《诺如病毒P结构域与EV71中和表位的嵌合蛋白及其特征研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
硕士研究生学位论文囊北京协和医学院研究生院 北京协和医学院硕士研宄生学位论文学校代码：１００２３学号：Ｓ２０１４０１８０１９硕士学位论文诺如病毒Ｐ结构域与ＥＶ７１中和表位的嵌合蛋白及其特征研宄ＣｈｉｍｅｒｉｃｒｏｔｅｉｎｏｆｎｏｒｏｖｉｒｕｓＰｄｏｍａｉｎａｎｄＥＶ７１ｐｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｅｐｉｔｏｐｅｓ，ａｎｄｉｔｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ所院：医学生物学研究所姓名：李超指导教师：刘红旗导师小组：刘建生、陶玉芬学科专业：免疫学研宄方向：基因工程疫苗７完成日期：２０１．０５ 北京协和医学院硕士研究生学位论文目录摘要ＩＡＢＳＴＲＡＣＴＩｌｌ第１１章前言１．１肠道病毒７１型和诺如病毒１１．１．１肠道病毒７１型简介１１．１．２诺如病毒简介５１．２ＥＶ７１中和表位和诺如病毒Ｐ颗粒８１．２．１ＥＶ７１中和表位８１．２．２诺如病毒Ｐ颗粒８１．３嵌合疫苗简介１０１．４本文的研宄内容和研宄意义１１１．４．１研究内容１１１．４．２研宄意义１１第２聿嵌合蛋白重＿粒的构建１２２．１弓１２丨言２．２实验材料１２２．２．１质粒和感受态细胞１２２．２．２试剂和试剂盒１３２．２．３实验仪器１４２．２．４合成的引物、寡核苷酸和基因１５２．３实验方法１６２．３．１质粒Ｐ４２的获取１６２．３．２双酶切质粒Ｐ４２１７２．３．３目的基因的获取１８２．３．４目的基因的重组２０２．３．５转化（ＤＨ５ａ）２１２．３．６重组质粒的获取２２２．３．７重组质粒的鉴定２３２．３．８嵌合蛋白的空间结构预测２３２．４实验结果２４２．４．１含Ｐ结构域载体质粒Ｐ４２的鉴定２４２．４．２酶切获取ＥＶ７１的中和表位基因片段２４ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文２．４３ＰＣＲ扩増ＥＶ７１的中和表位基因片段２５．２．４．４重组质粒测序验证２５２．４．５嵌合蛋白的空间结构预测２７２．５本章小结２７第３章嵌合蛋白的銳和纯化２８３．１弓２８Ｉ言３．２实验材料２８３．２．１质粒和感受态细胞２８３．２．２实验试剂和试剂盒２９３．２．３实验仪器３０３．３实验方法３２３．３．１转化（ＢＬ２１ＤＥ３）３２（）３３３．３．２蛋白表达３．３．３破碎菌体３５？３．３．４ＢｅａｖｅｒＢｅａｄｓＧＳＨ磁珠纯化蛋白３６３．３．５Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析３８？３．３．６ＧＳＴｒａｐＦＦ（５ｍＬ）柱纯化蛋白３９３．３．７目的蛋白溶液的超滤４０３．３．８ＧＳＴ标签的除去４１３．３．９目的蛋白性质的初步鉴定４２３．４实验结果４３３．４．１目的蛋白的诱导表达４３３．４．２表达目的蛋白的可溶性分析４４３．４．３磁珠纯化目的蛋白４４３．４．４目的蛋白的免疫印迹分析４５３．４．５Ｐ结构域蛋白的纯化４６３．４．６Ｐｍ＋ＳＰ５５－７０－２８嵌合蛋白的纯化４７３．５本章小结４９第４章嵌合蛋白的免疫原性评价５０４．１弓５０Ｉｔ４．２实验材料５０４．２．１小＿５０４．２．２细胞和病毒５０４．２．３实验试剂５０ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文４．２．４实验仪器５１４．３实验方法５２４．３．１小鼠免疫５２４．３．２ＥＬＩＳＡ分析５３４．２．３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析５４４．３．４中和试验５５４．４实验结果５７４．４．１免疫后血清的抗体滴度５７４．４．２各表位嵌合蛋白的免疫印迹分析５９４．４．３中和试验５９４．５本章小节６０第５聿讨论和结论６１５．１讨论６１５６２．２＾＃＃嫌６３英文缩略词表６８６９个人简介７３在读期Ｒ参与发表鮮雜文７３在读期间参与申请的发明专利７４致谢７５独创性声明７６学位论文版权使用授权书７６ 北京协和医学院硕士研究生学位论文摘要ｎ－肠道病毒７１型（Ｅｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１，ＥＶ７１）是导致５岁以下儿童患手足口病（ｈａｎｄ一－ｆ－ｏｏｔａｎｄｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅ，ＨＦＭＤ）的主要病原体之，同时该病毒具有嗜神经组织。ｉｒｕＮｏＶ的特性，致死率和致残率都很高诺如病毒（Ｎｏｒｏｖｓ，）是造成儿童和成人非细菌性急性胃肠炎流行的重要原因。这两种病毒都对人类的健康构成了不可忽视一的威胁，研制有效的疫苗是防治它们最有效的途径之。本研究的目的是获得含有ＥＶ７１线性中和表位和诺如病毒Ｐ结构域的嵌合蛋一。白，并对其进行初步的免疫原性评价，主要包括了３个部分的研究内容第部分，运用基因克隆的技术，将文献报道的３个ＥＶ７１线性中和表位以单个或串联的形式分别克隆到含诺如病毒Ｐ结构域的原核表达质粒中，经测序验证重组质粒；第二部分，将构建正确的重组质粒转入到大肠杆菌表达系统中，通过ＩＰＴＧ诱导嵌合蛋白表达，并用亲和纯化的方式对嵌合蛋白进行纯化，；第三部分用纯化后的嵌合蛋白免疫小鼠ＩＳＡ，通过免疫印迹、ＥＬ以及中和试验对嵌合蛋白的免疫原性进行初步的评价。通过以上３个部分的研宄，我们取得了如下结果：１）成功构建了含ＥＶ７１的３个单表位、４个串联表位与诺如病毒Ｐ结构域嵌合的重组质粒２）这些重组质粒；在大肠杆菌中所表达的７个嵌合蛋白都以部分可溶的形式存在；３）通过亲和纯化获得的Ｐ结构域和Ｐｍ＋ＳＰ５５－７０－２８嵌合蛋白都能够自发形成直径约２０ｎｍ的颗１３２０００、１１０２４粒，用这两种蛋白免疫小鼠后获得的血清抗体滴度分别是：：０００；，，，４）免疫印迹分析表明，（ｉ）７个嵌合蛋白都能与抗诺如病毒Ｐ结构域的抗血清发生（ｉｉ）反应；除了含单表位ＳＰ５５和ＳＰ２８的嵌合蛋白外，其它嵌合蛋白均能与抗ＥＶ７１的抗血清反应；（ｉｉｉ）除了Ｐ结构域蛋白、含单表位ＳＰ５５和ＳＰ７０以及含串－７０的嵌Ｐｍ＋ＳＰ５５－７０－２８的抗血清联表位ＳＰ５５合蛋白外，其它嵌合蛋白都能与抗＋ＳＰ－－）发生反应，５５７０２８小鼠血清的中和抗体效价约；５中和试验结果表明抗Ｐｍ为１：４。综上所述，本研宄获得了７个含ＥＶ７１线性中和表位和诺如病毒Ｐ结构域的嵌合蛋白，这些蛋白中部分具有针对ＥＶ７１和诺如病毒的双重抗原性；用嵌合蛋白一Ｐｍ＋ＳＰ５５－７０－２８免疫后的小鼠血清对ＥＶ７１具有定的中和作用。因此，本研宄为诺如病毒和ＥＶ７１二价疫苗的研发奠定了基础，同时也为基因工程疫苗的研制提供了新思路。Ｉ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文；中和表位关键词：肠道病毒７１型；诺如病毒；Ｐ结构域；嵌合疫苗ＩＩ 北京协和医学院硕士研究生学位论文ＡｂｓｔｒａｃｔＥｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１（ＥＶ７１）ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍａｉｎｐａｔｈｏｇｅｎｓｔｈａｔｍａｋｅｓｃｈｉｌｄｒｅｎｕｎｄｅｒ－－ｔ－ｍｏｕ５ｅａｒｓｏｆａｅｓｕｆｆｅｒｆｒｏｍｈａｎｄｆｏｏａｎｄｔｈｄｉｓｅａｓｅＨＦＭＤａｎｄｔｉｉｓａｙｇ（），ｎｅｕｒｏｔｒｏｉｃｖｉｒｕｓｒｅｓｕｌｔｉｎｉｎｈｉｈｍｏｒｔａｌｉｔ．ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＮｏＶｉｓｔｈｅｍｏｓｔｉｍｏｒｔａｎｔｐ，ｇｇｙ（）ｐ－ｃａｕｓｅｏｆｅｔｔｔｔｔｉｌｔ．ｐｉｄｅｍｉｃｎｏｎｂａｃｅｒｉａｌａｃｕｅｇａｓｒｏｅｎｅｒｉｓａｍｏｎｇｃｈｉｌｄｒｅｎａｎｄａｄｕｓＢｏｔｈＥＶ７１ａｎｄＮｏＶｂｒｉｎｇａｓｅｒｉｏｕｓｔｈｒｅａｔｔｏｈｕｍａｎｈｅａｌｔｈ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｅｆｆｅｃｔｉｖｅｖａｃｃｉｎｅｓｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｅｆｆｅｃｔｉｖｅｗａｙｓｔｏｃｏｎｔｒｏｌｔｈｅｍ．ＴｈｅａｉｍｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗｅｒｅｔｏｏｂｔａｉｎｃｈｉｍｅｒｉｃｒｏｔｅｉｎｓｃｏｎｔａｉｎｉｎＶ７１ｌｉｎｅａｒｐｇＥｎｅｕｔｒａｉｚｉｎｉｔｏｉｎ，ａｎｒｔｈｅｒｔｔｉｔｌｇｅｐｐｅｓａｎｄＮｏＶＰｄｏｍａｄｆｕｏｅｖａｌｕａｅｓｉｅｎ．Ｔｈｍａｌｉｎｒｒ．Ｉｉｒｒｗｅｌｍｍｕｎｏｉｃｉｔｉｓｓｔｕｄｉｎｃｌｕｄｅｓｔｈｅｅａｔｓｎｔｈｅｆｓｔａｔｃｏｎｅｄｇｙｙｙｐｐ，ＥＶ７１ｌｉｎｅａｒｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｅｐｉｔｏｐｅｓｓｉｎｌｏｒｔａｎｄｅｍｌｉｎｔｏｔｈｅｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｇｙｙＮｉｉｉ．ｈｏＶＰｄｏｍａｉｎｗｈｃｈｗａｓｃｏｎｆｒｍｅｄｂｓｅｕｅｎｃｎＩｎｔｅｓｅｃｏｎｄａｒｔｗｅ，ｙｑｇｐ，ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌａｓｍｉｄｓｉｎｔｏｔｈｅＥ．ｃｏｌｉｐｅｘｒｅｓｓｉｏｎｓｓｔｅｍａｎｄｔｈｅｃｈｉｍｅｒｉｃｒｏｔｅｉｎｓｅｘｒｅｓｓｉｏｎｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｂＩＰＴＧ．ｐｙ，ｐｐｙＴｈｅｃｈｉｍｅｒｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｐｕｒｉｆｉｅｄｖｉａａｆｆｉｎｉｔｙｃｏｌｕｍｎ．Ｉｎｔｈｅｌａｓｔｐａｒｔ，ｗｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｍｉｃｅｗｉｔｈｔｈｅｕｒｉｆｉｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃｐｒｏｔｅｉｎｔｈｅｉｍｍｕｎｏｅｎｉｃｉｔｏｆｗｈｉｃｈｐ，ｇｙｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｂｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎＥＬＩＳＡａｎｄｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｔｅｓｔ．ｙｇ，Ｔｈｒｏｕｈｔｈｅｅｘｅｒｉｍｅｎｔｓａｂｏｖｅｒｅｓｕｌｔｓｔｈａｔｗｅｏｔｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：１ｗｅｇｐ，ｇ）ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｘｒｅｓｓｉｏｎｌａｓｍｉｄｓｃｏｎｔａｉｎｉｎ３ｓｉｎｌｅｐｐｇｇｉｔ４ｔｉｔｆＥＶ７１ｗｉｔｈＮＰｄｏｍａｉｎ．２Ｔｈ７ｃｈｉｍｅｒｅｏｅｓａｎｄａｎｄｅｍｅｏｐｅｓｏｏＶｅｉｃｐｐｐ）ｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｐａｒｔｉａｌｌｙｓｏｌｕｂｌｅｉｎ￡．ｃｏｌｉ．３Ｔｈｅｕｒｉｆｉｅｄｃｈｉｍｅｒｉｃ）ｐ－ｒｏ＋ＳＰ５－ｔｅｉｎｏｆＰｄｏｍａｉｎａｎｄＰｍ５７０２８ｃａｎｓｏｎｔａｎｅｏｕｓｔｒｍｐｐｌｙａｓｓｅｍｂｌｅｏｆｏａｒｔｗ￣ｉｃｔｈｉｔｒ２０ｎｍ．Ｔｈｅｓｅｒｕｍａｎｔｉｂｏｄｔｉｔｒｆｒｏｍｉｍｍｉｚｐｌｅｓｉａｄａｍｅｅｏｆｙｅｓｕｎｅｄｎｄ－－２８ｗｅｒｅ１：３２ｍｏｕｓｅａｇａｉｎｓｔＰｄｏｍａｉｎａＰｍ＋ＳＰ５５７００００ａｎｄ１：１０２４０００，，，－ｔｉｖｅｉｉｉｉＮｏＶｎｉ．ｒｅｓｌ４Ａｌｌ７ｉｒｒｔｎｓｃｏｕｌｄｒｅａｃｔｗｔｈａｎｔＰｄｏｍａｉｎａｔｂｏｄｐｅｃｙ．）ｃｈｍｅｃｐｏｅｙＦ－－－－－ｉｖｅＰ７０ＳＰ５５７０２８ＳＰ５５７０ＳＰ５５２８ＳＰ７０２８ｏｕｔｏｆ７ｃｈｉｒｒｔｉｎｓｍｅｉｃｏｅ（Ｓ，，，，）ｐ－ｃｏｕｌｄｂｅｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙａｎｔｉＥＶ７１ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｅｘｃｅｐｔｔｗｏＰｄｏｍａｉｎｉｍｅｒ５５８．ＨｏｗｅｖｅｒｈｅｎｉｃｅｄｂｃｈｉｃｒｏｔｅｉｎｓｏｆＳＰａｎｄＳＰ２ｔａｔｂｏｄｉｎｄｕｐ，ｙｙＰｍ＋ＳＰ５５－－－－－－７０２８ｃｏｕｉ７０２８２８ｌｄｏｎｌｒｅｃｏｎｚｅ４ＳＰ２８ＳＰ５５ＳＰ５５ＳＰ７０２８ｙｇ（，，，）ｏｕｔｏｆ７ｃｈｉｍｅｒｉｃｒｏｔｅｉｎｓｂｕｔｎｏｔｔｗｏＰｄｏｍａｉｎｃｈｉｍｅｒｉｃｒｏｔｅｉｎｓｏｆＳＰ５５ＳＰ７０，ｐｐ，ａｎｄＰ５５－７０Ｓ．５Ｒｅｓｕｒｔｎｔｔｈｔｒａｚｎｔｔｌｔｓｏｆｎｅｕｔａｌｉｚａｉｏｔｅｓｓｈｏｗｅｄａｔｔｈｅｎｅｕｌｉｉｉｅｒｏｆ）ｇ－－－ｗａｓａｎｔｉＰｍ＋ＳＰ５５７０２８ｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍａａｉｎｓｔＥＶ７１ｉｎｖｉｔｒｏａｂｏｕｔ１：４ｇ．ｉｎ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文ｗｅｏｂｔａｉＩｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｉｎｅｄ７ｃｈｉｍｅｒｉｃｒｏｔｅｉｎｓｃｏｎｔａｎｉｎＶ７１ｌｉｎｅａｒ，ｐｇＥｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｅｐｉｔｏｅｓａｎｄＮｏＶＰｄｏｍａｉｎａｒｔｏｆｗｈｉｃｈｈａｄａｎｔｉｅｎｉｃｉｔａａｉｎｓｔｇｐ，ｐｇｙｇｓｅｒｕｍｏｆｂｏｔｈＥＶ７１ａｎｄＮｏＶ．Ｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍｒａｉｓｅｄｂｙｔｈｅｔ＋ＳＰ－－ｔｉｍｍｕｎｉｚａｉｏｎｏｆｃｈｉｍｅｒｉｃｐｒｏｔｅｉｎＰｍ５５７０２８ｃａｎｐａｒｌｙｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｔｈｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＥＶ７１ｉｎｖｉｔｒｏ．ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｌａｙｓａｃｅｒｔａｉｎｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＥＶ７１ａｎｄＮｏＶｂｉｖａｌｅｎｔｃｈｉｍｅｒｉｃｖａｃｃｉｎｅ，ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｓａｎｅｗｔｔｉｄｉｅａｏｆｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｏｆｅｎｅｔｉｃｅｎｉｎｅｅｒｉｎａｃｃｉｎｅ．ｇｇｇｖＫｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＰｄｏｍａｉｎｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｅｉｔｏｅｓｃｈｉｍｅｒｉｃｖａｃｃｉｎｅ；；；ｇｐｐ；ＩＶ 北京协和医学院硕士研宂生学位论文第１章前言１．１肠道病毒７１型和诺如病毒１．１．１肠道病毒７１型简介一肠道病毒７１型（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１，ＥＶ７１）在１９７４年首次从名脑炎婴儿的粪一Ｗ便样本中分离出来，并确定为种新的肠道病毒。在病毒分类学上，ＥＶ７１属于小＿‘’ＲＮＡ病毒科（ｐ／ｃｏｍａｗｒ／ｄａｅ）、肠道病毒属（ｅｎｔｅｒｏｗｒｕｓｇｅｍｖｓ）。ＥＶ７１病毒颗粒２］［二ｎｍ（．１）直径大约３０图１，呈十面体立体对称的球形结构，由外层的衣壳和内３［］部的ＲＮＡ核心构成，无包膜（．２），先由４个结构；外层衣壳组成较为复杂图１一蛋白ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４组成原聚体（ｐｒｏｔｏｍｅｒ），再由５个原聚体组装成个五聚体（ｐｅｎｔａｍｅｒ），１２个五聚体再封装病毒基因组就构成了完整的病毒颗粒。从ＥＶ７１衣壳的结构上来看，ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３位于衣壳的外表面，而ＶＰ４位于衣－壳的内部（图１．２）。因此，ＥＶ７１的抗原表位基本位于ＶＰ１３。ＥＶ７１基因组全长一＾．约７４ｋｂ，为单股正链ＲＮＡ，其中仅含个开放性阅读框（ＯＲＦ），两端为５和＇＇３非编码区（ＵＴＲ），５端含内部核糖体进入位点（ＩＲＥＳ），具有指导病毒蛋白质翻＇５４［］译的作用，３端含有多聚腺苷酸尾，可以维护病毒基因组的稳定性。编码区分为３个亚－，Ｐ１、Ｐ２和Ｐ３１，区，Ｐ区编码的是４个结构蛋白ＶＰ１４Ｐ２、Ｐ３区编码的７１［是７个非结构蛋白（图１．２）。麵琢戀—图１．１：ＴｈｅｍｏｒｈｏｌｏｏｆｕｒｉｆｉｅｄＥＶ７１ｖｉｒｉｏｎｓｗａｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｐｇｙｐ２［］＝ｂｙｎｅｇａｔｉｖｅｓｔａｉｎｉｎｇｕｎｄｅｒＴＥＭ．Ｓｃａｌｅｂａｒ５０ｎｍ．１ 北京协和医学院硕士研宂生学位论文＿＿－ＴＰＰ２￣ＩｉＩ，？ＶＰＶＰ４ＶＰ３ＰＪ—ＡＡＡｎＶ１２Ａ３Ｂ３Ｃｌｇ２ＶＰ２Ｂ２Ｃ３Ａ３Ｄ＾ＴｔｃｔｕｒａｌｒｏｔｅｉｎｓＮｓｒｕｃｔｕｒａｌｒｏｔｅｉｎｓｒａｎｓｌａｔｉｏｎＳｒｕｏｎｔｐｐＰ１ＰＰ２３Ｐ——；一“ｒｏｃｅｓｓｉｎｇ么歲ｂｖｉｒａｌｒｏｔｅａｓｅｐｙＶＰＯ２ＢＣ＾３ＣＤｒｏ＾３〇２＾ＡＣＤ＾Ｃｐｒｏｔｅａｓｅ１＾３［】图１．．２：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１ＥＶ７１ｖｉｒｉｏｎ（）－ＥＶ７１感染的对象主要是儿童，粪口途径是其最重要的传播途径，其次是呼吸８＿９］［道、直接接触等，隐形感染者和病毒携带者是其最重要的传染源。在临床上，ＥＶ７１感染主要表现为典型的手足口病（ｈａｎｄｆｏｏｔａｎｄｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅＨＦＭＤ），，，症状和１１体征，如发热，手．）、足、口腔出现皮疹或疱疹等（图１３＇它是导致５岁以下一，儿童患手足口病的主要病原体之。ＥＶ７１感染引起的手足口病大多是自限性疾病一，预后良好，，（ｅｎｆｅｒｏｗ／ｕｓ）般１周内疫愈但是与肠道病毒属ｓｆｅｎｕｓ的脊髓灰质炎病毒（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）类似，ＥＶ７１也具有嗜神经组织的特性，可造成部分感染的儿童出现重症，发生无菌性脑膜炎（ａｓｅｐｔｉｃｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、脑炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）和脊－髓灰质炎样麻瘦性疾病（ｏｉｔｉ）ｐｌｏｍｙｅｌｉｉｓｌｉｋｅｐａｒａｌｙｓｓ等多种与神经系统相关的并发１１＾１症，病情发展迅速，致死率和致残率都很高，严重威胁着儿童的健康。ＶＣ，？改访．ｉＷｋ？１．３Ｖｉｌｔｈｌｍａｒｅａ：ｅｓｃｅｓｏｎｔｈｅｆｏｏｔｍｏｕａｎｄａ，ｐ１０ｏ［］ｆｃｈｉｌｄｒｅｎｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＨＦＭＤ．２ 北京协和医学院硕士研宂生学位论文自上世纪７０年代以来，全世界范围内己经出现过多次因ＥＶ７１的流行而引起１２［］手足口病（ＨＦＭＤ）疫情的暴发（表１．１），这对全球儿童的身心健康造成了巨大的伤害。近年来，ＥＶ７１在亚太地区的流行呈现出上升的趋势。２００７年和２００８年，我国山东临沂和安徽阜阳先后暴发了手足口病疫情同时涉及到了我国大部分地区。其中，２００８年报道ＥＶ７１感染引起的手足口病病例４８８，９５５例，死亡１２８１４［］例，部分病例表现为脑炎口、神经源性肺水肿和肺衰竭等。２００９年，我国手足病发病病例为１１５５５２５例，其中重症１３８１０例，，８１％，，，死亡３５３例；经证实的重１６［】症和９０％的死亡病例均是由ＥＶ７１引起。我国己将手足口病列为法定的丙类传染病进行管理。ＮｕｍｂｅｒｏｆＶ７１ＮＥｃａｓｅｓｕｍｂｅｒｏｆｆａｔａｌｃａｓｅｓＭａｍｃｌｍ．ｃａｌｒｅｓｅｎｔａｔ．ｎｐｏｓｒｅｒｔｅｄｒｅｐｏｔｐｏｒｅｄＣａｌｉｆｏｒｎｉａ．ＵＳＡ，１９６９－７２２０１ｎｈｌｉｔｎｉｔｘｋｖｒｕ－ｌｉｉ１Ｅｃｅｐａｉｓ，ｍｅｎｉｇｉｓ．ｃｏｓａｃｉｅｉｓｋｅｌｎｅｓｓＮｅｗｒ１１ｍＹｏｋ，ＵＳＡ，１９７２０ＡｓｅｔｎｎｔｎｈａｌｉｔｓＨｎｌｎｅｉｃｅｉｉｉｓ，ｅｃｅｉ，ＦＭＤｏｏｅｃａｓｐｇｐ（ｙ）Ｓｗｅｄｅｎ，１９７３Ｉ９５０ＡｓｅｔｉｃｍｅｎｉｎｉｔｉｓＨＦＭＤｍｃＪｐｇ，（ｓｏｅａｓｅｓ）Ａｉｎｉｉｆｉ．ｒｉｎｕｕｒｓｅｔｃｍｅｎｓａａｌｔｃｄｉｓｅａｓｅ，ｉｃｌｄｉｎｂｌｂａＢｕｌａｒｉａｐｇｐｙｇ１９７５７４ｇ０５４ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓＳｏｍｅｄｅａｔｈｓ，ｅｘａｃｔｎｕｍｂｅｒＨＦＭＤｉｔｔｎｔｒｒｎｔｎｎｔ（ｎｍｏｓａｉｅｓ，ｃｅｅｂｅｌｌａｅｃｅｈａｌｉｉｓ，ｍｅｉｉｉｓｐ）ｐｇ，Ｊａｐａｎ１９７３１９７７１９７８１０３１ｕｗｒｎｋｎｏｎａｃｕｔｅｆｌａｃｃｉｄａａｌｓｉｓｐｙＣＮＳｒｉｒｄｉｓｅａｓｅ，ＨＦＭＤ．ａｃｕｔｅｅｓｐｒａｔｏｉｌｌｎｅｓｓ，ａｃｅｕｔｗｒＡ１ｙＮｅＹｏｋＵＳ９７７１２０ａｒｒｔｓｔｏｅｎｔｅｉｉｓ＾？一ｇｗｈｅｒＨｔｈｅａ丨ｄｕｅｕｎｇａｒｙ，１９７８３２３ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｃｏｎｆｉｒｍｅｄＭｅｎｉｎｉｔｉｓ，ｅｎｃｅｈａｌｉｔｉｓ，ｏｌｉｏｍｅｌｉｔｉｓ．ＦｏｎｆｒｇｐｐｙＨＭＤｌｏｕｃａｓｅｓ（ｙ）ＨＭＤｉｎｍｏｓｔｃａｓｓｍｅｎｎｉｉｈｌｉＦｅ，ｉｔｓ，ｅｎｃｅａｉｔｓ．Ａｕ（）ｇｐｓｔｒａｌｉａ１１４１９８６０ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｏｐａｔｈｙＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９８７５０Ａｃｕｒｔｅｆｌａｃｃｉｄａａｌｓｉｓｐｙ｜－ｒ－１９８５８９：ａａｌｓｉｓ，ｍｅｎｉｎｉｉｓ，ｎｈｌｉｉｒ．Ｇｉｌｐｙｇｔｅｃｅｐａｔｓ，ａｓｈｕｌａｉｎＵＳＡ－１ｗｎ１９７７９１９３ｌｂｏｒｔｒｎｆｉｒｍｎ，ａａｏｙｃｏｅｄＵｋｎｏＢａｒｒｅｒｓｙｎｄｏｍｅＨＦＭＤ，ａｓｅｐｔｉｃｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ，ａｃｕｔｅｆｌａｃｃｉｄａｒａｌｓｉｓＳａｐｙ，ｒａｗａｋ．Ｍａｌａｓｉａ．９６ｙ１９７２２８３４ｒｃａｒｄｉｏｒｅｉｒｔｒｄｆｕｎｃｉｓｐａｏｙｙｓｔｏｎｊＨＦＭＤ，ｈｅｒｐａｎｇｉｎａ，ｍｅｎｉｎｏｅｎｃｅｈａｌｉｔｉｓ，ｅｎｃｅｈａｌｉｔｉｓ．Ｏ７ｇｐｐｔｓｕＪａｐａｎ１９９１２０ｔｍｅｎｉｎｇｉｉｓＥｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓａｓｅｔｉｃｍｅｎｉｎｉｉ，ｕｌｍｏｎｗｎ，ｐｇｔｓａｒｏｅｄｅｍａｏｒＴａ１ｐｙｉａ９９８２９０１１６７８ｈａｅｍｏｒｔｉｒｉｒｈａｇｅ，ａｃｕｅｆｌａｃｃｄａｒａｌｓｉｓ，ｍｏｃａｄｉｔｓｐｙｙＫｅｎａ．１９９９８０ｒｔｔｔｙＤｅｍａｉｉｓ，ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ，ｍｙｏｓｉｉｓＨＦＭＤ，ｔｉｍｅｎｉｉｔｉｒｒｔｘｕｔａｓｅｐｃｎｇｓ，ｃｅｅｂｅｌｌａａａｉａ，ａｃｅｆｌａｃｃｉｄＨｙｏｇｏＪａｐａｎ２０００６０１ｐａｒａｌｓｉｓ，ｂｒａｉｎｓｔｅｍｅｎｃｅｈａｌｉｔｉｓｙｐ＿ＨＦＭＤ．ａｓｅｐｔｉｃｍｅｎｉｎｇＵｉｓ．ａｃｕｔｅｆｌａｃｃｉｄａｒａｌｓｉｓ，ｂｒａｉｎｓｔｅｍＳｗｐｙａｒｋ．Ｍｌｉ２００１ｒｔｒｎｒａａａａｓａ．０６９ｌａｂｏａｏｃｏｆｉｍｅｄ２ｙｙｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓＳｎｒｉｇａｐｏｅ，２０００３７９０５ＨＦＭＤｎｌ，ｅｕｒｏｏｇｉｃａｌｄｉｓｅａｓｅＫｏｒｅａ２０００Ｕｗｎ，ｎｋｎｏｎ０ＡｓｅｐｔｉｃｍｅｉｎｇｉｔｉｓＨＦＭＤｈｅｒａｎｉｎａ．ａｃｔｆｌ，，ｐｇｕｅａｃｃｉｄｐａｒａｌｙｓｉｓＨＦＭＤ．ａｓｅｐｔｉｃｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ，ａｃｕｔｅｆｌａｃｃｉｄａｒａｌｓｉｓ，ｂｒａｉｎｓｔｅｍＳｗｐｙａｒｒｒａａｋ．Ｍａｌａｓｉａ．２００３１０７ｌａｂｏａｔｏｃｏｎｆｉｒｍｅ１ｙｙｄｅｎｃｅｈａｌｉｔｉｓｐＦｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｊａａｎ．１９８３－２００３ＵｎｎｏｗｎｎｋｎｏｗｎｎｎｏｎｐｋＵＵｋｗＭｅｎｔｖｉｎｇｉｔｉｓ，ａｃｕｅｆｌａｃｃｉｄａｒａｌｓｉｓ，ｆｅｅｒ，ｃａｒｄｉｏｕｌｍｏｎａｒＤｎｐｙｐｙｅｖｅｒＵＳＡ２００３８１＇’ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ？ＨＦＭＤｔｉｉｉｉｔｆｌｒｎｍＳｏｈ，ａｓｅｐｃｍｅｎｎｇｔｓ，ａｃｕｅａｃｃｉｄｐａｒａｌｙｓｉｓ，ｂａｉｓｔｅｕｒＶｉ２００ｒｔｒｔｅｎｅｔｎａｍ．５１７３ｌａｂｏａｏｙｃｏｎｆｉｒｍｅｄ３ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓＳａｒａｗａｋ．Ｍａｌａｓｉａ．２００６２９１ｌａｂｏｒａｔｏｒｃｏｎｉｒｍｅｔｒｉｔｙｙｆｄ６ＨＦＭＤ．ａｓｅｐｔｉｃｍｅｎｉｎｇｉｉｓ，ｂａｎｓｅｍｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓＤｅｎｖｅｒ．ＵＳＡ．２００５８０Ｍｅｎｎｔｖｔｉｇｉｔｉｓ，ａｃｕｅｆｌａｃｃｉｄａｒａｌｓｉｓ，ｆｅｅｒ，ｅｎｃｅｈａｌｉｉｓｐｙｐＢｒｕｎｅｉ．２００６１６８１３ＨＦＭＤ．ｎｅｕｒｏｌｏｉｃａｌｄｉｓｅａｓｅｇＳｈａｎｄｏｎｇＣｈｉｎａ，２００７Ｈｒ．１１４９３ＦＭＤ．ｂａｉｎｓｔｅｍｅｎｃｅｈａｌｉｔｉｓ，ａｓｅｔｉｃｍｅｎｉｎｉｔｉｓ．