11种糖尿病并发症相关物质的HPLC测定方法的建立及应用

《11种糖尿病并发症相关物质的HPLC测定方法的建立及应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

分类号：R917学号：2015111159重庆医科大学硕士学位论文（学术学位）11种糖尿病并发症相关物质的论文题目HPLC测定方法的建立及应用作者姓名黄丹指导教师姓名（职称、单位名称）蒋心惠教授重庆医科大学药学院一级学科名称药学二级学科名称药物分析学论文答辩年月2018年5月 目录英汉缩略语名词对照...................................................1中文摘要.............................................................2英文摘要.............................................................6论文正文：11种糖尿病并发症相关物质的HPLC测定方法的建立及应用.......12前言............................................................12第一部分大鼠脑组织和血浆中9种物质含量测定方法的建立...............151.仪器与试剂...................................................152.实验方法.....................................................163.结果和讨论...................................................174.结论.........................................................32第二部分大鼠脑组织和血浆中高半胱氨酸和半胱氨酸的HPLC-ECD测定方法研究331.材料和仪器...................................................332.实验方法.....................................................343.结果与讨论...................................................354.结论.........................................................43第三部分糖尿病模型及给药组大鼠海马、皮层和血浆中11种神经递质的含量测定..................................................................441.仪器与试剂...................................................442.实验方法.....................................................453.结果与讨论...................................................464.结论.........................................................52全文总结............................................................53参考文献............................................................54文献综述............................................................59致谢............................................................68攻读硕士期间发表的论文..............................................69 英汉缩略语名词对照英文缩写英文全称中文全称HPLCHigh-performanceliquidchromatography高效液相色谱FLDFluorescencedetector荧光检测器ECDElectrochemicaldetector电化学检测器GCGaschromatography气相色谱法CECapillaryelectrophoresis毛细管电泳MSMassspectrometry质谱法OPAO-phthalaldehyde邻苯二甲醛LOQLimitofquantitation定量限LODLimitofdetermination检测限RSDRelativestandarddeviation相对标准偏差DMDiabetesmellitus糖尿病DEDiabeticencephalopathy糖尿病脑病CNSCentralnervoussystem中枢神经系统HcyHomocysteine高半胱氨酸CysCysteine胱氨酸AspAspartate天冬氨酸GluGlutamate谷氨酸GlyGlycine甘氨酸TauTaurine牛磺酸GABAγ-aminobutyricacid氨基丁酸TrpTryptophan色氨酸MetMethionine蛋氨酸5-HTSerotonin5-羟色胺DADopamine多巴胺HseHomoserine高丝氨酸InsInsulin胰岛素VidVildagliptin维格列汀MHMetforminHydrochloride盐酸二甲双胍1 11种糖尿病并发症相关物质的HPLC测定方法的建立及应用摘要背景近年来，糖尿病(DM)的发病率逐渐升高，糖尿病的并发症日益受到广泛关注。