.3实验试剂牛外周血白细胞分离液试剂盒购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，PrimeScriptone-stepEnzymeMix、DL2000DNAMarker、TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5购自宝生物工程(大连)公司；MEM和高糖型DMEM培养基购自海克隆公司；细胞培养板购自美国康宁公司；胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶购自Gibco公司；RIPA细胞裂解液购自碧云天生物技术公司。5.2实验方法5.2.1实验感染模型的建立取实验室保存的BEFVJT02L牛体传代病毒血液的血毒20mL，静脉注射046、048号黄牛各10mL。在攻毒后的1~10天内，每天颈静脉采集抗凝血及全血，连续监测10天，并测量体温。5.2.2RT-PCR测病毒血症使用TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0试剂盒提取血液中病毒RNA，利用4.2.1和4.2.5中的引物和扩增方法扩增G基因3’端420bp的DNA片段。5.2.3病毒的分离5.2.3.1白细胞的分离27 中国农业科学院硕士学位论文第五章BEFV病毒的分离及全基因组的测定以牛外周血白细胞分离液试剂盒对39.0~42.0℃高热期的抗凝血进行淋巴细胞分离，操作程序为：1.取7mL血液，将血液与样本稀释液1:1稀释混匀备用，取一支50mL离心管，先加入与样本等量的分离液。2.将血液样本小心加于分离液之液面上，750g，离心30min。3.离心后用吸管小心吸取所有环状乳白色细胞层，加入10mL清洗液，混匀细胞，离心10min。重复洗涤2-3次，即得所需白细胞。5.2.3.2病毒的传代培养1.配制10%FBS细胞生长液：取10mLFBS加入到90mL的DMEM培养基中，轻轻混匀；2.从液氮中取出冻存的MDBK细胞，放入37℃温水中，令其溶化。3.从37℃温水中取出冻存管，使用75%酒精对冻存管进行消毒后移入生物安全柜中进行操作；4.打开冻存管盖子，用移液枪吸取细胞悬液，加入到25mL的细胞品种，然后加入5mL的细胞生长液，轻轻吹打，混匀细胞，移入37℃，5%CO2温箱中培养。5.待细胞培养品种细胞贴壁后，更换培养基，继续传代培养；6.弃去细胞生长液，用无血清的DMEM培养基清洗2遍。加入分离的牛淋巴细胞，37℃吸附1h。7.加入5mL2%FBS的DMEM维持液，在5%的CO2培养箱中继续培养72h。收集细胞置于-80℃。反复冻融三次，以4000g室温离心10min，取2mL上清接种MDBK细胞，进行盲传。并于倒置显微镜下观察是否发生病变。5.2.4RT-PCR方法鉴定分离毒株参考2.2.1.1实验方法5.2.5抗原捕获ELISA检测取RT-PCR阳性且可产生细胞病变的BEFV传代培养物，重新接种MDBK细胞，于接种后48h收集细胞，加入500µLRIPA细胞裂解液与冰上裂解10min，之后于12000g，4℃离心3min，收集上清作为待检抗原。同时利用未接毒的MDBK细胞制备阴性对照抗原。5.2.6BEFVJT02L毒株全基因组测序根据BEFV保守片段设计引物（表5.1），提取细胞中传代的BEFVJT02L毒株的RNA，进行RT-PCR扩增，回收目的片段并克隆至pGEM-Teasy载体，挑斑、摇菌并经PCR鉴定后将阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。28 中国农业科学院硕士学位论文第五章BEFV病毒的分离及全基因组的测定表5.1BEFVJT02L基因组扩增引物Table5.1PrimersforusedamplificationofgenomeofBEFVJT02LPrimerNucleotidesequence(5’-3’)PositionAmplicon(bp)BEFV1FACGAGAAAAAACAAAAAAACTAATTG1730BEFV730RTACCTGGAAGCTACTGTGCCA730BEFV601FTTGCTGTTCACGGAAGTTGG6011775BEFV2375RATTCCTATCATCCACTGAGCCT2375BEFV2100FTGCCAGGAACATATCACGACTTG21001111BEFV3210RATGGGCTTGAAGTGATAATTCAT3210BEFV3058FATGTTCAAGGTCCTCATAATTACC30581871BEFV4928RTAATGATCAAAGAACCTATCATCA4928BEFV4750FTCTCACAGTAAGCATAGGGAAG47501778BEFV6527RCATCGCCTTCTAGTGTTTTATTG6527BEFV6370FAATATATACTGACACTGAAAG63701851BEFV8220RTACGTTTTCCTATTGCTCTTC8220BEFV8010FTGCCTGATCAAGAATGTTGCTG80102041BEFV10050RTCCTTAGCCTTTAGTCCAATTAC10050BEFV9900FAGGCGGTGAATGATTATGG99001802BEFV11701RATCCCAAATAGGCATTAC11701BEFV11452FATTCCTGTGGTTGAGAAC114522018BEFV13469RAGTGAGCTCCCGTTGC13469BEFV13290FTGGAAGAAAGACGAACATG132901611BEFV14900RACGAAGAAAAACAAATAAAATAC149005.3实验结果5.3.1临床症状攻毒的46、48号两头黄牛在攻毒后的3~4天后都出现了体温升高的症状，体温变化见图5.1。并伴有精神沉郁和食欲减退的症状。图5.1攻毒后牛的体温变化曲线Fig5.1Temperaturechangecurveaftervirusinnoculation29 中国农业科学院硕士学位论文第五章BEFV病毒的分离及全基因组的测定5.3.2RT-PCR检测病毒血症病毒检测从全血中提取病毒RNA作为模板进行RT-PCR检测，分析发现在接种后采集的39.0~42.0℃牛高热期血液中均检测到BEFVG基因C端420bp核酸片段（图5.2）5.3.3病毒的分离及鉴定MDBK细胞接种高热期牛淋巴细胞后盲传三代，在第4代MDBK细胞72h后明显发生病变（图5.3），以RT-PCR方法检测到BEFVG蛋白3’端420bp的片段（图5.4），证明BEFV成功感染MDBK细胞。对照组72h接毒组72hpi图5.3BEFV感染MDBK细胞Fig.5.3MDBKcellinfectedbyBEFV图5.4BEFVG基因3’端的RT-PCR扩增Fig.5.4RT-PCRamplificationofBEFVGgene3’terminal5.3.4抗原捕获ELISA诊断BEFV抗原捕获ELISA结果显示，在BEFV接种MDBK48h后可检测到病毒抗原，而对照的MDBK细胞无阳性信号检出。30 中国农业科学院硕士学位论文第五章BEFV病毒的分离及全基因组的测定5.3.5BEFVJT02L毒株全基因组测序测序结果表明，BEFVJT02L毒株基因组为14941nt。其中第1~50位为前导序列，第14869~14941位为尾随序列。该基因组共编码8个ORF，分别为N（51~1378位）、P（1405~2262位）、M（2307~2997位）、G（3045~4941）、GNS(4993~6777位)、α1α2（6815~7452位）、β（7492~7951位）、γ（8020~8419位）、L（8399~14868位）。各基因的基因间隔区分别为26,44,47,51,37,39,68及-21nt。此外还有两个可变阅读框编码P’蛋白和α3蛋白，分别位于基因组1692~1838位及7165~7338位。在基因水平上，JT02L毒株与Henan1/2012毒株的相似性（99.2%）高于澳大利亚的BB7721毒株（90.6%），表明JT02L与Henan1/2012毒株具有较高的亲缘关系。JT02L毒株基因组与澳大利亚毒株BB7721和我国Henan2012毒株的功能区虽有较高的相似性，但具有自身独特的基因组结构特征。主要表现为JT02L的α3ORF和βORF分别比BB7721和Henan1/2012毒株长18nt和120nt。比较不同BEFV毒株与其它毒株相同，JT02L毒株各基因的转录启始序列的上游都含保守的UUGUCC序列，但是在基因下游的不同的毒株的序列存在一定程度的变异。JT02L的β和γ基因间隔含38nt的AT丰富区，并且其各基因下游的转录终止/多聚腺苷酸化序列序均为GUAC[U]7，而细胞传代的BB7721及Henan1/2012毒株的β基因下游的转录终止/多聚腺苷酸化序列GUAC[U]6。5.4讨论BEFV在我国流行范围广泛，在1949年前部分地区就有BEF流行，但直至1955年才正式报道，并于1976年分离到病毒。此后20多年一直无关于病毒分离的正式报到，直至2002年研究人员陆续从浙江、河南、山东等地分离获得了JT02L、LS11、LYC11和Shandong2011、Henan1/2012等毒株（Zhengetal.,2009;侯佩莉等，2012），而且过去对我国BEFV毒株的研究主要集中对G蛋白进行研究分析（Zhengetal.,2012），对全基因组的研究还不够深入。本研究利用实验室保存的2002年采集的JT02L感染实验牛，分离淋巴细胞并将BEFV适应至MDBK细胞上传代培养。在利用细胞培养进行病毒分离的过程中，结合常规的RT-PCR检测，利用本研究建立的BEFV抗原捕获ELISA对培养物中的病毒进行抗原检测进一步确认病毒在细胞中的增殖。结果表明，建立的BEFV抗原捕获ELISA方法能够检测到细胞毒中的BEFV抗原，可作为BEFV的分离鉴定的一种可靠的检测技术。本研究在获得JT02L分离株的基础上测定获得了其全基因组编码信息并揭示了其基因组的独特的特征，尤其是β基因及β-γ的基因间隔区的特殊结构是否与病毒对宿主的致病性存在关联，还需在后续的研究中深入分析。31 中国农业科学院硕士学位论文第六章全文结论第六章全文结论1.