ｐｐｇＡｎｈｕｉ，Ｃｈｉｎａ．２００８４８８９５５ｎｒｎｕｌｎｒｏｍ１２８ＨＦＭＤ．ｅｕｏｇｅｉｃｍｏａｅｄｅａｐｙ２表１．１：ＥＶ７ｔ＂１１ｏｕｂｒｅａｋｓｗｏｒｌｄｗｉｄｅｂｃｏｕｎｔｒａｎｄｅａｒ．，ｙｙｙ在长期的进化过程中－，ＥＶ７１出现了不同的基因型（ｅｎｏｔｅ）和基因亚型ｓｕｂｇｙｐ（＿１７１９１［ｅｎｏｔｅ）。根据ＶＰ１核苷酸序ｇｙｐ列的差异，将ＥＶ７１基因型分Ａ、Ｂ、Ｃ共３型。Ａ基因型仅１个成员，即是１９６９年分离的ＥＶ７１原型株（ＢｒＣｒｓｔｒａｉｎ）；Ｂ基因型分为５个基因亚型Ｂ１－Ｂ５，大多是１９８５年以前发Ｃ基因现的病毒株；型也有Ｃ－１Ｃ５共５个，多是１９８５年以后发现的病毒株基因亚型。从基因型及基因亚型的３Ｑ】【ｐ全球分布来看（图１．４），欧美国家主要流行Ｃ１和Ｃ２亚型病毒，而在亚太地区却存在着Ｂ、Ｃ基因型的多种基因亚型病毒共同循环的状态。目前，我国流行的３ 北京协和医学院硕士研宂生学位论文２＿１２２［］ＥＶ７１病毒主要为Ｃ４亚型。不同的基因型可在不同的时间和地区流行于不同２３［］，ＥＶ７１感染引起的手足的人群中，不同的基因型之间还可能发生重组这也就是一口病难以很好控制的原因之。ＥＶ７１ｅｎｏｔｙｅｓｇｐＡ■Ｂ２■Ｂ３■！Ｂ４Ｂ５■Ｃ１■Ｃ２■Ｃ３■Ｃ４■Ｃ５■７－－－－－Ｃｏｕｎｔｒ－２１１１４ｉｅｓ１９９１９９９２０００２００２２００３２００５２００６００８２００９２０１２０２２０ＡｕｓｔｒａａｌｉＢＳＳＳｌｉｉｉｌ＾２＾＾Ｃｈｉｎａ＂Ｃ２Ｃ４Ｍ—Ｓｉ５５５５５５５ＨｏｎｇＫｏｎＣＡｗｍｍｍｍｍｇＪａａｎ＂１Ｃ２ｐｗｍｍＳＳＳＳ＾Ｃ３ＨＩＢ■■■Ｃ２ｋ。。Ｋｏｒｅａ〇４ｍｍｍｗ＾ｍＢ３圓１１１１１１１１１１１１＾＂１１１１１１１１＾ＭａｌａｙｓｉａＳＥ＾ｌＪＳＳＳＳＳＳＳＳＳＪＪＳＳＳＳＳＳＳＴ？—Ｃ２￣ＳｉｎａｐｏｒｅｇｈＨＩ■■■ＣＰｉｌｎｅｓ１１ＢＢＣ２Ｃ２ＩＢＩ２ｉｐｐｉ乂縣“Ｂ４■■■■■■■■Ｂ５ＴａｉｗａｎＣ２一■Ｃ２Ｃ４—■Ｃ４—Ｉ———■５Ｃ￣￣：ＢｉｍｍｍｍｍａｍｍｍＯｍｍｍｍａｍｂＴｈａｉａｎｄａ￣—８２—Ｃ４■ｉＴｒＶｉｅｔｎａｍ■？＊＊ｉｌ＾＊０１＂＇＂￣Ｃ１ＥＵｆａ｜Ｃ２ＩＩ｜３１１图１．４Ｖ７ｔｉｔｉｆｉｆｒｏｍｏｕｔｂｒｅａｋｓ．：Ｅ１ｇｅｎｏｙｐｅｓｄｅｎｅｄ目前，临床上对于ＥＶ７１的感染并没有可靠的治疗手段，也没有特效的抗病毒药物。预防ＥＶ７１感染引起的手足口病，最有效的方法还是疫苗免疫。我国有３家３［］７１灭３（１．２）ＥＶ７１机构的ＥＶ活疫苗都完成了期临床试验表，其中有２家机构的＆２５［］，但是灭活疫苗己经成功上市。虽然ＥＶ７１的灭活疫苗具有良好的免疫保护性一些传统疫苗所遇到的问题它在应用中还是会面临，比如接种后副反应、不同基因型之间的交叉保护力有限等。因此，研发ＥＶ７１的新型疫苗也十分有必要。Ｐ〇〇ｎＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｓＥＶ７１ｓｔｒａｉｎＤｏｓａｇｅｇＳｔａｔｕｓＲｅｆｅｒｅｎｃｅｓ（ｐ）Ｊ｜＾＾ｔ－ｏｎＢｔｐｈａｓｅｃｏｍｌｅｔｅｌ°ｅｃｈＣ〇６３ｈ３ｄ．＂ＰＮＣＦＹ７ＶＰ５ｉ〇２４５１５Ｃ４ａｓｔｒａｉｎ１Ｔ００７８５７（、＇＝，）Ｌｔｄ．Ｃｈｉｎａｃｈｉｌｄｒｅｎａｒｏｖｅｄ（）ｐｐｅ－ＢｉｉｎＶｉｏｏＢｉｏｌｏｉｃａｏｎｔｌ６３ｈｊｇｇｇ〇１ｌｅｔｅ８００７７Ｐｈａｓｅ３ｃｏｍｒｐｄＮＣＴ０１５０８２４７、＇ｃ，ｈｊ，Ｃｏ．ｔ．Ｃｉｎａｉｌｄｒｅｎ，Ｌｄ（ｈ）＾ＣＡＭＳＣｈｉｎａＣ４ａＦＹ２３ｓｔｒａｉｎ０．２５１２〇〇〇ＮＣＴ０１５６９５８１（）（）＾，ｈｒｅｎｊｉｄＮＨＲＩＴａｉｗａｎ巳４５ａｎｄ１０Ａｄｕｌｔｓ６０Ｐｈａｓｅ１ｃｏｍｌｅｔｅｄＮＣＴ０１２６８７８７）ｐ（ａｏｒｅａｎｄｕｔｓｈａｓｅｏｍｅｔｅｄＴ０１３７６４７９ＩｎｖｉｒａｅｎＳｉｎＢ２０．６３Ａｄｌ３６Ｐ１ｃｌＮＣｇ（ｇｐ）ｐ３［］－ｍａｎｃ表１．２：Ｆｏｒｍａｌｉｎｔｉｔ１ｔｔｉｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｉｎａｃｖａｅｄＥＶ７ｖａｃｃｉｎｅｓｅｓｅｄｎｈｕ４ 北京协和医学院硕士研究生学位论文１．１．２诺如病毒简介诺如病毒（ＮｏｒｏｖｉｒｕｓｏＶ）是首个被确认为引起人类急性胃肠炎的病毒，于，Ｎ１９７２年通过免疫电镜技术从１９６８年美国诺瓦克镇（Ｎｏｒｗａｌｋ）暴发胃肠炎患者的样本中首次检出ｎ〇Ｖ属于人类杯状病毒科（Ｃａ／／ｃ／Ｖ／／７ｄａｅ），诺如病毒属＇一２７［１（Ａ／ｏｒｏｗｏｖｓ），是种单股正链的ＲＮＡ病毒，无包膜。１＼１〇乂基因组全长约７．５ｋｂ，一含有３个开放性阅读框（ＯＲＦ）（图１．５），。０ＲＦ１长度约５ｋｂ编码个非结构蛋白，该蛋白由病毒自身的蛋白酶酶切为６个小蛋白，包括病毒复制所必需的ＲＮＡＲＮＡ（－依赖的聚合酶ＲＮＡｄｅｐｅｎｄｅｎｔＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＲｄＲｐ）：０ＲＦ２编码主２８ＶＰ［１１，〇ＲＦ３编码ＶＰ２ＶＰ１是病毒衣壳的主要的结构蛋白结构蛋白。要组成部分，ＶＰ２的功能目前尚不明确。ｖｐａａａａａａｇＮＳ１￣２ＮＳ４ＶＶＰ２ＮＴＰａｓｅＶＰｇＰｒｏｔｅａｓｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ「Ｘ－ａａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅＤｅｔｉｌｏｆｔｈｅＮｏｒｗａｌｋｖｉｒｕｓｃａｐｓｉｄＶＰ１ｓｕｂｕｎｉｔ—邊—图１．５：Ｈｕｍａｎｎｏｒｏｖｉｔｉｉｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅｏｒｇａｎｚａｏｎａｎｄｖｒｕｓｅｎｃｏｄｅｄｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＧｌｏｂａｌＢｕｒｄｅｎｏｆＮｏｒｏｖｉｒｕｓａｎｄＰｒｏｓｅｃｔｓｆｏｒＶａｃｃｉｎｅＤｅｖｅｌｏｍｅｎｔ，ＢｅｎＬｏｍａｎ（ｐｐｐ）２６ｐ９１［－ＮｏＶ病毒颗粒在电镜下具有典型的羽状外缘（图１．６）。，直径约为２７３０ｎｍ３（Ｗ１１［最新研宄表明，依据ＶＰ１氨基酸序列的多样性，可将ＮｏＶ分为７个基因组（ｅｎｏｒｏｕ）－ｔｇｇｐ，即ＧＩＧＶＩＩ，不同的基因组中包含许多个基因型（ｇｅｎｏｙｐｅ），例如：ＧＩ组９ＧＩＧ包含个、Ｉ组包含２０个、Ｇ川包含３个等。Ｇｌ、ｉｌ、ＧＩＶ基因组的病毒主要感染人类．．，其中ＧＩＩ１５病毒目前只在人类中检测到，ＧＩＩ４病毒是全世界诺如３２病毒感染的主要类型［ｈＧｍ和ＧＶ病毒分别感染牛和鼠；ＧＶＩ、ＧＶＩＩ病毒主要感３３１）染犬类。５ 北京协和医学院硕士研宂生学位论文图１．６：Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｏｆｎｏｒｏｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｎｆｅｃｅｓ．ｈｔｔｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｅｄｉａ．ｏｒ／ｗｉｋｉ／Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ（ｐｉｐｇ）０１＂ｇｈｉ＼Ｖ．ｂ，ＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩ（ｃａｎｍｅＧｅｎｏｒｏｕｐＩ＼ＪｇＩＩｂ〇ｖｉｎｅ—纖／／肩ａ＇＜／ＧｕｐｌＪ１Ｔ：＼＼ｅｎｏＶ－ＧｇｒｏｕｐＩ乂＾＼Ｌ＼ｃａｎｉｎｅ、，ｇｉｖ（＿２）＼ＧｅｎｏｒｏｕＶ＼ＧｅｎｏｇｒｏｕｐＶｇｐＩｍｕｒｉｎｅｈｕｍａｎ，ｆｅｌｉｎｅ／ｃａｎｉｎｅ（＼＼〉，＞）ＷＧ，Ａ．７Ｓ１：Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｏｒｏｖｉｒｕｓｅｓｉｎｔｏ７ｅｎｏｒｏｕｓｂａｓｅｄｏｎａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｕｅｎｃｅｇｇｐｑ３０［］ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｔｈｅｃｏｍｌｅｔｅＶＰ１ｃａｓｉｄｒｏｔｅｉｎ．ｐｐｐ６ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文）诺如病毒（ＮｏＶ具有较强的感染性，从儿童到成人的各个年龄段人群都容易受到它的感染。在临床上，诺如病毒感染主要表现为腹泻、腹痛、恶心、呕吐等急，，比如学校性胃肠炎的症状多在半封闭的环境和人口集中的地方暴发、游轮、军３４＿３５［］－队。诺如病毒对外界的抵抗能力较强，可以通过粪口途径、直接接触、工厂等传播，也可以通过被病毒污染的食物和水传播，冬季是发生诺如病毒感染的多发季３６３７＿３９［１一［］节。研宄表明，诺如病毒引起的急性胃肠炎己经成为了个全球性的公共卫生问题（图１．８）。由诺如病毒引起胃肠炎占全球胃肠炎总病例数的１８％，每年全球感染诺如病毒的病例中位数（ｍｅｄｉａｎｎｕｍｂｅｒ）近７亿，其中死亡达２１９，，０００例４（）［］－这造成的社会经济负担相当沉重，２００６２０１３。诺如病毒感染在我国也普遍存在年，我国诺如病毒感染性腹泻暴发和住院病例数呈逐年上升趋势，全国报告诺如病毒感染性腹泻疫情达５６起，发病４９７９例，平均每起暴发８９例病例，这对我国居民的健康构成了极大的威胁，需要引起我们足够的重视。．．獅－Ｎｔｕｍｂｅｒｏｆｓｕｄｉｅｓ一ｙ￣ＡＥ＼［－■６－２１３ＮＬ３９８Ｈ１］ｆｄｆｈｃｏｕｎ．图１．：ｅａｔｍａｐｏｕｎｉｑｕｅａｔａｓｅｔｓｒｏｍｅａｃｔｒｙ一－诺如病毒感染般是自限性的疾病，病程２３天，预后良好，但是，免疫力较４１［］弱的人，如老人和儿童病情或更严重，病程也较长，甚至会引起死亡。目前，对于诺如病毒的感染也没有有效的抗病毒药物。预防诺如病毒感染最有效的措施还是，也没有合适的动物模型研发针对性的疫苗。由于诺如病毒不能实现体外培养，传统疫苗研发较为困难，现在大多数针对诺如病毒的疫苗研发都是以ＶＬＰ（ｖｉｒｕｓｌｉｋｅ４２４５４６ａｒｔ［］［ｐｉｃｌｅ）作为免疫原。虽然最新研究表明１可以通过人的小肠干细胞来源的，肠道样组织实现诺如病毒的体外培养，但是肠道样组织很难建立和维持并不适合于传统疫苗研发、生产所需要的大规模培养，所以基因工程疫苗是诺如病毒疫苗研发的最佳选择。综上所述，ｎｔｅｒｏｖ）（）肠道病毒７１型（ＥｉｒｕｓＥＶ７１Ｎｏ「ｏｖｉｒｕｓＮｏＶ，和诺如病毒，都对人类的健康造成了严重的影响，至今都还没有针对这两种病毒的有效治疗药物，一研制针对性的疫苗是预防它们最有效的途径之。７ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文１．２ＥＶ７１中和表位和诺如病毒Ｐ颗粒１．２．１ＥＶ７１中和表位ＥＶ７１的中和表位（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｅｐｉｔｏｐｅ）是指ＥＶ７１病毒结构蛋白上能刺激机一４７［］体产生中和抗体的免疫活性区，般具有保守的氨基酸序列。中和抗体被认为是抵抗ＥＶ７１感染的重要因素。中和抗体能够改变病毒表面的构型，阻止病毒吸附于４８１［易感细胞，从而使病毒不能进入细胞内进行复制。，ＥＶ７１、增殖目前结构蛋白４８Ｍ＿５１［］［上许多线性的中和表位己经被确定］。Ｆｏｏ等研宄发现，结构蛋白ＶＰ１上两－－个合成肽ＳＰ５５（１６３ａａ１７７ａａ）、ＳＰ７０（２０８ａａ２２２ａａ）存在于ＶＰ１的主要亲水区域，并且暴露在ＶＰ１的表面。在体外微中和试验中，ＳＰ５５、ＳＰ７０都能够引起抗ＥＶ７１的特异性中和抗体产生，抗体的类型主要为ｌｇＧ１，而且产生针对ＥＶ７１的一ＩｇＧ总量与ＥＶ７１全病毒免疫血清中ＩｇＧ的总量样高，抗ＳＰ７０的血清还显示出几乎和抗灭活ＥＶ７１病毒血清相当的效果，。通过氨基酸序列比对发现在不同的ＥＶ７１亚型中ＳＰ７０呈高度保守，ＳＰ７０在体内实验中也能提供很好的保护力。Ｌｉｕ５２［］－等研宄表明，来自于ＥＶ７１结构蛋白ＶＰ２上的肽段ＳＰ２８（１３６ａａ１５０ａａ）可以与ＥＶ７１竞争性结合ＥＶ７１单克隆抗体ＭＡＢ９７９，表明ＳＰ２８是ＥＶ７１病毒的线性中和表位，而且ＳＰ２８在不同ＥＶ７１亚型间高度保守，不受福尔马林处理和长时间５３［］－－－储存的影响。Ｌｉ等研究证实，通过串联ＶＰ１ＳＰ５５、ＶＰ１ＳＰ７０、ＶＰ２ＳＰ２８这３个表位获得原核表达的重组蛋白（ｍＴＬＮＥ），抗ｍＴＬＮＥ血清能够有效地保护乳鼠受致死剂量的ＥＶ７１病毒攻击。这些研宄都表明了，ＳＰ５５、ＳＰ７０、ＳＰ２８是ＥＶ７１新型表位疫苗研发的良好候选分子。１．２．２诺如病毒Ｐ颗粒一诺如病毒Ｐ颗粒（Ｐｐａｒｔｉｃｌｅ）是种亚病毒颗粒，它既可以作为载体来呈递外５４［］，，也可以作为诺如病毒基因工程疫苗研发的候选抗原源抗原。通过结构分析发现诺如病毒衣壳由１８０个结构蛋白ＶＰ１构成，结构蛋白ＶＰ１包含了２个主要结构域：Ｎ端的Ｓ结构域（ｓｈｅｌｌｄｏｍａｉｎ）和Ｃ端的Ｐ结构域（ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎｄｏｍａｉｎ），两者通过柔性的铰链连接，彼此可在结构和功能上独立。Ｓ结构域形成病毒衣壳的一内部结构，单独表达会形成个表面光滑的小颗粒（Ｓｐａｒｔｉｃｌｅ，图１．９），不具有结５５－５６】［ＧＢＡ（ｈ－ｉｓｔｏｂｉ），ＨＧＢＡ合ＨｌｏｏｄｇｒｏｕｐＡｎｔｇｅｎ受体的功能受体与诺如病毒侵入人体细胞有关。Ｐ结构域与病毒衣壳外部形成的凸起有关，又分为Ｐ１和Ｐ２两个子区域（图１．９），Ｐ１与内部Ｓ结构域相连，Ｐ２则位于衣壳最外端，包含了与ＨＧＢＡ受体结合的位点，通，。单独表达Ｐ结构域蛋白过末端修饰即可以形成Ｐ颗＿５７６＜３一ａ［］粒（Ｐｐｒｔｉｃｌｅ）。Ｐ颗粒是个直径为２０ｎｍ、分子量约为８４０ｋＤａ的八面体亚病毒颗粒，它是由２４个Ｐ结构域单体（Ｐｍｏｎｏｍｅｒ）组装成的１２个二聚体（ｄｉｍｅｒ）构成（图１．９），可在￡ｃｏ／／和Ｐ／ｃ／７／ａｏａｓｔｏｒ／ｓ中表达，性质较为稳定，ｊ８ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文，同时还保留了与ＨＧＢＡ受体结合的活性，具有较高免疫原性是诺如病毒基因工程６１？［］疫苗的研宄热点。在Ｐ结构域单体蛋白的末端都存在３个环形（ｌｏｏｐ）凸起－．，结构ｌｏｏｐ１ｌｏｏｐ３（图１１０）。在形成Ｐ颗粒后，这些环形凸起就展示在最外端这６５［］些凸起给外源抗原的插入和识别提供了良好的位点。每个Ｐ颗粒包含了２４个Ｐ结构域单体蛋白，如果在１个或３，每个Ｐ结构域单体蛋白又包含了３个环形凸起个环形凸起上插入１个外源抗原，那么在形成Ｐ颗粒时就会在Ｐ颗粒的表面展示出２４或７２个相同的外源抗原，这可以极大的提高外源抗原的暴露机会，增加其免，因此Ｐ颗粒可以作为外源抗原呈递的良好平台疫原性。繼ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＣａｐｓｉｄ１８０ＶＰ１ＣａｓｉｄＰｒｏｔｅｉｎＶＰ１ｄｉｍｅｒＩｓｏｌａｔｅｄＰｄｏｍａｉｎＰｄｉｍｅｒ（）ｐ（）（）參餐－￣－ｍｅ＝＊ｍ＝Ｓａｔ＞ｔ．ｒｉｃｌｅ１８０ｒ．ｄ２０ｎｍＰａｒｉｃｌｅ２４ｅｒＯ２０ｎｍｐ（）ｐ（）５８＂５９Ｐｄｏｍ［］ｍｔｈｅｎｏｒｏｖｉ？１．９：ＦｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＰｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｒｏｉｒｕｓａｎ．ＳｕｒｆａｃｅｌｏｏｐｓｏｆｔｈｅＰａｒｔｉｃｌｅＬｏｏｗｉｔｈａｓｍａｌｌｅｉｔｏｐｐ２ｐｐｅＨＢＨＨＩＩ＾Ｈｌ＾９〇？ＩｔＩｌｉ４０５５７０８５１００㈧擊？－Ｗ－ｉｌｄｅＰａｒｔｉｃｌｅｉｌｅｅｉｏｈｉｍｅｒａｔｙｐＰａｒｔｃｔｃｐｐｐｐｅ６７１１图１．１０ｌｔｔｔｌ．：ＴｈｅｐｒｉｎｃｉｐｅｏｆａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎａｉｏｎｂｙｎｏｒｏｖｉｒｕｓＰａｒｉｃｅｓｐ９ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文６５＿６９］Ｔａｎ等［Ｐ结构域蛋白的将Ｈｉｓｔａｇ、流感病毒Ｍ２ｅ等短肽段分别插入到ｌｏｏｐ２中进行表达，结果表明这些小肽段能够成功插入并正确表达出新的Ｐ结构域，蛋白，ｌｏｏ２中。此外他们还将轮状病毒ＶＰ８插入到ｐ结果证实这些长肽段也可以顺利插入，经表达、纯化的新的Ｐ结构域蛋白能够自发形成Ｐ颗粒。重要的是，Ｔａｎ等对新形成的Ｐ颗粒进行免疫活性检测时发现，含Ｈｉｓｔａｇ、Ｍ２ｅ的Ｐ颗粒免疫小鼠后获得的抗体效价明显高于单独肽段Ｈｉｓｔａｇ、Ｍ２ｅ免疫小鼠的抗体效价，并且用含Ｍ２ｅ的Ｐ颗粒免疫后的小鼠能在流感病毒攻毒试验中１００％存活，而单６６［］独Ｍ２ｅ肽段免疫的小鼠存活率小于，Ｐ颗粒可以作为提高外源抗１０％这证实了，原免疫活性的载体。同时，他们还发现含Ｍ２ｅ、ＶＰ８的Ｐ颗粒免疫小鼠后的血清既能结合流感病毒，还能产生阻断诺如病毒ＶＬＰ与ＨＢＧＡ受体的结合、轮状病毒６７［１，。Ｆａｎｇ等人研宄表明，在小鼠体内由ＤＣ细胞提呈的Ｐ颗粒不仅能诱导针对６３［］诺如病毒的体液免疫应答，还能诱导针对诺如病毒的细胞免疫应答。总之，这些研究结果表明，含Ｐ结构域的嵌合蛋白不仅易于表达、成本低、结构稳定，而且免疫原性高，即可以作为提呈其它病原体抗原成分的载体，又可以作为诺如病毒本身疫苗研发的免疫原，为二价嵌合疫苗的研宄提供了良好的基础和平台。１．３嵌合疫苗简介，近年来，随着基因工程技术许多疫苗不、分子生物学等相关领域的快速发展一，断的被研制和开发。新疫苗的出现也伴随了系列的问题。疫苗种类的增多儿童，这给接种的次数就会增多，接种副反应也会增加，疫苗管理的困难程度也会加大７（３［］。儿童，嵌合、家长和医护人员带来了诸多的不便所以研发嵌合疫苗十分有必要一类新型疫苗疫苗是应用基因工程技术构建基因能表达两种以上病原体抗原的。嵌７（３［１，关于嵌合疫苗的合疫苗可以是多疾病嵌合疫苗也可以是单疾病嵌合疫苗。目前７１１１（ｄｉｒ研宄有很多，比如Ｃｈａｎｇ等将登革病毒ｅｎｇｕｅｖｕｓ）和日本脑炎病毒（Ｊａｐａｎｅｓｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）的Ｅ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）基因进行比例嵌合，最后表达出的Ｅ蛋白既包含了登革病毒又包含了日本脑炎病毒Ｅ蛋白的部分氨基酸序列。用嵌合的Ｅ蛋白进行免疫可以在攻毒实验中给小鼠提供很好的保护力。Ｋａｗａｈａｒａ等７２１［－（ｂａｃＣａ－Ｇｉ）ＩＶ１Ｖ３抗原进行嵌合表达，用ＢＣＧｉｌｌｕｓｌｍｅｔｅｕ６ｒｎ作为载体与Ｈ获得的嵌合蛋白采用直肠内和皮内相结合的方式免疫豚鼠，结果诱导了针对Ｖ３和＿结核分枝杆菌的迟发型超敏反应，同时也有高滴度抗ＨＩＶ１特异性ＩｇＧ产生。这些研宄都显示出嵌合疫苗是具有很好的应用前景的。１０ 北京协和医学院硕士研究生学位论文１．４本文的研宄内容和研宄意义１．４．１研究内容本研宄以诺如病毒Ｐ颗粒为平台，运用基因工程嵌合疫苗研发的策略，首先是获取包含了诺如病毒Ｐ结构域的原核表达质粒，再将ＥＶ７１的３个线性中和表位（ＳＰ５５、ＳＰ７０、ＳＰ２８）以单独或串联组合的方式克隆到其Ｐ结构域的ｌｏｏｐ２中，构建成重组质粒。经测序鉴定目的基因片段正确插入后，将重组质粒转入大肠杆菌，以表达系统中ＩＰＴＧ诱导嵌合蛋白表达，运用亲和纯化的原理对嵌合蛋白进行纯。化，最终获得纯化后的嵌合蛋白用嵌合蛋白免疫小鼠，获取免疫后的血清，以免。疫印迹、ＥＬＩＳＡ、中和试验的方法对其免疫原性进行初步分析１．４．２研宄意义肠道病毒７１型（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１，ＥＶ７１）和诺如病毒（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ，ＮｏＶ）都对人类的健康造成了严重的威胁，至今仍无有效的药物来治疗这两种病毒引起的感染，一通过疫苗免疫接种是预防它们感染最有效的措施之。本研究主要通过基因工程技术，结合相关的研宄结果，构建出既包含诺如病毒抗原成分，又包含ＥＶ７１抗原成分的嵌合蛋白，通过初步免疫原性分析来证实这些嵌合蛋白是否能有望作为抗诺如病毒、ＥＶ７１这两种病毒的二价嵌合疫苗，为诺如病毒、ＥＶ７１新型疫苗的研宄奠定一一。了定的理论基础，也为基因工程疫苗、二价疫苗的研发做出了进步的探索１１ 北京协和医学院硕士研究生学位论文第２章嵌合蛋白重组质粒的构建２．１引言一般来说，嵌合蛋白的获得需要前期利用分子克隆技术进行嵌合蛋白的分子构一ｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎ段目的基因片段插入到载体中建。分子克隆（ｍｏｇ）就是在体外将，形成重组载体，再将重组载体导入受体细胞后扩增形成大量子代的过程。本研宄的目的基因为ＥＶ７１的３个单独中和表位（ＳＰ５５、ＳＰ７０、ＳＰ２８）以及由这３个表位－７０－２８－－－组合而形成的４个串联表位（ＳＰ５５、ＳＰ５５７０、ＳＰ５５２８、ＳＰ７０２８），根据。它们的氨基酸序列，设计对应的核苷酸序列获得的目的基因需要连接合适的载体。质粒（ｐｌａｓｍｉｄ）是最常用的载体，它是由双链环状的ＤＮＡ组成的独立遗传因子，存在于多种细菌中。通常情况下，质粒基因产物对宿主细胞是有利的，比如某些抗生素的抗性。质粒可以通过转化进入处于感受态（暂时易于让较小的ＤＮＡ分子通过）的细胞，即感受态细胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ－－（ｌｌｃｅ）。本研究所使用的载体为质粒Ｐ４２，该质粒由ｐＧＥＸ４Ｔ１质粒ＧＥ公司）与诺如病毒ＧＩＩ４基Ｐ结构域（ＶＡ３８７Ｇｌ：１４６３８７０１６。．因型，）基因重组而成质粒Ｐ４２具有以下特点：１、含有ＧＳＴ标签，可以增加所表达的融合蛋白的可溶性和稳２ＧＳＴＴｈｂｉｎ３Ｐ定性，使融合蛋白易于纯化、标签可以通过ｒｏｍ、结构；去除；在域的ｌｏｏｐ２处存在常用酶切位点（ＳｐｅＩ和ＣｌａＩ），外源目的基因片段可通过此处插入而不影响ｌ〇ｏｐ２的形成；４、为氨苄青霉素抗性，有利于重组后的筛选；５、含ｌａｃｑｌ基因Ｉ，启动子为Ｔａｃ，转入表达受体菌后可以通过ＰＴＧ诱导而高效地表达目的蛋白。目的基因与载体质粒连接后的重组质粒需要转入合适的克隆系统。克隆系统多选择大肠杆菌中的ＤＨ５ａ菌株，该菌株主要表现为对外源性ＤＮＡ缺乏免疫，同时对氨苄青霉素敏感，故常被用来作为基因工程克隆质粒的受体菌。提取在受体菌中扩增后的重组质粒进行测序，就可以验证目的基因是否正确插入到了载体质粒中，从而完成分子构建。在本章中，我们通过分子克隆的方法，成功构建出了含诺如病毒Ｐ结构域与ＥＶ７１中和表位嵌合基因的７个重组质粒，结构预测显示Ｐ结构域蛋白能很好地在其凸起上展示ＥＶ７１的各个中和表位。２．２实验材料２．２．１质粒和感受态细胞ｔ质粒Ｐ４２（图２．１）来自于美国辛辛那提儿童医院医学中心（ＣｉｎｃｉｎｎａｉＣ’ｈｉｌｄｒｅｎｓＨｏｓｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ），由本实验室保存；￡＿ｃｏ／／ＤＨ５ａ感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。１２ 北京协和医学院硕士研究生学位论文ＴｈｂｉｎｒｏｍＬｏｏｐ２＾￣．．．ＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴ．－．ｋｃＴＴＡＣＣＡＣＡ．．．．．．．．．ＡＧＡＡＴＣＧｆＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＢａｍＨＩＳｐｅＩＣｌａＩｓｔｏｐｃｏｄｏｎＮｏｔｉＩ｜／ｉｆＰ４２ＷＩＩ￣５９３９ｂｐＪｑ｜ｌａｃ图２．１Ｐ４２的质粒图谱及其Ｐ结构域ｌｏｏｐ２的核苷酸序列Ｆｆｌ２ｏｄｉｕｒｅ２．１ＭａｏｆＰ４２ａｓｍｉｄａｎｄｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｏｏｆＰｏｍａｉｎｇｐｐｌｐ２．２．２试剂和试剂盒主要试剂和试剂盒（１）货号氨苄青霉素钠上海翊圣生物科技有限公司６０２０３ＥＳ１０ＴｒｙｐｔｏｎｅＯｘｏｉｄＬＰ００４２ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔＯｘｏｉｄＬＰ００２１氯化钠四川西陇化工有限公司／－ＬＧｌｙｃｅｒｏｌＡＭＲＥＳＣＯ０８５４１ＡａｒｏｓｅＢｉｏｗｅｓｔ１４２０６０ｇ１ＩＦ６０１４４４２ｍＬＣｕｌｔｕｒｅＴｕｂｅｓＢＢＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓｂａＢ－ＡｒＳａｓｅｉｏＡ０１０１ｇａ．１１．５ｍＬＭｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅＴｕｂｅ无锡耐思生物科技有限公司６１５００１－－－ｊＰ１２００ＬＹｅｌｌｏｗｉｅｔＴｉｓＡｘｅｎＴ２００Ｙ｜ｐｐｙｇ？ＥＰＰ－ａｓｙｕｒｅｌａｓｍｉｄＭｉｎｉＰｒｅｋｉｔ北京全式金生物技术有限公司ＥＭ１０１０２ｐＤＮＮ－ＦＤａｓｅ／ＲａｓｅｒｅｅｅｉｏｎｉｚｅｄＲＴ－天根生化科技（北京）有限公１２１０２Ｗａｔｅｒ无水乙醇四川西陇化工有限公司／？－ａｎｄＳｅｉＮＥＢＲ３１３３ＳｐｌＨＦＮｅｗＥｎｌＢｏｌａｂｓｇ（）ＣｌａＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ巳ｉｏｌａｂｓ（ＮＥ巳）Ｒ０１９７ＳＪ１３ 北京协和医学院硕士研宂生学位论文主要试剂盒试剂盒（２）货号？１〇ｘＣｕｔＳｍａｒｔＢｕｆｆｅｒＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＮＥＢＢ７２０４Ｓ（）ＴａＫａＲａＭＡｌｉｎ旧ＥＳＴｇａｒｏｓｅＧｅＴａＫａＲａ９７６２ＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ－ＰａｒａｆｉＰＭ９９６ｉｌｍＭＢｅｍｓ５〇ｘＴＡＥ北京索莱宝科技有限公司Ｔ１０６０ＥｔｈｉｄｉｕｍＢｒｏｍｉｄｅ（ＥＢ）北京索莱宝科技有限公司Ｅ８０６０６ｘＬｏａｄｉｎｂｕｆｆｅｒＴａＫａＲａＡ７１０１ＡｇＴｒａｎｓ－ｌ５ＫＤＮＡＭａｒｋｅｒ北京全式金生物技术有限公司ＢＭ１６１０１ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒＴａｋａＲａ３４２７Ａ，ＧｏＴａｑ？Ｇ２ＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘＰｒｏｍｅｇａＭ７１２３Ｔ４ＤＮＡＬｉａｓｅＮｅｗＥｎＢｉＮＥＢＭ０２０２Ｓｇｇｌａｎｄｏｌａｂｓ）（１〇ｘＢｕｆｆｅｒｆｏｒＴ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＮＥＢＢ０２０２Ｓ（）５ｘｌｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＥｎｚｙｍｅＰｒｅｍｉｘＴａＫａＲａ／ＣｌｏｎｔｅｃｈＳＴ０３４４２．