糖尿病病人常伴随着脑部疾病（糖尿病脑病，DE）的产生，其临床表现为：轻、中度认知功能障碍，学习和记忆能力下降，判断能力、理解能力等下降并伴有神情淡漠，目光呆滞，反应迟钝等。其中，学习、记忆障碍是DE的主要临床表现。其发病机制涉及多种因素，其中神经递质在并发症中的作用正在研究中。动物体内的神经递质及其相关物质在神经通路传递过程中具有重要作用,即可调节对信息的获取、储存等学习记忆生理活动。有研究表明，大脑不同部位对学习和记忆的影响不同，但尤以大脑皮层、海马为主。脑内神经递质可分为兴奋性神经递质和抑制性神经递质。兴奋性神经递质作用于受体后，可促进学习和记忆等生理过程；若过度增加，使得神经元持续性去极化，造成神经毒性，最终导致细胞死亡。抑制性神经递质可作用于突触前减少Glu的释放，同时使得突触后神经元处于保护状态；当抑制性神经递质浓度升高时，使神经元处于超抑制状态，从而影响神经递质传递过程，学习和记忆能力下降。脑内神经递质对大脑维持正常的生理活动有关键作用，其浓度的变化可诱发认知缺陷、学习障碍、帕金森等多种神经疾病。定量测定大脑内各物质的浓度对临2 床疾病的控制有重要作用。目前，较少使用HPLC-FLD法同时测定氨基酸类和单胺类物质的含量，因此，本文分为三个部分分别探讨同时测定9种物质含量的HPLC-FLD方法，同时测定高半胱氨酸及半胱氨酸的HPLC-ECD方法以及11种物质在糖尿病病程中的含量变化。第一部分大鼠脑组织和血浆中9种物质测定方法的建立目的：建立同时测定大鼠脑组织和血浆中9种物质的HPLC-FLD方法。方法：采用Agilent1260HPLC仪，配有荧光和紫外检测器。色谱条件如下：色谱柱为HypersilBDS（4.6mm×250mm,5µm）；-1-1流动相A为pH=6.0的缓冲液（含35mmol·L醋酸钠，5mmol·L柠檬酸），流动相B为甲醇；梯度洗脱程序为：0-23min：28%B，23.01min:60%B，分析时间为35min；荧光检测：激发波长为335nm，-1发射波长为460nm；柱温为30℃；流速为1.0mL·min；进样体积为20µL。海马、皮层和血浆样品经预处理后进样测定。结果：天冬氨酸（Asp），谷氨酸(Glu)，甘氨酸(Gly)，牛磺酸(Tau)，γ-氨基丁酸(GABA)，色氨酸（Trp），蛋氨酸(Met)，5-羟色胺(5-HT)，多巴胺2(DA)分离较好。9种待分析物的标准曲线的r≥0.9991。最低检测限-1-1为0.8-9.2ng·mL，定量限为：2.6-30.5ng·mL。相对回收率为79.82%-111.11%，绝对回收率为77.79%-100.25%，日内和日间精密度的RSD分别小于10.01%和12.80%。结论：本文建立的检测方法简便、快速，分离度好，灵敏度高，适用于与糖尿病并发症相关的物质的分离测定。第二部分大鼠脑组织和血浆中高半胱氨酸和半胱氨酸的HPLC-ECD3 测定方法研究目的：建立同时测定大鼠脑组织和血浆中2种物质的HPLC-ECD方法。方法：日本岛津HPLC(LC-20AD)仪，配有电化学检测器（ED723）和DAD检测器。色谱条件为：色谱柱为C18（4.6mm×250-1mm,5µm）分析柱；流动相为甲醇：醋酸盐缓冲液（30mmol·L醋-1酸钠，100µmol·L辛烷磺酸钠，pH=5.0）=0.1：99.9，v/v；分析时-1间为30min；检测电压为900mv。柱温为30℃。流速为0.7mL·min。进样体积为20µL。样品预处理方法如下：海马和皮层称重，按1:3（m:v）的比例加入超纯水，用玻璃匀浆器手动匀浆。取匀浆液或血-1浆100µL，加入10µL2mol·L的四氢硼酸钠溶液，涡旋1min，静-1置5min后，加入200µL0.4mol·L高氯酸，涡旋30s，于15000×g，4℃，离心15min，取上清液直接进样测定。结果：高半胱氨酸和半-1胱氨酸得到良好分离，其分离度大于2。在浓度0.02-4µg·mL范围2内，线性关系良好，标准曲线的r≥0.9991。最低检测限为5-10-1-1ng·mL，定量限为10-20ng·mL。相对回收率79.82%-110.18%，绝对回收率84.26%-100.25%，日内和日间精密度的RSD分别小于6.71%和9.96%。结论：所建立的检测方法操作简便，灵敏度高，适用于生物样品中高半胱氨酸和半胱氨酸的分离测定。第三部分糖尿病模型及给药组大鼠海马、皮层和血浆中11种神经递质的含量测定目的：测定正常组、糖尿病模型及给药组大鼠海马、皮层、血浆中11种物质的含量，探讨11种物质的含量变化与糖尿病并发症之间4 的关系。方法：雄性SD大鼠50只，用SPF级基础饲料适应性喂养一周后分组进行实验，包括对照组、糖尿病组、胰岛素组、维格列汀组和二甲双胍组。收集各组大鼠的脑组织和血浆样品，样品经预处理后进样测定。结果：与对照组比较，糖尿病组大鼠皮层中Gly、GABA、Trp、Met、5-HT和Cys的浓度有显著性差异（p<0.05)。糖尿病组大鼠海马中Glu、Trp和Met的浓度有显著性差异（p<0.05)。糖尿病组血浆中Asp、Glu、Trp和DA的浓度有显著性差异（p<0.05)。三种药物均可不同程度的改善由糖尿病所引起的几种物质含量的变化。结论：与正常组比较，糖尿病组中这几种物质浓度在中枢和外周均有不同程度的差异，提示11种物质的含量变化与糖尿病的并发症有关。