在原核表达系统中成功表达了含有全部抗原位点的BEFVG蛋白，以牛BEFV阳性血清验证了重组G蛋白的反应原性，进而制备了高效特异的兔源多克隆抗体，而且与BEFV天然抗原具有较好的反应活性。2.以制备的多克隆抗体和特异的单克隆抗体初步建立了能够用于实验室检测的BEFV抗原捕获ELISA方法，与同科的狂犬病毒、水泡性口炎病毒以及普遍流行的牛病毒性腹泻病毒无交叉反应，特异性较好。3.利用田间样品，对BEFV抗原捕获ELISA进行了评价，并使用成熟的抗体和核酸检测方法，首次证实了白牦牛可自然感染BEFV，拓宽了关于BEFV宿主范围的认识。4.从实验感染牛分离淋巴细胞并接种MDBK传代细胞，利用抗原捕获ELISA成功检测到传代培养物中的BEFV抗原，进而通过测序获得JT02L毒株的全基因组信息，揭示了其独特的β基因及β-γ的基因间隔区结构，为BEFV分子致病机制研究奠定了基础。32 中国农业科学院硕士学位论文参考文献参考文献1.侯佩莉，等.牛流行热病毒山东流行株G基因的克隆及序列分析[J].动物医学进展,2012,33(10):1-5.2.邱基洪.奶牛流行热的防控技术[J].中国乳业,2016,(12):48-49.3.吴清明，等.奶牛流行热疫情的防控总结与思考[J].中国奶牛,2016,(10):34-37.4.AbuElzeinE.M.,etal.ObservationsontherecentepizooticofbovineephemeralfeverinSaudiArabia[J].RevueScientifiqueEtTechnique,1999,18(3):672-680.5.AbuElzeinE.M.,etal.ObservationsontherecentepizooticofbovineephemeralfeverinSaudiArabia[J].RevueScientifiqueEtTechnique,1999,18(3):672-680.6.AbuelzeinE.M.,etal.AstudyonbovineephemeralfeverinvolvingsentinelherdsandserosurveillanceinSaudiArabia[J].RevueScientifiqueEtTechnique,2007,25(3):1147-1151.7.Anderson.,etal.,Theprevalenceofantibodytothevirusesofbovinevirusdiarrhoea,bovineherpesvirus1,riftvalleyfever,ephemeralfeverandbluetongueandtoLeptospiraspinfree-rangingwildlifeinZimbabwe[J].Epidemiology&Infection,1998,121(2):441-449.8.Aziz-BoaronO.,etal.Theprotectiveeffectivenessofaninactivatedbovineephemeralfevervirusvaccine[J].VetMicrobiol,2014,173(1-2):1-8.9.Aziz-BoaronO.,etal.CirculationofbovineephemeralfeverintheMiddleEast-Strongevidencefortransmissionbywindsandanimaltransport[J].VeterinaryMicrobiology,2012,158(3-4):300-307.10.BaiW.B.,EpidemiologyandcontrolofbovineephemeralfeverinChina[A].In:StGeorgeTD.,etal.Bovineephemeralfeverandrelatedrhabdoviruses[C].Canberra:AustralianCentreforInternationalAgriculturalResearch,1993,20–22.11.BaiW.B.,etal.Studiesonavaccineagainstephemeralfever[A].,In:StGeorgeTD.,etal.Bovineephemeralfeverandrelatedrhabdoviruses[C].Canberra:AustralianCentreforInternationalAgriculturalResearch,1993,111-114.12.BaiW.B.,etal.Clinicalandpathologicalresponsesofwaterbuffalo(Bubalusbubalis)toexperimentalinfectionwithbovineephemeralfevervirus-Chinesestrain[J].AustralianVeterinaryJournal,1989,66(11):373-374.13.BarnardB.J.H.,AntibodiesagainstsomevirusesofdomesticanimalsinsouthernAfricanwildanimals[J].OnderstepoortJournalofVeterinaryResearch,1997,64(2):95-110.14.BassonP.,etal.Thepathologyofephemeralfever:astudyoftheexperimentaldiseaseincattle[J],J.Sth.Afr.Vet.Med.Ass,1970,40:385-397.15.BevanL.E.W.,Preliminaryreportontheso-called“stiffsickness”or“three-day-sickness’ofcattleinRhodesia[J].JournalofComparativePathology&Therapeutics,1907,20(7):104-113.16.CybinskiD.H.,etal.IsolationofarbovirusesfromcattleandinsectsattwosentinelsitesinQueensland,Australia,1979-85[J].AustralianJournalofZoology,1990,38(1):25-32.33 中国农业科学院硕士学位论文参考文献17.CybinskiD.H.,etal.Mappingofantigenicsitesonthebovineephemeralfevervirusglycoproteinusingmonoclonalantibodies[J].1990,71(Pt9)(9):2065-2072.18.DaviesF.G.,ThenaturalhistoryofephemeralfeverinKenya[cattle].[Symposiumpaper][C].ACIARProceedings-AustralianCentreforInternationalAgriculturalResearch(Australia),1993,.19.DaviesF.G.,etal.ObservationsontheepidemiologyofephemeralfeverinKenya[J].JournalofHygiene,1975,75(2):231-235.20.DumagP.U.,Livestockdiseasesandparasites:preventionanditscontrol[J].PhilippineJournalofAnimalIndustry,1977,32:127-143.21.ElzeinE.M.E.A.,etal.BovineephemeralfeverinSaudiArabia.[J].VeterinaryRecord,1997,140(24):630.22.ErasmusB.J.,UseofliveephemeralfevervaccineinSouthAfrica[A].In:StGeorgeTD,,etalProceedingsofthe4thSymposiumonArbovirusResearchinAustralia,Brisbane,[C].Australia:ArbovirusResearchinAustraliaSymposium,1986,318-31923.FaragM.A.,etal.EpizooticsofbovineephemeralfeverondairyfarmsinSaudiArabia[J].RevueScientifiqueEtTechnique,1999,17(3):713-722.24.GeorgeT.D.S.,etal.Theepizootiologyofbovineephemeralfeverinaustraliaandpapua-newguinea[J].AustralianVeterinaryJournal,1977,53(1):17-28.25.HamblinC.,etal.Antibodiestosomepathogenicagentsinfree-livingwildspeciesinTanzania[J].Epidemiology&Infection,1990,105(3):585.26.HertigC.,etal.Vacciniavirus-expressedbovineephemeralfevervirusGbutnotG(NS)glycoproteininducesneutralizingantibodiesandprotectsagainstexperimentalinfection[J].JournalofGeneralVirology,1996,77(Pt4)(2):631-640.27.HsiehY.C.,etal.BovineephemeralfeverinTaiwan(2001-2002)[J].JournalofVeterinaryMedicalScience,2005,67(4):411-416.28.HsiehY.C.,etal.DNAsequenceanalysisofglycoproteinGgeneofbovineephemeralfevervirusanddevelopmentofadoubleoilemulsionvaccineagainstbovineephemeralfever[J].JournalofVeterinaryMedicalScience,2006,68(6):543-548.29.InL.S.,etal.Sero-surveyonAino,Akabane,Chuzan,bovineephemeralfeverandJapaneseencephalitisvirusofcattleandswineinKorea[J].JournalofVeterinaryScience,2007,8(1):45.30.InabaY.,etal.Formalin-inactivated,aluminumphosphategel-adsorbedvaccineofbovineephemeralfevervirus[J].ArchivesofVirology,1973,42(1):42-53.31.InabaY.,etal.Serologicalidentificationofbovineepizooticfevervirusasephemeralfevervirus[J].JapaneseJournalofMicrobiology,1970,13(4):388-389.32.JohalJ.,etal.AntigeniccharacterizationofbovineephemeralfeverrhabdovirusGandGNSglycoproteinsexpressedfromrecombinantbaculoviruses[J].ArchivesofVirology,2008,153(9):1657-1665.33.JoubertD.A.,etal.Bovineephemeralfeverrhabdovirusα1proteinhasviroporin-likepropertiesandbindsimportinβ1andimportin7[J].JournalofVirology,2014,88(3):1591-1603.34 中国农业科学院硕士学位论文参考文献34.KempG.E.,etal.IsolationofbovineephemeralfevervirusinNigeria[J].VeterinaryRecord,1973,93(4):107.35.KimY.H.,etal.SeroprevalenceoffivearbovirusesinsentinelcattleaspartofnationwidesurveillanceinSouthKorea,2009-2012[J].JournalofVeterinaryMedicalScience,2014,77(2):247-250.36.KirklandP.D.,Akabaneandbovineephemeralfevervirusinfections[J].VeterinaryClinicsofNorthAmericaFoodAnimalPractice,2002,18(18):501-514.37.KirklandP.D.,etal.Theepidemiologyofbovineephemeralfeverinsouth-easternAustralia:evidenceforamosquitovector[A].In:StGeorgeT.D.,etal.BovineEphemeralFeverandRelatedRhabdoviruses[C].Canberra:AustralianCentreforInternationalAgriculturalResearch,1993,33-37.38.KongsuwanK.,etal.LocationofneutralizingepitopesontheGproteinofbovineephemeralfeverrhabdovirus[J].JournalofGeneralVirology,1998,79(11):2573-2581.39.LaneR.P.,InsectsofSaudiArabia-Culicoides(Diptera:Ceratopogonidae)ofSaudiArabiaandtheirpotentialveterinaryimportance[J],FaunaofSaudiArabia,1983,5:529-544.40.LiZ.,etal.Large-scaleserologicalsurveyofbovineephemeralfeverinChina[J].VeterinaryMicrobiology,2014,176(1-2):155-160.41.MackerrasI.M.,etal.ExperimentalStudiesofEphemeralFeverinAustralianCattle[J].BulletinoftheCouncilforScientific&IndustrialResearchAustralia,1940,136:1-116.42.MalviyaH.K.,etal.Ephemeralfever-aclinicalandepidemiologicalstudyincross-bredcowsandbuffaloes[J].IndianVeterinaryJournal:1977:440-444.43.MckenzieR.A.,etal.DiseasesofdeerinsoutheasternQueensland[J].AustralianVeterinaryJournal,1985,62(12):424.44.McwilliamS.M.,etal.GenomeorganizationandtranscriptionstrategyinthecomplexGNS-Lintergenicregionofbovineephemeralfeverrhabdovirus[J].1997,78(Pt6)(6):1309-1317.45.MurphyF.A.,etal.Bovineephemeralfevervirusincellcultureandmice[J].ArchivesofVirology,1972,38(2):234-249.46.MurrayM.D.,Thespreadofephemeralfeverofcattleduringthe1967-68epizooticinAustralia[J].AustralianVeterinaryJournal,1970,46(3):77-82.47.NewtonL.G.,etal.TheoccurrenceandspreadofephemeralfeverofcattleinQueensland[J].AustralianVeterinaryJournal,1970,46(12):561.48.NiwaT.,etal.OccurrenceofbovineephemeralfeverinOkinawaPrefecture,Japan,in2012anddevelopmentofareverse-transcriptionpolymerasechainreactionassaytodetectbovineephemeralfevervirusgene[J].JournalofVeterinaryMedicalScience,2015,77(4):455-460.49.OguzogluT.C.,etal.AReportonBovineEphemeralFeverVirusinTurkey:AntigenicVariationsofDifferentStrainsofEFVinthe1985and2012OutbreaksUsingPartialGlycoproteinGeneSequences[J].Transboundary&EmergingDiseases,2013,62(5):e66.50.PatelP.R.,etal.Epidemiology,clinicalfindingsandtreatmentofephemeralfeverinbuffalo35 中国农业科学院硕士学位论文参考文献(Bubalusbubalis)[A].In:StGeorgeTD.,etal.BovineEphemeralFeverandRelatedRhabdoviruses[C].Canberra:AustralianCentreforInternationalAgriculturalResearch,1993,57-58.51.PrasadB.,etal.Clinicalreportonephemeralfeverincattle[J].IndianVeterinaryJournal,1997,74(8):685-686.52.RabagliatiD.S.,Threedays'feverorsti€sicknessincattle[J].VetRec,,1924,4:503-505.53.SeddonH.R.,Thespreadofephemeralfever(three-daysickness)inaustraliain1936-37[J].AustralianVeterinaryJournal,2010,14(14):90-101.54.ShirakawaH.,etal.AcomparisonoftheepidemiologyofbovineephemeralfeverinSouthKoreaandsouth-westernJapan[J].AustralianVeterinaryJournal,1994,71(2):50-52.55.SnowdonW.A.,Bovineephemeralfever:thereactionofcattletodifferentstrainsofephemeralfevervirusandtheantigeniccomparisonoftwostrainsofvirus[J].AustralianVeterinaryJournal,1970,46(6):258-266.56.SolehaE.,etal.AstudyofbovineephemeralfevergrouprhabdoviralinfectionsinWestJava,Indonesia[A].In:StGeorgeTD.,etal.BovineEphemeralFeverandRelatedRhabdoviruses[C].Canberra:AustralianCentreforInternationalAgriculturalResearch,1993,45-50.57.StG.T.D.,etal.TheisolationofephemeralfeverfrommosquitoesinAustralia[J].AustralianVeterinaryJournal,1976,52(5):242.58.StG.T.D.,etal.Thenaturalhistoryofephemeralfeverofcattle[A].In:StGeorgeTD.,etal.BovineEphemeralFeverandRelatedRhabdoviruses[C].Canberra:AustralianCentreforInternationalAgriculturalResearch,1993,13-19.59.StramY.,etal.Areal-timeRT-quantative(q)PCRforthedetectionofbovineephemeralfevervirus[J].JournalofVirologicalMethods,2005,130(1-2):1-6.60.TianF.G.,etal.AcomparisonofaChineseandanAustralianstrainofbovineephemeralfevervirus[J].Australianveterinaryjournal,1987,64(5):159.61.TingL.J.,etal.Relationshipsofbovineephemeralfeverepizooticstopopulationimmunityandvirusvariation[J].VeterinaryMicrobiology,2014,173(3-4):241-248.62.TonbakS.,etal.Alarge-scaleoutbreakofbovineephemeralfeverinTurkey,2012[J].JournalofVeterinaryMedicalScience,2013,75(11):1511-1514.63.TrinidadL.,etal.EvolutionofbovineephemeralfevervirusintheAustralianepisystem[J].JournalofVirology,2014,88(3):1525.64.TziporiS.,etal.Studiesonvaccinesagainstbovineephemeralfever[J].AustralianVeterinaryJournal,1973,49(4):183-187.65.UrenM.F.,etal.EpidemiologyofbovineephemeralfeverinAustralia1981-1985[J].AustralianJournalofBiologicalSciences,1987,40(2):125.66.UrenM.F.,etal.Theeffectofanti-inflammatoryagentsontheclinicalexpressionofbovineephemeralfever[J].1989,19(2):99-111.67.UrenM.F.,etal.Studiesonthepathogenesisofbovineephemeralfeverinexperimentalcattle.III.36 中国农业科学院硕士学位论文参考文献Virologicalandbiochemicaldata[J].VeterinaryMicrobiology,1992,30(4):297-307.68.UrenM.F.,etal.EffectivevaccinationofcattleusingthevirionGproteinofbovineephemeralfevervirusasanantigen[J].Vaccine,1994,12(9):845-850.69.VanselowB.A.,etal.AbovineephemeralfevervaccineincorporatingadjuvantQuilA:acomparativestudyusingadjuvantsQuilA,aluminiumhydroxidegelanddextransulphate[J].TheVeterinaryrecord,1985,117(2):37-43.70.VanselowB.A.,etal.Fieldtrialsofephemeralfevervaccines[J].VeterinaryMicrobiology,1995,46(1-3):117-130.71.WalkerP.J.,BovineephemeralfeverinAustraliaandtheworld[J].CurrentTopicsinMicrobiology&Immunology,2005,292(292):57.72.WalkerP.J.,etal.Proteinsofbovineephemeralfevervirus[J].JournalofGeneralVirology,1991,72(Pt1)(1):67-74.73.WalkerP.J.,etal.Thegenomeofbovineephemeralfeverrhabdoviruscontainstworelatedglycoproteingenes[J].Virology,1992,191(1):49-61.74.WalkerP.J.,etal.Epidemiologyandcontrolofbovineephemeralfever[J].VeterinaryResearch,2015,46(1):124.75.WallaceD.B.,etal.ImmuneresponsestorecombinantsoftheSouthAfricanvaccinestrainoflumpyskindiseasevirusgeneratedbyusingthymidinekinasegeneinsertion[J].Vaccine,200523(23):3061-3067.76.WongwatcharadumrongR.,etal.PreliminaryreportofneutralizingantibodyexaminationinbovineephemeralfeverintheSouthernpartofThailand[J].FoodChemistry,1984,30(3):191-203.77.YeruhamI.,etal.EpidemiologicalinvestigationsofoutbreaksofbovineephemeralfeverinIsrael[J].VeterinaryRecord,2002,151(4):117-121.78.YeruhamI.,etal.EpidemiologicalinvestigationofbovineephemeralFeveroutbreaksinIsrael[J].VeterinaryMedicineInternational,2010(3):1-5.79.YoungP.L.,etal.Theroleofneutrophilsinbovineephemeralfevervirusinfectionofcattle[J].JournalofInfectiousDiseases,1980,142(1):50-55.80.ZaherK.,etal.Investigationsonbovineephemeralfevervirusinegyptiancowsandbuffaloeswithemphasisonisolationandidentificationofafieldstrain[J].GlobalVeterinaria,2011,6(5):447-452.81.ZhengF.,etal.IsolationandcharacteriztionofafieldstrainofbovineephemeralfevervirusinChina[J].JAniVetAdv,2009,8:1478-1483.82.ZhengF.,etal.PhylogeneticrelationshipsoftheglycoproteingeneofbovineephemeralfevervirusisolatedfrommainlandChina,Taiwan,Japan,Turkey,IsraelandAustralia[J].VirologyJournal,2012,9(1):1-8.37 中国农业科学院硕士学位论文附录附录附录1推导的JT02L毒株G蛋白氨基酸序列38 