２．３雛仪器主要实验仪器（１）型号－超净工作台苏州安泰空气技术有限公司ＳＷ－ＣＪ２Ｆ超低温冰箱ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ９０２海尔电冰箱青岛海尔股份有限公司６４９ＷＥ－３台式全温震荡器上海精宏实验设备有限公司ＴＱ２１２Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４３０ＲＥｐｐｅｎｄｏｒｆ５４２８ＶｏｒｔｅｘＭｉｘｅｒＬａｂｎｅｔＺ２０３０２７１？ＡｃｃｕＢｌｏｃｋＤｉｇｉｔａｌＤｒｙＢａｔｈＬａｂｎｅｔＤ１１００Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度计Ｔｈｅｒｍｏ２０００一电热恒温培养箱上海恒科学仪器有限公司ＤＨＰ－９４０２ＴｅｃａｎｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ｐｒｏＴｅｃａｎＭ２００ｐｒｏ核酸电泳槽ＬａｂｎｅｔＥ０１４５Ａ一电泳仪电源北京六生物科技有限公司ＤＹＹ－７Ｃ１４ 北京协和医学院硕士研究生学位论文主要实验仪器（２）型号＾一紫外仪北京六生物科技有限公司ＷＤ－９４０３ＤＰｏｗｅｒＳｈｏｔＧ１６ＣａｎｏｎＧ１６电子天平杭州友恒称重设备有限公司２０００２雪花制冰机常熟市雪科电器有限公司－ＩＭＳ２０？ＰＣＲ扩增仪ＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒｒｏＥｅｎｄｏｒｆ６３２５ｐｐｐＨ－ＳＩＧＨＰＲＥＳＳＵＲＥＴＥＡＭＴｏｍＤＢ－ｉｏＸｙｉｇｉｔａｌｌｏｇｙＳ７００ＳＴＥＲＩＬＩＺＥＲＭ－微波炉广东美的厨房电器制造有限公司１２３５Ａ分析天平ＳａｒｔｏｒｉｕｓＣｕｂｉｓ电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司ＤＫ－Ｓ２４Ｍ－ｉｎｉＳｈａｋｅｒ海门市其林贝尔仪器有限公司ＱＢ８００２实验室ＰＨ计ＭＥＴＴＬＥＲＴＯＬＥＤＯＦＥ２０２．２．４合成的引物、寡核苷酸和基因丨ｎｖｔｒ，包括：引物或寡核苷酸的合成：由上海ｉｏｇｅｎ生物技术有限公司完成Ｐ４２测序引物（＃１６６）、ＳＰ２８寡核苷酸（＃１７３和＃１７４）、ＳＰ５５寡核苷酸（＃１８５和＃１８６）、－－ＳＰ７０寡核苷酸（＃１８７和＃１８８）、无缝克隆引物（ＳＰ５５Ｆ的＃１９１、ＳＰ７０Ｆ的＃１９２－Ｒ＃和ＳＰ２８的１９３）。，基因合成：基于报道的中和抗原表位氨基酸序列根据原核表达对核苷酸序列－－，：７０的密码子偏好性进行优化后，由北京唯尚立德公司完成基因合成包括３口５５－－２８－、ＳＰ５０７０、ＳＰ５５２８和ＳＰ７０２８。合成的基因保存于质粒中。１５ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文２．３实验方法本论文中的重组质粒构建示意图如下：Ｌｏｏｐ２ｏｆＰｄｏｍａｉｎＳｐｅｆＣｌａｔＴＣＴ．ＡＣＴＡＧＴＡＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＴ．■ＴＡＡ．…．…．：……ＴＳｌ４ｌＤ……１５１１５２＾ＩＳＰ５５ｌ１ＳＰ７Ｑ＼ＳＰ１２８ＪＳＰ５５－７０［ＳＰ５５－２８，ｊＳＰ７０－２８ｉ｜－－ｌＳＰ５Ｓ７０２８｜图２．２Ｐ４２相关重组质粒的构建Ｆｉｉｒｅ２．２ＴｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＰ４２ｒｅｔｅｄｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｄｇｕｌａｒｅｐａｓｍ２．３．１质粒Ｐ４２的获取１、ｉ开启超净工作台，紫外消毒３０ｍｎ，然后开启风机，抽风３０ｍｉｎ；°°－２－Ｃ（）Ｃ、从８０冰箱中取出本实验室保存的含质粒Ｐ４２的甘油菌ＤＨ５ａ、从２０冰箱中取出氨苄青霉素钠溶液（１００ｍｇ／ｍＬ，配制见附录二），放入超净工作台；（在超净工作台中进行３、４操作）３、取无菌的１２ｍＬ培养管１支，向其内加入２ｍＬ己高压灭菌的２ＹＴ（配制见附，ｊ），混匀录二）培养基再加入２Ｌ解冻后的氨苄青霉素钠溶液（１００ｍ／ｍＬ；）ｇ４、用已高压灭菌的手动移液器吸头或牙签在含质粒Ｐ４２的甘油菌（ＤＨ５ａ）中蘸取少量菌液，将蘸有菌液的手动移液器吸头或牙签放入上步的２ｍＬ培，１养管中轻轻盖上培养管的盖子；°５、将培养管放入摇床中，设置参数：３７Ｃ、２２０ｒ／ｍｉｎ，过夜摇菌；（关闭超净工作台，将甘油菌及氨苄青霉素钠溶液放回原处。）（第二天）“？”６、按照ＥａｓｙＰｕｒｅＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉＰｒｅｐＫｉｔ使用说明小量提取质粒：１取过夜培养的含质粒Ｐ４２的菌液，用１个１．５ｍＬ离心管分两次分装菌液，）并离心：室温、１ｍｉ、１００００ｇｎ，尽量吸尽去除上清，保留菌体沉淀；２加入２５０ｊＬ无色溶液ＲＢ（ＲｅｓｕｓｅｎｓｉｏｎＢｕｆｅｒ，含ＲＮａｓｅＡ）游润），用｜ｐ震荡器震荡，悬浮菌体沉淀，不应留下小的菌块；－３加入２５０Ｌ蓝色溶液ＬＢ（ＬｓｉｓＢｕｆｅｒ），轻轻地上下翻转混合４６次，使）ｐｙ－３ｍ菌体充分裂解２ｉｎ，形成蓝色透亮溶液；１６ 北京协和医学院硕士研究生学位论文４Ｌ黄色溶液ＮＢ－加入３５０ｐ（ＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎＢｕｆｅｒ），轻轻混合５６次，直至）管内形成紧实的黄色块状物，约１ｍｉｎ，再室温静置２ｍｉｎ；５）离心：室温、１２０００ｇ、５ｍｉｎ，取上清加入到吸附柱中，尽量不要吸到沉淀；６离心：室温、１２０００、１ｍｉｎ，弃滤出液；）ｇ７）加入６５〇ｍＬ溶液ＷＢ（ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｅｒ，含１００％乙醇），离心：室温、１２０００ｇ、１ｍｉｎ，弃滤出液；８）离心：室温、１２０００ｇ、２ｍｉｎ，去除残留的ＷＢ；９一取１．５ｍＬ离心管个，将吸附柱置于１．５ｍＬ离心管中，在柱中央加入３〇Ｌ）ｍ＾－去离子水（ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅＦｒｅｅＤｅｉｏｎｉｚｅｄＷａｔｅｒ，下同６００预热）；，室温静置１ｍｉｎ；１０）离心：室温、１００００ｇ、１ｍｉｎ，滤出液中即含有质粒Ｐ４２。７、用Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００分光光度计测定所提取质粒Ｐ４２溶液的浓度和纯度，然后°－２０Ｃ将质粒保存于。２．３．２双酶切质粒Ｐ４２°？一－ｘ１、制作个冰盒，从２０Ｃ中取质粒Ｐ４２溶液、１〇ＣｕｔＳｍａｒｔＢｕｆｅｒ置于冰上，待解冻；°？－Ｃ中－２、从２０ｌＨＦ、Ｃ取出限制性核酸内切酶（ＳｐｅｌａＩ），在１．５ｍＬ离心管中建立如下双酶切体系：（注：加样时尽量先加大体积成分再加小体积成分；加入质粒ＤＮＡ总量为－１、Ｂｆｆｅｒ、２０尤保存。）ｐｇ；酶ｕ质粒样品用完后及时放－－组分名称加样体积１（ＭＬ）加样体积２（ＭＬ）质粒Ｐ４２Ｘ（ｕｐｔｏ１Ｘｕｔｏ１ｊｐｇ）（ｐ｜ｇ）？Ｓｅ－１ｐｌＨＦ．００．７５ＣｌａＩ１．００．７５？１〇ｘＣｕｔＳｍａｒｔＢｕｆｆｅｒ４．０３．０去离子水ｔｏ４０．０ｔｏ３０．０°３、将各组分加样完成后的１．５ｍＬ离心管放于３７Ｃ培养箱３ｈ，酶切；４、称取０．５ｇ琼脂糖加入到干净的２５０ｍＬ三角瓶中，再在三角瓶中倒入５０ｍＬｘ１ＴＡＥ溶液轻轻摇匀，然后将其放入微波炉中，加热至琼脂糖完全溶解，待其冷却至５０１左右时加入２ｐＬＥＢ，混匀，趁热倒入塑料胶槽中、插入梳齿待其凝固成型即为１％的琼脂糖凝胶；５、拔出梳齿出上样孔，露，去掉残余凝胶，放置完好的整块凝胶到电泳槽中，倒１７ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文入新的１ＷＡＥ缓冲液，使缓冲液完全没过上样孔；°６、从３７Ｃ中取出酶切完成的质粒Ｐ４２样品，加入８ｊＬ６ｘＬｏａｄｉｎＢｕｆｅｒ，混匀，｜ｇ将全部样品加入到电泳槽内琼脂糖凝胶的上样孔中一，在另上样孔中加入１５ＫＤＮＡＭａｒｋｅｒ２ｐＬ，然后进行电泳：１００Ｖ、４０ｍｉｎ；７一、电泳完成后，取１．５ｍＬ离心管个，称空重并记录，在紫外仪中观察电泳完成后的凝胶，用相机拍照并保存，然后用手术刀片准确、迅速地切下目的条带所在位置的胶块．５ｍＬ，，装入刚刚已称重的１离心管中再次称重并记录；“”８、用ＴａＫａＲａＭｉｎ旧ＥＳＴＡｇａｒｏｓｅＧｅｌＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ按以下步骤进行琼脂糖凝胶内ＤＮＡ的回收：通过＝１２次的称重记录，计算胶块的体积，以１ｍｇ１ｐＬ计算，向胶块中加）入胶块溶解液ＢｕｆｆｅｒＧＭ：，加入量按下表进行计算凝胶浓度ＢｕｆｅｒＧＭ使用量１．０％３个胶块体积量￣１．０％１％４个胶块体积量．５￣１．５％２．０％５个胶块体积量２，室温放置，间断震荡混合混合均匀后，使胶块充分溶解，约５ｍｉｎ＞；３安装试剂盒中的ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ到ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＴｕｂｅ上，将步骤２所得溶液））＾＇丨〇、１、１全部转移至安装好的３口１１£１７１１１中，离心：室温２００〇９｜１１１１１，弃掉滤出液；４）取７００｜ｊＬＢｕｆｅｒＷＢ加入ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中，离心：室温、１２０００ｇ、３０ｓ，弃掉滤出液一，再完成次此步操作；５）将ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ重新安置于新的１．５ｍＬ离心管上，在ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ膜的°中央加入３０ＪＬ去离子水（６０Ｃ预热），室温静置１ｍｉｎ；｜６离心：室温、１２０００ｇ、１ｍｉｎ，洗脱ＤＮＡ。）９、洗脱下来的溶液中即含双酶切后带粘性末端的质粒Ｐ４２，测其浓度和纯度后保°－２０Ｃ中存于。２．３．３目的基因的获取因本研究包括的目的基因片段较多一，获取的方式也不样。通过文献报道获得ＥＶ７１中和表位ＳＰ５５、ＳＰ７０、ＳＰ２８的氨基酸序列，由北京唯尚立德生物科技有限公司根据大肠杆菌密码子使用的偏好性设计其对应的核苷酸序列，用优化后的核苷酸序列进行引物及基因的合成。单表位（ＳＰ５５、ＳＰ７０、ＳＰ２８）两条核苷酸链分１８ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文别以引物合成的方式由上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生物技术有限公司合成。串联表位由单表位－－－－－组合构成，分别为：ＳＰ５５７０２８、ＳＰ５５７０、ＳＰ５５２８、ＳＰ７０２８，其中在各单表位之间加入了连接肽（ＧＧＧＧＳ）进行连接，这４个串联表位以基因合成的方式由北京唯尚立德生物科技有限公司合成。因单、串联表位序列均需要与双酶切（ＳｐｅＩ、Ｃ，ｌＰ４２重组、基因时在各单、双链的５和ｌａ）后的质粒连接，所以设计合成的引物＇３端分别加上了Ｓｐｅ丨、Ｃｌａ丨部分或全部酶切位点。合成的引物、基因通过下面的具体方式进行处理，以获得最终需要的目的基因片段。？退火（以获取ＳＰ２８双链为例）１、取＃１７３、＃１７４两管引物干粉，均按照说明书用去离子水稀释为２５０ｊＭ浓度，｜在ＰＣＲ管中建立如下退火体系：组分名称加样鵂（ｍｌ）引物＃１７３４终浓度为１００ｍｍ引物＃１７４４终浓度为１００ＭＭｘ１〇退火缓冲液１配制见附录二去离子水１°２、加样完成后，Ｃ干热器中将ＰＣＲ管内的溶液轻轻混匀，盖紧管盖，放置于９５，孵育２ｍｉｎ后关闭干热器电源，待其自然冷却至室温；３－、最后的退火产物ＳＰ２８的双链４尤或２０１保存。即为单表位目的基因，置于４、用（＃１８５、＃１８６）、（＃１８７、＃１８８）引物以同样的方式获分别取单表位目的基因ＳＰ５５、ＳＰ７０的双链。？双酶切以基因合成方式合成的串联表位均在北京唯尚立德生物科技有限公司的＇ＷＳＶ质粒载体中＇ｐ，串联表位的５和３端分别加上了Ｓｐｅ丨、Ｃｌａ丨全部酶切位点序“”２。列．３．２双酶切质粒Ｐ４２，通过双酶切获取串联表位的目的基因片段。方法参考？ｐｃＲｒ＾ｉ因质粒Ｐ４２双酶切后为粘性末端，ＰＣＲ扩增出来的基因片段为平端，要将扩增目的基因插入到质粒Ｐ４２中，则ＰＣＲ的引物需按照无缝克隆的引物设计原则来设计＇，即：通过在引物５端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增？０３一致的序列产物５＾最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全（１５ｂ？２０ｐｂｐ）。利用Ｐｒｉｍｅｒｐｒｅｍｉｅｒ５．０软件，根据无缝克隆引物设计要求设计无缝１９ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文－－（＃１９１、＃１９２、＃１９３）ＳＰ５５７０２８为克隆引物并合成，以获取串联表位目的基因例，方法如下：？一－＋ＳＰ－－１、制作个冰盒，从２０１取ＧｏＴａｑ酶、ｐＷＳＶ５５７０２８质粒置于冰上解冻；２、将引物＃１９１、＃１９３干粉用去离子水稀释为工作液浓度在ＰＣＲ管中建立如下ＰＣＲ反应体系：组分名称加样体积（ＭＬ）？ＧｏＴａＧ２ＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭ．５ｉｘ２Ｘ１２ｑ，引物＃１９１１．０引物＃１９３１．０－－２８－ＷＳＶ＋ＳＰ５５７０粒１．０５．０（＜２５０ｎｐ质ｇ）去离子水ｔｏ２５．０３、开启ＰＣＲ仪，将加样完成的ＰＣＲ管放入仪器中，设置ＰＣＲ的反应条件如下：°（退火温度通常为２条引物Ｔｍ值的平均值减去５Ｃ；延伸时间根据目的基因？长短而定，ＧｏＴａｑ酶延伸速度约为１０００ｂｐ／ｍｉｎ。）预变性９５尤２ｍｉｎ「°、变性９５Ｃ３０ｓ°退火６５Ｃ３０ｓｘ４０次、卜延伸７２ｔ：３０ｓ，＾°Ｃ１０ｍ最后延伸７２ｉｎ保存产物４１４、ＰＣＲ完成后，根据琼脂糖凝胶的线性ＤＮＡ分离范围（见附录二），配制２％的琼脂糖凝胶，将ＰＣＲ所得产物溶液直接全部上样进行电泳，并做琼脂糖凝胶“－－，７０２８。２．３内ＤＮＡ回收所得产物即为串联表位目的基因ＳＰ５５具体参考．２”“”中４－９相应方法双酶切质粒Ｐ４２。５、用（＃１９１、＃１９３）、（＃１９２、＃１９３）引物以同样的方式分别获取串联表位目的－２８－基因ＳＰ５５、ＳＰ７０２８。２．３．４目的基因的重组由于目的基因获取的方式不同，所以目的基因与Ｐ４２连接形成重组质粒的方式也不同，包括两种方式：Ｔ４酶连和无缝克隆。？Ｔ４酶连一－１、制作个冰盒，从２０ｔ：取双酶切后回收的质粒Ｐ４２、获取的目的基因、１０４４２０ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文ＤＮＡＬｉａｓｅＢｕｆｅｒ置于冰上解冻，取Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ置于冰上ｇ；２、在ＰＣＲ管中，建立Ｔ４酶连体系如下：组分名称加样体积（ｐＬ）双酶切后回收的质粒Ｐ４２Ｘ（ｔｏ５０ｊ）（ｇｔ获取的目的基因５．０（或ｏ５０ｊ）｜ｇｘ１〇Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅＢｕｆｆｅｒ２．０去离子水ｔｏ２０．０Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ（最后加）ｒ〇°°－３、将加样完成的ＰＣＲ管置于３７Ｃ培养箱中，孵育１ｈ，后置于２０Ｃ或冰上，即完成目的基因与双酶切后质粒Ｐ４２的Ｔ４酶连。參无缝克隆连接°一－１、制作个冰盒，从２０Ｃ取双酶切后回收的质粒Ｐ４２、获取的目的基因置于冰上ｘ－）解冻，取无缝克隆连接酶（５｜ｎＦｕｓｉｏｎＨＤＥｎｚｅＰｒｅｍｉｘ置于冰上ｙｍ；２、在ＰＣＲ管中，建立无缝克隆连接体系如下：组分名称加样体积（ＭＬ）－２００）双酶切后回收的质粒Ｐ４２Ｘ（ｔｏ５０ｎｇ－获取的目的基因Ｘ（ｔｏ５０２００ｎｇ）５ｘ｜ｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＥｎｚｙｍｅＰｒｅｍｉｘ２．０去离子水ｔｏ１０．０°３ＰＣＲ０Ｃ－、，１５ｍｉｎ２０１将加样完成的管置于５干热器中孵育，后置于或冰上，即完成目的基因与双酶切后质粒Ｐ４２的无缝克隆连接。２．３．５转化（ＤＨ５ａ）１、开启超净工作台（紫外消毒３０ｍｉｎ，后通风３０ｍｉｎ）；将干热器或水浴锅开启，°调至４２尤；将摇床调至３７尤、１４０ｒ／ｍｉｎ；从４Ｃ中取出含氨苄青霉素钠的ＬＢ培养皿（配制见附录二），置于超净工作台中，待用；°一２－８０、制作冰盒个，在Ｃ冰箱中取出ＤＨ５ａ感受态细胞，置于冰上解冻，解冻后心管分装５〇－．５ｍＬ离Ｌ，余下感受态细胞及时放回８０ｔ：冰箱中用１ｍ；３、取５ｐＬ目的基因与双酶切后质粒Ｐ４２的连接产物（Ｔ４酶连或无缝克隆连接），加入到５〇ＬＤＨ５ａ中，轻轻混匆，放入冰中冰置３０ｍｉｎ；Ｍ２１ 北京协和医学院硕士研究生学位论文°４、将冰置完成的产物放入４２Ｃ干热器或水浴锅中，热击９０ｓ，再冰置２ｍｉｎ；（进入超净工作台中完成第５）、７步５、取２０〇ｍＬＬＢ培养基配制见附录二加入到再冰置完成的产物中，然后将其放（）°入３７Ｃ、１４０ｒ／ｍｉｎ摇床中，摇动复苏３０ｍｉｎ；６、将上步得到的产物进行离心：３５００ｒ、ｉｎｐｍ室温、３ｍ；７、弃１００Ｌ上清１．５ｍＬ掉ｐ，将离心管内剩余成分轻轻吹打混匀；８、拆开培养皿，将吹打混匀的样品吸出，分散加入到培养皿中，向培养皿内倒入“”４－６颗灭菌的小玻璃珠，然后上下、左右呈十字晃动培养皿，均匀涂布样品；°９、做好标记，将涂好的培养皿倒置放入３７Ｃ培养箱中（培养箱中放适量水），过夜培养，第二天观察培养皿是否长出阳性菌落。２．３．６重组质粒的获取转化后第二天，如果培养皿长出阳性菌落，那么在很大程度上说明目的基因与双酶切后质粒Ｐ４２已成功连接，组成了重组质粒，可以进行重组质粒的获取；如果培养皿上没有长出阳性菌落，则需要分析具体原因并重复之前步骤。重组质粒的获取方法如下：°－１、开启超净工作台（紫外消毒３０ｍｉｎ，后通风３０ｍｉｎ），从２０Ｃ中取出氨苄青霉素钠溶液，放入超净工作台，室温下解冻；（在超净工作台中完成第２、３步）２、取２支１２ｍＬ培养管，各加入４ｍＬ２ＹＴ培养基，再加入４｜ｊＬ氨苄青霉素钠溶液，混匀；３一、在转化后长出阳性菌落的培养皿中用灭菌的牙签或手动移液吸头挑取２个单一的菌落，，然后将牙签或手动移液吸头放入上步的培养管中轻轻盖上培养管的盖子，用封口膜封住培养皿；°４、将培养皿放于４Ｃ保存，将培养管放入摇床中，设置参数：３７Ｃ、２２０ｒ／ｍｉｎ，过夜摇菌。（第二天）５、开启超净工作台（紫外消毒３０ｍｉｎ，后通风３０ｍｉｎ），从摇床中取出过夜培养的菌液．５ｍＬＬ菌液，在超净工作台中用高压灭菌的１离心管分装７５０ｐ，再加入２５０ｐＬ已高压灭菌的５０％甘油（配制见附录二），配制成甘油菌（ＤＨ５ａ），放－８０Ｔ：保存，另取５０〇ｍＬ菌液送公司进行测序（也可将后续提取的重组质粒做样本送测序）；“”６、剩余菌液按２．３．１质粒Ｐ４２的获取操作步骤提取、保存重组质粒。２２ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文２．．３７重组质粒的鉴定所有获取的重组质粒均以菌液或提取的质粒形式送昆明硕擎生物科技有限公司进行测序鉴定。２．８．３嵌合蛋白的空间结构预测基于各个嵌合蛋白的氨基酸序列，我们通过在线蛋白质空间结构预测工具ＳＷ－ＩＳＳＭＯＤＥＬｈｔｐ／／ｉｓｓｍｌｅｘ．ｏｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ（：ｓｗｏｄｅ．ｐａｓｙｇ／）对嵌合蛋白质的空间结构进行预测。２３ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文２．４实验结果２．４．１含Ｐ结构域载体质粒Ｐ４２的鉴定？（Ｓｅ－用限制性核酸内切酶ｐｌＨＦ、Ｃｌａｌ）对质粒Ｐ４２双酶切。１％琼脂糖凝胶－电泳结果显示，在５０００７５００ｂｐ可见有明显的条带（图２．３），与预期双酶切后质（约５９３０ｂｐ粒Ｐ４２长度）相符。ｂ＜ｐ）７１５００—５０００３０００１５００■１０００■５００■麵：＆图２．３质粒Ｐ４２酶切后凝胶电泳分析Ｆｉｇｕｒｅ２．３ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｉｇｅｓｔｅｄｐｌａｓｍｉｄＰ４２ｂｙｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，：１、酶切的质粒ＤＮＡ为１系为３０，１％琼脂糖凝胶，１００Ｖ、３０ｍｉｎ：注［ｊｇ，酶切体ｐＬ酶切样品全部电泳”“Ｍ２、代表ＤＮＡ分子量Ｍａｒｋｅｒ，下同。２．４．２酶切获取ＥＶ７１的中和表位基因片段？－用限制性核酸内切酶（ＳｐｅｌＨＦＣｌａｌ）对４个含串联表位目的基因的质粒进、－－行酶切，７０被切下，在１００。２％琼脂糖凝胶电泳结果显示只有目的基因片段ＳＰ５５２５０一ｂｐ出现与预期长度相致的条带，其３个质粒均未被酶切开（图２．４），疑似基因合成过程中，部分酶切位点上的碱基被甲基化或其它影响酶切的修饰。／／／／＾＾＾＃ｂｐ（）２０００—Ｆ２５０—Ｈ＇－０塗ＳＰ５５７０１０．图２．４串联表位目的基因的获取Ｆｉｇｕｒｅ２．４Ｔｈｅａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔａｎｄｅｍｅｐｉｔｏｐｅｓ，、。：酶切各质粒ＤＮＡ均为体系为３〇Ｌ全部电泳，２％琼脂糖凝胶１００Ｖ３０ｍｉｎ注１Ｍｇ，酶切ｍ，酶切样品２４ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文２．４．３ＰＣＲ扩增ＥＶ７１的中和表位基因片段因３个含串联表位目的基因的片段无法从双酶切获得，故我们设计了无缝克隆＋ＳＰ－－＋ＳＰ－引物，将它们从基因合成的质粒中（ＰＷＳＶ５５７０２８、ｐＷＳＶ５５２８、＋ＳＰ－）ＰＷＳＶ７０２８通过ＰＣＲ扩增的方式扩增出来。２％琼脂糖凝胶电泳结果显示，－（）扩增后在预期长度位置（１００２５０ｂｐ）出现了明显的目的条带图２．５。〇？＞〇％Ｍ，５００一Ｊ２５０，图２．５串联表位目的基因的获取Ｆｉｕｒｅ２．５Ｔｈｅａｃｕｉｓｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔａｒｅｔｅｎｅｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｔａｎｄｅｍｅｉｔｏｅｓｇｑｇｇｇｐｐ：ＰＣＲ体系：２５ＪＬ，循环：４０次，ＰＣＲ完成后样品全，２％琼脂糖凝胶，ｍｎ。注部电泳１００Ｖ、３０ｉ（２４４重组．．质粒测序验证，．１７我们总共构建了７个重组质粒见表２。测序结果提示ＥＶ１各单表位和串联表位都被正确地克隆到质粒Ｐ４２Ｐ结构域ｌｏｏｐ２的ＳｐｅＩ和ＣｌａＩ酶切位点之间，我们成功地构建了７个含诺如病毒Ｐ结构域和ＥＶ７１中和表位嵌合基因的重组质粒。测序峰图结果如下（图２．６）：表２．１构建的７个重组质粒Ｔａｂｌｅ２．１Ｔｈｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ７ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓ重组质Ｅ的片段目的蛋Ａ分子歎（ｋＤａ）日的片ｔａ衡ｗ来办源？｜目｜｜丨目的连接方式舶标签＋ＧＳＴ－ｔ名称（ｔａ／ＧＳＴａ大小（ｂｐ＞ｇｇ）？Ｐ４２Ｐ．ｄｏｍａｎｉｎ／ＮｏＶ９９３／ＧＳＴ６２．４卜３６３？Ｐ４２＋ＳＰ５５ＳＰ５５／ＥＶ７１４５Ｔ４＿连ＧＳＴ６３．．９卜３７６Ｐ４２＋ＳＰ７０ＧＳＴ？６４ＳＰ２８／ＥＶ７１４５Ｔ４酶迮．１卜３７．８Ｐ４２＋ＳＰ２８ＳＰ７０￣￣／ＥＶ７１３９Ｔ４＿连ＧＳＴ６３．６／３７．３－－Ｐ４２＋ＳＰ５５７０－２８ＳＰＳＰ７０ＳＰ９ＳＴ６９－５５２无缝克降Ｇ．０４２．８、、２８／ＥＶ７１１／？－－Ｐ４２＋ＳＰ５５７０ＳＰ５５６６．７／４０．４、ＳＰ７０／ＥＶ７１１３５Ｔ４酶连ＧＳＴ￣－＋－Ｐ４２ＳＰ５５７０ＳＰ５５．９．ＳＰ２８／ＥＶ７１１２９无缝克降ＧＳＴ６６．２／３９－－＋－Ｐ４２ＳＰ７０２８ＳＰ７０ＳＰ２８．／ＥＶ７１１２９无缝克降ＧＳＴ６６．４／４０２、２５ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文＇ＡＴＣＣ６＾ＣＧＴ？ＣＣＡＣＴＡ６ＧＧＣＧ＾ＴＣＴＣＴＧＧＣＴＴＧＧＣＧＣＶＡＣＡＴＴＡＴＣ６ＧＣＣＣＣＧＣＧＡＣａｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｌｉ０２００２１０２２０２３０２４０２５０ＣＣＣＴＡＧｔ＇＊ＡｔａＣＣＣＧＡＴＴＣＧＴＧＣＡＡＡ／ＡＧＧ＊ＣＴＧｔＧＡ｜ＣＣＧＣＣＧＣＧＭａＴＣＴＡＴｂｉｌｌｉｉｌｉｔｅｉｉｌｉｉＭｉｌｌｉ；〇：ｍｚａｎ：；２ｄｉｊＡ＇ＡＣＣＡＣＴＡＧＴ６ＧＴＡＣＣＧＧＣＡＣＣ６６ＸＴＣＴＣＣＣＣＧＣＣ６ＴＡＣＣＧＡＴＣＧＡＴＡ１１９０２００２１０２２０３３０－＇－＾．Ｔ－ａｒ＇＇－－ｒｒＳＴｉｒ＾ＸＸＶＣＴ／ＧＩＸＯＳ－ＯＸＧＴＧｉＣＣＧ？￡ＴｅＧ：．＆ａａ：＾ＵｃａＣＧＧｒＧＧｒＯＳＧＧ．ＧＣＧＥＧＧＣＧｅＧＯｒｃｅｒＣＧＧＧｒＧａｒＸ（５０ＴＣＧ６ＧＣ０３Ｇｒ；ＧＧＧＧＷａｎｓｅｒａＧＧＧＧＣＧＧｒａｒ＾ｃａＫ＾ＧＥａｒＸｌＣ＾ＯＭＳ：ＯＵＧＣｉｒｃｒｉＭＯＸＴＣＧＣ＆Ｏ，；纏‘ｋｉ咖＂＇＇＇？＇＇！ｉ＾？＊＊ＡＣＣＡＣＴ＊６ＣＧＧＧＣＣＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣ６ＣＧＣ：：：ＣＧＧＧＧＧＧＧＧ６６ＣＧ６ＧＧＣＧ６６ＧＣＣＧＧ６ＧＧＧＧＯＣＣ＾ＣＣＧＣＣＣ６ＧＧｌ：ＧＧ６Ｃ：ＧＧ：ＣＧｔＣＣＧＧ＾Ｃｓ＿＿＿Ｌ趣赢義１９０２００２１０２２０２３０２４０２Ｓ０２６０２７０２８０２９０３００３１０３２０３３０＇＇ｒ＾ＣＡＣＣＡＣＴＡＧ－＞＇ＣＧ「ＡＴＴＣＣＧＧＧＣＣ（ＴＧＣ；Ｃ：ＧＧＣＧＧＣ６ＧＧＣＣＣＣＧＧＧＩＧＧ：Ｇ：ＧＧＣＧＧＣ６ＧＴＧＧＣＣＧＧＴＧ６ＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＴＣＣＧ６ＣＡＣＣＧＣ；ＣｖＣＣＣＧＣＣＧＣＧＡ７ＡＣＣＣＣＧＧＧＧ－３２３３０３０２００２１０２２０２３０２１０２５０２６０２７０２８０２９０３００３１００４＊＇ＣＡＧＧＣ■ＧＧＧＧＧＧＧ＇＇＇ａＡＣ（：ＣＧＧ：ＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧ：ＧＧＣＧＧＱＣＣＧＧｆＧＧ；ＣＣ６Ｇ：ＧＣＧＣ６ＣＧＡａＡ：ＧｃＣＣｉｉＭ２１？３２００２００２９０３００？０３２０３３０２０００２２００２４０５２６７２０１图２．６重组质粒测序峰图Ｆ．ｔｔｔｌｉ．ｉｇｕｒｅ２６Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｃｈｏｍａｏｇｒａｍｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｐａｓｍｄｓ＋＋（ａ．