关键词糖尿病脑病，氨基酸类物质，单胺类物质，高效液相色谱-荧光检测，高效液相色谱-电化学检测5 THEESTABLISHMENTANDAPPLICATIONOFHPLCMETHODDETERMINATIONON11SUBSTANCESRELATEDTODIABETICCOMPLICATIONSABSTRACTBackground:Inrecentyears,theincidenceofdiabetesgraduallyincreasedandthecomplicationsofdiabeteswerewidelyconcerned.Diabeticpatientsareoftenaccompaniedbybraindiseases(diabeticencephalopathy,DE)whichclinicalmanifestationsaremildtomoderatecognitiveimpairment,decreasedtheabilityoflearning,memory,judgment,comprehension,andotherswithsluggisheyesandunresponsive.Whats`more,learningandmemorydisordersarethemainclinicalmanifestationsofDE.Thepathogenesisofdiabeticencephalopathyismultifactorial.Theroleofneurotransmittersindiabeticcomplicationsisbeingstudied.Neurotransmittersandtheirrelatedsubstancesinanimalsplayanimportantroleinthetransmissionofneuralpathwayswhichcanregulatetheacquisitionandstorageofinformationandphysicalactivities,suchaslearningandmemory.Ithasbeenacceptedthatdifferentpartsofthebrainhavedifferenteffectsonlearningandmemoryandthatthecerebralcortexandhippocampusarepredominant.Neurotransmittersinthebraincanbedividedintoexcitatoryandinhibitoryneurotransmitters.Excitatory6 neurotransmittersactonreceptorstopromotelearningandmemoryphysiologicalprocesses.Iftheyincreaseexcessively,neuronsarecontinuouslydepolarized,resultinginneurotoxicityandeventuallycelldeath.InhibitoryneurotransmittersactonpresynapticallytoreducethereleaseofGluwhileleavingpostsynapticneuronsinaprotectivestate.Whentheconcentrationofinhibitoryneurotransmittersrises,neuronsareinastateofhyper-suppression,affectingtheprocessofneurotransmittertransmission,andmakingthelearningandmemoryabilitydecline.Neurotransmittersinthebrainplayakeyroleinmaintainingthenormalphysiologicalactivitiesofthebrain.Alterationofconcentrationscaninducecognitivedefects,learningdisabilities,Parkinson'sandotherneurologicaldiseases.Quantitativedeterminationofneurotransmittersinthebrainplaysanimportantroleinthecontrolofaclinicaldisease.FewermethodswereestablishedtosimultaneouslydetermineaminoacidsandmonoamineneurotransmitterswithHPLC-FLD.Therefore,thisarticleisdividedintothreeparts,respectively,toexplorethedeterminationmethodofnineneurotransmittersbyHPLC-FLD,andthedeterminationmethodofhomocysteineandcysteinebyHPLC-ECD,andtheconcentrationalterationof11neurotransmittersinbrainandplasmaofdiabetesmellitusrat.PartI:Theestablishmentofamethodforthedeterminationof9substancesinrat7 