中国农业科学院硕士学位论文附录附录2测定获得的JT02L基因组JT02LACGAGAAAAAACAAAAAAACTAATTGATATTTATACCCAATTAGTGTTTCAACAGGTCTCTTTCCTTTACCATGTATTGCACATTGAATA90JT02LAGAAAGAGATCAAGGCTGTTAAGCCAACTGATGCTATTCCTCCCCAATATCCTAAAGAGTTTTTTATAAATGGAAATGGTAAAAAGCCAA180JT02LCATTGAGAGTGCCACAAGGTAAATTAGACTTACCAACAGTAAGAGAATTAGTCTTTGGAGGTTTAGAAAGAGGTGAATTGGTCTTATCTC270JT02LATGTCATCCGATATTTATATCTAGTTGGAGAAAAAATCACTGAAAAATTGGAAGGAGACTGGATTTCTTTTGGTGTTAATATTGGAAGAC360JT02LGGAATCAGGAAATTAATGTTTGGAACTTTTATGAGGTAATCATAGAGGATGATCAGACAATAGATGGAAGAAGGGCAAATAATGTAGATG450JT02LAAAATGATGATGTATGGTTAACTCTAGCATTGCTTGCTTATTATAGATTAGGTCGATCTGCAAATCAAAATCATAGGAATAACTTGCTGA540JT02LTCAAATTGAATGCTCAGATCAAAGGATATAGAAAAGATGCACCCAATATTATTGATGATGTTGCTGTTCATGGAAGTTGGGTGACAAATA630JT02LGTGAATTTTGCAAAATTGCAGCAGGCTTTGATATGTTCATGAACAGATTCAAGAACAATAAATATGCTCATGTAAGATTTGGCACAGTCG720JT02LCTTCTAGATACAAGGATGCCGCAGGACTTATGGCATTAGGTCATGCTTGTGATGTGACCGGTTTGACCATTGAGGAGATTCTTGATTGGA810JT02LTTTTTGTATCTAATGTAGGAGAAGATGTAGTCAAAATTATGGAAGAGGGAAATGAAATAGATGAACCTTACTCTTACATGCCATATATGA900JT02LTGGATATGGGCATATCAAACAAGTCACCTTATTCATCAATCTCCTGTCCTCATATATATACCTTCTTACATCTGGTAGGAACTCTCCTGA990JT02LCTTCAGAAAGATCTAAGCATGCTCGTATGGTTAGTGAGCGCAATTTACAAAATATCAAAATGAATGCTTTTGTTGTCTCTTATGTAAAGT1080JT02LCCAATAAAGCTGCATTAACTAAAGCATTTTTGAAGTCTGAAGATAGGGATTATGAGAAAAGACAAGAAGAAGGAAGTGATGATGATGAGG1170JT02LATGAGGATGAATCAGAAAATGATGATGATTTTGGAGCAATGCCCAAATCCTCTGATCCAATGGAATGGTTCATTTTCCTAGAATCAAATC1260JT02LATTTCATTTTGCCTGAAAAAGTCACTGAGTTTTGCATCAGGGAGTGCAAGAAAATTCAAAATGCACGTCCTAATACAATTGGTAAATACT1350JT02LTAGCTTCAATTGTTTAGCATGAAAAAAACCTTTAAATCCACCATAATAAAATGCAACAGGCATCATGAGCCACTTGAAGCCCAAGATAAT1440JT02LGACCGGTGCATATGATGCTGAAAAACTGAGGAAAAATTTGCAAGAGCAAATTGCCTTGGAAGAAGATGAATTGGAAAATCAAACTGACTT1530JT02LTGAGAACAACAAAGAGGAATCAAATATTAGCAATAATCCTCTGATAATTAAACAAGAACCTGGCATTTACCCCATCGAAATCAATTTAGA1620JT02LGGATTTAGAAAAGGCCAATGGAATAGAAGAGGATTGGGAAAACAGTTTACTGAAAATTATTGAATCATCTGATGTCACCCCAAAATTATC1710JT02LATGGGATGATGAATTTGAGAATGATACATATAAAGGGTGTAATGTATTTACCAAGGATCTCTGCAATGACTCTGGCAATCAAGAGAAGAA1800JT02LTAATGTTCAGATTAAACAGAGCAGTCTTGCAGATGTAGCACAAGTACTGTCTCTATTTCATATAAGATCAGATGTTGATTATAAAACTGA1890JT02LAAAAGACAATAAGGGTCTAGTTAGAATTATCAAATTGAGTAAAAAAGATAAAAGTATTGAATCAAACAAGAGAGATATTGTTGATCAAGA1980JT02LGTCAGACAAGCATACGGAGTGCAATTCTAATTTCGATGCTGTGATGGACCAATTTCAAAAAGGAATCAGAGTGAAAAAGAGATTCGGTAA2070JT02LAGGTTATGTAAAAATAAATGCTGATAATATGCCAGGAACATATCATGACTTGTACAACGTGATATCAGCTGTTAAGGGTGAAAAAACTGT2160JT02LTGAAGAAATGATAAGATATCTATTCAAAAAATCAAAAAGTTTCAAGAGCATAAGTAAAACTCTTAACATTGATGAAATGATACTTTGTTA2250JT02LACATGAAAAAAACTAGATCAAGAATTTGTAAAACAAATAATCAATCTATTACATTTAACAGGCCTCAAAATGCTCACCCTTTTTAAGAAA2340JT02LGGGAAGTCCAAAGGAGGCTCAGTGGATGATAGGAACTCATCCTATGGAGAATCAGATCCTATGTTAGTATGGGGTACAGCTCCTCCAGAT2430JT02LTATTTGGATGTATATCATGACGAGAGAGACAAGAATGAATTGCAGTTTAACACAAAATCTTATCTAATACAGGCAAATTTAGAAGTCATT2520JT02LTCTTCAAAACCAATAGAAAGAACAACAGATATGTTGAAAGTATTGGATGTAATGGTTGATGAGTATGATGGGAGTTATCTATCCAAGGCC2610JT02LTTAATAATCACTAGTTACTTAACAATTGGAACTCATTTGAGAAGGATGATGTCTAGTGTTAAAAATAATCACAAGTACAATAATGGGTTT2700JT02LACCGAGGTAATAGAATTCACTGGAACTGCGGAAATACATCCTAGAGATCAGGAAATAAAATATAATAaATATTTAATGACTAGTCATATG2790JT02LGGAGAACCAGTATCCATATCCTATCAATTCTCATGCAAAAAGAGCAAAAGAAGAGGGAAGAATATACTTGATGCGTATAATCTGGAACTG2880JT02LGGAAACGGATCAAAACCCCCTGATTTGAAGGATTTATTGGAATCTTATGAGATTAATTTATGCTACAATTTGAGGGGAGAGCATGGTTTC2970JT02LACCAATTTAAGTAGGTCATGAAAAAAATCATATTAGATTAAGTAAGAGTGAAGGAAATTGAACAAATTTAGGTCAACAGGACCTCACAAT306039 中国农业科学院硕士学位论文附录JT02LGTTCAAGGTCCTCATAATTACCTTATTAGTCAATGGAATTAATTTTGAAAAAATTTACAATGTTCCAGTGAATTGTGGAGAACTTCATCC3150JT02LTGTAAAAGCCCATGAAATCAAATGTCCGCAACGTTTGAATGAATTGTCACTTCAGGCCCATCATAATCTCGCAAAAGATGAACATTACAA3240JT02LTAAGATCTGTAGACCACAGCTAAAAGATGATGATCATCTAGAAGGATTCATTTGTAGGAAGCAAAAGTGGATAACTAAATGTAGTGAAAC3330JT02LCTGGTATTTTTCTACTTCCATAGAATATCAGATATTAGAGGTAATCCCAGAATACTCTGGTTGCACAGATGCGGTTAAGAAGCTAGATCA3420JT02LAGGTGCATTAATTCCTCCTTATTACCCTCCTGCTGGATGCTTTTGGAATACGGAGATGAATCAAGAAATAGAATTCTATGTCCTAATACA3510JT02LACACAAGCCTTTTTTGAATCCTTATGATAACTTGATTTATGATTCTCGTTTTTTAACTCCTTGTACTATTAATGACAGTAAGACAAAGGG3600JT02LATGTCCTCTAAAAGATATAACCGGGACATGGATACCAGATGTGAGAGTCAAAGAAATAAGTGAACACTGTAATAGCAAACATTGGGAATG3690JT02LCATTACAGTTAAATCCTTTAGGAGTGAATTAAATGAGACAGAGAGATTATGGGAGGCTCCAGATATCGGGTTAGTCCATGTAAATAAGGG3780JT02LATGTCTATCTACGTTTTGTGGAAGAAATGGCATCATTTTTGAGGATGGAGAATGGTGGAGTATAGAAAACCAAACTGAATCTGATTTCCA3870JT02LAAATTTTAAAATTGAAAAATGTAAGGGTAAAAAGCCAGGTTTTAGAATGCACACAGATAGAACAGAATTTGAAGAATTAGATATTAAGGC3960JT02LAGAATTAGAACATGAACGATGTTTAAACACCATTAGCAAGATACTTAATAAAGAAAATATAAATACTTTGGATATGTCTTACTTGGCTCC4050JT02LCACAAGACCAGGAAGAGATTATGCATATTTATTTGAGCAAACAAGTTGGCAAGAAAAACTTTGTCTGTCCTTACCAGATTCAGGTAGAGT4140JT02LTTCAAAGGATTGCAGTATAGATTGGAGAACATCAACAAGAGGGGGAATGGTTAAAAAGAATCATTATGGGATCGGATCTTATAAAAGAGC4230JT02LTTGGTGTGAATACAGACCTTTCATTGATAAGAATGAAGATGGCTATATTGATATACAAGAATTGAATGGACATAATATGTCTAGAAATCA4320JT02LTGCTATATTAGAAACAGCACCAGCAGGAGGAAGCTCCGGAACGAAGCTTAATGTAACCCTAAATGGAATGATCTTTGTGGAACCAACTAA4