Ｐ４２ＳＰ５５ｂ．Ｐ４２＋ＳＰ７０．），ｃＰ４２ＳＰ２８，－ｄ－－＋ＳＰ－＋ＳＰ５５－＋ＳＰ７０．Ｐ４２＋ＳＰ５５７０２８ｅ．Ｐ４２５５７０ｆ．Ｐ４２２８．Ｐ４２２８（，，，ｇ）注，、、。：测序引物为＃１６６阴影部分为测序所显示的单表位（ａ、ｂ、ｃ）和串联表位（ｄ、ｅｆｇ）的核苷酸序列２６ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文２．４．５嵌合蛋白的空间结构预测－运用在线蛋白质空间结构预测工具ＳＷ，ＩＳＳＭＯＤＥＬ我们对设计构建的７个嵌合蛋白的空间结构进行了预测，（．７）结果显示图２，无论是单表位还是串联表位（虚线标识的红色部分），它们都能凸出展示在Ｐｄｉｍｅｒ（蓝色部分）的表面。Ｐｄｍｅｒ＋ＳＰ２８Ｐ＋ＳＰ５５Ｐｄｉｄｉｍｅ＋ＳＰ７０ｐｄｉｍｅｒｒｉｍｅｒｉｉ§ｐ＋－－－＋－Ｐ７０＋ＳＰ５５－７０２８ＰｄＰｄｉｍｅｒｉｍｅｒ＋ＳＰ５５７０Ｐｄ２８ｄｉｍｅｒＳＰ２８ｉｍｅｒＳＰ５５图２．７ＥＶ７１各表位和诺如病毒Ｐ结构域嵌合蛋白的空间结构模型Ｆｉｕｒｅ２．７ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｍｏｄｅｌｓｏｆｃｈｉｍｅｒｉｃｒｏｔｅｉｎｓｏｆＥＶ７１ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｐｇｅｐｉｔｏｐｅｓａｎｄｎｏｒｏｖｉｒｕｓＰｄｏｍａｉｎ．注－－：虚线标识为ＥＶ７１的各表位。片状结构为ｐ折叠片，螺旋形结构为ａ螺旋，线状结构为无规则卷。２．５本章小结一本章的主要内容是进行嵌合蛋白的分子设计和重组质粒构建，为下步的蛋白表达和纯化工作奠定基础。在实验方法上，运用到了许多分子克隆的基本技术，包括酶切，我们成功地将各个目的基因片段克、ＰＣＲ、酶连、转化等。测序结果表明隆到了质粒Ｐ４２的预期位置，总共构建了７个重组质粒。嵌合蛋白的空间结构预测表明，我们构建的嵌合蛋白中，ＥＶ７１的各个单表位及串联表位均能凸出地展示在诺如病毒Ｐ结构域的表面。２７ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文第３章嵌合蛋白的表达和纯化３．１引言基因表达系统主要包括了原核表达系统和真核表达系统，它们都有各自的优缺点，。原核表达系统是最早使用、最成熟的表达系统本研宄采用的是原核表达系统中最常用的大肠杆菌表达系统，该系统具有外源基因表达产物水平高、细菌生长速度快，ＤＥ３。ＢＬ２１ＤＥ３、操作简便等优点常用的表达菌株为ＢＬ２１是Ｌｏｎ蛋白水（）（）解酶、ｏｍＰＴ外膜蛋白水解酶缺陷型的菌株，因此，外源蛋白在该菌株中表达具有更局的稳定性。对转入了重组质粒的ＢＬ２１（ＤＥ３）进行培养，然后加入ＩＰＴＧ进行诱导，菌体内的表达质粒便可以表达出目的蛋白，。用超声波或者溶菌酶破碎菌体就可以使目的蛋白从菌体内部释放出来。破碎后的菌体通过离心会分离出上清和沉淀，如果目的，那么表示蛋白可溶性好，蛋白纯化相对比较高效，可蛋白存在于上清中、简便以，，无需复性利用亲和磁珠、亲和纯化柱等进行纯化纯化出的蛋白保持原有的状态；一如果目的蛋白以包涵体形式存在于沉淀中，般需要通过高浓度的尿素或盐酸胍等进行变性处理、纯化，然后再复性，纯化的方式较为繁琐、复杂，所以从上清中获得目的蛋白的方法最实用。用少量纯化的目的蛋白进行免疫印迹分析，可以初步鉴定出目的蛋白的免疫原性，对后续大量纯化目的蛋白具有指导意义。ＧＳＴ标签蛋白的纯化前期需要用亲和的方式获取含标签的嵌合蛋白，后期需要用Ｔｈｒｏｍｂｉｎ除去ＧＳＴ标签，然后还需要除去溶液中Ｔｈｒｏｍｂｉｎ，这样才能得到纯度高的不含标签的目的嵌合蛋白。在本章中，我们首先对前期所构建的７个嵌合蛋白进行诱导表达，发现表达后的７个嵌合蛋白均以部分可溶的形式存在于超声波破碎菌体后的上清中。然后，通＋ＳＰ５５－－过大量亲和纯化的方式，我们获得了诺如病毒Ｐ结构域蛋白和Ｐｍ７０２８嵌合蛋白，这两个蛋白都能自发形成直径约２０ｎｍ的颗粒。本章的工作为后期的动物免疫研宄奠定了基础。３．２实验材料３．２．１质粒和感受态细胞’原核表达质粒Ｐ４２来自于美国辛辛那提儿童医学中心（ＣｉｎｃｔｌｒｉｎｎａｉＣｈｉｄｅｎｓＨｏｓｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ），由本实验室保存；＋３「＋３？＋３？２８＋３？５５－经测序验证后的重组质粒卩４２５５、？４２７０、卩４２、？４２－－－＋ＳＰ５５－７０２８、Ｐ４２＋ＳＰ５５７０、Ｐ４２２８、Ｐ４２＋ＳＰ７０２８由本实验室构建和保存。￡．ｃｏ／／ＢＬ２１ＤＥ３感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。（）２８ 北京协和医学院硕士研究生学位论文３．２．２剂和试剂盒主要试剂和试剂盒（１）ｍｍ货号氨苄青霉素钠上海翊圣生物科技有限公司６０２０３ＥＳ１０ＴｒｙｐｔｏｎｅＯｘｏｉｄＬＰ００４２ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔＯｘｏｉｄＬＰ００２１氯化钠四川西陇化工有限公司／ＴＧ－ｔＩＰＳｅｒｉｌｅ天根生化科技（北京）有限公司ＲＴ１０８０１（）ＰＢＳＴａｂｌｅｔｓＡＭＲＥＳＣＯＥ４０４Ｐｈｅｎ－－ｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＰ７６２６２５ＧＳｏｄｍＤｏｄｅｃＳｕ－ｌｆａＳＤＳ１ｉｕｙｌｔｅ（）ＡＭＲＥＳＣＯ０２２７００ＧＡｍｍｏｎｉｕｍＰｅｒｓｕｌｆａｔｅＡＰＳＳｏｌａｒｂｉｏＡ８０９０（）ＴＲ－ＩＳＡＭＲＥＳＣＯ０４９７５００ＧＧ－ｌｙｃｉｎｅＡＭＲＥＳＣＯ０１６７１ＫＧＳ－Ａｃｒｌａｍｉｄｅ４０％ｓｏｔｉＡｌｄｉｌｕｉｏｎａｒｃｈＶ９００８４８ｙ，ｇｍＴＥＭＥＤＡＭＲＥＳＣＯ０７６－２５ＭＬ１Ａ－ｌｂｕｍｉｎＢｏｖｉｎｅＶＢｉｏｓｈａｒｐＡ３９１２脱脂奶粉完达山乳业股份有限公司／？ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＰｉｃｏＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ３４０７７ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＳｕｂｓｔｒａｔｅ－２ＭｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌＡＭＲＥＳＣＯ０４８２ＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌＢｌｕｅＡＭＲＥＳＣＯ０４４９ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ２６６１６ｃｏｍｌｅｔｅＵＬＴＲＡｔｐＴａｂｌｅｓＲｏｃｈｅ０５８９２９７０００１？ＴＷＥＥＮ２０ＡＭＲＥＳＣＯ０７７７－１Ｌ？Ｔ－－ｒｉｔｏｎＸ１００ＳＡｌｄｒｉｃｈＶ９００５０２ｉｇｍａ－－－ＤＬＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴＳｉａＡｌｄｒｉｃｈ４３８１６１０ＭＬ）ｇｍＥＤＴＡＡＭＲＥＳＣＯ０－１０５１ＫＧＬｅＳｍａ－－－ｙｓｏｚｙｍｉｇＡｌｄｒｉｃｈ６２９７１１０ＧＦ？－－ＢｅｎｚｏｎａｓｅＮｕｃｌｅａｓｅＳＡｌｄｒｉｃｈＥ０１４ｉｇｍａ１２５ＫＵ２９ 北京协和医学院硕士研究生学位论文主要试剂和试剂盒（２）货号盐酸胍国药集团化学试剂有限公司３００９５５１６乙酸（冰醋酸）四川西陇化工有限公司／盐酸重庆川东化工集团有限公司／（）Ｔｈｒｏｍｂ－－ｉｎＧＥ２７０８４６０１Ｔｈｒｏｍｂｉｎ上海翊圣生物科技有限公司２０４０２ＥＳ０３－ＮａＨＣＯｓＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＶ９００１８２－ｒ－ＮａＨＰ０Ｓｉ２４ｉｇｍａＡｌｄｃｈ２０９０８Ａ７Ｐ０ｍａ－ＮａＨ２４ＳｉｇＡｌｄｒｉｃｈＳ８２８２考马斯亮蓝染色液南京金斯瑞生物科技有限公司Ｌ００６８７Ｒ考马斯亮蓝脱色液南京金斯瑞生物科技有限公司Ｌ００６８７Ｒ甲醇四川西陇化工有限公司／异丙醇四川西陇化工有限公司／ＧＳＴＲａｂｂｉｔｍＡｂＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＃２６２５Ａｎ－－ｔｉｍｏｕｓｅＩＧＨＲＰｌｉｎｋｅｄｇ，ＣｅｌｌＳｌｉｅｃｈｎｏ７０７６ｉｇｎａｎｇＴｌｏｇｙ＃Ａｎｔｂｏｄｉｙ－－ＡｎｔｉｒａｂｂｉｔＩＧＨＲＰｌｉｎｋｅｄｇ，ＣｅｉｎａＴｅｃｈｌ７０７４ｌｌＳｇｌｉｎｇｎｏｏｇｙ＃Ａｎｔｉｂｏｄｙ抗ＥＶ７１兔血清医学生物学研究所ＩＢｒａｄｆｏｒｄ蛋白浓度测定试剂盒生工生物工程股份有限公司Ｐ０００６３．２．３实验仪器主要实验仪器（１）型号？ＧＳＴａＦＦ５ｍＬＧＥ－－ｐ１７５１３００１（）－－ＨｉｉＴｒａ巳ｅｚａｍｄｉｎｅＦＦ１ｍＬＧＥ１７５１４３０１ｐ（）？Ｂｅａｖｅ－ｒＢｅａｄｓＧＳＨ海狸纳米科技苏州）有限公司７０６０１５（紫外检测仪上海琪特分析仪器有限公司ＱＴ９８液相色谱数据工作站上海琪特分析仪器有限公司ＱＴ２０００３０ 北京协和医学院硕士研究生学位论文主要实验仪器（２）型号ＢＴ－蠕动泵兰格恒流栗有限公司１００２Ｊ超净工作台苏州安泰空气技术有限公司ＳＷ－ＣＪ－２Ｆ超低温冰箱ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ９０２海尔电冰箱青岛海尔股份有限公司６４９ＷＥ振荡培养箱上海旻泉仪器有限公司ＭＱＤ－Ａ３ＲＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５８１ＯＲＥｐｐｅｎｄｏｒｆ５８１ＯＲ？－ＡｍｉｃｏｎＵｔｒ１Ｃｅｎｔｒｉｆｕａｌｌａ５ｇＭｉｌｌｉｏｒｅＵＦＣ９０３００８ｐＦｉｔｒＤｉｌｅｅｖｃｅｓ？Ａｍ－ｉｃｏｎＵｒａｔｕｔｌｔ４ＣｅｎｒｉｆｇａｌＦｉｌｅｒＭｉｉｒｌｌｐｏｅＵＦＣ８０３００８Ｄｅｖｉｃｅｓ－ＭｉｎｉＳｈａｋｅｒ海门市其林贝尔仪器有限公司ＱＢ８００２实验室ＰＨ计ＭＥＴＴＬＥＲＴＯＬＥＤＯＦＥ２０－台式全温震荡器上海精宏实验设备有限公司ＴＱ２３１２一电热恒温培养箱上海恒科学仪器有限公司ＤＨＰ－９４０２分析天平ＳａｒｔｏｒｉｕｓＣｕｂｉｓ－超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技有限公司ＪＹ９２ＩＩＤＮ电动吸引器上海祁鑫医疗器械厂ＹＸ９２０Ｓ四维旋转混合仪海门市其林贝尔仪器有限公司ＢＥ－１１００ＴｅｃａｉｉＭ２００ｃａｎＭ２００ｎｉｎｆｎｔｅｐｒｏＴｅｐｒｏ－ＨｏｔＰｌａｔｅＳｔｒｉｒｒｅｒＬａｂｎｅｔＰＣ４２０ＤＣｈｅｍ－ｉＤｏｃＭＰＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍＢｉｏＲａｄ１７０２８２０？ＸＬｏｃｋＭ－ＣｅｉｎｉｌｌＳｕｒｅＣｅｌｌＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＥＩ０００１ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ？？－－－ＢｉＲａ１ｉｏＲａｄＴｒａｎｓＢｌｏｔＴｕｒｂｏＳｙｓｔｅｍＢｏｄ７０４１５０－－－ＭＢｉ１ｉｎｉＰＲＯＴＥＡＮ？ＴｅｔｒａｏＲａｄ１６５８００ＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎＥｌｅｃｔｒｏｎＨＴＡＣＨＩＩＨＴ７７００Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ３１ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文３．３麴摊３．３．１转化（ＢＬ２１ＤＥ３）（）？转化一（第天）１、，）开启超净工作台（紫外消毒３０ｍｉｎ后通风３０ｍｉｎ；将干热器或水浴锅开启，°°调至４２Ｃ；从４Ｃ中取出含氨苄青霉素钠的ＬＢ培养皿，置于超净工作台中，待用；°一－２、制作冰盒，个，从８０Ｃ冰箱取出ＢＬ２１ＤＥ３感受态细胞置于冰上解冻，解（）下感受态细胞及时放回－冻后用１．５ｍＬ离心管分装３〇Ｌ８０ｔ：冰箱中ｍ，余；３、取３ｊＬ，测序验证后的重组质粒溶液，加入到３〇ｍＬＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞中｜轻轻混勾，ｉｎ再放入冰中冰置３０ｍ；４、将冰置完成的产物放入４２ｔ干热器或水浴锅中，热击９０ｓ，然后再次放于冰中，冰置２ｍｉｎ；（进入超净工作台中完成第５、７、８步）°５、取２００｜ＪＬＬＢ培养基加入到再冰置完成的产物中，然后将其放入３７Ｃ、１４０ｒ／ｍｉｎ摇床中ｉ，摇动复苏３０ｍｎ；６、将第５步得到的产物进行离心：３５００ｒｐｍ、室温、３ｍｉｎ；７、弃掉１０〇ｍＬ上清，将１．５ｍＬ离心管内剩余成分轻轻吹打混匀；８、拆开ＬＢ培养皿，将吹打混匀的样品全部吸出，分散加入到培养皿中，再向培皿内４－６颗高压灭菌的小玻璃珠，养倒入，然后盖上培养皿，用手按住培养皿“”字样晃动呈上下、左右十，均匀涂布加入的样品；９、做好相应标记，将涂好的培养皿倒置放入３７１培养箱中（培养箱中放适量水）过夜培养，第二天观察培养皿是否长出阳性菌落。？菌种保存（第二天）如果培养皿中没有长出菌落，则需要分析具体原因，重新进行转化；如果培养皿中长出了阳性菌落，则可以挑取阳性菌落进行细菌培养和菌种保存，具体方法如下：（－１、紫外消毒３０ｍｉ２０１中开启超净工作台ｉｎ，后通风３０ｍｎ），从取出氨苄青霉）素钠溶液（１００ｍｇ／ｍＬ，放入超净工作台中，室温下解冻；（在超净工作台中完成第２、３步）２、取１支１２ｍＬ培养管（无菌），加入２ｍＬＬＢ培养基，再加入２Ｌ解冻的氨苄Ｍ３２ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文青霉素钠溶液（１００ｍｇ／ｍＬ），混匀；３、在转化后长出阳性菌落的培养皿中用灭菌的牙签或手动移液器吸头挑取１个菌一落，然后将牙签或手动移液器吸头放入上步的培养管中，轻轻盖上培养管的盖子；４、将培养管放入摇床中，设置参数：３７１、２２０ｒ／ｍｉｎ，过夜摇菌；°５、将用完的培养皿用封口膜（ＰａｒａｆｉｌｍＭ）封住，放于４Ｃ保存。（第三天）６、开启超净工作台（紫外消毒３０ｍｉｎ，后通风３０ｍｉｎ），从摇床中取出过夜培养的＝菌液：１：３．５ｍＬ，在超净工作台中用按菌液甘油（５０％）的比例将所有菌液用１离心管都分装，即１５〇ｍＬ菌液，再各加入５〇ｍＬ已高压灭菌的５０％甘油，配制－成２０〇ｍＬ／管的甘油菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）），放８ＣＴＣ冰箱保存，使用过的培养管倒入８４消毒液或７０％酒精进行消毒处理。３．２蛋白表达．３，获得阳性菌落的细菌菌种后先用菌种培养小量的菌液分析是否通过ＩＰＴＧ诱导能有目的蛋白的表达，再进行后续的大量表达和纯化蛋白。本研宄小量蛋白的表达为２ｍＬ，参考大量蛋白的表达方法，缩小体积即可，大量蛋白的表达的方法如下：一（、）第天：配制培养基预摇菌１、配制培养基：１取１０个１Ｌ三角瓶和１个２５０ｍＬ三角瓶，用蒸馏水洗净，并高压灭菌，）干燥后用于配制ＬＢ培养基；２１Ｌ三角瓶每瓶配制２００ｍＬＬＢ培养基，２５０ｍＬ三角瓶配制５０ｍＬＬＢ培养）一基，瓶口用两层纱布加层牛皮纸盖住，并用橡皮筋缠住，然后将培养基髙压灭菌（１２Ｈ、２０ｍｉｎ）后备用。２、预摇菌：－１）开启超净工作台（紫外消毒３０ｍｉｎ，后通风３０ｍｉｎ），从２０ｔ：中取出氨苄青霉素钠溶液（１００ｍｇ／ｍＬ），放入超净工作台，室温下解冻；２在己高压灭菌并冷却至室温的５０ｍＬＬＢ培养基中（２５０ｍＬ三角瓶）加入）°Ｌ氨－５０ｐ苄青霉素钠溶液（１００ｍｇ／ｍＬ），混匀，取１管（２００ｊＬ）８０Ｃ冰｜箱保存的重组质粒甘油菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）），解冻后全部加入到５０ｍＬＬＢ培，轻轻摇匀养基中；３将２５０ｍＬ三角瓶放入摇床中，设置参数：３７七、２２０ｒ／ｍｉｎ，过夜摇菌。）（第二天：转接、诱导）３３ 北京协和医学院硕士研究生学位论文３、转接：一１取第天已高压灭菌后的１０瓶ＬＢ培养基（１Ｌ三角瓶），每瓶加入２００ｊＬ）｜氨苄青霉素钠溶液（１００ｍｇ／ｍＬ），混匀；２）用电动移液器和灭菌的吸管吸取过夜预摇的菌液分装到１）中配好的１０瓶ＬＢ培养基中，分装量为５ｍＬ／瓶；３）分装完成后，瓶口只留２层纱布，并用橡皮筋缠住纱布，然后将三角瓶放°入摇床中，设置参数：３７Ｃ、２２０ｒ／ｍｉｎ，摇菌。４、诱导：一－１摇菌约６ｈ后，开启酶标仪，准备９６孔板个，随机从３５瓶的２００ｍＬ）菌液中取出３００ｐＬ加入到９６孔板中，１０〇ｍＬ／孔，即每个取样瓶菌液有３个复孔，加入时尽量不要产生气泡，用酶标仪检测加样各孔中菌液的ＯＤ６００值，取各复孔的平均值即为对应瓶中菌液的ＯＤ６Ｃ０值；一－０２值平均值达０．４５．５左右时）当各取样瓶中菌液的ＯＤ６〇〇，随机从瓶中取出１ｍＬ菌液到１．５ｍＬ离心管中，待用，然后向各瓶中加入４８〇ｍＬＩＰＴＧＧ终溶液（ＩＰＴ浓度为０．５ｍＭ），调整摇床参数为：２２Ｘ：、２２０ｒ／ｍｉｎ，过夜摇菌，诱导目的蛋白表达；３）将取出的１ｍＬ菌液离心：１２０００ｇ、室温、５ｍｉｎ，吸尽上清并弃掉，菌体°－Ｃ沉淀８０冰箱保存，该菌体用作未诱导蛋白表达的阴性对照。（第三天：制样、收菌体、考染分析）５、制样：°－Ｃｘ１）从２０冰箱中取出６ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｅｒ（配制见附录二），室温下解冻；从°－８０Ｃ冰箱冰箱中取出第二，室温下解冻天保存的阴性对照菌体沉淀；开启°干热器或水浴锅，温度调至１００Ｃ；－２从每瓶过夜（１６１８ｈ）摇菌的菌液中取出１ｍＬ菌液到１．５ｍＬ离心管中，）做好对应标识，并离心：１２０００、室温、５ｍｉｎｇ，吸尽上清，保留菌体沉淀；３将所有获得的菌体沉淀（１１管）用１００ＬＰＢＳ重新悬浮（配制见附录二），）Ｍ＞＜，ｊＬＬｏａｄ不应留有小块菌体完全解冻的６ｉｎＢｕｆｅｒ，震荡３０ｓ再加入２０，｜ｇ混勾；°４）用微型离心机将所有管内的液体离心至管底，然后全部置于１００Ｃ干热器一ｉｎ（１ｍｉｎ后开启管盖次或水裕锅中，煮沸１〇ｍ，再盖住，以此来避免管盖崩开）；５）煮沸完成后，取出各管，室温冷却约２ｍｉｎ后离心：１２０００ｇ、室温、３ｍｉｎ，完成制样。３４ 北京协和医学院硕士研究生学位论文６、收菌体：１用５０ｍＬ离心管分瓶、分次分装剩余的过夜摇菌的菌液，每次分装后进行）离心：１２０００ｇ、４ｔ：、１０ｍｉｎ，倒掉上清，保留菌体沉淀，即最后每管中含有２００ｍＬ菌液所得菌体；２菌液分瓶、分次离心完成后，用２０ｍＬＰＢＳ重悬每个５０ｍＬ离心管中获得）－、、的菌体，再次离心：１２０００ｇ４１１０ｍｉｎ，倒掉上清，菌体沉淀保存于８ＣＴＣ冰箱中或立即使用，完成收菌体；３每个使用过的三角瓶用８４消毒液浸泡后，再用蒸馏水清洗干净，以便下）次继续使用。７－、ＳＤＳＰＡＧＥ和考染分析：一配胶－ＰＡＧＥ＋１：配制１０孔、１．０ｍｍ厚的ＳＤＳ凝胶块（８％分离胶５％浓）缩胶，配胶方法见附录二）；２上样，ＬＭａｋｅＭｔ：安装好蛋白电泳装置按顺序在凝胶的上样孔中加入Ｓｐｒｒ）‘”存放一），然后取制样制得的样品各５ｍＬ依次加入到凝胶的下个上样孔°－中，上样完成后的样品放８０Ｃ冰箱中保存；３电泳：将电泳装置接通电源进行电泳，先８０Ｖ，３０ｍｉｎ，再１５０Ｖ，６０ｍｉｎ，）ｘ直至凝胶中６Ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｅｒ所带入的溴酚蓝线条不可见；４考马斯亮蓝染色分析（考染分析）：电泳完成后取出凝胶块，切掉浓缩胶的）部分，，保留分离胶并将分离胶放入考马斯亮蓝染色液（考染液）中进行－，间断用微波炉加热进行快速染色２ｈ，染色，约１后回收考染液换脱色液２－３ｈ后回对分离胶胶块进行脱色，间断用微波炉加热进行快速脱色，约收脱色液，然后在紫外仪中用相机对分离胶胶块成像，观察是否有预期分子量大小的目的蛋白条带出现。３，３．３破碎菌体破碎菌体可使用超声波或溶菌酶。小量菌体的超声波破碎用于鉴定目的蛋白是存在于菌体破碎后离心所得的上清还是沉淀中，大量菌体的超声波破碎及溶菌酶的裂解用于纯化前粗蛋白样品的制备：，具体方法如下？小童菌体的超声波破碎１、取蛋白表达时未诱导、诱导的各１ｍＬ菌液离心（１２０００ｇ、室温、５ｍｉｎ）所得的菌体沉淀，用１〇〇ＬＰＢＳ重新悬浮菌体沉淀并加入１ＪＬ蛋白酶抑制剂ＰＭＳＦｐ｜（１００ｍＭ，配制见附录二），在冰浴下对重悬菌体进行超声处理，超声波细胞粉碎机设置参数为：＃３变幅杆，１５％功率，工作２ｓ，间歇２ｓ，超声１０ｍｉｎ；３５ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文２、超声处理完成后肉眼可见菌体悬液较超声处理前变清亮，对悬液进行离心：１２０００ｇ、４尤或室温、５ｍｉｎ；收集离心后的上清１００ｊＬ，加入２０ｊＬ６ｘＬｏａｄｉｎ｜（ｇＢｕｆｅｒ，混匀，离心后所得的沉淀用１００ｐＬＰＢＳ重悬，加入２〇Ｌ６ｘＬｏａｄｉｎＭｇＢｕｆｅｒ，混匀，即制成超声后上清、沉淀２个样品；３、将上步所得２个样品进行考染分析。？灶菌体的超声波破碎“”１、用３．３．２蛋白表达的方法收获菌体；°２－、取２００ｍＬ菌液所得的菌体（经考染分析存在目的蛋白表达８０Ｃ；冰箱取出时需要解冻１５ｍｉｎ左右），用２０ｍＬＰＢＳ重新悬浮，不应留有小块菌体，并加入２００ｐＬ蛋白酶抑制剂ＰＭＳＦ（１００ｍＭ），在冰浴下对重悬菌体进行超声处理，超声波细胞粉碎机设置参数为：＃６变幅杆，，３０％功率，工作２ｓ间歇２ｓ，超声３０ｍｉｎ；３、超声处理完成后肉眼可，见菌体悬液较超声处理前变清亮对悬液进行离心：１８０００ｇ、４ｔ：、３０ｍｉｎ，保留上清，该上清即是纯化前粗蛋白样品。？溶菌酶破碎菌体”“１、用３．．３２蛋白表达的方法收获菌体；°２－、从８０Ｃ２００ｍＬ菌液所得的菌体（经考染分析存在目的蛋白表达冰箱中取出；－８０＾冰箱中放，室温下解冻１５ｍ收获菌体至少在ｉｎ）ｉｎ左右置３０ｍ；３－、按照１００ｍＬ菌液所得菌体加入１０ｍＬＰＢＳＬ（含溶菌酶，配制见附录二）的比例加入ＰＢＳ－Ｌ并进行菌体重新悬浮；４、将含重悬后菌体的５０ｍＬ离心管固定在旋转混合仪上，室温下，旋转混合３０ｍｉｎ，使菌体得以充分破碎；°５、将菌体破碎完成后的悬液进行离心：１８０００ｇ、４Ｃ、３０ｍｉｎ，保留上清，该上清即是纯化前粗蛋白样品。？３．３．４ＢｅａｖｅｒＢｅａｄｓＧＳＨ磁麟化蛋白先用磁珠小量纯化粗蛋白样品中的目的蛋白，为后续的蛋白纯化提供参考，具体方法如下：１、缓冲液：１）ＢｕｆｆｅｒＡ（Ｂｉｎｄｉｎｇｕｆｆｅｒ）：ＰＢＳ，７．４ＢｐＨ－２ＢｕｆｆｅｒＢ（ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｅｒ）：５０ｍＭＴｒｉｓＨＣＩ，２０ｍＭ还原型谷胱甘肽，ｐＨ８．０）（现配现用，放置于冰上或室温）３Ｂｕｆ－ｆｅｒＣ：０．１ＭＴｒｉｓＨＣＩ０．５ＭＮａＣＩＨ８．５，，ｐ）３６ 北京协和医学院硕士研究生学位论文４ＢｕｆｆｅｒＤ，：０．１ＭＣＨ３ＣＯＯＮａ０．５ＭＮａＣＩ，．５）ｐＨ４“２、粗蛋白样品制备：收集１００ｍＬ含目的蛋白表达的菌液所得菌体，按照大量菌”体的超声波破碎方法分离出１〇ｍＬ超声后上清液，并用０．４５ｊｍ滤膜过滤，所｜得滤液即为粗蛋白样品；３、磁珠预处理：１）取３ｍＬ磁珠悬液于１５ｍＬ离心管中，再将其置于磁性分离器上，待溶液变澄清后，移去磁珠保存液；２）加入１０ｍＬＢｕｆｅｒＡ到上述装有磁珠的离心管中，盖紧盖子，漩涡震荡１５ｓ，使磁珠重新悬浮，，，再将离心管置于磁性分离器上磁性分离移去上清液；重复此步骤２次；４、目的蛋白与磁珠结合：１将粗蛋白样品，盖紧离心管盖，）１〇ｍＬ加入到装有预处理磁珠的离心管中将离心管置于漩涡震荡器上震荡１５ｓ，然后置于旋转混合仪上，室温旋转混合３０ｍｉｎ；２）将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，移出上清液，从磁性分离器上取下离心管进行后续洗涤步骤。５、磁珠洗涤：１）加入１０ｍＬＢｕｆｅｒＡ到装有磁珠的离心管，旋转混合２ｍｉｎ，磁性分离，移去清洗液；２加入，Ｊ１０ｍＬＢｕｆｅｒＡ到装有磁珠的离心管中使磁珠重新悬浮将磁珠悬液转移至新的离心管，避免原离心管壁管壁上非特异性吸附的蛋白污染目的蛋白，，移去上清液磁性分离；６、目的蛋白洗脱：１加入ＩｍＬＢｕｆｅｒＢ（可根据需要改变洗脱体积调整目的蛋白浓度）于离心），室温旋转混合２ｍｉｎ管中，盖紧离心管盖，然后将离心管置于旋转混合仪上；２）磁性分离，收集洗脱液到１．５ｍＬ离心管中，即为纯化的目的蛋白样品，取样进行考染分析；７、磁珠清洗：先在使用后的磁珠中加入１０ｍＬＢｕｆｅｒＣ，漩涡振荡６０ｓ，磁性分离，除去上清液；再加入ｌＯｍＬＢｕｆｅｒＤ，漩润振荡６０ｓ，磁性分离，除去上清液；重复该步骤２次。８、磁珠保存：１）完成清洗操作后，如果需要继续使用磁珠用于蛋白纯化，则用ＢｕｆｅｒＡ洗￣于同种蛋白纯化涤２３次后，用；￣２如果不需要继续使用３次后，），则用２０％乙醇洗涤磁珠２再加入２０％乙°醇到磁珠中使总体积为１０ｍＬ，保存于４Ｃ。３７ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文９、考染分析：取纯化过程中收集的样品制样进行考染分析，主要看收获的蛋白是一否与预期的目的蛋白的分子量大小致以及蛋白纯度。３．ｔ．３５Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏ分析对磁珠纯化获得的目的蛋白样品进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，具体方法如下：一（第天）１、样品准备：１）用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定磁珠纯化收获的目的蛋白溶液的浓度；２取一一一定量目的蛋白溶液浓度和同，进，使各目的蛋白均化到同体积行）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ制样；２－ＰＡＧＥ和考染分析、电泳：将制样的样品进行ＳＤＳ；３、转膜：，、、、）１电泳结束前约１０ｍｉｎ准备转膜用物品（转膜仪海绵滤纸ＮＣ膜等，）一ｘＴ将已裁至合适大小的ＮＣ膜切掉小块角然后浸入ＩｒａｎｓｆｅｒＢｕｆｅｒ（配制见附录二）中，浸泡约１０ｍｉｎ（整个过程中用镊子夹取ＮＣ膜的边缘，尽量不要接触ＮＣ膜的表面ＰＶＤＦ膜时为甲醇浸泡－３ｍ）、１ｉｎ，；使用海绵滤纸也需要用１＾ＴｒａｎｓｆｅｒＢｕｆｅｒ润湿，并排除海绵中的气泡；２一电泳结束后，将凝胶取出，去掉浓缩胶，在分离胶的左上角切掉小块做）标识用（Ｍａｒｋｅｒ在左边），按海绵、滤纸、凝胶、ＮＣ膜、滤纸、海绵的顺？－ｍ序放入ＸＣｅｌｌＳｕｒｅＬｏｃｋＭｉｎｉＣｅｌｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＳｙｓｔｅ（转膜仪）中一（，胶块的切角放于右上角，ＮＣ膜切角与胶块的切角放置方向致）安装好转膜装置，４５Ｖ、１ｈ转膜（或７Ｖ过夜转膜）；４、封闭：１）用ＰＢＳＴ溶液（配制见附录二）配制５％封闭液（配制见附录二）；２）转膜完成后，取出己经附着有目的蛋白的ＮＣ膜（切角在左上角时，正面即蛋白附着面），将其放入封闭液中室温下封闭１ｈ（蛋白附着面宜朝下）；一５、孵抗：ＳＡ一１用２．