Objective:ToestablishanHPLC-FLDmethodforsimultaneousdeterminationofninesubstancesinratbrainandplasma.Method:TheHPLCsystem(Agilent1260)equippedwithafluorescencedetector(FLD-G1321B)andUVdetectorwasemployedinourstudy.TheseparationswereperformedonaHypersilBDScolumn(4.6mm×250mm,5µm)fittedwithaC18securityguardcartridge.Themobilephase-1-1Aconsistedof35mmol·Lsodiumacetateand5mmol·Lcitricacid,adjustingpHto6.0.ThemobilephaseBwasmethanol.Thegradient-1elution,ataflowrateof1.0mL.min,wasused.28%Bfrom0to23min,then60%Bat23.01mintilltheendoftheanalysis.Fluorescencedetectionwasperformedwithexcitationat340nmandemissionat460nm.Thecolumnoventemperaturewassetat30℃.Theinjectionvolumewas20µL.Thesamplesofbraintissueandplasmawerepretreatedasfollows:ultrapurewaterwasaddedataratioof1:3(m:v)tocortexandhippocampus,themixturewasmanuallyhomogenizedwithaglass-1homogenizer,then200μLof0.4mol·Lperchloricacidwasaddedtothe100μLhomogenate.Afterthoroughlymixed,themixturewascentrifugedat15000×g,4°Cfor15min,thesupernatantwasdilutedandinjected.Results:Asp,Glu,Gly,Tau,GABA,Trp,Met,5-HT,DAwerecompletelyseparated.Thecorrelationcoeffectionsof9analyteswere2-1morethan0.9991(r≧0.9991).TheLODwas0.8-9.2ng·mLandthe-1LOQwas2.6-30.5ng·mLwithRSD%ofintra-dayprecision≤10.01%8 andinter-dayprecision≤12.80%.Therelativerecoveriesrangedfrom79.82%to111.11%andabsoluterecoveryrangedfrom77.79%to100.25%.Conclusion:Thedeterminationmethodwasrapidandsimplewithhighsensitivitywithgoodseparation.Itcouldbeappliedtodeterminetheconcentrationofneurotransmittersrelatedtodiabeticcomplications.PartII:TheestablishmentofamethodforthedeterminationofHcyandCysinratbraintissuesandplasmaObjective:ToestablishanHPLC-ECDmethodforsimultaneouslydeterminetheconcentrationoftwosubstancesinratbrainandplasma.Method:Shimadzuhigh-performanceliquidchromatographyinstrumentequippedwithanelectrochemicaldetector(ED723)andaDADdetectorwasadoptedinourstudy.TheseparationwasachievedonC18(4.6mm×250mm,5μm).ThemobilephasewasconsistedofmethanolandpH=5.0-1-1buffersolutioncontaining30mmol·Lsodiumacetateand100μmol·Lsodiumoctanesulfonatewith0.1:99.9,v/v.Thewholeanalysistimewas30min.Detectionvoltage:900mv.Thecolumntemperaturewassetat-130℃.Theflowratewas0.7mL·min.Theinjectionvolumewas20μL.Thesamplepretreatmentmethodwasasfollows:thebraintissuewasweighed,andultrapurewaterwasaddedataratioof1:3(m:v),andthemixturewasmanuallyhomogenizedwithaglasshomogenizer.After-1homogenization,10μLofa2mol·Lsodiumtetrahydroboratesolution9 