410JT02LATTATACTTGCATACAAAATCCATATACGAGGGAATAGAGGAATATCAAAAATTGATAAAATTTGAGGTAATGGAGTATGATAACATAGA4500JT02LGGAAAACTTGATTAAGTATGAGGAAGATGAGAAATTTAAGCCAGTGAATTTAAGCCCACATGAGAAAAGTCAAATTAATCGAACTGATAT4590JT02LAGTGAGAGAAATTCAAAGAGGAGGAAAGAAGGTTTTATCTGCTGTTGTAGGTTGGTTTACAAGCACAGCAAAAGCAGTAAGATGGACAAT4680JT02LTTGGGCTGTAGGTGCAATAGTCACAACGTATGCAATTTACAAATTGTACAAAATGGTCAAATTTAACTCATCTCACAACAAGCATAATGA4770JT02LAACTGATCTGGAAGGACTTCAATCTATAACAAAAGAAAATATGAAGATGGAAAAGAATGACAAGAATTATCAAGATTTGGAATTAGGGTT4860JT02LATATGAAGAAATTAGAAGCATCAAGAGTGGGAGTAAACCAATCGGTGATGATAGATTCTTTGATCATTAACATGAAAAAAACCAATTTAC4950JT02LATCATGTGTCTACAAAGTAAAATTAAAACAAAATTAAAAGGCAACAGGGCAATCATGTTCCTGCAACTTTTTAACCTCATATTAGTATAC5040JT02LTGTGTAAAAACCTCTAAATCAACCTGGATCAACTATCCTGAGAATTGTACATCTATCAGCTTGCAAGATGGACTGAAGGAATTATGTGGA5130JT02LGGTGATCAGTTGATGAATATTAGAAATCGGCTTTTGGATGATACATATAAAGAAATAGGAGAAATATGCACCCCAAATTATAGTATGGAG5220JT02LAAAAAATCAGAAGGGTACCGTTGTGCATCAATAAAGAAAAAAGTAATTTGTAAAATGCTAGAAAACTTTGATCATGAGGTGACATATATA5310JT02LAGTGAATCACACCCGATAGACAAAGCCAAATGCCATGAGTTAATAATTAGTAAGGATTTACTTAACAACATTGAAGAGCCTTATTATCCT5400JT02LCCTCCAAAGTGCGATTCTTCTAAATCTTCTGTTAGTGAACTTGAATTCATCAAATTGATAAATTATGATGTTGTCTTAGATCCGGTAGGA5490JT02LTTTCAGAATGAGGATAATTACTTATTTAAATTCGATAAAACTAATGCTATACCTATTGATTATATATACCAATCTGAATTTTGTCAATCC5580JT02LAAGAATTGGATATGCCACGGGGATAAATCATACATACCATTAGAAATATTTAAGGGTGATAATCAGGCTAGTATTAGACTAGAGTTGATT5670JT02LAAGCTTAGCATTATATATGATAGTAATTTTGGAGAGCTACCAATTAAAGATGCCTGTAGGTTACACTACTGTGGGAGGCCAGCAATTAAA5760JT02LTTATTCAATGGTGCCATCATAAAGATCAAGGAGTCACCTATAATCCTGGGACTCCCATCTTGCAATAGGAGTAGAATAGAAATGCCAGAG5850JT02LACAAATTTAGCTAAGAAAAGATATTCAAATGTAGGCCCTGTTTTATTAACTACATTGAATAAGAGATTTGAACTTTGCAAGAAGATTAAA5940JT02LAAGAATTTGGAATCAAAACAATCAATACCAATTAACAATCTTCATTATCTAGCTCCATTTGAGCCAGGCAAACATCCTGCTTTAGTGTAT6030JT02LCGATTGGTTAGTACCACAATCAGTCAATCACTGAGAAGTAAGGTTGTACCTGTTAGTATGCTGTCCATGAGTATGTGCGAATACATAACA6120JT02LGGTCAGATTATTGAAGATGGAATTAAAAAGAATTTAACTGATGAAGATACTGTCATTATATTAGCTAATAACAAAGAGATCAAGTGGAAG621040 中国农业科学院硕士学位论文附录JT02LGATTTTAAAGGCAGAGAGAATTGGTATAAAGAACAAGCCAATCCGAATATAATAGATAAAAACCCGGATGAATTATCTCATTACTGGTAT6300JT02LAATGGAGTTATGAGGAGAGAAGATAAGTTAACCTATCCATCTAGCTATATCCTCCAAACATTAAAGAAAATATATACTGACACTGAAAGG6390JT02LGAATCCAGAATATCGTTTTTTAAATTTAGATTAGAAAGAAACATAACTAAAACAGAAATAATTAAGTTTAAGGACACAGAAGAGTCATTA6480JT02LAATCAAACTCACTCAAGTTCAGTCAACGATACACTAGATGGTGATGACTACTTGAATTGGGTTGAAGAAAACACAGGTGATAAAAATAAG6570JT02LACAGAGGGCTCTATAGGAGATGAGAAACAAACCATACAGAATAAGGAATATTGGAATGAGGAATCATCAATCTGGGGAATTTCAACCATA6660JT02LATTACAGTTCTTGGAATTTATTACATATATAGGAAAAATAGAAGGGAAAAGATCTTTTTGAATATGAAACACAGAGTACAAAGATTCTTT6750JT02LAAGTTAGATTATTAAGCATGAAAAAAATAATAATAATAGTCTGCATTGATCAAGTCCAACTGGCAACAGGCAATGGAGAAAGGCCTGCTG6840JT02LTCTAATTTTTGGAATGATTTCAAGCAGTGGTCTGAAGATAGGAAAGTTGAGATAGTAAATTGGTGGTCAAATCTAGAAAGTAAAGTAAGA6930JT02LCTAGGATTTTGGATTATATTGATTATATTGCTGGGAATTCTTGCAATTAGGATAGCTATCAAAGTGTATCAATGTGTTAAGTTGACAACT7020JT02LAAAGGTGTGAAGAAAATCAAGCGAGTCATTAAAAAGAAAAGATCAATCAAAAAATACAGGAAAACATAAAATGTTTGGTTACATGGAAAT7110JT02LCTGTGTAAGAGTTGAAATTGGTAAACAAAACAATAGGATACATAAATTAGAATTATGGAAATTGATGGAGGAAGGCTTGCATGCCCTGAT7200JT02LGAAGAAGGAAAAATTGGACATAATGCTAAAGGAAGAAGCAAACTTCGGCTTTTGTCGATGGCTCAACACCAGAGGGAATTGGTTATGTTT7290JT02LGGAAGATGTAAGGAAACCGATATTAATCGAGTTCCAGAATCTTTTTAATTGCATGAGTTACCCTTCAAGAGTCTACAAGATAACTGTGCA7380JT02LAAATAATGACTACAAACTAGGTTCAATTAAAGATCTCCAAATTAAATTGTTCTTCTTTTGACTTGAAAAAAACTAAGACATGTAAATCAG7470JT02LTTTAAAATCTGTAAAAGCAGCAACAGGCATCATGGACTTTATCCGGTGTCATGTTGCCATGCAGATAATCAATTTTAGAGCATTAGAGAT7560JT02LAGACAAAAGATCATTATTGGGAATCCTAGTCATCAAGAATATTAAAAATTTACATCGGTCAAATCAATTGTTAACTCGGTTATCTGATCT7650JT02LTATGATACCTAGTGTAATTCATAATGGAGAGTTTGTAATGAGAAACGATAAGAATAATAAATTATGGATTTTTGTAGGAGAAAGTTGGGC7740JT02LAAGTTTAGACTTAGAAGATTTGAATGGTGTGAGGGATAATGTATTCAACCTTAGCAAAACTGTTCCTTTACTCATTCAAGGAGAGGAATA7830JT02LTGGTGTAATTGACATCAGCATTAAGGTAGAACCTAGGGGATTGAGATTTTTGAAAAGATCAAGTGAAATAGATATATGTGATATTCCTAG7920JT02LGAAAGTCAGAGTTGTGCCTACATGAAAAAAACTAGATAAATTCTCAAGATCATTTAAAATTAAATTTTAAACTTAAATTTAAATTTAAAA8010JT02LTTAAAAATTAACAGGCATCATGGATCTCAAGTTCAGATGCCTGATTAAGAATGTTGCTGATGGTAGAGCAGGGGAAATAATAGTTGAGGA8100JT02LATGCTTGGAGATTATAGAACAAAAATATTTAAGACTTATGGCCATTGATTTAAAGGAGATTAGATCTAGCATGTTTGATCAAGAGAGTAA8190JT02LTCCATGGGTATATGTGTTTGGCAAAATTCATGTTTCTGGTTTGATGGGCAGAGCCATAGGAAATCGTATGGTTAAGAGAGGAACATATAG8280JT02LAATCAAGGAAGGAGAACTAATCAATCATTTTGAGGGTGTGCATATCCATTTTTATAAGGATATAGAAAAAATCTTCCACTCTATCAGAGT8370JT02