５％Ｂ溶液（配制见附录二）配制适当比例的抗溶液）；２，取出封闭完成的ＮＣ膜，用ＰＢＳＴ轻轻冲掉残留的封闭液然后将其放入）°一一抗溶液中Ｃ过夜孵育，蛋白附着面朝下，４抗；（第二天）６、洗膜：°一１回收抗溶液，可重复使用，４Ｃ保存；）２）将ＮＣ膜用ＰＢＳＴ漂洗３次，１０ｍｉｎ／次，蛋白面朝上；３８ 北京协和医学院硕士研究生学位论文７、孵二抗：１）用２．５％脱脂奶粉液（０．５ｇ脱脂奶粉＋２０ｍＬＰＢＳＴ）配制适当比例、相应抗性的二抗溶液；２）将漂洗完成的ＮＣ膜放于二抗溶液中，蛋白附着面朝下，室温下孵育１ｈ；８、洗膜：１）弃掉二抗；２将ＮＣ膜用ＰＢＳＴ漂洗３次，２０ｍｉｎ／次；）９、显色成像：？１ＳｌＣｉｌｉＳ取出ＳｕｐｅｒｉｇｎａＷｅｓｔＰｉｃｏｈｅｍｕｍｎｅｓｃｅｎｔｕｂｓｔｒａｔｅ显色试剂盒，）按ＮＣ膜大小配制适量显色液；２）将漂洗完成的ＮＣ膜从ＰＢＳＴ中取出，轻轻甩掉膜上残留的液体，然后将一其平整的放到张透明，将配制好的显色液均匀的滴加、干净的塑料膜上－３ｍｉｎ到ＮＣ膜上，反应２；３）用镊子夹起ＮＣ膜（勿夹含目的蛋白区域），轻轻甩掉膜上残留的显色液，一再次将其平整的放到透明、干净的塑料膜上，并在ＮＣ膜的上方再盖层透明、千净的塑料膜ｉＤｏＭＰ，铺平整，然后放入凝胶成像系统中（ＣｈｅｍｃＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ），调整参数进行曝光成像，曝光时间视图像信号强弱而－定，约３１０ｍｉｎ；４根据曝光形成的图像进行结果分析。）？３．３．６ＧＳＴｒａｐＦＦ（５ｍＬ）柱纯化蛋白？本研宄采用ＧＳＴｒａｐＦＦ（５ｍＬ）纯化柱与上海琪特分析仪器有限公司的自动（１）液相色谱分离层析仪组合进行蛋白纯化，该仪器主要由三个部分构成：蠕动泵，用于调控缓冲液的流速，（２）紫外检测仪ｎｍ，，检测穿过溶液的２８０吸光度值用（３），于判断溶液中是否有蛋白质的存在，液相色谱数据工作站收集和转换紫外检测仪的信号，传导至计算机，利用配套软件形成可视化的界面，具体纯化方法如下：１、缓冲液：１Ｂｉｎｄｉｎｕｆｆｅｒ：ＰＢＳ，Ｈ７．４；）ｇＢｐｔ－２Ｅ，ｌｕｉｏｎＢｕｆｅｒ：５０ｍＭＴｒｉｓＨＣＩ，２０ｍＭ还原型谷胱甘肽ｐＨ８．０（现配现）用，放置冰上或室温）；３ＳｔｏｒａＢｕｆｅｒ：２０％乙醇。）ｇｅ２、粗蛋白样品制备：取超声波或溶菌酶破碎菌体后离心（１８０００ｇ、４ｔ：、３０ｍｉｎ），并用滤膜（０．２２ｍ／０．４５Ｍｍ）过滤得到的上清Ｍ；３？、平衡柱子．３９ 京协和医学院硕士研究生学位论文一１用塑料软管连接好蠕动泵、纯化柱、紫外检测仪，可在柱子的入口处加）０个．２２ｊｍ／０．４５，连接柱子时，软管内应充满缓冲液，尽量避免）Ｍｍ的滤膜空气进入柱子内部；２开启各个仪器及计算机配套软件，将蠕动泵流速调整为５ｍＬ／ｍｉｎ，使蠕动）、泵吸取ＰＢＳ通过柱子内部，对柱子进行冲洗平衡，约１０ｍｉｎ；３此时，计算机软件显示紫外吸收值为平稳的基线，流速不应过快，避免造）成柱子损坏；４、样品上样：１），并通过软管连接蠕动泵）将过滤后的上清（粗蛋白样品置于冰上；２，上样过程中计算机软件界面会显示出现明将蠕动泵流速调整为２ｍＬ／ｍｉｎ）显高于基线水平的的紫外吸收值峰；，过柱后的液体即是穿透液５、洗涤柱子：１，／ｍ上样完成后调整蠕动栗流速为５ｍＬｉｎ）；蠕动泵吸取ＰＢＳ洗涤柱子约１０ｍｉｎ，直至紫外吸收值降到大约平衡柱子时的基线水平，以便除去未能与柱子特异性结合的杂蛋白；６、目的蛋白洗脱：１配制ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｅｒ，放置于常温或冰上）；２调整蠕动泵流速为３ｍＬ／ｍｉｎＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ曰ｕｔｉｏｎＢｕｆｅｒ），吸取，当穿过柱子后，计算机软件紫外吸收值会慢慢开始上升，出现洗脱峰，此时开始收集洗脱液，到紫外吸收值出现平台期时停止收集洗脱液，收集的洗脱液样品即是纯化的目的蛋白样品；７、柱子的清洗和保存：１洗脱完成后，调整蠕动泵流速为５ｍＬ／ｍｉｎ，吸取ＰＢＳ冲洗柱子，约１０ｍｉｎ，）直至紫外吸收值降到大约平衡柱子时的基线水平；２２０％０％蠕动泵流速不变，吸取酒精穿过柱子，使柱子内部充满２酒精，约）°５ｍｉｎ，然后封好柱子，置于４Ｃ保存。３．３．７目的蛋白溶液的超滤本研宄选用Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司的蛋白超滤管，根据的目的蛋白是否含ＧＳＴ标签选）择了两种不同标称分子量（ＮＭＷＬ的蛋白超滤管，３０ｋＤａＮＭＷＬ用于带ＧＳＴ标签蛋白的超滤，１０ｋＤａＮＭＷＬ用于除去了ＧＳＴ标签的蛋白的超滤，同时选择了４ｍＬ、１５ｍＬ的两种不同的规格，超滤方法如下：１、预漂洗：在新开封的超滤管内管中加入蒸馏水（需用０．２２ｍｉｔｉ滤膜过滤）浸泡约１０ｍｉｎ心滤出或直接倒掉蒸馏水，然后离；？２－、浓缩：分次加入１２ｍＬ（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ１５ＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＤｅｖｉｃｅｓ）或３．５ｍＬ４０ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文？￣（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ４ＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＤｅｖｉｃｅｓ）目的蛋白洗脱液到超滤管内管中，用离心机Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５８１０Ｒ的定角转头进行离心，离心条件为：４０００ｇ？？－－（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ１５ＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＤｅｖｉｃｅｓ）／７５００ｇ（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ４ＣｅｎｔｒｉｆｕａｌＦｉｌｔｅｒＤｅｖｉｃｅｓ）、４１、１０ｍｉｎｇ；３一２２０、缓冲液置换：根据最后次离心后超滤管内管内剩余溶液的量，分次加入°倍该体积的ＰＢＳ（需用０．２２ｊｍ过滤４Ｃ预冷，）到超滤管内管中，继续进行ｊ，直到最后收集到不产生沉淀的最小体积蛋白溶液离心，离心条件同上，即是目的蛋白溶解于ＰＢＳ中；４－、１２次离心完成后，离心管内管底部会开始出现淡黄色样高浓度蛋白溶液，需要用手动移液器轻轻吹打，此时淡黄色溶液会消失，溶液颜色容易变清亮，然后再继续加入洗脱液或ＰＢＳ进行超滤，这样能尽量避免出现不溶性的物质，提高超滤蛋白的回收效率。３．３．８ＧＳＴ祕的除去本研宄中重组质粒表达出的融合蛋白己含有凝血酶（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）的蛋白酶切位点ｉ，ＧＳＴ，可以通过Ｔｈｒｏｍｂｎ除去ＧＳＴ标签标签的除去方法如下：？蛋白酶切１、经超滤后获得足够量的含ＧＳＴ标签的目的蛋白，目的蛋白溶解的缓冲液为ＰＢＳ；２、按１ｍｇ含ＧＳＴ标签的融合蛋白加入１０ＵＴｈｒｏｍｂｉｎ（ＧＥ）的比例计算需要加入的酶量；°３、将Ｔｈｒｏｍｂｉｎ与ＧＳＴ标签蛋白溶液混合均匀，２２Ｃ酶切１６ｈ，期间轻轻摇动酶－５次和蛋白的混合液４，，或放入摇床转速１８０ｒｐｍ；４ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、酶切完成后，取少量样品进行和考染分析，判断酶切效果。？获取不含ＧＳＴ标签的目的蛋白１、再纯化：？１）按照蛋白纯化的方法平衡ＧＳＴｒａｐＦＦ（５ｍＬ）柱子，？２将酶切完成的蛋白溶液进行上样，通过ＧＳＴｒａｐＦＦ（５ｍＬ）柱子后收集）穿透液并保存，穿透液中即包含了不含ＧＳＴ标签的嵌合蛋白，其它处理同前所述蛋白纯化；２、除去凝血酶：１）连接脱酶柱ＨｉＴｒａｐＢｅｚａｍｉｄｉｎｅＦＦ（１ｍＬ）和纯化仪，用５ｍＬ结合缓冲－ＨＣ液（０．０５ＭＴｒｉｓＩ０．５Ｍ７．４）平衡柱子１ｍＬ／ｍｉｎ，氯化钠，ｐＨ，流速；４１ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文平衡完成后“”２，将再纯化步骤收集的穿透液全部上样，流速ＩｍＵｍｉｎ，同）样收集穿透液并保存，穿透液中即含有目的蛋白（己除去了ＧＳＴ标签和凝血酶Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）；３穿透液收集完成后，用５ｍＬ结合缓冲液冲洗柱子，流速１ｍＬ／ｍｉｎ；）４－用５ｍＬ洗脱缓冲液（０＿０５ＭＧｌｃｉｎｅＨＣＩＨ３０６Ｍ盐，．，或酸胍）洗脱）ｙｐ结合在柱子上的凝血酶（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ），流速１ｍＬ／ｍｉｎ，然后再用５ｍＬ结合缓冲液冲洗柱子，流速１ｍＬ／ｍｉｎ；５）将储存缓冲液（０．０５Ｍ醋酸，含２０％乙醇，ｐＨ４．０）穿过柱子，使其完全°充满柱子后封住柱子，放置于４Ｃ保存。？蛋白超滤对收集的不含ＧＳＴ标签、不含Ｔｈｒｏｍｂｉｎ的目的蛋白溶液进行超滤，以提高目的蛋白浓度，此处不需要进行缓冲液的置换，对最后获得浓缩后的目的蛋白进行浓－，并通过ＳＤＳＰＡＧＥ和考染分析进行纯度判断度测定，以便于后续实验。３．３．９目的蛋白性质的初步鉴定取１０ｐＬ最后收集的浓缩后的目的蛋白溶液，经负染色后用透射电子显微镜￣（ＴＥＭ，电镜）进行观察，查找是否存在有预期直径大小（２０ｎｍ）的颗粒形成。４２ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文３．４实验结果３．４．１目的蛋白的诱导表达为验证本研宄中所构建的７个重组质粒是否能在ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达目的蛋白，我们对己转入正确重组质粒的大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）进行培养，并在各自培养．５左右时加入菌液的〇Ｄ６００值达到０ＩＰＴＧ进行诱导表达，过夜培养后收取菌体。－ＰＡＧＥ和考染分析发现通过ＳＤＳ，经过ＩＰＴＧ诱导过后，本研究构建的７个重组质粒都存在蛋白的表达，且这些重组质粒所表达的蛋白分子量与我们预期的嵌合蛋－白的分子量基本相符，位于５５７２ｋＤａ之间（图３．１）。Ｅｔｏｅｓ３ｐｉｐＮｏｎＳＰ５５ＳＰ７０ＳＰ２８－＋－＋－－ＩＰＴＧＭ＋＋７２ｋＤａ－＾５５ｋＤａ－＾．＾Ｙ．？＊＊幽＊？＊？＊ｂＳＰ５５＋＋－＋Ｅ—ｐｉｔｏｐｅｓＳＰ７０＋＋＋ＳＰ２８－＋＋＋￣￣－－ＩＰＴＧＭ＋＋＋＋腦－＿＜，＜：５５ｋＤａ－３－图．１ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析蛋白表达ａ．各单表位嵌合蛋白的表达．，ｂ各串联表位各嵌合蛋白的表达－Ｆｉｕｒｅ３．１ＳＤＳＰＡＧＥａｎａｓｓｏｔｉｅｘｒｅｓｓｏｎｇｌｙｉｆｐｒｏｅｎｓｐｉａ．Ｔｈｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｉｎｌｅｅｉｔｏｐｅｃｈｉｍｅｒｉｃｒｏｔｅｉｎｓｐｇｐｐｂ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔａｎｄｅｍｅｐｉｔｏｐｅｓｃｈｉｍｅｒｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ注：１、取各表位重组质粒未诱导１ｍＬ，，０〇Ｓ，、诱导表达的菌液各离心后保留菌体用１ｍＬＰＢ重悬菌体再加入２〇Ｌ６ｘＬｏａｄｍ－ｉｎＢｕｆｅｒ，１００＾：煮沸１０ｎＳＤＳ％浓缩胶）ｔ样，Ｍｇｉ：ＰＡＧＥ（８％分离胶＋５５ｐＬ电泳条件为：先８０Ｖ、３０ｍ，，，。ｉｎ再１５０Ｖ６０ｍｉｎ电泳完成后进行考马斯亮蓝染色及脱色“”２、代表蛋白质分子量ＭａｒｋｅｒＮｏｎ代表诺如病毒Ｐ结构域蛋白，不含ＥＶ７１的中和表位。；４３ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文３．４．２表达目的蛋白的可溶性分析重组质粒所表达的目的蛋白位于细菌菌体内部，为了将菌体内部的目的蛋白释，我们首先用ＰＢＳ将收获的菌体重新悬浮放出来，再通过超声波的作用来破碎菌－体，破碎后的菌体悬液经离心后分成上清和沉淀，我们对上清、沉淀均进行了ＳＤＳＰＡＧＥ．和考染分析，发现预期分子量大小的目的蛋白在上清和沉淀中都存在（图３２）。Ｐ４２Ｐ４２＋ＳＰ５５Ｐ４２＋ＳＰ７０Ｐ４２＋ＳＰ２８一一＋＋一＋－＋ＴＧＩＰＴＩＰＧｇｂＭ＃ＭＪ＃Ｖ，＃ＭＪ＃Ｍ＾＃＾＊＊＊－ＷＶ？ｆ一＿－７２ｋＤａ＿Ｆｌ７２ｋＤａｉＨＨ锋＾Ｗ｜ｐ｜＿ＪＬ一＾鱗５５ｋＤａ－ｂｂｋＵａ％＊麵５５ｋＤａ－＾＾金｜｜＾餘＾ｄ－“２ｐｒ？冒冒－爾画霸響＋－＋－Ｐ４２＋ＳＰ５５－７０－２８Ｐ４２＋ＳＰ５５－７０Ｐ４２ＳＰ５５２８Ｐ４２ＳＰ７０２８￣—￣－￣＋＋＋ＩＰＴＧ＿±＿ＩＰＴＧ，Ｍ＾＃ＭＭ＃Ｍ＾＃—＾ｉ：＾一？＾Ｍ＊？５Ｊ＾＊ａａｗ？ｍｍｍｍｅ＃？Ｗ：ＳＳｔｓ＿—，７２ａ－聊３－一ｋＤ＊＿蘭士＇５＾‘＾２ｋａ－－Ｂ？５５Ｄ５５ｋＤａ？｜２疆Ｓｗｇ《■＞｜｜疆ｊｉＩ＾１ｌＪ響－图３．２ＳＤＳＰＡＧＥ分析目的蛋白的可溶性表达－Ｆｌｉｉｉｇｕｒｅ３．２ＳｏｌｕｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｙｓｓｏｆｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｎｂｙＳＤＳＰＡＧＥ、ｍＬ，１０ｍＬｊＬＰＢＳ重悬菌注、，：１取各表位重组质粒未诱导诱导表达的菌液各１〇〇离心后保留菌体用｜体，加入１００ＬＰＭＳＦ（１００ｍＭ），冰浴超声２０ｍｉｎ（＃６探头，３０％功率，工作２ｓ，停歇２ｓ）；ｐｘ２，，６ｉｎ、取超声后的悬液１０〇Ｌ，离心后分出上清、沉淀沉淀用ｌＯＯＬＰＢＳ重悬各加入２〇ＭＬＬｏａｄｇｍ＾°－＋ｕｒ，Ｂｆｅ到上清和重悬沉淀中，Ｃ煮沸１０ｍｉｎ；ＳＤＳＰＡＧＥ（８％分离胶５％浓缩胶）上样５Ｌ电１００ｍ。泳条件为：先８０Ｖ、３０ｍ，ｍｉｎ，电泳完成后进行考马斯亮蓝染色及脱色ｉｎ，再１５０Ｖ６０“”３、Ｍ代表蛋白质分子量Ｍａｒｋｅｒ。３．４．３磁珠纯化目的蛋白由于对沉淀中的目的蛋白进行纯化的方式较为繁琐，涉及到变性的处理，、复杂这样对目的蛋白的活性及后续的蛋白纯化不利，所以我们用ＧＳＴ亲和磁珠（Ｂｅａｖｅｒ？－ＢｅａｄｓＧＳＨ）对上清中存在的目的蛋白进行了预纯化。ＳＤＳＰＡＧＥ和考染分析．３，结果显示（图３），从上清中能够获得预期分子量大小的蛋白质获得的目的蛋白纯度也符合预期。４４ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文－－－ＳＰ５５＋＋＋＋—Ｅ————ｐｉｔｏｐｅｓＳＰ７０＋＋＋＋２８—一－－ＳＰｍ＋＋＋＋７２ｋＤａ－Ｍ；；：５５ｋＤａ－图３．３纯化后的目的蛋白纯度分析Ｆ．ｉｔｆｔｔｔｉｇｕｒｅ３３Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｕｒｏｕｒｉｆｉｅｄａｒｅｒｏｅｉｎｓｐｙｐｇｐ－注：、．，１纯化的各目的蛋内上样量约０５ＳＤＳＰＡＧＥ（１０％分离胶＋５％浓缩胶）电泳条件为：先８０Ｖ、ｐｇ３０ｍ，ｉｎ，再１５０Ｖ６０ｍｉｎ，电泳完成后进行考马斯亮蓝染色及脱色。＂＂＂＂２、Ｍａｒｋｅｒ一代表蛋白质分子量Ｍ，。；３个表位均表示为诺如病毒Ｐ结构域蛋白下同３．４．４目的蛋白的免疫印迹分析为验证从上清中纯化的目的蛋白质，我们首先利用了ＧＳＴＲａｂｂｉｔｍＡｂ进行免疫印迹分析（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ），结果显示我们的目的蛋白均为预期的ＧＳＴ融合蛋白，￣７２ｋＤａ（图３．４ａ）且产生反应的目的蛋白质分子量也为预期大小，位于５５；然后，我们通过免疫印迹法对纯化的目的蛋白的免疫原性进行了初步分析，结果表明，除了含单表位ＳＰ５５和ＳＰ２８的目的蛋白没有明显免疫反应外，其他５个含单表位或－串联表位的目的蛋白都能与抗ＥＶ７１兔血清（ＲａｂｂｉｔａｎｔｉＥＶ７１ｐＡｂ）产生很强的免疫反应（图３．４ｂ）。————ＳＰ５５＋＋＋＋————ＥｐｉｔｏｐｅｓＳＰ７０＋＋＋＋———ＳＰ２８Ｍ－＋＋＋＋７２ｋＤａ—ｊｉｉｐ：５５ｋＤａ－：７２ｋＤａ－ｂｋｍ５５ｋＤａ－＾图３．４纯化后目的蛋白的免疫印迹分析ａ．抗ＧＳＴ单抗，ｂ．抗ＥＶ７１兔血清Ｆ－．ｌｉｉｉｉｇｕｒｅ３４ＩｍｍｕｎｏｂｏｔａｎａｌｙｓｓｏｆｔａｒｇｅｔｅｄＧＳＴｆｕｓｏｎｐｒｏｔｅｎｓ－－ａｉＲ．ＲａｂｂｔａｎｔｉＧＳＴｍＡｂ．ａｂｂｉｔａｎｔｉＥＶ７１Ａｂ，ｂｐ？一－－注？各目的蛋白上样量约０．５。抗（Ｒａｂｂｔａｎｔ，ｔａｎｔ）叫ｉｉＧＳＴｍＡｂＲａｂｂｉｉＥＶ７１ｐＡｂ配制比例为１：５０００，－抗兔二抗（Ａｎｔ－ｉｒａｂｂｉｔＩｇＧ，ＨＲＰｌｉｎｋｅｄＡｎｔｉｂｏｄｙ）配制比例为１：１００００。４５ 北京协和医学院硕士研究生学位论文３．４．５Ｐ结构域蛋白的纯化重组质粒表达的７个嵌合蛋白都含有诺如病毒的Ｐ结构域和ＥＶ７１的中和表位，我们用来自于本研究所的抗ＥＶ７１兔血清检测了这些嵌合蛋白，部分嵌合蛋白具有针对ＥＶ７１的抗原性，。根据预期研宄设计我们还需要用抗诺如病毒Ｐ结构域抗体来检测这些嵌合蛋白，以验证嵌合蛋白是否具有针对ＥＶ７１和诺如病毒的双重抗原性，我们进行了Ｐ结构域蛋白的纯化，利用Ｐ结构域蛋白免疫小鼠可以。因此获取抗诺如病毒Ｐ结构域的多克隆抗体，我们将质粒Ｐ４２。为了获取Ｐ结构域蛋白转入大肠杆菌表达系统ＢＬ２１（ＤＥ３）中，经培养后诱导表达含ＧＳＴ标签的Ｐ结构域蛋白，然后通过纯化、蛋白酶切、再纯化、除去酶、超滤的方式获得了纯化后的Ｐ结构域蛋白（图３．５），Ｐ结构域蛋白即是Ｐ颗粒形成的基础单元：Ｐ单体（ｍｏｎｏｍｅｒ）。经过负染色后，在透射电子显微镜（ＴＥＭ）下观察我们纯化的Ｐ结构域蛋白（Ｐｍ）样品，可以发现直径约２０ｎｍ的颗粒，证明我们纯化的Ｐ结构域蛋白能自发形成预期的Ｐ颗粒．６）。（图３Ｍ１２Ｍ３Ｗ，轉．７２ｋＤａ－ｂ？Ｉ…５５ｋＤａ－＾續於ＨｉＰｍ：——ｐｍ３４—３４ｋＤａ－德ｋＤａ＾ＧＳＴ－＊？２６ｋＤａ－２６ｋＤａｊ－图３．５ＳＤＳＰＡＧＥ分析纯化的Ｐ结构域蛋白Ｆ－ｉｒｅ３５ＡｌｉｆｉｆｉＰｉｉＰＡＧＥｇｕ．ｎａｙｓｓｏｐｕｒｅｄｄｏｍａｎｐｒｏｔｅｎｂｙＳＤＳ－－－ｉｈｉ注：１：ＧＳＴＦｕｓｉｏｎ２：ＧＳＴＦｕｓｏｎｃｕｔｂｔｒｏｍｂｉｎ３：ＴｈｒｏｍｂｎＲｅｌｅａｓｅｄＰｍ；ｙ；４６ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文：編ｘ图３．６Ｐ结构域蛋白形成的Ｐ颗粒（黄色圈中．，２５０Ｋ）Ｆｉｇｕｒｅ３．６ＰｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｏｒｍｅｄｂＰｄｏｍａｉｎｒｏｔｅｉｎｓ（ｅｌｌｏｗｃｉｒｃｌｅｓ＞＜２５．ＯＫ）ｙｐｙ，注，。：Ｐ颗粒大小约２０ｎｍ大致呈五边形３＋ＳＰ５５－７－．４．６Ｐｍ０２８嵌合蛋白的纯化由于纯化蛋白的时间周期较长，所以我们暂时未能对己构建的所有嵌合蛋白进一行一纯化。相对来说，我们认为同时包含了３个中和表位的嵌合蛋白是比较理想－－的免疫原，于是我们先选择了含串联表位ＳＰ５５７０２８的嵌合蛋白进行纯化。通过大量表达、纯化、超滤、酶切、再纯化、除去酶、再超滤的方式获得了纯化后的Ｐｍ＋ＳＰ５５－７０－２８嵌合蛋白（图３．７），但是纯度不够理想，透射电。正如我们预期子显微镜－－（ＴＥＭ）观察纯化后的Ｐｍ＋ＳＰ５５７０２８嵌合蛋白样品可以发现直径约２０ｎｍ的颗粒－－，证明嵌合蛋白Ｐｍ＋ＳＰ５５７０２８能自发形成颗粒（图３．８）。４７ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文Ｕ２３＇＂＂８ｖ－，，Ｖ＾＾＾＾；；？＿…，一、７２ｋＤａ－７２ｋＤａ＾；＾＊ｊ？？＾ＧＳＴ，Ｆｕｓｏｎｆｊｇｉ＊５５ｋＤａ－Ｒ＾＾＾４３ｋＤａ———Ｐｍ＋ＳＰ５５－７〇－２８４３ｋＤａｎＫ－Ｐｍ＋ＳＰ５５－７０－２８＾＾＿麵ｓｆｅＧＳＴ２６ｋＤａ—３－＋ＳＰ５－－图．７ＳＤＳＰＡＧＥ分析纯化的Ｐｍ５７０２８嵌合蛋白Ｆ＋－－－ｉｇｕｒｅ３．７ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｕｒｉｆｉｅｄＰｍＳＰ５５７０２８ｃｈｉｍｅｒｉｃｐｒｏｔｅｉｎｂｙＳＤＳＰＡＧＥｐ－Ｆｕｓ－－＋－－ｉｏｎ２ｔｔＲｌ７０２８注：１：ＧＳＴ：ＧＳＴＦｕｓｉｏｎｃｕｂｈｒｏｍｂｉｎ３：ＴｈｒｏｍｂｉｎｅｅａｓｅｄＰｍＳＰ５５；ｙ；■■：．ｒ：１Ｋ偷棚３－－ｘ图．８Ｐｍ＋ＳＰ５５７０２８嵌合蛋白形成的颗粒（黄色圈中，３〇．〇Ｋ）－－ｘ３０Ｆ．ｔｌｆＰｍ＋ＳＰ５５７０２８ｃｈｉｍｅｒｉｃｔｉ（ｅｌｌｏｗｃｉｒｃｌｅｓ．０Ｋ）ｉｕｒｅ３８Ｐａｒｉｃｅｓｏｒｍｅｄｂｒｏｅｎｓｇｙｐｙ，注：Ｐ颗粒大小约２０ｎｍ，大致呈五边形。４８ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文３．５本章小结本章的主要工作是围绕重组质粒所表达的目的蛋白展开，结果表明，我们构建的７个嵌合蛋白都能在大肠杆菌ＢＬ２。１（ＤＥ３）中以含ＧＳＴ标签的形式正确表达超声波破碎菌体后发现，上清和沉淀中都有目的蛋白存在。用ＧＳＴ亲和磁珠能在一致上清中收获足量的目的蛋白，纯化获得的蛋白的分子量大小与预期大小。对纯ｔＧＳＴ化后的蛋白进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏ分析表明，这７个嵌合蛋白都能与抗单克隆抗发生免疫反应，用抗ＥＶ７１兔血清多克隆抗体检测时发现，除了含单表位ＳＰ５５和ＳＰ２８的嵌合蛋白没有明显免疫反应外，其他５个单表位或串联表位都有很强烈的免疫反应。通过大量的纯化工作，我们获得了纯度较高的Ｐ结构蛋白和纯度不理想＋ＳＰ－－２８嵌合的Ｐｍ５５７０蛋白。在透射电子显微镜（ＴＥＭ）下，这两个目的蛋白样品中都能发现大小约２０ｎｍ左右的颗粒，说明我们收获的目的蛋白能自发形成颗粒，结果符合我们的预期。４９ 北京协和医学院硕士研究生学位论文第４章嵌合蛋白的免疫原性评价４．１引言一基础研究中，动物实验是评价免疫原免疫效果的常用方法之，小鼠是最常用的实验动物，。免疫原注射进入小鼠体内后会刺激小鼠的免疫系统产生相应的应答比如产生特异性的抗体，这些抗体主要存在于血清中。获取免疫后小鼠的血清进行分析就可以初步判断所注射免疫原的免疫效果。嵌合蛋白免疫原性初步评价的方法有Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、ＥＬＩＳＡ、中和试验ｓｔｅｒｎ。Ｗｅｂｌｏｔ方法可以检测血清中的抗体与相关联蛋白的结合能力，以此鉴定相关联蛋白的。ＥＬＩＳＡ方法是通过抗原，免疫原性、抗体的相互作用反应出血清中抗体的总量从而检测出免疫后血清的抗体滴度，反映免疫原的免疫效果，此方法具有较高的灵敏度和特异性，是免疫效果评价中常用的方法。中和试验是用免疫后血清处理活病毒后再将其接种到细胞中，通过细胞病变的情况来分析血清中是否含有中和病毒的特异性中和抗体，从而判断免疫原是否能够诱导免疫机体的中和抗体的产生。－＋ＳＰ－７０本章中我们用纯化的Ｐ结构域蛋白，、Ｐｍ５５２８嵌合蛋白免疫小鼠免ｎｂ疫后的小鼠血清均能通过ＥＬＩＳＡ分析检测出抗体滴度；Ｗｅｓｔｅｒｌｏｔ的方法证实，Ｖ７＋ＳＰ５５－部分嵌合蛋白具有针对诺如病毒和Ｅ１的双重抗原性；中和试验显示Ｐｍ一７０－２８ＥＶ７１病毒具有定的中和作用嵌合蛋白免疫后的小鼠血清对。４．２实验材料４．２．１小鼠－本研宄选用的实验动物为８１０周龄ＢＡＬＢ／ｃ雄性小鼠，由医学生物学研究所小动物实验部提供。４．２．２细胞和病毒本研宄选用的Ｖｅｒｏ细胞和ＥＶ７１病毒均来源于本实验室，由本实验室保存。４．２．３实誠剂主要实验试剂（１）货号Ｑ－ｕｉｃｋＡｎｔｉｂｏｄｙＭｏｕｓｅ２Ｗ北京博奥龙免疫技术有限公司ＫＸ０２１００４３氯化钠注射液昆明南疆制药有限公司Ｃ１５０１０５－Ｆｅ－ｔａｖｉｎｅｎｄｕｓｔｒｌＢｏＳｅｒｕｍＦＢＳＢｉｏｌｏｉｃａｌＩｉｅｓ０４００１１Ａ，ｇＴｒＥＤＴＡＳ－－ｓｉｎｔｉｉｉｔｒｉ０３０５０１ＡｙｐｌｏｕｏｎＡＢｏｌｏｇｃａｌＩｎｄｕｓｅｓＣＳ５０ 北京协和医学院硕士研究生学位论文主要实验试剂（２）货号＾ｎ－ＰｅｉｃｉｔｒｔｉｌｌｉｎＳｅｐｏｍｙｃｎ－Ｂ－ｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ０３０３１１ＢＳｏｔｉｏｎｌｕＥＤＴＡＡＭＲＥＳＣＯ０－１０５１ＫＧＰＢＳＴａｂｌｅｔｓＡＭＲＥＳＣＯＥ４０４脱脂奶粉完达山乳业股份有限公司／硫酸四川西陇化工有限公司／ＴＭＢ－ＡＭＲＥＳＣＯ４４－ＬＩＱＵＩＤ１Ｊ６１００ＭＬｍａ－ＮａＨＣ０ＳｉＡｒｃｈＶ９００２３ｇｌｄｉ１８－ＨＰ０－ＮａＳｉａＡｒＡ７２４ｇｍｌｄｉｃｈ２０９０８ｍａ－ＳｌｒｉＮａＨ２Ｐ〇４ｉｇＡｄｃｈＳ８２８２？－ＴＷＥＥＮ２０ＡＭＲＥＳＣＯ０７７７１Ｌ？ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＰｉｃｏＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ３４０７７ＣｈｅｍｉｒｉｌｕｍｎｅｓｃｅｎｔＳｕｂｓｔａｔｅＢｒａｄｆｏｒｄ蛋白浓度测定试剂盒生工生物工程股份有限公司Ｐ０００６Ａｎ－－ｔｉＩＧＨＲＰｌｉｎｋｍｏｕｓｅｇ，ｅｄＣｅｌｉ７０７６ｌＳｉｇｎａｌｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＃Ａｎｔｉｂｏｄｙ－－ＡｎｔｉｒａｂｂｉｔｉｎｋＩＧＨＲＰｌｅｄｇ，ＣｅｉｎｌｌＳｉｇｎａｌｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＃７０７４Ａｎｔｉｂｏｄｙ抗ＥＶ７１兔血清医学生物学研宄所ＩＥＶ７１灭活疫苗原液民学生物学研宄所Ｆ２０１４２５４．２．４雛仪器主要实验仪器（１）型号Ｃ０２培养箱ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ３１１１生物安全柜ＴｈｅｒｍｏＲｓｈｅｒ１３００ＭＳＣＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４３０ＲＥｐｐｅｎｄｏｒｆ５４２８电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司ＤＫ－Ｓ２４倒置生物显微镜重庆奥特光学仪器有限责任公司ＢＤＳ３００台式低速自动平衡离心机湘仪离心机仪器有限公司Ｌ５００５１ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文主要实验仪器（２）型号ＴｅｃａｎｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ｐｒｏＴｅｃａｎＭ２００ｐｒｏ超低温冰箱ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ９０２海尔电冰箱青岛海尔股份有限公司６４９ＷＥＭ－ｉｎｉＳｈａｋｅｒ海门市其林贝尔仪器有限公司ＱＢ８００２雪花制冰机常熟市雪科电器有限公司－ＩＭＳ２０一电热恒温培养箱上海恒科学仪器有限公司ＤＨＰ－９４０２－ｎ－－ＭｉｔｒｉｉＰＲＯＴＥＡＮ？