wasaddedto100μLofthehomogenateorplasmasample.200μLof0.4-1mol·Lperchloricacidwasaddedtothemixedhomogenate.Afterthoroughlymixing,themixturewascentrifugedat15000×g,4°Cfor15min.Thesupernatantwasdirectlyanalyzed.Results:HcyandCyswerecompletelyseparatedwithgoodlinearityandresolutionrangingfrom-12-10.02to4µg·mL(r≥0.991,Rs>2.0).TheLODwas5-10ng·mLand-1theLOQwas10-20ng·mLwithintra-dayprecisionofRSD≤6.71%andinter-dayprecisionofRSD≤9.96%.Therelativerecoverieswere79.82%-110.18%andthemeanextractionrecoverieswere84.26%-100.3%.Conclusion:Theestablishedmethodwassimplewithhighsensitivity.Itcouldbeappliedtoseparationanddeterminationofneurotransmittersinclinicaldiabeticcomplications.PartIII:Determinationof11neurotransmittersinhippocampus,cortex,andplasmaofdiabeticmodelratsanddrugmodelratsObjective:Todeterminethelevelsof11substancesinthehippocampus,cortex,andplasmaofratsinthenormalgroup,thediabeticgroup,andthedrugstreatedgroupweretoinvestigatetherelationshipbetweenthealterationsof11substancesandthecomplicationsofdiabetes.Methods:FiftymaleSprague-DawleyratswerefedwithSPFgradebasicdietforoneweek.Fiftyratswererandomlydividedintocontrolgroup,diabeticgroup,insulingroup,vildagliptingroupandmetformingroup.AllratswerefedSPFgradebasaldietfor8weeks.10 Results:Comparedwiththecontrolgroup,theconcentrationofGly,GABA,Trp,Met,5-HT,andCysinthecortexofdiabeticratsweresignificantlyreduced(p<0.05).theconcentrationofGlu,Trp,andMetinthehippocampusofdiabeticratsweresignificantlydifferent(p<0.05).theconcentrationofAsp,Glu,Trp,andDAinplasmaofdiabeticgroupweresignificantlydifferences(p<0.05).Allthethreedrugscouldimprovetheneurotransmittersconcentrationchangescausedbydiabetes.Conclusion:Comparedwithnormalgroup,theconcentrationoftheseneurotransmittersinthecentralandperipheralsystemofdiabeticratshadalteredindifferences,suggestingthattheseneurotransmittersarerelatedtothecomplicationsofdiabetes.Keywords:Diabeticcomplications,Diabeticencephalopathy,Aminoacidsubstances,Monoaminesubstances,HPLC-FLD,HPLC-ECD.11 11种糖尿病并发症相关物质的HPLC测定方法的建立及应用前言糖尿病脑病（DE），被认为是糖尿病（DM）的并发症，其特征是由于缺乏胰岛素分泌或胰岛素作用而导致的高血糖症，其特点在于特定的认知和学习功能障碍，并伴有神经化学，神经生理学和结构异常[1-3]。然而，DE的发生机制是多因素的，目前尚未完全阐明。糖尿病脑病的发生可能与血脂异常、胰岛素抵抗、氧化应激、神经炎症的激活、乙酰胆碱酯酶活性改变、晚期糖基化终产物的增加以及包括单胺和氨基酸在内的神经递质失调有关[4-10]。此外，神经递质系统涉及认知障碍的早期病理生理学，神经递质的稳态和代谢在由糖尿病诱发的认知缺陷中发挥重要作用[11-12]。