LTTAAATGAATTTGAATTAATAATGAAATAACAGGAATCCATGAAAAAAATGGATCCTGTAGATTTTTTAGATTCAGAAGATACCGGCCAA8460JT02LAATAGTTGGAATGAGGAGGAATGTGGTGATGAGTTTTTTGAATATATTTGGGATCAAGATGAAGAGGAGTCCATGGACTTGATAAACAAT8550JT02LAAAGATTACAATCTTAATTCCCCTCTTATTATAGACCCTTTAGTAGAGTTGAAAAATTGGATTAATAATGAGAGAGGATATAGTGAATCA8640JT02LGATCTTGGAAGTCAACAAACTTTTGAGTTGAGGGAATTTGATATAATCAAAAGAGTGTTAAAGAATTTTATAAACAATATTAATTTGAGG8730JT02LAGACCGGAAGATTCTCATCATATATTTGCAAAATTCTTAAATCAAGTTATTGTGACAAATGATTATTGGAATCTAGGAGAGACGTTGAGC8820JT02LAAAATAGTAGAAGATATAAGAGAGGTTGGAGCAAGTTTTTATAGAGGATTAGATTTAGATGAAGAGATAATTATAGACAACATCAGAAGA8910JT02LAATTGGAATGACGTGCCCCAATTAGGTAAGAGTTGGTTTTTGAAGTTTTTTGAACTGCATAGAGTTATTTGTGTCATGAATGCAAGATCT9000JT02LAACATTGAGTTAAAAAACCTCCAATCAAAAAATAAGTTAAAGAAAATTAAGTTGCCTAAAGATTTAGAAGAGAGGGGTCACAAATGTTGG9090JT02LATTCTAGATTTGGACATAAGTGGACGGTGGATAATTTTTGATAATTATGCTTATTGGGAACTCCAAAGGATTATACTAAATAGAGAATTT9180JT02LATTCTGATGATGAAAGATGTATTAATTAGCAGGTTTCAAACCATTCTAAGTATGAACGTTTGTACTGATGAATATAAATACACAGAAGAA9270JT02LGACATTGAGACCATGATGAGCTTGTACCGTGAAGGTGATTTAATCTTGGAAGAACATGGTAATAAGAGTTATAAAGGTCTTAAATTATTG936041 中国农业科学院硕士学位论文附录JT02LGAGAGCATTTGTAACTTAAGATTAATTAAGATTGTACGAAAAAGTAGACCCAAGATACCAGAGTTCCCAAATTTTGAAAATCATATTTAT9450JT02LTCAAGTTTGAATGATTTAAGGGTTGAAAGAGGAATTGACTTAAGTAAATTTTCTAACATTATCCTGAGAGAAGAAAGCATTGATATGGTG9540JT02LTTAGCATTTTATAGCTCATTTAGACATTTTGGACATCCCTGGATTGATTATTTAACTGGATTAGATAAATTAGAGTCCCAAGTAAATAAA9630JT02LGGCTGTCACGTTGATGTTCAATACGCTAATTTATTGGCCAGTGATTTAGCTTTCAAAATATTACGAAAAAATTTCTTGGAAAAGAAGTGT9720JT02LTGGTCTGTAGACAAAACTAAGATGGATAAAAAGCATAAGTTATATCATCACATCAGTCATAACACTTGGCCCACCCAACAGATTGTAGAT9810JT02LGAGTTTGGAGATCATTGGCATGAATTGCCCATCATTCAATGTTATGAAATACCAGATATGATTGATATAAGTCAGATCTATTCTGACAAG9900JT02LAGTCACTCATTGGATAGATCAGAGGTCCTTAAAATAATTAAAGAGCAAAAACATAAAAGAATACCTACCAAAAGAGTACTGCAAACTTTG9990JT02LCTTGAAAAACCAGCAACAAATTGGCCAGAATTTCTTAAGGCAGTGAATGATTATGGTTTAGATTGGGAAAAGCTGGTAATTGGACTTAAA10080JT02LGCCAAGGAAAGAGAGCTCAAGGAAGAAGGGAGATTCTTCTCATTAATGTCTTATGAGTTGAGGGATTACTTTGTTTCAACAGAGTACTTA10170JT02LATAAAGAAATACTTTGTACCGTTATTTGAGGGGTTAACAATGGCCGATGACTTAAATACTGTGATTAAAAAGATGTTAGATGTCTCTAGC10260JT02LAGTCAGGGAACAAGGGAATATGAATATATCACAATTGCCAACAATATTGATTATGAGAAATGGAATAACTATCAAAGAATTGAATCAAAT10350JT02LGGTCCGGTATTCACTGTGATGGGGCAATTTTTGGGCTTGCCTAATTTGTTTACCAGAACCCATGAGTTTTTCCAAAAGAGTTTAATTTAT10440JT02LTATAATCAAAGACCAGATCTAATGATGGTAAGAGGACGGGAATGTCTAAACAGATTAGGAGTTAAAGTGTGTTGGGAAGGACAAAAGGGA10530JT02LGGATTAGAAGGTCTAAGACAGAAGGGATGGAGCATATTAAACTATTTAATGATAGAGAGAGAAAGTAGAGTAAGAAATACAAGGGTGAAA10620JT02LATACTTGCTCAAGGGGACAATCAGACAATAAGCATGTGTTATAAAACAGAGAGCTGGCAAAATGAGGAAGAGTTAGATAATCATATCAAA10710JT02LAACATGGTCTCCAATAACAATCAAATAATGCAAGCGATTATAAGTGGGACTGAGAAGCTTGTATTGAGAATCAATTTAGATGAGACCATG10800JT02LACAAGTGCCGATTATATAAACTATGGGAAAGTTCCTATAATTGAAGGAACAATAAAGGGACTGCCAACAAAAAGATGGTCTCGAGTTAAT10890JT02LTTTACATCCAATGATCAACTCCCTAGCACTTCAACCGTCATTAATTCTAGTTCTACAAATGCTTTAACAGTTGGACATTTTAGCGAAAGA10980JT02LCCCCATGATGCAATTAATGGACACTTACTGTTTGGATCTTTGGGTTTATTGCTGTTGGATTACCATAATCCAGCAATCAGAGGAGAAATC11070JT02LAGTGAGTTTATACCAGAAGCAAATATAAATAATAAATTATACAACATCTTATTATTGTATTTGGATCCAAGCCTTGGAGGAATAGCTGGA11160JT02LACTAGTTTAACTAGATTCTTTATTCGAGGTTTTCCTGATGGAGTAACGGAATCTTTGACATTCTGGAAAATTGTCGGAGAATCAACTAAC11250JT02LGATCAAGATATAAAAAGACTTGCATCTACTGTTGGTTCACCAGAGTTGAGTCCATTCAAGCCTGAGGATCTAGATAAACTAATAGAAAAA11340JT02LCCAGAGTCTTTAAACATTAGACATGGACTTAGCTCAAGTAACATGATTAAAGGGGAAGTAAAAAAGAATATAATTGAAAATTGCTCAAAA11430JT02LATTCAAAACGAAATTATAAGAGATGCAGCAAGAAATCTAGTTAGTGAAGAAAATCAATTATTCCTGTGGTTGAGAACAATAAATCCCTTG11520JT02LTTTCCTAGATTTTTGAGTCAATTTGCAGAATCTACTTATTATGGTGTGACAAAAAGTTTAATTAACTTGTTTACTAATTCGAAAACGATC11610JT02LAGAGGTATTTATAAAAAGAAATATAGAAAGGAATTAGATCAGCTTATGATTAAAGGTGAGGTACGGAGCATATTAGGGCTGATTAAGATT11700JT02LGTCAACAGAAGCAAGCAATCTGTAATGCCTATTTGGGAATGCTCAGCATCTTTGGCTGATTCATTGAGGAAACGATCATGGGGAAAAGAA11790JT02LGTGTTAGGTACAACAGTGCCACATCCTGCAGAAATGTTTAAGGGATACAGAGGGGGAGAGGACTCCTGCAGCTTTTGCAGGGGAAACGGA11880JT02LTATAATAATAATTATCTAACAGTTCTGATGCCCAGAGGAATTCCCATGAAATGTCATTATAGGGGTCCTTATTATCCTTATTTAGGATCA11970JT02LAATACAAAAGAGAGTACATCTATTTTACAACCATGGGAAAAAGAAACCAAAGTGCCAGTTCTTAGAAGAGCATGTGATTTGAGGAAAAGT12060JT02LATTAATTGGTTTGTAAATCCAGATAGTCTATTGGCTAAATCGATTTTCAATAACCTCAAAGCATTGACAGGAGAAGATTGGGAAGATCAG12150JT02LATCAAAGGGTATAAGAGAACTGGGTCTTCCCTTCATCGATTCGGATGTAGTAGAGTGAGTTCAGGTGGATTCTCTGCAAATTCACCTAGC12240JT02LTGTTTCACTTGGTGTATTGCGACAACAGATACAATGTGTGGGTTAGGGGAGGTTAATTATGATTTCATGTTTCAATCAACATTGGTTTGG12330JT02LTGTCAGATGTCCTCTATAATTAGAGAGAGGGGAAATTTACACTCCAAAGTACATCATTATCATATTAAATGCAACAAGTGTTTGCGTGAA12420JT02LATACAAGAACCTGTATTGGAATCAGGATGGGAATATCAACCAAGAAATGTGTCTCAGATCCTAGAAAAATGGAGACCAAAAAATATGAAA1251042 