ＴｅａＢｏＲａｄ１６５８００１ＣｈｅｍｉＤＭＰｏｃＩｍａｇｉｎｇＢ－ｉｏＲａｄ１７０２８２０Ｓｙｓｔｅｍ？？－ｎｓ－ＢｉｏＲａｄＴｒａＢｌｏｔＴｕｒｂｏ－ＢｉｏＲａｄ１７０４１５０Ｓｓｔｅｍｙ４．３实验方法４．３．１小鼠免疫１、抗原配制：°－１）开启超净工作台（紫外消毒３０ｍｉｎ，后通风３０ｍｉｎ），取８０Ｃ保存的纯化后的蛋白置于冰上解冻；２解冻后的蛋白溶液用０．２２ｊｍ滤膜过滤后进行使用；）｜３－Ｊ－原注射量为３０５０，，０．３）抗｜按照蛋白溶液的浓度将其用生理盐水稀释为－／ｊｉｕｔ０＿ｉ．５口１，取１００Ｌ稀释后的蛋白溶液加入１００ｊＬ」（ＱｉｃｋＡｎｂｏｄ｜佐齐四｜ｙＭｏｕｓｅ２Ｗ），混匀，用１．５ｍＬ离心管分装为１００ｊＬ／管，然后置于冰上，｜备用；２、免疫前采血１，正确抓住小鼠并固定暴露小鼠的尾部；）２用７０％酒精消毒的眼科剪快速剪断小鼠尾部末端约０－．３０．５ｃｍ，用手指从）远及近轻轻按压小鼠的尾部，使剪断处流出血液；３用手动移液器吸取血液到１．５ｍＬ离心管中，直至吸取大约５０ＪＬ左右血液）｜为止；４用干棉球压迫小鼠尾部的剪断处止血，约３０ｓ）；°°５将取到的血液放置于３７Ｃ培养箱，１ｈ后转移至４Ｃ冰箱中，过；）夜放置５２ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文６，，１００００、室温、１０ｍ，第二天对过夜放置的血液进行离心ｉｎ然后分离）ｇ°－８０Ｃ冰箱中出上清液即是免疫前血清，其余沉淀弃掉，血清保存于。３、抗原注射１用１ｍＬ的注射器吸取配制好的抗原液１００ｊＬ，放置，避免污染；）｜２）正确抓取小鼠，暴露小鼠后腿左、右腿的肌肉，用７０％酒精棉球擦拭左、右腿区的皮肤进行消毒；３通过肌肉注射配制好的抗原液，左、右腿各注射１针，１０〇ｍＬ／针；）４注射完成后将小鼠放回鼠笼喂养，记录时间，每天或隔天观察其状态，及）时添加鼠料和水。４、收取免疫后血清１抗原注射后第１４天采集免疫后血液；）２一正确抓取并固定小鼠，，暴露其中只眼球，用镊子夹住并轻轻摘掉眼球）使血液流出．５，用１ｍＬ离心管接住血液，至血液不再流出；３）再采用脱颈的方式处死小鼠，小鼠尸体做相应处理；°°７）将获取的全血于３７Ｃ培养箱放置１ｈ，然后转移至４Ｃ冰箱中，过夜放置；４第二天，对过夜放置的血液进行离心，１００００ｇ、室温、１０ｍｉｎ，分离出上）清液即是免疫后血清，其余沉淀弃掉，血清小部分分装，用于后续实验，°－８０Ｃ保存于。４．３．２ＥＬＩＳＡ分析用ＥＬＩＳＡ的方法检测免疫原免疫后小鼠血清中特异性的ＩｇＧ反应，确定免疫后血清的抗体滴度，具体实验方法如下：１、准备：一１先确定所要检测的免疫后血清稀释度的范围，般按２倍关系递增，以５）、４０００、８０００、１１６０００、１３２０００个稀释度为例，如１：２０００１：１：：：，每个稀释度复孔数为３个；２免疫前血清作为阴性对照，它的稀释比例为设定的免疫后血清稀释比例的）最低稀释比例，：２０００此处为１；３）另需要３个空白对照孔，则共需要２１？Ｌ，其中需要抗原包被的孔为１８个，一步的抗原总用量以此确定下。２、抗原包被：一一１按上步计算所得的孔数，取定量的注射小鼠的抗原溶液，用抗原包被）液（配制见附录二）将其稀释至５Ｍｇ／ｍＬ，加入到９６孔板中，１０〇ｍＬ／孔，即每孔包被的抗原量为０．５ｐｇ；２空白对照孔只加入抗原包被液，将各样品孔用封板膜封住，放于４尤过夜；）５３ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文（第二天）３、封闭：１用ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）和脱脂奶粉配制成封闭液（配制见附录二）；）２取出过夜包被的９６孔板，倒掉每孔中的溶液，并在每孔中加入２００ｊＬ）｜ＰＢＳＴ进行洗板，共３次，５ｍｉｎ／次；３）洗板完成后每孔中均加入封闭液，２０〇ｍＬ／？Ｌ，再次用封板膜封住各样品孔，°放３７Ｃ培养箱封闭２ｈ；４、血清孵育：“”１取免疫前、后的血清，按准备步骤设定的稀释比例用３００ｐＬ封闭液对血）清进行稀释；封闭完成后，２，弃尽每孔的封闭液加入按设定比例稀释的免疫前、后血清，）并做好标识，１００ＭＬ／孔，每个稀释比例样品复孔数为３个，空白对照孔中°，再次用封板膜封住各样品孔，放３７Ｃ培养箱孵育１ｈ只加入封闭液；５、二抗孵育：１）血清孵育完成，弃尽每孔中的液体，再在每孔中加入２０〇ｍＬＰＢＳＴ进行洗，／板，５ｍｉｎ次共３次；－－ｍｏｕｓｅ２ｎｔｉ丨ＧＨＲＰｌｉｎｋｅｄＡｎｔｉｂｏｄ１：５０００比）取二抗Ａｇ，ｙ，用封闭液按例稀释，１００Ｌ／孔，加入到各样品孔中照孔只加入封闭液ｕ，空白对，用封板°膜封住各样品孔，放３７Ｃ培养箱１ｈ孵育；６、显色：１二，抗孵育完成后，弃尽每孔中的液体再在每孔中加入２００ＭＬＰＢＳＴ进行）ｉｎ欣洗板，共３次，５ｍ；２洗板完成后，在每孔中（包括空白对照孔）加入显色液ＴＭＢ，１０〇Ｌ／孔，）ｍ室温避光放置３０ｍｉｎ；３放置完成后在每孔中（包括空白对照孔）加入１０〇Ｌ的终止液（２ＭＨ２Ｓ０４，）ｍ配制见附录二），终止显色；７、结果分析：１终止显色后，用酶标仪立即测定每样品孔在４５０ｎｍ处吸光度值）；－－２通过获得的数值计算比值：（免疫后血清孔空白孔）／（免疫前血清孔空白））－，ｌｍ／ｒｅ。孔即是ｐｌｍ３－ｌｍ／ｐｒｅｌｍ比值大于２．０即为阳性。）４．３．３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｔｌｏ分析用获取的小鼠免疫后血清配制一抗溶液，以各嵌合蛋白为检测样品，进行验步骤“”Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，具体实同第３章Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。５４ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文４．３．４中和试验基质细胞：Ｖｅｒｏ，病毒株：ＥＶ７１１、溶液配制：－１：ＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ１％ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎＳｔｒｅｔｏｍｃｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎ）细胞培养液，ｐｙ；２－病毒（血清）稀释液：ＤＭＥＭ２％ＦＢＳ１％ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎＳｔｔｃｉｎＳｏｌｕｉｏ），，ｒｅｏｍｔｎｐｙ；２、参考病毒ＣＣＩＤ５０滴定和滴度梯度制备＿１８１用病毒（血清）稀释液将参考病毒１０倍系列稀释为１０至１ＣＴ病毒液，）各加入细胞板内丨，，每孔５０卩每稀释度４孔细胞；２每孔加Ｖｅｒｏ细胞悬液５０ｐｌ，同时设细胞对照（５０ｊｌ稀释液＋５〇Ｉ细胞悬）｜ｍ液），３７ｔ：培养７ｄ，观察细胞病变；ｈ－３按ＢｅｒｅｎｓＫＳｒｂｅｒ公式计算出分离病毒株的ＣＣＩＤ５０：）＝－－．ｌｏｇＣＣＩＤ５０ＬｄＳ０５，其中（）＝Ｌ实验中使用的最低稀释度的ｌｏｇ值ｄ＝稀释梯度的ｌｏｇ值Ｓ＝终判时阳性部分的总和（即出现ＣＰＥ的细胞孔所占的比例之和）；４￣３次０正式试验前应先滴定攻击病毒２．０５ｍＬ中含，取其平均值，求出每）１００ＣＣＩＤ５０的病毒载量；５）按照计算好的稀释比例配制攻击病毒，求出试验所需的病毒总量（即１００ＣＣＩＤ５０／０．０５ｍＬ）；６取３支小试管，每只加病毒稀释液０．９ｍＬ；）７）用带滤芯的吸尖（ＡＲＴ吸尖）吸０．１ｍＬ己经稀释好的攻击病毒液（即１０一ＣＣ一ＩＤ５０／０．０５ｍＬ）到第支小试管中，换另支ＡＲＴ吸尖，轻轻并彻底．地混匀，避免产生大量气溶胶，按照此方法依次稀释至１ＣＣＩＤ５０／００５ｍＬ．１ＣＣＩＤ５０／０。和０．０５ｍＬ３、稀释血清１用病毒（血清）稀释液将血清进行４倍倍比稀释，即１：４、１：１６、１：６４、）１：２５６、１：１０２４等；２将各个稀释度的待检血清加样至９６孔细胞培养板内Ｉ／，５〇孔，每个稀释）ｍ度都要平行做两孔，另设待测血清对照孔两孔，每孔中补加稀释液０．０５ｍＬ。４、病毒中和１取稀释好的ＥＶ７１毒株样品（１００ＣＣＩＤ５０／５０ＭＬ）加入９６孔细胞培养板）°中５０（ＪＬ／孔，置３７Ｃ孵箱与稀释血清中和２小时。同时设细胞对照、血清对照及病毒对照各４孔。２一另取块９６孔板纵向使用，做１００ＣＣＩＤ５０／０．０５ｍＬ病毒滴度的核实（每）次实验都必须做）。每孔先加病毒稀释液０．０５ｍＬ０．１，然后从５５ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文ＣＣＩＤ５０／０．０５ｍＬ加起，每孔０．０５ｍＬ，每个稀释度８孔，不必更换吸尖，—直加至１００ＣＣＩＤ５０／０．０５ｍＬ４孔做为细胞对照孔入；同时留出，每孔加°０．１ｍＬ病毒稀释液，然后放入４Ｃ冰箱中暂存。５、制备细胞悬液在５孵育期间，用消化液消化细胞，准备细胞悬液，细胞悬液的浓度为＞１０个／ｍＬ９６孔板至少需要准备１０ｍＬ，每块；６、接种细胞孵育结束后每个待测血清孔、血清对照孔（待检标本板）和病毒回滴孔和细胞对照孔（病毒回滴板）分别加入０．１ｍＬ，然后用微量板混匀器混匀细胞悬液，放入°３７ＣＣ０２孵箱中孵育培养；７、实验结果观察使用倒置显微镜每天观察ＣＰＥ，并记录病毒滴定结果，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。当１００ＣＣＩＤ５０／０．０５ｍＬ的病毒对照孔出现完全￣７ｄ病变时，判定最终结果（约５）；８、结果判定：一当最高稀释度血清的２孔中有１孔出现细胞病变，另孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数计即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度２孔完全病变，相邻低稀释度２孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效，价，；当两个相邻稀释度血清均出现１孔细胞病变另１孔不出现细胞病变则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价。５６ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文４．４实验结果４４．．１免疫后血清的抗体滴度我们用纯化后的诺如病毒Ｐ结构域蛋白（Ｐｍ）、含诺如病毒Ｐ结构域和ＥＶ７１串联中和表位的嵌合蛋白＋ＳＰ５５－７０－２８）分别作为免疫原配合佐剂（Ｐｍ－Ｗ（ＱｕｉｃｋＡｎｔｉｂｏｄｙＭｏｕｓｅ２）对小鼠进行免疫，２Ｗ后获得免疫后小鼠血清。为了检测出免疫后小鼠血清中的抗体滴度，我们将收集到的小鼠血清进行了ＥＬＩＳＡ分－－析，，Ｐ１３２０００４．１），Ｐｍ＋ＳＰ５５２８结果显示ｍ免疫小鼠后抗体滴度约为：（图７０免疫小鼠后抗体滴度约为１．）：１０２４０００（图４２；以ＥＶ７１灭活疫苗原液为抗原，抗＋ＳＰ－－）Ｐｍ５５７０２８的小鼠血清抗体滴度约为１．：４００（图４３。２５－１２０－１５ｉＪｌｉ．一０＾＾＾＾＾＃Ｎ－ＳｅｒｕｍＤｉｌｕｔｉｏｎ图４．１抗Ｐｍ小鼠血清ＥＬＩＳＡ分析Ｆ－ｉｕｒｅ４．１ＥＬＡｓｉｓｔｎｏｍｅｔｍｏｕｓｔｇＩＳａｎａｌｙｏｆａｎｉＰｍｏｒｒｏｅｉｎｅａｎｉｓｅｒｕｍｐ一「ｅ－注：免疫前小鼠血淸为ｌｍ样品ｌｍ样。，ｐ，免疫后小鼠血清为品按定比例稀释免疫后的小鼠血清并依次与包被的免疫原（Ｐｍ，０．５ｐｇ／孔）、抗鼠二抗（１：５０００）进行孵育，再加入显色底物ＴＭＢ溶液，显色ｍ－３０ｍｉｎ后终止，测各样品孔在４５０ｎｍ，各样品孔去空白后ｒｅｍ．处吸光度值，丨／ｐｌ值大于２０（虚线）即可视为阳性。５７ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文－１２０．４－ＳｅｒｕｍＤｉｌｕｔｉｏｎ－７０－图４＋ＳＰ５５Ｉ．２抗Ｐｍ２８小鼠血清ＥＬＳＡ分析Ｆ－＋－－ｉｕｒｅ４．２ＥＬＳＡｆｔｔｔｇＩａｎａｌｙｓｉｓｏａｎｉＰｍＳＰ５５７０２８ｃｈｉｍｅｒｉｃｐｒｏｅｉｎｍｏｕｓｅａｎｉｓｅｒｕｍ＋－－：方法同４注．１注，包被的免疫原为ＰｍＳＰ５５７０２８（０．５Ｍｇ／孔）。］〇＿＿＿＋＋＋＇人＇／，＾妒＃＃＼－ＳｅｒｕｍＤｉｌｕｔｉｏｎ４＋－－图．３抗ＰｍＳＰ５５７０２８小鼠血清ＥＬＩＳＡ分析－＋－－Ｆ．ｌｔ７０ｔｔｉｉｇｕｒｅ４３ＥＬＩＳＡａｎａｙｓｉｓｏｆａｎｉＰｍＳＰ５５２８ｃｈｉｍｅｒｉｃｒｏｅｉｎｍｏｕｓｅａｎｓｅｒｕｍｐ注．１注，（０．５／。：方法同４包被的免疫原为ＥＶ７１灭活疫苗原液叫孔）５８ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文４．４．２各表位嵌合蛋白的免疫印迹分析利用收获的抗Ｐ结构域蛋白小鼠血清进行免疫印迹分析（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ），结果显示，我们构建的７个嵌合蛋白（含ＧＳＴｔａｇ）都能与小鼠源性的抗血清发生免疫反应（图４．４ａ），结合第３章的免疫印迹结果，可以说明这些嵌合蛋白中部分具有针对这两种病毒的双抗原性＋ＳＰ５５－７０－２８的小鼠血清进行免疫印迹分。利用抗Ｐｍ析（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ），结果显示，我们构建的７个嵌合蛋白（不含ＧＳＴｔａｇ）中，除ＳＰ５５－了含、ＳＰ７０、ＳＰ５５７０表位的３个嵌合蛋白外，其余４个嵌合蛋白都能与该（．血清发生免疫反应，Ｐ４ｂ）。；同时结构域蛋白不与该血清产生免疫反应图４ａ－－－ＳＰ５５＋－＋＋＋————ＥｐｉｔｏｐｅｓＳＰ７０＋＋＋＋ＳＰ２８ｍ—＿—＋＋—＋＋７２ｋＤａ－｜舊ｂ－－—ＳＰ５５＋＿＋＋＋————ＥｐｉｔｏｐｅｓＳＰ７０＋＋＋＋ＳＰ２８————＋＋ｍ＋＋■＂５０ｋＤａ－Ｆ＾：＿３７ｋＤａ－＿較＿＿麵图４．４免疫印迹法分析ＥＶ７１中和抗原表位和诺如病毒Ｐ结构域嵌合蛋白ａ＋－－．抗Ｐ结构域小鼠血清，ｂ．抗ＰｍＳＰ５５７０２８小鼠血清Ｆ．４ｌｉ１ｉｇｕｒｅ４ＩｍｍｕｎｏｂｏｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｈｉｍｅｒｉｃｐｒｏｔｅｎｓｏｆＥＶ７ｎｅｕｔｒａｉｉＰｌｉｚｉｎｇｅｐｔｏｐｅｓａｎｄＮｏｒｏｖｒｕｓｄｏｍａｉｎ－ａＰＭ－＋ＳＰ５５－－．ＭｏｕｓｅａｎｔｉｄｏｍａｉｎｐＡｂｂ．ｏｕｓｅａｎｔｉＰｍ７０２８Ａｂ，ｐ一－注．．。ｏｕｓｅａｎｔａｎＡ１：各蛋白样品卜样Ｍ均约０５ｐｇ抗ＭｉＰｄｏｍｉｐｂ：５００、ｏｕｓｅａｎｔ－＋－－１Ｍ，ｉＰｍＳＰ５５７０２８ｐＡｂ１：０００抗鼠二抗配制比例为１：５０００。４．４．３中和试验因Ｐｍ＋ＳＰ５５－７０－２８嵌合蛋白免疫小鼠后获取的抗血清量较少，所以我们做了小量的中和试验。结果显示，Ｖｅｒｏ细胞单独接种ＥＶ７１病毒（１００ＣＣＩＤ５０）时，＋ＳＰ５５－－细胞病变明显，呈圆形，几乎无贴壁生长现象；以１：４稀释抗Ｐｍ７０２８的小鼠血清，（１００ＣＣｒ然后与ＥＶ７１ＩＤ５０）共同孵育，再将其接种到Ｖｅｏ细胞，结＋ＳＰ５５－－果发现细胞病变相对较少，大部分的细胞都能贴壁正常生长，说明抗Ｐｍ７０２８的小鼠血清能一（．够中和部分ＥＶ７１，使细胞不产生明显的病变图４５）。５９ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文Ｖｅｒｏｃｅｌｌｓ－＊Ｎｏ＾１＾ＣＣＤ５０ＥＶ７＋ｉｅ１０ＩＤ５０ＥＶ／１０Ｉ１１００ＣＣＩＤ５０Ｖ７１ＣＣＥ＇．ｍ＋＾ｅＳｅｒｕｍｉ，ｒｕｍ１４＋ｅｒｕｍ１＋ｅｒｕｍ１．１）２ＳＳ．８Ｓ６＿＿＿＿＿＾ｖ■ＭｎＮＴＭＭＨＨＴＰ＾．觀．＇．＇，：：．．－：．４ＨＨＨｉＨＨＨＨＨＨｉｉ■－＋＋＋＋＋６７＋＊ｒｕｍ１．４ＥＶ７１ｎｊｍ１．７１Ｓｅａｉｒｎ１：１ＥＶ１Ｓｅｒｕｍ１．３２＋７１Ｓｅ）Ｓｅ（８）ＥＶ（）（）ＥＶＩ（＇４＇”＇：，■■■——ｉ＋Ｓｅｒｕｍ１：４＋ＥＶ７１＋Ｓｅｍｍ１：８＋ＥＶ７１＋Ｓｅｒｕｍ（１：１６＋ＥＶ７１＋Ｓｅｒｕｍ（１：３２）＋ＥＶ７１（）（））■ｊｉＨｉ■ｉｍ■ｕ■＋Ｓｅ－？＾７＋ｅｒｕｍ１＋Ｖ７ｒｕｍ１４＋ＥＶ７１ｍ＋ｅｒｕｍ１＋ｐ７１Ｓｅｒｕｍ１１６ＥＶ１Ｓ３２）Ｅ１Ｉ（）Ｓ（８）ＥＶ）＿（＿＾＿＿ＥＶ７７ｌｌ００ＣＣＩＤ５０４＋－－图．５不同抗ＰｍＳＰ５５７０２８小鼠血清稀释度对ＥＶ７１的中和作用比较Ｆｉｇｕｒｅ４．５ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＥＶ７１ｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔ－－－ａｎｔｉＰｍ＋ＳＰ５５７０２８ｓｅｒｕｍｄｉｌｕｔｉｏｎ５ｘ注、．，５６ｔ：、３０ｍｉｎ）：１各组中Ｖｅ「ｏ细胞数量均为１〇１〇个各组小鼠血清使用前均进行了补体灭活处理（；ｘ２。、接种处理后第５天用倒置显微镜观察各组细胞的形态变化并拍照记录（１〇）４．５本章小节本章的主要内容就是利用前期纯化的蛋白作为免疫原对小鼠进行免疫，免疫原＋ＳＰ５５－－７０２８嵌合蛋白，包括了Ｐ结构域蛋白（Ｐｍ）和Ｐｍ。通过ＥＬＩＳＡ分析表明Ｐ结构域蛋白免疫后的小鼠血清抗体滴度可达到１：３２０００，７个嵌合蛋白都可以与该血清发生免疫反应＋ＳＰ５５－７０－２８作为免疫原可以在小鼠血清中获得。利用Ｐｍ１：１０２４０００的抗体滴度，且免疫印迹分析表明该血清中的抗体可以与部分含ＥＶ７１＋ＳＰ－－中和表位的嵌合蛋白发生免疫反应。中和试验结果明，Ｐｍ５５７０２８免疫后的一Ｖ７血清能够对ＥＶ７１起到定的中和作用，使细胞接种Ｅ１后不产生明显的病变。６０ 北京协和医学院硕士研究生学位论文第５章讨论和结论５．１讨论肠道病毒７１型（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１ＥＶ７１）和（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ，ＮｏＶ）均，诺如病毒为单股正链ＲＮＡ病毒，，它们在复制的过程中没有对遗传物质进行校对的功能所以一病毒的基因型容易发生突变，，这对它们的传统灭活疫苗研发带来了定的困难即使研发成功也需要考虑到不同基因型病毒之间交叉保护力的问题。诺如病毒目前还。工程新型疫苗不能实现大规模的体外培养，传统疫苗研发难度大因此，研制基因对预防这两种病毒的感染十分有必要。本论文以基因工程嵌合疫苗的研发策略为基础，嵌合表达既含有诺如病毒抗原成分又含有ＥＶ７１抗原成分的目的蛋白。在设计ＥＶ７１串联中和表位核苷酸序列时，我们在单表位之间加入了甘氨酸（Ｇ）、丝氨酸（Ｓ）组成的连接肽（Ｇ４Ｓ３，这样不）仅能使各单表位保持相对独立，还有利于各单表位的展示、呈递。蛋白质的空间结构对蛋白质的功能具有十分重要的影响，我们通过蛋白质空间结构预测的方法对构建的嵌合蛋白进行了空间结构的模拟，结果显示，无论是嵌合蛋白中的单表位，还是串联表位，它们都能充分的凸出展示在Ｐ结构域蛋白的ｌ〇〇ｐ２上，这从结构上体现了我们构建的嵌合蛋白作为免疫原的优势。蛋白质的可溶性会对蛋白的纯化产生影响。经超声波破碎菌体后的鉴定表明，我们构建的７个嵌合蛋白都是以部分可溶的形式存在于上清中。从包涵体中纯化目一，的蛋白涉及到变性的处理，虽然后期会再复性，但是复性不定完全这对蛋白质的活性影响很大，相对来说，从上清中纯化目的蛋白对蛋白质的活性几乎没有影响，所以我们采用了从上清中获取目的蛋白的方法。用亲和磁珠的预纯化也证实能够从一上清中获得预期的目的蛋白，而且这些蛋白都具有定的免疫原性。经过后期的蛋、白表达、超声参数、纯化仪器参数实验方法等条件的优化，我们可以通过亲和柱从。１Ｌ表达菌液的菌体中获得约４ｍｇ的含ＧＳＴ标签的目的蛋白我们首先对诺如病毒Ｐ结构域蛋白进行了纯化，并通过免疫小鼠获得了抗诺如病毒Ｐ结构域的多克隆抗体，用该抗体对我们构建的７个嵌合蛋白进行免疫印迹分析发现，它们都能与抗Ｐ结构域血清产生免疫反应。在前期的免疫印迹分析中，除含单表位ＳＰ５５和ＳＰ２８的嵌合蛋白不与抗ＥＶ７１的兔血清产生免疫反应外，其它单表位和串联表位形成的嵌合蛋白都显示出免疫反应。这两种免疫印迹分析结果表＋ＳＰ＋ＳＰ－－＋ＳＰ－＋ＳＰ－明７０、Ｐｍ５５７０２８、Ｐｍ５５７０、Ｐｍ５５，７个嵌合蛋白中有５个（Ｐｍ＋ＳＰ７０－２８、Ｐｍ２８）具有针对ＥＶ７１和诺如病毒的双重抗原性。含单表位ＳＰ５５和ＳＰ２８的嵌合蛋白对抗ＥＶ７１兔血清不表现出抗原性的原因可能是：１）相对来说，３个线性中和表位中，ＳＰ７０的抗原性比ＳＰ５５和ＳＰ２８强。２）ＳＰ５５和ＳＰ２８嵌－。３）２８串联表位的合在Ｐ结构域ｌｏｏｐ２中可能并不能够很好的展示出来含ＳＰ５５６１ 北京协和医学院硕士研究生学位论文，表明ＳＰ５５和ＳＰ２８之间可能存在协同增强抗原性的作用嵌合蛋白具有抗原性。，在７个嵌合蛋白中基于前期纯化诺如病毒Ｐ结构域蛋白的基础，我们首先选＋ＳＰ５５－７０－２８）择了纯化含３个串联表位的嵌合蛋白（Ｐｍ，因为它完全包含了３个中和表位，所以我们认为它的免疫效果相对来说会更好，纯化的Ｐ结构。研究表明域嵌合蛋白中９０％的单体蛋白会自发形成直径约２０ｎｍ的颗粒，我们纯化的Ｐｍ＋ＳＰ５５－７０－２８嵌合蛋白在电镜下可以发现直径约２０ｎｍ的颗粒，所以我们暂时没有做类似于分子筛原理的实验来筛选嵌合蛋白所形成的颗粒，而是直接用纯化后－－Ｐｍ＋ＳＰ５５－７０２８嵌合蛋白作为免疫原对小鼠进行免疫的，最终获得抗Ｐｍ＋ＳＰ５５７０－２８１Ｌ小鼠血清的抗体滴度可达：１０２４０００（ＥＩＳＡ分析），。免疫印迹分析表明除－－含ＳＰ５５７０表位的嵌合Ｐｍ＋ＳＰ５５７０－、ＳＰ７０、ＳＰ５５蛋白不与抗２８小鼠血清产生免疫反应外，其余嵌合蛋白都能与之产生免疫反应，。同时Ｐ结构域蛋白也未与抗Ｐｍ＋ＳＰ５５－７０－２８小鼠血＋ＳＰ５５－７０－清产生免疫反应，２８小。中和试验表明抗Ｐｍ鼠血清对ＥＶ７１的中和能力有限。免疫原性初步评价的效果都不理想的原因可能是：ＤＳ－－－１）ＳＰＡＧＥ和考染分析显示我们纯化的Ｐｍ＋ＳＰ５５７０２８嵌合蛋白纯度约６０％，一这对免疫效果评价有定的影响）＋ＳＰ５５－７０－２８嵌合蛋。２我们直接用纯化后的Ｐｍ白作为免疫原免疫小鼠，可能并没有充分体现出Ｐ颗粒载体的优势，理想的免疫原＋ＳＰ５５－７０－２８嵌合蛋白应该完全是Ｐｍ所形成的颗粒。３）嵌合蛋白中的串联中表位并没有充分的诱导小鼠产生相应的中和抗体，所以中和试验结果也不理想）ＥＶ７１。４一定的种属特异性中和表位的反应性可能具有。一总的来说，Ｐ本论文的研宄工作为诺如病毒结构域的应用做了进步的探索，一也为诺如病毒和ＥＶ７１二价嵌合疫苗的研发奠定了定的基础，同时拓展了基因工程疫苗研制的新思路。５＿２结论本论文的主要内容是以诺如病毒Ｐ结构域所形成的Ｐ颗粒为载体，嵌合ＥＶ７１的中和表位，构建出嵌合蛋白，并通过免疫印迹、ＥＵＳＡ、中和试验的方法对嵌合蛋白的免疫原性进行了初步评价，获得的主要结论如下：１、成功构建了７个含ＥＶ７１单中和表位、串联中和表位嵌合诺如病毒Ｐ结构域的原核表达质粒；２、获得了５个具有针对ＥＶ７１和诺如病毒双重抗原性的嵌合蛋白（Ｐｍ＋ＳＰ７０、＋ＳＰ－＋ＳＰ５＋ＳＰ７－Ｐｍ５５７０－２８－７０Ｐｍ＋ＳＰ５５－、Ｐｍ５、２８、Ｐｍ０２８）；３＋ＳＰ－－、纯化出的Ｐ结构域蛋白（Ｐｍ）和Ｐｍ５５７０２８嵌合蛋白都能自发形成直径约２０ｎｍ的颗粒，并且两者均可以诱导小鼠产生体液免疫应答；一－４－、用Ｐｍ＋ＳＰ５５７０２８嵌合蛋白免疫后的小鼠血清能够对ＥＶ７１病毒产生定的中和作用。６２ 北京协和医学院硕士研究生学位论文参考文献１．ＳｃｈｍｉｄｔＮＪＬｅｎｎｅｔｔｅＥＨＨｏＨＨ．ＡｎＡａｒｅｎｔｌＮｅｗＥｎｔｅｒｏｖｉａｉｓＩｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＰａｔｉｅｎｔｓ［，，］ｐｐｙｗｉｔｈＤｓｅａｓｅｏｆｈｅＣｅｎｔｒａｌＮｅｒｖｏｕｓＳｓｔｅｍＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉ１９ｉｔｙｓｅａｓｅｓ７４，，［］１２９３３０４－３０９：．（）２ｔｔｔｔｒｔｔ．ＬｉｎＹＬＹｕＣＨｕＹＣｅａｌ．Ｅｎｅｒｏｖｉｒｕｓｅ７１ｎｅｕａｌｉｚｉｎａｎｉｂｏｄｉｅｓｉｎｈｅｓｅｒｕｍｏｆ，，，［］ｙｐｇｕｅｍｏｎｋｅｓ－ｍａｃａｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈＥＶ７１ｖｉｍｓｌｉｋｅａｒｔｉｃｌｅｓＪ．Ｖａｃｃｉｎｅ２０１２３０７：ｑｙｐ，，［］（）－１３０５１３１２．３．ＹｉＥＪＳｈｉｎＹＪＫｉｍＪＨｅｔａｌ．Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｖａｃｃｉｎｅｓＪ．Ｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄ，，，［［］］Ｅｘｅｔ－ｒｉｍｅｎａｌＶａｃｃｉｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ２０１７６１：４１４．ｐ，，（）４．ＢｒｏｗｎＢＡＰａｌｌａｎｓｃｈＭＡ．Ｃｏｍｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１ｉｓｄｉｓｔｉｎｃｔ［］，ｐｑ－－ｆｒｏｍｏｌｉｏｖｉｒｕｓＪ．ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ１９９５３９２３：１９５２０５．ｐ，，［］（）＇５．ＬｉｎＪＹＳｈｉｈＳＲＰａｎＭｅｔａｌ．ｈｎＲＮＰＡ１ｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈｔｈｅ５ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｉｏｎｓｏｆｔ，［］，ｇｅｎｔｅｒｏｖｒｕｓ７１ａｎｄＳｉｎｄｖｉｒｕｓＲＮＡａｎｉｓｒｅｕｉｒｅｄｆｏｒｖｉｒａｌｒｅｌｉｃａｔｉｏｎｏｕｒｎａｏｆｉｂｉｓｄｑｐＪ．Ｊｌ［］ｏ－６Ｖｉｒｌｏ２００９８３１２：６１０６１１４．ｇｙ，，（）６，．张胜王杨，李凌佳．肠道病毒７１型与临床手足口病关系的研宄进展Ｊ．国际检验医学杂［］［］７－１２１７志，２０１６，３：６６５１６６．（）７．ＭｃＭｉｎｎＰＣ．Ａｎｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１ａｎｄｉｔｓｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｕｂｌｉｃ［］ｐ－ｈｅａｌｔｈｓ）．Ｆｃｒｏｂｉｏｌｏ２００２２６１９１１０７，ｉｎｉｆｉｃａｎｃｅ＾ＥＭＳＭｉＲｅｖｉｅｗ，：ｇ］ｇｙ，（）８ＴｓｅｎＨｕａｎＣＣｉＣＹｔａｌＥｉｉｏｌｏｉｃａｌｓｕｒｖｅｏｆｅｎｔｅｒｏｖｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｈｅ．ｄｅｍｉｒｕ［］ｇＦＣ，ｇＨ，，ｐｇｙｏｃｃｕｒｒｉｎｇｉｎＴａｉｗａｎｂｅｔｗｅｅｎ２０００ａｎｄ２００５：ａｎａｌｓｉｓｏｆｓｅｎｔｉｎｅｌｈｓｉｃｉａｎｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅｙｐｙｄａｔａＪ－．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃａｌＶｉｒｏｌｏ２００７７９１２：１８５０１８６０．［］ｇｙ，，（）９ｔ，ＷａｎＹＦｅｎＺＹａｎＹｅｔａｌ．ＨａｎｄｆｏｏｔａｎｄｍｏｕｈｄｉｓｅａｓｅｉｎＣｈｉｎａ：ａｔｔｅｒｎｓｏｆ，，，，，［］ｇｇｇｐｓ－ｐｒｅａｄａｎｄｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｉｌｉｔｙＪ．Ｅｉｄｅｍｉｏｌｏ１１２２６：７８１７９２．［］ｐｇｙ，２０，（）ｅＰＴＣＬｅｖｅ－１０．ＹｅＰｏｈ．ＤｌｏｍｅｎｔｏｆＮｏｖｅｌＶａｃｃｉｎｅｓａａｉｎｓｔＥｎｔｅｒｏｖｉｍｓ７１Ｊ．Ｖｉｒｕｓｅｓ，ｇ，［］ｐ［］２０１５８１：Ｅ１．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ８０１０００１．，）（１１．ＨｕａｎＣＣＬｉｕＣＣＣｈａｎＹＣｅｔａｌ．ＮｅｕｒｏｌｏｉｃＣｏｍｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＣｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈ，，，［］ｇｇｇｐＥｎｔ－ｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１ｌｎｆｅｃｉｏｎＪ，ＮｅｗＥｎｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ１９９９３４１１３：９３６９４２．［，，］ｇ（）１２，ＯｏｉＭＨＷｏｎＳＣ，ＬｅｗｔｈｗａｉｔｅＰ，ｅｔａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓ，ｄｉａｎｏｓｉｓ，ａｎｄｍａｎａｅｍｅｎｔｏｆ［］，ｇｇｇ－ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１Ｊ．ＬａｎｃｅｔＮｅｕｒｏｌｏｇ２０１０９１１：１０９７１１０５．，，［］ｙ（）ｔｔｔｔ１３．ＺｈａｎＹＴａｎＸＪＷａｎＨＹｅａｌ．Ａｎｏｕｂｒｅａｋｏｆｈａｎｄｆｏｏａｎｄｍｏｕｈｄｉｓｅａｓｅ，，，，，［］ｇｇａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｓｕｂｅｎｏｔｅＣ４ｏｆｈｕｍａｎｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１ｉｎＳｈａｎｄｏｎＣｈｉｎａＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｇｙｐｇ，［］ｏ－ｆＣｌｉｎｉｃａｌＶｉｒｏｌｏ２００９４４４：２６２２６７ｇｙ，．，（）ａｎＦｎ＇１４ｌｎｔｅｒｏｖＯｕｔｂｅａｋｔｌｅ．ＹｇＲｅｎＬＬＸｉｏＺＨｅｔａ．Ｅｉａｉｓ７１ｒｉｎｈｅＰｅｏｐｓＲｅｕｂｌｉｃｏｆ，，ｇ，［］ｐＣｈ－ｉｎａｎ０８ＪＪｏｕｒｎａｏｆＣｎｉｃａｌＭｉｃｏ００９ｉ２０．ｌｌｉｒｏｂｉｏｌ４７７：２３５１２３５２．［］ｇｙ，２，（）６３ 北京协和医学院硕士研究生学位论文１５ＺｈａｎＹＺｈｕＺＹａｎＷＺｅｔａ．ｔｔｌＡｎｅｍｅｒｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｈｕｍａｎｅｎｅｒｏｖｉｒｕｓ７１，，，，［］ｇｇｇｇｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｔｈｅ２００８ｏｕｔｂｒｅａｋｏｆＨａｎｄＦｏｏｔａｎｄＭｏｕｔｈＤｉｓｅａｓｅｉｎＦｕｙａｎｇｃｉｔｙｏｆＣｈ－ｉｎａＪ．ＶｉｒｏｌｏＪｏｕｒｎａｌ２０１０７１：１９．，，［］ｇｙ（）１６，ＡＧｕｉｄｅｔｏｃｌｉｎｉｃａｌｍａｎａｅｍｅｎｔａｎｄｕｂｌｉｃｈｅａｌｔｈｒｅｓｏｎｓｅｆｏｒｈａｎｄｆｏｏｔａｎｄｍｏｕｔｈ［ｇｐｐ，］ｄｉｓｅａｓｅＦＭＤ２０１１．Ａｖａｉｌａｂｌｅｆｒｏｍｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｐｒｏ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｅｍｅｒｉｎｇｄｉｓｅａｓｅｓ／（Ｈ）ｇ＿ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ＨＦＭＤＧｕｉｄａｎｃｅ／ｅｎ／．１７．占，柯昌文．全球手足口病流行现状及分子流行病学研宄进展［Ｊ．华南预防医学，２０１１，［华剑］】３７５－：３４４１．（）１８．ＴｅｅＫＫＬａｍＴＴＣｈａｎＹＦｅｔａｌ．ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒＧｅｎｅｔｉｃｓｏｆＨｕｍａｎＥｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１：Ｏｒｉｉｎ［，，，，］ｙｇＰｏｕｌａｔｉｏｎＤｎａｍｉｃｓＮａｔｕｒａｌＳｅｌｅｃｔｉｏｎａｎｄＳｅａｓｏｎａｌＰｅｒｉｏｄｉｃｉｔｏｆｔｈｅＶＰ１ＧｅｎｅＪ，ｐｙ，，ｙ［］－ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏ２０１０８４７：３３３９３３５０．ｇｙ，，（）１９．ＯｂｅｒｓｔｅＭＳＭａｈｅｒＫＦｌｅｍｉｓｔｅｒＭＲｅｔａｌ．ＣｏｍａｒｉｓｏｎｏｆＣｌａｓｓｉｃａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ，，，［］ｐＡｒｏａｃｈｅｓｆｏｒｔｈｅＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＵｎｔｅａｂｌｅＥｎｔｅｒｏｖｉｎｊｓｅｓＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌｐｐｙｐｆ］２０００－Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ３８３１１７０１１７４．ｇｙ：，，（）２０．ＤｏｎＸＮＹｉｎＪＣｈｅｎＹＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｉｄｅｍｉｏｌｏａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｗｏｒｌｄｗｉｄｅ，，［］ｇｇｐｇｙｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１ｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ１９７０ｔｏ２００４Ｊ．ＣｈｉｎｅｓｅＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｌｅｔｉｎ２００７［］，，－５２１１：１４８４１４９０（．）［２１］．江丽凤，叶鹏凌，高风华，等．中国大陆ＥＶ７１病毒分离株的分子流行病学研究［Ｊ］．热带病－学杂志，２０１１，１１１２）：１３４１１３４５。（２２ｉｉｔ．ＺｈａｎＹＷａｎＪＧｕｏＷｅｔａｌ．ＥｍｅｒｅｎｃｅａｎｄＴｒａｎｓｍｓｓｏｎＰａｈｗａｓｏｆＲａｉｄｌ，，，［］ｇｇｇｙｐｙＥｖｏｌｕｔｒＣＳｔｒｏｆｕｍａｎＥｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｉｎｔｈｅＣｅｎｔｒａｌＰｌａｉｎｌｖｉｎｇＥｖｏｉｏｎａｙＢｒａｎｃｈ４ａａｉｎｓＨ７１ｏｆＣｈｉｎａＪ，ＰＬｏＳＯＮＥ２０１１６１１：ｅ２７８９５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｏｕｒｎａｌ，ｏｎｅ．００２７８９５．，，）ｐ［］（ｊ２３．ＭｃＷｉｌｌｉａｍＬｅｉｔｃｈＥＣＣａｂｒｅｒｉｚｏＭＣａｒｄｏｓａＪｅｔａｌ．Ｔｈｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，，，［］ｅｖｅｎｔｓｉｎｔｈｅｆｏｕｎｄｉｎｇａｎｄｅｍｅｒｅｎｃｅｏｆｓｕｂｅｎｏｒｏｕｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｌｉｎｅａｅｓｏｆｈｕｍａｎｇｇｇｐｙｇｅｎ－ｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１Ｊ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏ２０１１８６５：２６７６２６８５．［］ｇｙ，，（）２４．ＬｉＲＬｉｕＬＭｏＺｅｔａｌ．Ａｎｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１ｖａｃｃｉｎｅｉｎｈｅａｌｔｈｙｃｈｉｌｄｒｅｎＪ，Ｎｅｗ，，，［］［］Ｅｎ－ｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ２０１４３７０９：８２９８３７．ｇ，，（）２５．ＺｈｕＦＸｕＷＸｉａＪｅｔａｌ．ＥｆｆｉｃａｃＳａｆｅｔａｎｄＩｍｍｕｎｏｅｎｉｃｉｔｏｆａｎＥｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１［］，，，，，ｙｙｇｙ－Ｖａｃｃｉｎｅａｌｏｅｄｉｃ：ｉｎＣｈｉｎａＪ，ＮｅｗＥｎｌａｎｄＪｏｕｒｎｆＭｉｎｅ２０１４３７０９８１８８２８．，，Ｊ］ｇ（）２６．ＫａｉｋｉａｎＡＺＷａｔｔＲＧＤｏｌｉｎＲｅｔａｌ．ＶｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎｂＩｍｍｕｎｅＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｏｆ，，，［］ｐｙｙｐｙ＇ａ２７－ｎｍＰａｔｔｔｔｔｔｔｔｔｒｉｃｌｅＡｓｓｏｃｉａｅｄｗｉｈＡｃｕｅＩｎｆｅｃｉｏｕｓＮｏｎｂａｃｅｒｉａｌＧａｓｒｏｅｎｅｒｉｉｓＪ．［］７２－ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏ１９１０５：１０７５１０８１．ｇｙ，，（）２７．ＲｏｂｉｌｏｔｔｉＥＤｅｒｅｓｉｎｓｋｉＳＰｉｎｓｋＢＡ．ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＪ．ＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏＲｅｖｉｅｗｓ２０１５［］，，ｙ，，［］ｇｙ－－２８１．：１３４１６４ｄｏｉ：１０．１１２８／ＣＭＲ．０００７５１４．（）２８，ＨａｒｄＭＥ．ＮｏｒｏｖｉｒｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎＪ，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｅｒｓ，２００５，［］ｙ［］６４ 北京协和医学院硕士研究生学位论文２５３－１：１８．（）２９．ＭｏｒｉｌｌｏＳＧＴｉｍｅｎｅｔｓｋＭＣ．Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ：ａｎｏｖｅｒｖｉｅｗｊ．ＲｅｖｉｓｔａＤａＡｓｓｏｃｉａｃａｏＭｅｄｉｃａ，［］ｙｆ］Ｂ－ｒａｓｉｉｅｉｒａ２０１１５７４：４５３４５８．，，（）３０，ＶｉｎｅＪ．ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＬａｂｏｒａｔｏｒＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＴｉｎｏｆＮｏｒｏｖｉｒｕｓＪ．［］ｊｙｙｐｇ［］－ＪｏｕｒｎａｌｏｆｉｉＭｉ２０１５５３２７３３８１．Ｃｌｎｃａｌｃｒｏｂｉｏｌｏ：３ｇｙ，，（）３１．ＫｒｏｎｅｍａｎＡＶｅａＥＶｅｎｎｅｍａＨｅｔａｌ．Ｐｒｏｏｓａｌｆｏｒａｕｎｉｆｉｅｄｎｏｒｏｖｉｒｕｓｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，，，［］ｇｐｔｓｏｒｏｏ－ａｎｄｅｎｏ：ｉｎＪ．ＡｒｃｈｉｖｅｆＶｉｌ２０１３１５８１０２０５９２０６８．ｇｙｐｇ，，［］ｇｙ（）３２．ＳｉｅｂｅｎａＪＪＶｅｎｎｅｍａＨＺｈｅｎＰｅｔａｌ．ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＩｌｌｎｅｓｓＩｓａＧｌｏｂａｌＰｒｏｂｌｅｍ：［，，，］ｇｇＤＥｍｅ－ｒｅｎｃｅａｎｄＳｒｅａｄｏｆＮｏｒｏｖｉｒｕｓＧＩＩ．４Ｖａｒｉａｎｔｓ２００１２００７Ｊ，ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｇｐ，［］ｆ－ｔｉｏＤｉｓｅａｓｅｓ２００９２００５：８０２８１２．Ｉｎｅｃｕｓ，，（）３３，ＶｅａＥＢａｒｃｌａＬＧｒｅｏｒｉｃｕｓＮｅｔａｌ．ＧｅｎｏｔｉｃａｎｄＥｉｄｅｍｉｏｌｏｉｃＴｒｅｎｄｓｏｆＮｏｒｏｖｉｒｕｓ，，ｇ，ｐｇ［］ｇｙｙｐＯｕｔｂｒｅａｋｓｉｎｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ２００９ｔｏ２０１３Ｊ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ２０１４，［］ｇｙ，，１－５２１：４７１５５．（）３４．ＧｌａｓｓＲｌＰａｒａｓｈａｒＵＤＥｓｔｅｓＭＫ．ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓＪ．ＮｅｗＥｎｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆ，，［］［］ｇ－Ｍｅｄｉｃ１ｉｎｅ２００９３６１８：１７７６１７８５．，，（）３５．＿ＧｏｏｄａｍｅＲ．ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓＪＣｕｒｒｅｎｔＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅＲｅｏｒｔｓ２００６，，［］ｇ［］ｐ８５－：４０１４０８．（）３６．ＷｉｄｄｏｗｓｏｎＭＡＳｕｌｋａＡＢｕｌｅｎｓＳＮｅｔａｌ．ＮｏｒｏｖｉｒｕｓａｎｄＦｏｏｄｂｏｍｅＤｉｓｅａｓｅＵｎｉｔｅｄ，，，，［］Ｓｔａｔｅｓ－ｔ１１９－１０１９９１２０００Ｊ，ＥｍｅｒｉｎＩｎｆｅｃｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ２００５１：５２．，，，（）［］ｇｇ３７．ＢａｒｔｓｃｈＳＭｆＬｏｍａｎＢＡ，ＯｚａｗａＳ，ｅｔａｌ．ＧｌｏｂａｌＥｃｏｎｏｍｉｃＢｕｒｄｅｎｏｆＮｏｒｏｖｉｒｕｓ［］ｐＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯＮＥ，２０１６，１１（４）：ｅ０１５１２１９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１５１２１９．３８，ＬｏｍａｎＢＡＳｔｅｅｌｅＤＫｒｔａ．ｔａｎｄＶａｒｉｅｄＧｌｏｌｕｒｄｅｎｏｆｉｋｗｏｏｄＣＤｅｌＴｈｅＶａｓｂａＢ［］ｐ，，，Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ：ＰｒｏｓｅｃｔｓｆｏｒＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄＣｏｎｔｒｏｌＪ．ＰＬｏＳＭｅｄｃｉｎｅ２０１６１３４：ｐ［］，，（）ｅ１００１９９９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｏｕｒｎａｌ．ｍｅｄ．１００１９９９．ｊｐ３９．ＡｈｍｅｄＳＭＨａｌｌＡＪＲｏｂｉｎｓｏｎＡＥｅｔａｌ．Ｇｌｏｂａｌｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆｎｏｒｏｖｉｒｕｓｉｎｃａｓｅｓｏｆ，，，［］ｐａｓ－ｔｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ：ａｓｓｔｅｍａｔｉｃｒｅｖｉｅｗａｎｄｍｅｔａａｎａｌｓｉｓＪ．ＬａｎｃｅＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓｇｙｙ，［］２０－１４１４８：７２５７３０．，（）４０，Ｊ．张静，常昭瑞，孙军玲等．我过诺如病毒感染性腹泻流行现状及防制措施建议．［疾病［］］２９７－监测，２０１４：５１６５２１．，（）－４１１１１１：．．徐丹，陆学东．诺如病毒感染的研宄进展Ｊ．热带医学，２０１１０９１１２［杂志，（）【］］４２ｔ，ＡｔｍａｒＲＬＢｅｒｎｓｔｅｉｎＤｌＨａｒｒｏＣＤｅｔａｌ．ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＶａｃｃｉｎｅａａｉｎｓＥｘｅｒｉｍｅｎｔａｌＨｕｍａｎ，，［］，ｇｐＮｏ－ｒｗａｌｋＶｉｒｕｓｌｌｌｎｅｓｓＪ，ＮｅｗＥｎｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ２０１１３６５２３：２１７８２１８７．，，［］ｇ（）４３ＸＶａｃｃｉｎｅａａｉｎｓｔｎｏｒｏｖｉｒｕｓＪＨｕｍａｎＶａｃｃｉｎｅ＆Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｅｕｔｉｃｓ．ＴａｎＭＪｉａｎｇ．．［］，ｇ［］ｐ，２０－１４１０６：１４４９１４５６．，（）６５ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文－４４．ｔ．ＫｒａｌｏｖｅｔｚＭＨＭａｓｏｎＨＳＣｈｅｎＱ．ＮｏｒｗａｌｋｖｉｒｕｓｌｉｋｅａｒｔｉｃｌｅｓａｓｖａｃｃｉｎｅｓＪＥｘｅｒ，，［］ｐ［］ｐＲｅｖ－ｉｅｗｏｆＶａｃｃｉｎｅｓ２０１０９３：２９９３０７．，，（）４５．ＢａｅｈｎｅｒＦＢｏａｅｒｔｓＨＧｏｏｄｗｉｎＲ．Ｖａｃｃｉｎｅｓａａｉｎｓｔｎｏｒｏｖｉｒｕｓ：ｓｔａｔｅｏｆｔｈｅａｒｔｔｒｉａｌｓｉｎ，，［］ｇｇｃｈ－ｉｌｄｒｅｎａｎｄａｄｕ！ｔｓＪ，ＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｎ２０１６２２５：１３６１３９．［］ｇｙ，，（）４６．ＥｔｔａｅｂｉＫＣｒａｗｆｏｒｄＳＥＭｕｒａｋａｍｉＫｅｔａｌ．Ｒｅｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｎｏｒｏｖｉｒｕｓｅｓｉｎｓｔｅｍ［］ｙ，，，ｐ－－ｃｅ．ｌｌｄｅｒｉｖｅｄｈｕｍａｎｅｎｔｅｒｏｉｄｓＪＳｃｉｅｎｃｅ２０１６３５３６３０６：１３８７１３９３．，，ｆ］（）４７．达尔肯，张渝疆，Ｊ．疾．托肯孙素荣．病毒抗原表位研究方法进展及其多表位疫苗的应用［［］］病预防控制通报１－，２０１６３４：８３８７．，（）４８．毛群颖，何鹏，于祥，等．人肠道病毒７１型中和抗体检测方法的实验室评价［Ｊ．中国生物［］］－，２０１０２３８：８８５８８８制品学杂志．，（）４９．高文超，国泰，王玉琳．ＥＶ７１抗原表位的研究方法及研宄进展［Ｊ．中国生物制品学杂志，［］］２０－１４２７６：８５２８５５．，（）５０ＦｏｏＤＧＡｌｏｎｓｏＳＰｈｏｏｎＭＣｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｌｉｎｅａｒｅｉｔｏｅｓｆｒｏｍ．，］，，ｇｐｐ［ｔｈｅＶＰ１ｃａｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎｏｆＥｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１ｕｓｉｎｇｓｎｔｈｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓＪ．ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈｐｙ，［］２００７－１２５１６１６８．，（）；５１ｌ．ＦｏｏＤＧＡｏｎｓｏＳＣｈｏｗＶＴｅｔａｌ．Ｐａｓｓｉｖｅｒｏｔｅｃｔｉｏｎａａｉｎｓｔｌｅｔｈａｌｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１，，，［］ｐｇｆｔｉｉｎｅｕｔａｌｔｉｔｅａｓｔｔｔｉｄｅｉｎｅｃｏｎｉｎｎｅｗｂｏｒｎｍｃｅｂｒｉｚｉｎａｎｂｏｄｉｅｓｅｌｉｃｉｄｂｎｈｅｉｃｐｅＪ．ｙｇｙｙｐ［］－ＭｉｃｒｏｂｅｓａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｎ２００７９１１１３０６：２９９１．，，（）５２ＣｈｏｕＡＨＬｔｔｔｔｔ？．ＬｉｕＣＣｉｅｎＳＰｅａｌ．Ｉｄｅｎｉｆｉｃａｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｅｒｉｚａｉｏｎｏｆａｃｒｏｓｓ，，，［］ｎｅｕ－ｔｒａｌｚａｔｉｏｎｅｉｔｏｅｏｆＥｎｅｒｏｖｉｒｕｓ７１．Ｖａｃｃｉｎｅ２０１１２９２６：４３６２４３７２．ｉｐｐｔＪ［］，，（）－５３．ＬｉＹＸＺｈａｏＨＣａｏＲＹｅｔａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔａｎｄｅｍｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｒｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｅｉｔｏｅｓｏｆ［］，，，ｇｐｐｈｕｍａｎＥｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１ｅｌｉｃｉｔｅｄｒｏｔｅｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｉｎｍｉｃｅＪ．ＶｉｒｏｌｏＪｏｕｒｎａｌ２０１４ｐｙ，，［］ｇｙ－１１１：７９８６．（）ｒａｓＢＶＨａｒｄＭＥｏｋ－５４ａｄＤｌａｎｄＴｅｔａｒａＣｒｔｌｈｉｃＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｔｈｅｒｗａ．Ｐｌ．ＸａｌｏｒａｆＮｏｌｋ］，，，ｙｓｐ［ｙｙｇ－Ｖｉ２９０ｉｒｕｓＣａｓｉｄＪ．Ｓｃｅｎｃｅ１９９９２８６５４３８：２８７．ｐ，，（［］）５５，ＣｉａｒｌｅｔＡＢＷｈｉｔｅＬＪＣｈｅｎＲｅｔａｌ．ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＲｅｕｉｒｅｍｅｎｓｆｏｒｔｈｅＡｓｓｅｍｂｌｏｆＮｏｒｗａｌｋ，，ｔ［］，ｑｙ－－．ＶｉｒｕｓＬｒｔｃｌｅｓＪ．ｏｕｒｎａｏｆＶｒｏｌｏ２００２：４０ｉｋｅＰａｉ［Ｊｌｉｇｙ，，７６（８）４４４０５５］５６ＴａｎＭＨｅｄｅＲＳＪｉａｎＸＴｈｅＰＤｏｍａｉｎｏｆＮｏｒｏｖｉｒＣａｓｉｄＰｒｏｔｅｉｎＦｏｒｍｓＤｉｍｅｒａｎｄ．．ｕｓ］，ｇ，ｇｐ［－ｔ－ＢｉｔＶ７８ｉｎｄｓｔｏＨｉｓｔｏＢｌｏｏｄＧｒｏｕＡｎｅｎＲｅｃｅｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｉｒｏｌｏ２００４１２：６２３３ｐ，，ｇｐ［ｊ］ｇｙ（）６２４２．５７．ＴａｎＭＪｉａｎＸ．ＴｈｅＰＤｏｍａｉｎｏｆＮｏｒｏｖｉｒｕｓＣａｐｓｉｄＰｒｏｔｅｉｎＦｏｒｍｓａＳｕｂｖｉｒａｌＰａｒｔｉｃｌｅ［］，ｇＴｈａ－２２ｔＢｉｎｄｓｔｏＨｉｓｔｏＢｌｏｏｄＧｒｏｕＡｎｔｉｅｎＲｅｃｅｔｏｒｓＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏ２００５７９：ｐｇｐ［］ｇｙ，，（）－１４０１７１４０３０．５８．ＢｅｒｅｓｚｃｚａｋＪＺＢａｒｂｕＭｔｔｔｔＩＭＴａｎｅａｌ．ＳｒｕｃｔｕｒｅｓａｂｉｌｉａｎｄｄｎａｍｉｃｓｏｆｎｏｒｏｖｉｒｕｓＰ［］，，，，ｙｙｄｏｍａｉｎｄｅｒｉｖｅｄｒｏｔｅｉｎｃｏｍｌｅｘｅｓｓｔｕｄｉｅｄｂｎａｔｉｖｅｍａｓｓｓｅｃｔｒｏｍｅｔｒＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｐｐｙｐｙ［］６６ 北京协和医学院硕士研究生学位论文Ｓｔｒｕｃｔｕ－ｒａｌＢｉｏｌｏ２０１２１７７２：２７３２８２．ｇｙ，，（）５９．ＴａｎＭＦａｎＰＡ，ＸｉａＭｅｔａｌ．ＴｅｒｍｉｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｎｏｒｏｖｉｒｕｓＰｄｏｍａｉｎｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎａ［］，ｇ，ｎｅｗ－ｔｅｏｆｓｕｂｖｉｒａｌａｒｔｉｃｌｅｓｔｈｅｓｍａｌＰａｒｔｉｃｌｅｓＶｉｒｌｏ２０：４５ｙｐｐｌＪ．ｏ，１１４１０２３３５２．，ｐ［ｇｙ，（）］６０ＴａｎＭ－ｌｒＪｉａＣＴｅｒｍｉｎＣｌｔｔｔ．ＭｅｌｅＪｎＸ．ａｌＡｒｉｎｉｎｅｕｓｅｒＩｓＥｓｓｅｎｉａｌｆｏｒＲｅｃｅｏｒＢｉｎｄｉｎ［］，，ｇｇｐｇ－ｏｆｉｔＮｏｒｏｖｉｒｕｓＣａｓｄＰｒｏｅｉｎＪ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏ２００６８０１５：７３２２７３３１．ｐ［］ｇｙ，，（）６１．ＴａｎＭＦａｎＰＡＣｈａｃｈｉｏＴｅｔａｌ．ＮｏｒｏｖｉｒａｌＰａｒｔｉｃｌｅ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｆｕｎｃｔｉｏ［］，ｇ，ｙ，ｐｎａｎｄ，－ａ－ｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｖｉｒｕｓｈｏｓｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎＪＶｉｒｏｌｏ２００８１：１１５ｐｐ．３８２１２３．［］ｇｙ，，（）６２．ＴａｎＭＪｉａｎＸ．ＴｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＰａｒｔｉｃｌｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｍｍｕｎｏｅｎｉｃｉｔｏｆｎｏｒｏｖｉｒｕｓＰ，［］ｇｐｇｙ－ｒｏｔｅｉｎＪ．ｉｍｍｕｎｏｌｏ２０１２１３６１：２８２９．ｐ，，［】ｇｙ（）６３．ＦａｎＨＴａｎＭＸｉａＭｅｔａｌ．ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＰＰａｒｔｉｃｌｅＥｆｆｉｃｉｅｎｔｌＥｌｉｃｉｔｓＩｎｎａｔｅＨｕｍｏｒａｌａｎｄ，，，，［］ｇｙＣｅｌｌｕｌａｒｌｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯＮＥ，２０１３，８（４）：ｅ６３２６９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｍａｌ．ｐｏｎｅ．００６３２６９．６４，ＣａｏＳｏｕＺＹＴａｎＭｅｔａｌ．ＳｔｒｕｃｔｕｒａａｓｓｏｒｔｈｅＲｅｃｏｎｔｎｏｏｏｄＧ，，，ｌＢｉｆｉｉｏｆＢｌｒｏｕ［］Ｌｇｐｆ－ＴｒｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｂＮｏｒｏｖｉｒＪＪｏｕｒｎａＶｉｒｏｌｏ１１１ｕｓ．ｌｏｇｙ：５９４９５９５７．ｙ［］，２００７，８（）６５．ＴａｎＭＨｕａｎＰＷＸｉａＭｅｔａｌ．ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＰａｒｔｉｃｌｅａｎｏｖｅｌｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｖａｃｃｉｎｅ，，，，［］ｇｐｐ－ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔａｎｄａｎｔｉｂｏｄｒｏｄｕｃｔｉｏｎＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏ２０１１８５２：７５３７６４．ｐｙｐ［，，］ｇｙ（）６６．ＸｉａＭＴａｎＭＷｅｉＣｅｔａｌ．ＡｃａｎｄｉｄａｔｅｄｕａｌｖａｃｃｉｎｅａａｉｎｓｔｉｎｆｌｕｅｎｚａａｎｄｎｏｒｏｖｉｒｕｓｅｓＪ．，，，［］ｇ［］Ｖａｃｃｎｅ－１２９４４：７．ｉ２０１６７０７６７７，，（）６７．ＴａｎＭＪｉａｎＸ．ＮｏｒｏｖｉｍｓＰａｒｔｉｃｌｅａｓｕｂｖｉｒａｌｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｆｏｒｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔ［］，ｇｐ，ｐｐａａ－ｉｎｓｔｎｏｒｏｖｓｒｏｔｆｌｇｉｒｕａｖｉｒｕｓａｎｄｉｎｕｅｎｚａｖｉｒｕｓＪ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ２０１２７６：８８９８９７．，，，［］（）６８．ＷａｎＬＨｕａｎＰＦａｎＨｅｔａｌ．Ｐｏｌｖａｌｅｎｔｃｏｍｌｅｘｅｓｆｏｒｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔ＾．，，，［］ｇｇｇｙｐｐ］Ｂ－ｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２０１３３４１８：４４８０４４９２．，，（）［６９］．ＷａｎｇＬ，ＣａｏＤ，ＷｅｉＣ，ｅｔａｌ．ＡｄｕａｌｖａｃｃｉｎｅｃａｎｄｉｄａｔｅａｇａｉｎｓｔｎｏｒｏｖｉｒｕｓａｎｄｈｅｐａｔｉｔｉｓＥｖ－ｒｕｓ．ａｃｃｎｅ：ｉＪＶｉ，２０１４３２４４４５４５２，［，］（）－７０，．庄敏，．Ｊ．国２００４２７３：１３７１４１．］李迪病毒嵌合疫苗的研宄进展外医学免疫学分册，［［］（）７１．ＣｈａｎＧＪＨｕｎｔＡＲＨｏｌｍｅｓＤＡｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｂｉｏｓｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆ，，，［］ｇｇｙｒｅｍｅｍｂｒａｎｅａｎｄｅｎｖｅｌｏｅｒｏｔｅｉｎｓｂｔｈｅｃｈｉｍｅｒｉｃｌａｓｍｉｄｏｆｄｅｎｕｅｖｉｒｕｓｔｅ２ａｎｄｐｐｐｙｐｇｙｐＪａａｎｅｓｅ－ｅｎｃｅｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓＪ．Ｖｉｒｏｏ２００３３０６：１７０１８０．ｐｐｌ，，１［］ｇｙ（）７２ＫａｗａｈａｒａＭａｔｓｕｏＫＮａｋａｓｏｎｅｅｔａｌＣｏｍｂｉｎｅｄｉｎｔｒａｒｅｃｔａｌ／ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｏｆ，．［］，，ｃｏｍｂ－ｒｅｉｎａｎｔＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓｂａｃｉｌｌｕｓＣａｌｍｅｔｔｅＧｕ６ｒｉｎＢＣＧｉｎｄｕｃｅｓｅｎｈａｎｃｅｄ（）－ｔ－－ｔｔｉｍｍｕｎｅｒｅｓｏｎｓｅｓａａｉｎｓｈｅｉｎｓｅｒｔｅｄＨＩＶ１Ｖ３ａｎｉｅｎＪ．Ｖａｃｃｉｎｅ２００２２１３４：１５８ｐｇｇ［］，，（）１６６．６７ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文＿一英文缩略词表英文缩写歡全称中文全称ＡＰＳＡｍｍｏｎｉｕｍＰｅｒｓｕｌｆａｔｅ过硫酸铵ＢＳＡＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ牛血清白蛋白ＣＣＩＤ５０ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＩｎｆｅｃｔｉｖｅＤｏｓｅ５０半数致细胞病变剂量ＣＰＥＣｙｔｏｐａｔｈｉｃＥｆｆｅｃｔ细胞病变效应ＤＮＡＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ脱氧核糖核酸ＤＴＴＤＬ－Ｄｔｉｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ二硫苏糖醇ＥＢＥｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ溴化乙淀ＥＤＴＡＥｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃＡｃｉｄ乙二胺四乙酸ＦＢＳＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ胎牛血清ＧＳＴＧｔｔ－ｔｒｌｕａｈｉｏｎｅＳａｎｓｆｅｒａｓｅ谷胱甘肽巯基转移酶－ＢＨＢＧＡＨｉｓｔｏｌｏｏｄＧｒｏｕｐＡｎｔｉｅｎ组织血型抗原ｇＨＦＭＤＨａｎｄＦｏｏｔａｎｄＭｏｕｔｈＤｉｓｅａｓｅ手足口病，，３－－ＩＰＴＧＩｓｏｐｒｏｐｙｌＤｔｈｉｏｌａｃｔｏｒａｎｏｓｉｄｅ异丙基硫代半乳糖苷（ｇａｐｙＩＲＥＳＩｎｔｅｒｎａｌＲｉｂｏｓｏｍｅＥｎｔｒｙＳｉｔｅ内部核糖体进入位点ＬＢＬｙｓｏｇｅｎｙＢｒｏｔｈ溶菌肉汤ＮＣＮｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ硝酸纤维素ＮＭＷＬＮｏｍｉｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｈｔＬｉｍｉｔ标称分子量ｇＯＲＦＯｐｅｎＲｅａｄｉｎｇＦｒａｍｅ开放性阅读框ＯＤＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ吸光度ＰＣＲＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ聚合酶链式反应ＰＢＳＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ磷酸盐缓冲液＿ＰＶＤＦＰｏｌＶｉｎｉｄＦｌｉｄｙｌｅｎｅｕｏｒｅ聚偏氟乙烯ｙＰＭＳＦＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌＦｌｕｏｒｉｄｅ苯甲基磺酰氟ＰＡＧＥＰｏｌｙａｃｒｙ丨ａｍｉｄｅＧｅ丨曰ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ聚丙稀酰胺凝胶电泳ＲＮＡＲｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ核糖核酸ＳＰＳｙｎｔｈｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅ合成肽ＳＤＳＳｏｄｉｕｍＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｆａｔｅ十二炼基硫酸钠ＴＥＭＥＤＴｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ四甲基乙二胺ＵＴＲＵｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄＲｅｇｉｏｎｓ非翻译区ＶＬＰＶ－ｉｒｕｓＬｉｋｅＰａｒｔｉｃｌｅ病毒样颗粒ＶＰＶｉｒａｌＰｒｏｔｅｉｎ病毒蛋白质ｘｘ２ＹＴ２ＹｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔＴｒｙｐｔｏｎｅ２酵母提取物胰蛋白胨６８ 北京协和医学院硕士研究生学位论文縣二主要溶液配制１．氨节青霉素钠溶液（１００ｍｇ／ｍＬ，１０ｍＬ）一取１５ｍＬ离心管个．０，加入１０ｍＬ蒸馏水到其中，然后用分析天平称取１ｇ氨苄青霉素钠粉末，使其完全溶解于１〇ｍＬ蒸馏水中；在开启的超净工作台中用、０．５ｍＬ离心．２２Ｍｍ的滤器将溶解完全的氨苄青霉素钠溶液过滤，并用１管分装，１ｍＬ／－。管，保存于２０ｔ冰箱２．ＬＢ培养基（２００ｍＬ）））、（称取氣化钠（ＮａＣＩ：２．０ｇ、胰蛋白胨（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ：２．０ｇ酵母提取物Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ）：１．０３种成分用２００ｍＬ蒸馏水溶解于１Ｌ干净的三角瓶中，对其ｇ，将这进行高压蒸汽灭菌１２１Ｘ：、２０ｍｉｎ后冷却使用。不同配制体积按比例增减。３．２ＹＴ培养基（２００ｍＬ）称取氯化钠（ＮａＣＩ）：１．０ｇ、胰蛋白胨（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）：２．０ｇ、酵母提取物（Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ）：２．０ｇ，将这３种成分用２００ｍＬ蒸馏水溶解于１Ｌ干净的三角瓶中，对其°进行高压蒸汽灭菌１２１Ｃ、２０ｍｉｎ后冷却使用。不同配制体积按比例增减。４．ＬＢ皿，９０ｘ１５ｍｍ）培养（８个称取氯化钠（ＮａＣＩ）１．０、ｔ：１．０、：ｇ胰蛋白胨（Ｔｒｙｐｏｎｅ）ｇ酵母提取物（Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ）：０．５ｇ、琼脂（Ａｇａｒ）：１．５ｇ，将这４种成分用１００ｍＬ蒸馆水溶解于２５０ｍＬ°１Ｃ、２０ｍ。千净的三角瓶中，对其进行高压蒸汽灭菌２１ｉｎ灭菌完成后，进入超净工°作台，待灭菌后的溶液温度降至约５０Ｃ时（手可触摸，无明显烫感），加入１０〇ｍＬ氨苄青霉素钠溶液（１〇〇ｍｇ／ｍＬ），充分摇匀，取８个培养皿空板，趁热将三角瓶中的溶液尽量等体积的倒入８个空培养皿中，使溶液均匀铺满培养皿的底部，保持培养皿呈水平，放置超净工作台中，待其冷却、凝固，然后盖上培养皿盖，用封口膜°（ＰａｒａｆｉｌｍＭ）封住培养皿，做好标识，放置４Ｃ保存。５．５０％甘油（５０ｍＬ）用量筒量取２５ｍＬ甘油，加入到适当容器中，再量取２５ｍＬ蒸馏水，混匀后，°高压蒸汽灭菌１２１Ｃ、２０ｍｉｎ，完成后放入超净工作台中，常温放置即可。６．谅臟雛浓度与线性ＤＮＡ分离范围琼脂糖凝胶浓度线性ＤＮＡ长度（ｂｐ）０—．５１０００３００００—０１．０５００１０００—１．２４００７０００—１．５２０３０００２—．０５０２０００６９ 北京协和医学院硕士研究生学位论文７．１〇ｘ退火缓冲液（１〇ｍＬ）、称取Ｔｒｉｓ：０．１２１ｇ、ＥＤＴＡ：０．０２９ｇ氯化钠（ＮａＣＩ）：０．５８４ｇ，加入到１５ｍＬ－：离心管中．５ｍＬ，１．０ｍＬ／，置于２０ｔ，用１０ｍＬ去离子水完全溶解，１离心管分装管保存。８．ＰＢＳ溶液（００ｍＬ）１０取ＰＢＳＴａｂｌｅｔｓ１０片，加入到适当容器中，用１０００ｍＬ蒸馏水使其完全溶解，室温下保存。９．ＰＢＳＴＣｌＯＯＯｍＬ）溶液？取Ｎａ２ＨＰ０４：１．４２ｇ、ＮａＨ２Ｐ０４：０．２２ｇ、氯化钠（ＮａＣＩ）：８．１９ｇ、ＴＷＥＥＮ２０：２ｍＬ，加入到适当容器中，用９００ｍＬ蒸馏水完全溶解，调ｐＨ至７．４，最后用蒸馏水定容至１０００ｍＬ，室温下保存。１０．．抗原包被液（ｐＨ９６，５００ｍＬ）取ＮａＨＣ０３：４．２ｇ，加入到适当容器中，用５００ｍＬ蒸馏水完全溶解，调ｐＨ至９．６。，室温下保存１１■终止液（２ＭＨ２Ｓ０４０ｍＬ），１０用适当容器加入８０ｍＬ蒸馏水，取浓硫酸溶液加入其中，再用蒸馏水定容至１００ｍＬ，室温下保存。１２．２．５％ＢＳＡ（５０ｍＬ）＂，＿，称取八丨１）１１１＾１６￡＾１１６７：１．２５９加入适当容器中，量取５〇１＾１卩６３１加入使°ｘ）其完全溶解，再加入５０ｐＬＮａＮ３（１０００，混匀后置于４Ｃ保存。１３．５％封闭液（５０ｍＬ）称取脱脂奶粉，：２．５ｇ，加入适当容器中量取５０ｍＬＰＢＳＴ加入，使其完全溶解，置于４Ｃ保存。－１４．．１５ＭＴｒｉｓＨＣＩＣＨ８．８，５００ｍＬ）ｐ用天平称取Ｔｒｉｓ：９０．８５５，加入到适当容器中ｇ，用４５０ｍＬ蒸馏水溶解后，用浓盐酸调ｐＨ至８．８，最后用蒸馏水定容至５００ｍｌ，室温下保存。－１５．０．５ＭＴｒｉｓＨＣＩＣｐＨ６．８，５００ｍＬ）用天平称取Ｔｒｉｓ：３０．２８５，加入到适当容器中ｌｇ，用４５０ｍ蒸馏水溶解后，用．８５００ｍｌ。浓盐酸调ｐＨ至６，最后用蒸馏水定容至，室温下保存１６．５０ｍＭＴｒｉｓＣ５００ｍＬ），用天平称取Ｔｒｉｓ：３．０２９加入到适当容器中，用５００ｍｌ蒸馏水溶解后ｇ，室温下保存。ｘ上－１７．６（１〇ｍＳＤＳ样缓冲液ｌ，ＰＡＧＥ用）用１５ｍＬ离心管取１．０ＭＴｒｉｓ：３．０ｍｌ、ＳＤＳ：１．０ｇ、溴酷蓝（ＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌＢｌｕｅ）：２４．０ｍｇ、甘油：３．０ｍｌ，溶解后用蒸馏水定容至１０ｍＬ，再分装于１．５ｍＬ离心管中，７０ 北京协和医学院硕士研究生学位论文°－－Ｌ－Ｍｅ１ｍＬ／管，２０Ｃ保存，使用时每管再加入５０ｊｐ巯基乙醇（２ｒｃａｔｏｅｔｈａｎｏｌ）。｜ｐ１８．１〇ｘ电泳液缓冲液（Ｒｕｎｎｉｎｇｂｕｆｅｒ，１０００ｍＬ）２８５４４．０．称取Ｔｒｉｓ：３０．ｇ、甘氨酸：１ｇ、ＳＤＳ：１００ｇ，加入到适当容器中，用８００ｍＬ蒸馏水溶解后，再用浓盐酸调ｐＨ至８．５，最后用水定容至１０００ｍｌ，室温下ｘ保存，；使用工作液时，取１〇电泳缓冲液１〇〇ｍＬ加入蒸馏水定容至１０００ｍＬ即可。１９．１〇ｘ转移缓冲液（Ｔｒａｎｓｆｅｒｂｕｆｅｒ，１０００ｍＬ）ｒｉｓ．２、１４．，，称取Ｔ：３０８５ｇ甘氨酸：４０ｇ加入到适当容器中用８００ｍＬ蒸馏水溶解后，最后用水定容至１〇〇〇ｍｌ，室温下保存；使用１ｘ工作液时，取１〇ｘ转移缓冲液１００ｍＬ，加入适当容器中，再取２００ｍＬ甲醇（终浓度为２０％），然后用蒸馏水定容至１０００ｍＬ即可。２０．１０％过硫酸铵（ＡＰＳ，１０ｍＬ）称取１．０ｇ过硫酸铵加入到１５ｍＬ离心管中，加入１０ｍＬ蒸馏水使其完全溶解，°°ｍ－，１，２０，４Ｃ。然后用１．５Ｌ离心管分装．０ｍＬ／管Ｃ保存使用时放２１．１０％ＳＤＳ（３０ｍＬ；戴口罩操作，避免吸入粉末）称取３．０ｇＳＤＳ加入到５０ｍＬ离心管中，加入３０ｍＬ蒸馏水使其完全溶解，常°温保存。因气温低结晶时放３７Ｃ再溶解即可。２２＿１００ｍＭＰＭＳＦ（１０ｍＬ；戴口罩操作，避免吸入粉末）称取０．１７４ｇＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ）加入到１５ｍＬ离心管中，°ｍＬ－用１０ｍＬ异丙醇使其完全溶解，１．５ｍＬ离心管分装，１．０／管，２０Ｃ保存。２３ＳＤＳ－ＰＡＧＥ．分离胶ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝—胶配方表（１．０ｍｍ１０孔）￥离胶度８、１０、１２％｜＿＿＿—＾￣￣ｓ３块４块１块２块３块４块１块２块３块７ｊＴ二二＾ｆ｜｜｜ＨＯ．６５ｍｌ５．３０ｍＬ７．９５ｍｌ１０．６Ｌ２．４０Ｌ４．８０ｍ７．２０ｍＬ．６ｍＬ２．１５ｍｌ４．０ｍＬ６４５ｍＬ８６．２ｍｍＬ９０３．．０ｍＬ－３组１．５ＭＴｒｉｓＨｃｌＨ：．８１２Ｌ２．５０．７５５．０ｍＬ．２５２．５０ｍ３．７５ｍｌ．０ｍＬ．２５ｍＬ．５ｍＬ．７ｍＬ５．Ｌ（ｐ８５ｍｍＬｍＬ１ｍＬＬ５１２３５０ｍ）４０％Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ１．０ｍＬ２＞０ｍＬ３．０ｍＬ４．０ｍＬ１．２５ｍＬ２．５０ｍｌ３７５ｍＬ５．０ｍＬ１．５０ｍＬ３．０ｍＬ４．５ｍＬ６．０ｍＬ１０ＨＳＤＳ５０ｘｌ１００ｌ１５０ｉｉ２００ｐｉ５０ｐｉ１００１５０ｍＬ２００ｍＬ５０１００ｍＬ１５０２００ｉｌ＼ｎ＼＼＾１０％ＡＰＳ２５ｍＬ５０ｎＬ７５ｎＬ１００ｕＬ３５７０ｌＬ１０５ｌｌ１４０ｉｉ７ｉｌ１０５Ｌ１４０ｉＬ＼＼０３＼０［ｍｊＴＥＭＥＤ４ｉｉ１Ｌ１６．５ｉＬ１Ｌ１９．５Ｌ６Ｌ７．５Ｌ１３ｉｌ１９．２６ｘ８＼２ｐ６｜３ｍｐ２ｐｍ＼５ｆＬ总体积约５ｍＬ１０ｍＬ１５ｍＬ２０ｍＬ５ｍＬ１０ｍＬ１５ｍｌ２０ｍＬ５ｍＬ１０ｍＬ１５ｍＬ２０ｍＬ——ＳＤＳ－ＰＡＧＥ—＾．５１５Ｉ（１ｍｍ？ｌ）分离胶浓度８％１０％１２Ｈ￣块数块２块３块４块１块２块３块４块１块２块３块４块Ｈ．０４．７７ｍＬ９．５４ｍＬ１４．３ｍＬ１９．１ｍＬ４．２ｉｎＬ８．６４ｍ１．０ｍＬ１７．ｍＬ．８７ｍＬ７．７４ｍＬ１１．６ｍＬ１．５ｍｌ３Ｌ３３３５纽１．５ＭＴｒｉｓ－Ｈｃｌ（ｐＨ：８．８２．２５ｍＬ４．５０ｍＬ６．７５ｍｌ９．０ｍＬ２．２５ｍＬ４．５０ｍｌ６．７５ｍｌ９．０ｍＬ２．２５ｍＬ４．５ｍＬ６．７５ｍｌ９．０ｍＬ）４〇知Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ１．８ｍＬ３．６０ｍＬ５．４ｍＬ７．２ｍＬ２．２５ｍＬ４．５０ｍｌ６．７５ｍＬ９．０ｍＬ２．７０ｍＬ５．４ｍＬ８．１ｍＬ１０．８ｍＬ１０％ＤＳ９Ｌ１８Ｌ２７０Ｌ３６ｉＬ９０ｉｌ１０２７０Ｌ６０ｘＬ１＜－２７０Ｌ６０ｘＬＳ０ｍ０ｐＭ０＼８ｐＬｐ３９０ｙ８０ｍ３＼｜哞Ｍ分Ｐ４Ｌ１Ｌ１８ｉｉ１０％ＡＳ５ｍ９０Ｍｉ－３５ｕ１８０以６３ｍＬ１２６＼ｉｌ９２５２［Ｌ５４１０８ｊＬ１６２ＭＬ２１６［ｉｌＴＥＭＥＤ７．２ｕＬ１４．４＾ｉＬ２１．６ｐＬ２８．８＼ｉｌ１１．７ｍＬ２３．４３５．１＼ｉＬ１１７＼ｉｌ１３．５ｙｉｌ２７４０．５｜ｉＬ５４ｕＬ总体积约９ｍＬ１８ｍＬ２７巾Ｌ３６ｍＬ９ｍＬ１８ｍＬ２７ｍＬ３６ｍＬ９ｍＬ１８ｍＬ２７ｍＬ３６ｍＬ｜７１ 北京协和医学院硕士研究生学位论文２４－＿ＳＤＳＰＡＧＥ浓缩胶－ＳＤＳＰＡＧＥ凝胶配方表（浓缩胶５％）—孔数１——厚度．０ｍｍ１０孔１．５ｍｍ１５孔１块２块３块４块１块２块３块４块雙Ｈ２０１．２０ｍＬ２．４０ｍＬ３．６ｍＬ４．８ｍＬ１．８ｍＬ３．６０ｍＬ５．４０ｍＬ７．２０ｍＬ－组０．５ＭＴｒｓｃ．．．．．．．ｉＨｌｐＨ：６８５００ｍＬ１０ｍＬ１５ｍＬ２０ｍＬ７５０１５０ｍＬ２２５ｍＬ３０ｍＬ（）４０％Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ２４０ｐＬ４８０ｐＬ７２０ｉｌ９６０ｘｌ３６０Ｌ７２０ｉｌ１．０８ｍＬ１．４４ｍＬ＼＼ｐ＼１０％ＳＤＳ２４叫４８＼ｘｌ７２ｉｌ９６ｘｌ３６ｍＬ７２ｍＬ１０８ｐＬ１４４ｐＬ＼＼分０％ｘｘｘｘ１ＡＰＳ１４ｍＬ２８ｊＬ４２Ｌ５６ｌＬ２１ｘｌ４２ｌ６３ｌ８４ｌ｜＼［＼＼＼＼ＴＥＭＥＤ２．６ｎＬ５．２７．８ｘｌ１０．４叫３．９ｘｌ７．８ｉＬ１１．７１５．６ｉＬ＼＼｜｜总体积约２ｍＬ４ｍＬ６ｍＬ８ｍＬ３ｍＬ６ｍＬ９ｍＬ１２ｍＬ２５ＰＢＳ－Ｌ１００．（ｍＬ）终浓度储存液加入量ＰＢＳ／／９０ｍＬｅｔｅＲＡＴａｂｌｅｔｃｏｍｐｌＵＬＴｓ／／２片巳ｅｎｚｏｎａｓｅ？Ｎｕｃｌｅａｓｅ／２５０Ｕ／ｊＬ２．４Ｌ｜ｐ？Ｔｒｔｏ－ｉｎＸ１００１％（ｖ／ｖ）１０ｍＬ．－ＤＬＤｉｔｈｔｒｉｔＤＴＴ１．１０ｉｏｈｅｏｌ（）ｍＭ１０Ｍ０ｊＬ｜ＥＤＴＡ１ｍＭ１１．０Ｍ００ｊＬ｜Ｌｙｓｏｚｙｍｅ１ｍｇ／ｍＬ１００ｍｇ／ｍＬ１．０ｍＬ加蒸馏水定容至１００ｍＬ。７２ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文个人简介姓名：李超性别：男出生年月：１９８９．０８民族：汉籍贯：四川省南充市学习和工作经历：？２００７—。．０９２０１２．０６在川北医学院学习，专业为临床医学，获医学学士学位？２０１３—．１０２０１４．０６在成都市新都区人民医院工作。？—２０１４．０９２０１７．０６在北京协和医学院学攻读医学硕士学位，专业为免疫学《在读期间参与发表的学术论文１．李超，．ＥＶ７１，刘波，陶玉芬，李昕潼，刘建生刘红旗病毒中和表位和诺如病－？中国生物工程杂志．２０１７３７１１６＿毒Ｐ结构域嵌合蛋白的原核表达，（：）２，，ＩＩ．１７型诺如．刘波，李超，陶玉芬，李昕潼刘建生和占龙，刘红旗．猴源Ｇ．病毒Ｐ结构域及其变体的原核表达．实验、纯化和抗原性鉴定动物与比较医学２０－１６３６５：３３４３３９．，）（３，．陶玉芬，刘波，李超，李昕潼刘建生，杨昭庆，刘红旗．阿司匹林诱导ＥＢ病－毒转化的人Ｂ淋巴细胞凋亡．中国药理学通报．２０１７３３２：１８５１９０．，（）４．ＺｈａｎｌｏｎｅＢｏＬｉｕＹｕｆｅｎＴａｏＣｈａｏＬｉＭｉｎＸｉａＷｅｉｍｉｎｈｏｎＸｉＪｉａｎｇＨ，，，，ｇ，，，ｇＺｇｇＨｏｎｉＬｉｕＭｉｎＴａｎ．ＮｏｒｏｖｉｒＧＩＩ．１７ＮａｔｕｒａｌＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎＲｈｅｓｕｓｇｑ，ａｎｄｇｕｓ－ＭｏｎｋｅｙｓＣｈｉｎａ．ＥｍｅｒｉｎＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ．２０１７２３２：３１６３１９．，ｇｇ，（）５．ＣｈａｏＬｉＹｕｆｅｎＴａｏＣｈａｏＬｉ，ＢｏＬｉｕ，ＪｉａｎｓｈｅｎＬｉｕ，ＧｕａｎｌｉｎＷａｎ，Ｈｏｎｉ，，ｇｇｇｑ－－ＬｌｉｎＴｉｔｔｉＡｉｎｄｏｔｏｓｉｓｉｎｍｕｒｉｎｅｉｕ．ＰＵ．１Ｂｉｍａｘｉｓｉｓｉｎｖｏｖｅｄｒｃｈｏｓａｎｕｃｅｄａｐｐ－ｒｏＢｌｈｏｍａＦＬ５．１２ｃｅｌｌｓ．ＡｃｔａＢｉｏｃｈｉｍｉｃａＢｉｏｈｓｉｃａＳｉｎｉｃａ２０１６４８９：ｐｙｍｐｐｙ，，（）８５０－８５５．６ｔ．ＬｉｕＢＴａｏＹＬｉＣＬｉＸＬｉｕＪＨｅＺＸｉａＭＪｉａｎＸＴａｎＭＬｉｕＨ．Ｃｏｍｌｅｅ，，，，，，，ｇ，，ｐｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａＧＩＩ．１７ｎｏｒｏｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍａｒｈｅｓｕｓｍｏｎｋｅｙｉｎｇ－Ｃｈｉｎａ．ＧｅｎｏｍｅＡｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔｓ．２０１６４５：ｅ００９０４１６．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｅｎｏｍ，（）ｇｅＡ－．００９０４１６．７３ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文在读期间参与申请的发明专利１．发明名称：ＥＶ７１中和抗原表位与诺如病毒Ｐ结构域嵌合载体的构建和表达方法发明人１：刘红旗，发明人２：李超：刘波，发明人３申请号或专利号：２０１６１０６１３３９７．０２．发明名称：猴源ＧＩＩ．１７型诺如病毒Ｐ结构域及其变体的目的蛋白？：刘红旗：．李超发明人１，发明人２刘波，发明人３．申请号或专利号：２０１６１０７１７６２１．０７４ 北京协和医学院硕士研究生学位论文致谢本论文的全部工作是在中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研宄所感染与免疫实验室完成，非常荣幸我能在这些优秀的平台上学习、成长。２０１５年３月一一我来到了感染和免疫实验室，作为个临床医学生，我对基础医学研宄的切都充满了兴趣。在实验室老师和同学们的帮助下，，我很快适应了实验室的生活并积极地投入到了相应的科研工作中。两年多过去了，我的科研能力得到了很好的培养和，我也掌握了科研工作中的许多实验技能，，锻炼，最重要的是在这个大家庭里我感受到了老师们悉心的教导、无私的关爱，还有同学们相互的鼓励、支持和帮助，！在此，我向你们表示最真诚的感谢！首先，由衷的感谢我的导师刘红旗老师刘老师为人和善、学识渊博，对待科研工作有着认真的态度，对待学生有着严谨的要求。从本论文最初研宄的构思到实验的进行再到最后论文的撰写，刘老师都给我了很大的帮助和支持，正是通过他悉心的指导我才能顺利的完成实验和论文；在生活上，刘老师也给予我了很多的关心和照顾。因此，十分感谢刘老师。！其次，感谢陶玉芬老师和刘建生老师陶玉芬老师在工作上细心、认真，待人真诚，关心学生，在实验上给予我了很大的帮助，谢谢陶玉芬老师。刘建生老师资历丰富，为人平和，在实验上也对我提供了很多的帮助，尤其是本论文的中和试验，。部分是在刘建生老师的帮助下完成，谢谢刘建生老师！再次，感谢已经顺利毕业的李晓菲师姐、李超师兄刚刚来实验室的时候是他一一们带着我，步步做实验，让我有了良好的技能和理论基础给我后续的工作和学习提供了很大的帮助。同时，感谢刘波同学、李昕潼师妹、陆巍师弟、时宇师妹，感谢你们这几年里对我的支持和鼓励，还有在生活和工作中的互相帮助，正是因为。有你们，才使得我的研宄生生活更加的丰富多彩，然后，感谢美国辛辛那提儿童医院医学中心的谭明教授谭教授在实验技术和理论知识上都给我提供了很多的帮助。感谢医学生物学研宄所的董承红老师为我们实验室提供了抗ＥＶ７１兔血清和ＥＶ７１灭活疫苗原液。感谢电镜室的周竞贤老师提供了电镜相关技术的指导。感谢医学生物学研宄所教育处的李艳梅老师、陈晨老师，她们对待研宄生的各项工作都是认真、负责，为我们研究生组织了许多课余的活动，丰富了我们研宄生的生活，感谢她们。重要的是！，我还要感谢我的家人谢谢他们对我无微不至的关心，谢谢他们常年默默对我的支持和理解！最后，十分的感谢在百忙之中参与审阅、评议本论文的各位老师；同时，也十分感谢参与本人论文答辩的各位老师！７５ 北京协和医学院硕士研宄生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。ｄ学位论文作者签名：签字日期：年月０日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解北京协和医学院有关保存、使用学位论文的管理办法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权北京协和医学皖可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：４ｇ导师签名：ｏｉ签字日期：ｖ？年４月Ｗ曰签字日期：年士月▲日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：：通讯地址：邮编７６
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