中枢胆碱能系统是学习和记忆的重要系统。胆碱是乙酰胆碱（ACh）的前体，并参与多种生化途径，胆碱在体内的主要代谢途径见图1。首先，胆碱是乙酰胆碱的前体和代谢产物。其次，胆碱用于合成磷脂酰胆碱和鞘磷脂。第三，胆碱经酶氧化产生甜菜碱。甜菜碱为高半胱氨酸（Hcy）转变为甲硫氨酸（Met）的过程中提供甲基，甜菜碱去甲基化产物（二甲基甘氨酸）可进一步转化为甘氨酸（Gly）[13-15]。据报道，糖尿病大鼠中乙酰胆碱酯酶的活性显着增加[16]，这可能导致其他神经递质异常代谢。有文献采用衍生化法[17]测定体内高半胱氨酸含量。高半胱氨酸在体内含量低，因此要求检测方法具有较高灵敏度。相较于传统的电化学检测器的玻碳电极及多孔碳电极，本文采用新型掺硼钻石电极，其化学性质稳定，电化学活性强，灵敏度高。本文以香草酸为内标，建立了HPLC-ECD法同时测定生物样品中高半胱氨酸和半胱氨酸的含量。图1胆碱在体内的转化12 Fig.1TheconversionofCholineinvivo谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）和5-羟色胺（5-HT）是中枢神经系统（CNS）的主要兴奋性神经递质，γ-氨基丁酸（GABA）、甘氨酸（Gly）和多巴胺（DA）是主要的抑制性神经递质[18-19]。据报道，血糖升高时，海马中Glu含量显著增加，表明高葡萄糖环境可能增加谷氨酸的神经毒性，从而损伤神经元并导致认知功能障碍[20]。Tau不仅是一种渗透剂和神经调节剂，还对Glu诱导的神经毒性发挥神经保护作用[21]。据报道至少有三分之一的CNS神经元利用GABA作为其主要神经递质[22]，而胆碱能神经元直接同时释放GABA和ACh，GABA对学习和记忆的影响可能是通过其对胆碱能系统的作用而实现的[23-24]。5-HT和DA在皮层和海马中的作用是非常复杂的。据报道，糖尿病以非常特异的方式改变儿茶酚胺系统，糖尿病大鼠中5-HT和DA的水平在一定程度上有所改变[25-26]。作为5-HT的前体，色氨酸（Trp）是值得研究的一种物质。由于神经递质的含量在糖尿病发生过程中可能改变，建立一种简单、准确、可靠的可同时测定单胺类和氨基酸类物质的方法具有非常重要的意义。高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）[27]、毛细管电泳（CE）[28]和液相色谱-质谱联用（HPLC-MS)[29]技术已广泛应用于测定各种物质的含量。质谱法有非常高的灵敏度，但仪器设备价格昂贵。Trp、5-HT、DA等单胺类物质结构中有酚羟基，具电化学活性，可采用电化学法测定；大多数氨基酸本身并没有电化学活性。在我们的研究中，我们建立了一种通过用2-O-邻苯二甲醛（OPA）衍生化的HPLC-FLD法同时测定3种单胺类和6种氨基酸类物质，即以高丝氨酸（Hse）为内标，同时测定糖尿病大鼠脑组织及血浆中天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、牛磺酸、γ-氨基丁酸、色氨酸、蛋氨酸、5-羟色胺和多巴胺的含量。11种待测物质及内标的化学结构见图2。OHNHOH2OOOHOOOOHNH2OHOHNH2ASPGluHse(IS)13 OOH2NOH2NSOH2NOHOHOHGlyTauGABAHONH2OSOHNNH2HMetTrp5-HTHOHONH2DAHcyCys香草酸图1.11种物质及内标的化学结构Fig.1Thechemicalstructuresofelevensubstancesandinternalstandards(IS)14 第一部分大鼠脑组织和血浆中9种物质含量测定方法的建立1仪器与试剂1.1实验仪器高效液相色谱系统（Agilent1260）美国Agilent公司BDS色谱柱（4.6mm×250mm,5µm）大连依利特公司荧光检测器（G1321A）美国Agilent公司玻璃匀浆器重庆北碚化玻厂低温高速离心机美国Thermo公司超纯水机上海和泰仪器公司电子分析天平德国赛多利斯公司pH计上海仪电科学仪器公司台式离心机（TGL-16G）上海市安亭科学仪器厂超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司1.2材料与试剂名称厂家甲醇美国TEDIA公司醋酸钠上海维塔试剂公司柠檬酸成都市科龙化工试剂厂高氯酸上海维塔试剂公司邻苯二甲醛上海阿拉丁公司L-天冬氨酸上海阿拉丁公司DL-谷氨酸日本TCI公司L-甘氨酸上海麦克林公司L-牛磺酸上海阿拉丁公司γ-氨基丁酸上海麦克林公司15 L-色氨酸上海阿拉丁公司L-蛋氨酸上海麦克林公司5-羟色胺上海麦克林公司多巴胺上海阿拉丁公司L-高丝氨酸上海麦克林公司2实验方法2.1溶液的配制2.1.1对照品溶液的配制分别精密称取ASP，Glu，Gly，Tau，GABA，Trp，Met，5-HT，DA和Hse（IS）对照品各10.00mg于10mL容量瓶中，加入适量0.1mol·L-1高氯酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1.0mg·mL-1的对照品储备液，分装后，于-20℃冰箱中保存备用。临用前用0.1mol·L-1高氯酸溶液稀释至所需浓度。2.1.2衍生化试剂溶液的配制精密称取邻苯二甲醛(OPA)22.0mg于EP管中，加入0.5mL甲醇，待OPA溶解后加入4.45mL0.1mol·L-1硼砂缓冲盐（pH=9.8）及0.05mL巯基乙醇，充分混匀，可得浓度为4.4mg·mL-1的OPA衍生剂，避光低温（4℃）保存，可使用一周。