中国农业科学院硕士学位论文附录JT02LACATGGGGAGAAGAGAAAATACACATGGACATTAAAGACAATGACGAGGAATGGGACAATTTAACTGTAGAAGACAAGTCTTATGAAATT12600JT02LGGTAAAACTATCGGATGGTTGGTAGGTGATTCACTGTTAAGTCACAAAAGAAATTATGAATTTAAAAGTTTATTCCCTGTTTCGATTCGG12690JT02LTCTAAATTAGAAGGTTTTCCGTTCTTGGAGGGGATACTGGATGGTTTTAAAATATGTGGATCGTTAAATTTGACTCATCGCAGGAATTAC12780JT02LATGATTTTAAAGAAACCGAAGCTAGCACTTCAAGGAACTGTATTCTTTTTAATTGATAGATCATCATTTATATCAGAGTTCACTAATTTC12870JT02LATAAGTCACCCCAAAATTTATAAGGCAATTAAAAGTTTGCCCCATAAAATACCTACAAGTTATCCTATGAACTTAAGTGATCTGGGAAGC12960JT02LATCCTTAGATCATTTTTAAAACAATTATATTACCGAAGAAAAGAACTAATCATTAAAAGGAGTTCTTGGGTTTTCTCAGACATGAGGACA13050JT02LAATGAAGTTATCTGTAGTTTCGGACTGAGTCATTTGACATACAAAATATTAATTCAGGAAGGGCTAAACAAGGATATGAAATTAAGATTA13140JT02LCAACAATGCCAAGATTTGTATATCAATATTATGACAGAATCAAAGGAGGAACTGGATAAGAGTAGTGCTAAACGAGAAATAGTTGAATGT13230JT02LTTAAAGGACCTAAAATTTGTTAGTTCCGAAATACGGCATGCTGTTAAATTCAGGTATCTAACAGGAGGGAAAGATGAAGTAAAGCTGATA13320JT02LAAAGAAATGGATGAAAGACGAACATGGGGGAGTGAATACACAGGAAAAGCAAATCTATTAGATGTTTGGTATTTGACTTCACAAAGCATA13410JT02LGAAAATAAGAATCTGGTCAAAGGAATCAAAATTCCTTATCATTCAAATCCCACAGTATCTGGATTAAGAATTAATCAAATTGCTACAGGA13500JT02LGCTCACTATAAACTGCGAACATTAATCAACGTGACTGGAATCACTTATCGGGACTTTATATGTGGAGGAGACGGATCTGGTGGAATGACA13590JT02LTCATGTTTGTTGAGACTAAAACCATTGAGTAGAGGTGTATTCAACAGTTTACTGATTTTAGATGACAAACCACTCCATGGAACAAGACCC13680JT02LAGTCCTCCAACTGCGATAATGGAACTAGGAGAAGATTCACTTAGATGTGTTAACTGCTATGATGTGTGGAAAGAACCGAGTGATTTGTCA13770JT02LAAACAGGAAACATGGAAATATTTTGTCAAATTGAGGAAACAGAATTCTATGATGATTGACCTGATTGTCTTGGATATGGAAATCATAAAT13860JT02LGATGAAGTTATTGAGGGTATCTATCAAAACACAAAGAATCATTTGATATACTTACTGGAGGAAGGAGGTTGTTTAATAATCAAAACCTAT13950JT02LTTAACATACTTGTTAAAGGAAAATACAAATATATTAGACATGCTAGGACATTTGTTCACTTCTGTTCGACTAATCAACACCAATTTATCT14040JT02LAGTACGAAAACAAGTGAAATATATGTGCTATTTAAAAATTATAGAAACAAGTTAACTCCATGTTTACAGTTTGATAGGAATATTATTTTA14130JT02LGATAATTGGAATTTCTTTTACATTAATAAATCAATCAGAGAAGAATTTGAAAGAGCTCGAGAGTTATTAAGTGAAGACTTGGGGATGGGA14220JT02LATGCCTAAAGAATTACAACCAAATCCGCTGATAGAATTAAGTCAAATGTTGCAAAATTCTGGAGTAGATGGGGTAGCAATGTCAGCAATA14310JT02LTCTCAAGAAGAAAACTTATCCTTCTTTTCTACAAAAGAGTTGGCTGTCATTTGTTTGATTATCATATCAGAGAGTCATCTAGTAACAACA14400JT02LAAGAAACATAAAAATGACTGCAATTGTTTACAAGAAAAACCATATTCGGATCAGGAAATTAAATTGTGGATGAGTGGTATTATAGGTATC14490JT02LGGATTATATTTATCTTTGTTGGACAATAAAATGAATTCATTTGAGGTTTTAGATGATCTCATCAACTCAGACTTGAAAAGTGTTCATGTT14580JT02LAATTTCAACAAGGAAAGAGAACTATGCTGGAGTCTCAATTACTCATCAAATGAGAAAAAAGGGAAGGACTTATGGAAAAAGAGATTTTCA14670JT02LGTTAAAGATAAAATGGCCTTCATGGGGAACTGGATTCGCTTGTTACACAGACAAAAGGTAAAAAACCAAAAATGTGAATATAAGGAAGGT14760JT02LAGAATAAACAACTTCTTAAAATTCATCAACAAAGGTTTGAATTTACAAAAAGTCAAATCTCAGTACGAAGAAGAAATTGCAAAATTACTA14850JT02LTAAATTGCATGAAAAAAAAGAAAAAGAAAAGGAACCAAAAGACACAATTCGATAAAAAATAAGGAATTGTATTTTATTTGTTTTTCTTCG14940JT02LT1494143 中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢研究生的学习时光如白驹过隙，转眼间就到离别。三年的学习中有失败的沮丧也有成果的喜悦，有离家的思念也有新朋的陪伴，有迷茫也有老师指导后的成长。三年收获的不仅是知识的积累，还有个人整体的成长。此时最想说的是感谢。在此感谢兰州兽医研究所外寄生虫与虫媒疫病创新团队为我提供良好的学习环境和实验平台，得以让我的实验顺利进行。特别的感谢我的导师殷宏研究员。殷老师正直的为人、优良的作风、渊博的知识以及严谨的科学态度、一丝不苟的工作作风、高效的执行能力深深地感染着我，为我树立了一个德才兼备知行合一的学习榜样。殷老师在忙碌的工作中不忘督促我的学习与实验，给予了我许多宝贵的意见，在他的悉心指导下完成我硕士期间的论文研究。殷老师一直以来的言传身教让我受益匪浅。在此论文完稿之际，特向我的恩师致以崇高的敬意和衷心的感谢！非常感谢高闪电老师。一直以来高老师以其认真的工作态度，高效的工作效率，乐于助人的精神影响着我。在学习中高老师给了我很多宝贵的意见并对我无私的帮助使我得以顺利完成我的论文研究，在此感谢高老师一直以来如师如兄般的帮助和照顾。特别感谢独军政、田占成老师在我的科研和生活中给予的无私帮助和指导，在此表示由衷的感谢！特别感谢罗建勋研究员、刘光远研究员、关贵全研究员、李有全研究员、刘志杰副研究员、张林副研究员、郑福英副研究员，感谢他们在我实验过程中提出的宝贵意见和帮助，在此特向几位老师表达我的敬意和感谢！感谢谢俊仁师兄、刘军龙师兄、罗金师兄、杨吉飞师兄、赵帅阳师兄、于培发师兄、陈泽师姐、牛庆丽师姐、刘爱红师姐、任巧云师姐、韩蓉师姐、殷方媛师姐、邢闪闪师姐、陈秋雨师姐、刘娟师姐、秦鸽鸽师姐、郭燕妮师姐等师兄和师姐给予的关心和帮助。感谢本所科研处鲁炳义处长、李潇萍老师、张娟老师、周广清老师以及农科院研究生院王仕龙老师等给予的关心和帮助。感谢我的同窗张国芮、李四通、郝佳伟、王振国、翟斌涛、何欣、潘玉萍、刘小翠、等给予的帮助与支持。感谢康彪、于瑞明、郭鹏飞、吴锋、王震、康棣、杜晓悦、韩元、陈银银等师弟师妹在工作及生活中支持和帮助。感谢我的家人，近20年的求学历程，离不开家人的支持和鼓励，他们无私的付出和鼎力支持是我求学路上最坚强的后盾，衷心祝愿我的家人身体健康、幸福平安！同时感谢我的亲戚朋友给予的大力支持和帮助，也祝愿他们身体健康！感谢曾经支持和帮助过我的人们！本论文受到国家公益性行业（农业）科研专项经费（2013030305）等项目的资助，在此表示感谢！本论文是在中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室完成的。44 中国农业科学院硕士学位论文作者简历作者简历黄德萱，男，汉族，1991年4月出生，福建省三明市人。2009年9月至2013年7月就读于西南大学荣昌校区动物医学系，获农学学士学位。2014年9月考入中国农业科学院研究生院攻读硕士学位，2015年5月至2017年6月在中国农业科学院兰州兽医研究所完成硕士学位论文相关工作。论文发表情况：1.黄德萱，高闪电，康彪，独军政，田占成，殷宏*.牛流行热在天祝白牦牛中流行病学调查[J].中国兽医科学.（已接收）。45
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