2.2生物样品预处理2.2.1脑组织样品将大鼠用乙醚麻醉后断头处死，剪开头皮，在冰盘上迅速分离大鼠海马和皮层，置于EP管中，立即保存于-80℃冰箱中。临用时，海马和皮层解冻后称重，以1:3(m/v)的倍数加入超纯水，用玻璃匀浆器手动匀浆，匀浆均匀后取出100µL匀浆液，加入200µL0.4mol·L-1高氯酸溶液（含内标Hse30µg·mL-1），漩涡混和30s，15000×g，4℃，离心15min，上清液经0.22µm微孔滤膜过滤后再用0.1mol·L-1的高氯酸稀释10倍，保存于冰盒中，待衍生化。2.2.2血浆样品将大鼠用乙醚麻醉后断头处死，收集血液于含肝素的EP管中，于6000×g，16 常温，离心10min，上清液（血浆）分装于EP管中，于-80℃条件下保存备测。临用时，取出血浆，解冻，取100µL血浆样品，按1:3（v/v）加入300µL0.4mol·L-1高氯酸溶液（含内标Hse30µg·mL-1）充分混匀后于15000×g，4℃，离心15min，上清液经0.22µm微孔滤膜过滤后再用0.1mol·L-1的高氯酸稀释2倍，保存于冰盒中，待衍生化。2.3衍生化反应取100µL对照品工作液或预处理后的样品溶液，加入10µL1.0mol·L-1碳酸钠溶液，混匀，加50µLOPA衍生化试剂，室温涡旋50s后并放置1min，进样20µL进行色谱分析。2.4色谱条件高效液相色谱仪：Agilent1260，配有荧光检测器。色谱柱：HypersilBDS分析柱（4.6mm×250mm,5µm,大连依利特分析仪器有限公司）。流动相A：35mmol·L-1醋酸钠，5mmol·L-1柠檬酸，pH=6；流动相B：甲醇。用0.22µm滤膜真空抽滤后超声脱气10min。梯度洗脱程序为：0-23min：28%B；23.01min:60%B，分析时间为35min。检测波长：激发波长为335nm，发射波长为460nm。柱温设置为30℃。流速为1.0mL·min-1。进样体积为20µL。3结果和讨论3.1分析方法的建立查阅文献发现，多种衍生化试剂可与氨基酸反应，如6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯（AQC）[24]，4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯[25]，4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑（NBD-F）[26]和异硫氰酸苯酯（PITC）[27]。我们试图通过PITC衍生来测定各待测物质。但是，PITC的衍生化过程操作复杂，而且产生了许多影响目标分析物分离和测定的干扰物质。因此，我们决定选择OPA作为衍生化试剂。经查阅文献，OPA的衍生物可以通过HPLC-ECD测定。衍生化试剂中的β-巯基乙醇（β-MCE）可用亚硫酸钠代替[28-30]。我们尝试用β-MCE和亚硫酸钠作为衍生化辅助剂，用HPLC-ECD测定各物质的含量。结果发现Met在亚硫酸钠存在下表现出更高的电化学活性，而Asp在β-MCE中表现出更高的电化学活性。17 OPA-亚硫酸盐衍生物的电化学活性在OPA过量的情况下相对惰性[29-30]。显然，OPA必须过量才能定量测定各物质。因此，我们选择β-MCE作为衍生化辅助剂，通过HPLC-FLD来测定各物质的含量。在预实验中，我们发现用0.1mol·L-1Na2CO3溶液稀释储备液时(pH≈9)，5-HT和DA的稀释液放置15min后颜色逐渐变深，可能是因为其被氧化成醌类物质。因此，尽管衍生化反应是在碱性条件下进行的，但与碱性条件相比，5-HT和DA在酸性条件下更稳定。因此，储备溶-1HClO液用0.1mol·L4稀释，直到衍生化时再用Na2CO3调节pH至碱性。3.2检测波长的确定OPA可与伯氨基在室温条件下迅速反应，生成异吲哚类衍生物。该类衍生物可经荧光检测，而OPA本身没有荧光。为确定该类衍生物的检测波长，我们将各衍生物经过紫外-可见扫描，扫描结果见图1.1-A，可发现各衍生物在约335nm有最大吸收，5-HT的最大吸收波长为300nm，但在335nm处也有较强吸收。因此我们选择335nm作为激发波长，扫描记录各发射波长下的荧光强度，结果见图1.1-B，发现各待测物质在460nm处有最大荧光强度。因此，我们选择335nm作为激发波长，460nm作为发射波长进行样品的测定。18 图1.1各待测物的检测波长Fig.1.1Thedetectionwavelengthofanalytes3.3衍生化反应条件的考察3.3.1衍生化试剂浓度的选择在衍生化反应中，为了确保各待测物质被定量测定，衍生化试剂必需过量。我们使用较大浓度的对照品混合液（10µg·mL-1)，与5个不同浓度的OPA试剂反应（OPA的浓度：2-6mg·mL-1），衍生化后的物质进入色谱仪，记录色谱图和峰面积。数据处理结果见图1.2。结果显示，当OPA加入量超过20mg，即4mg·mL-1时，各待测物质衍生化产物的峰面积趋于稳定。因此我们选择4.4mg·mL-1的OPA溶液作为衍生化试剂。图1.2OPA用量对各待测物峰面积的影响Fig.1.2TheeffectofOPAamountonpeakareaofanalytes19 3.3.2流动相pH的选择考察了不同pH值（5.0到6.5）对各待测物质分离度和衍生产物响应值的影响。考察结果见图1.3，结果提示随着pH值的增加，氨基酸衍生物的响应值逐渐增加；然而，5-HT和DA的衍生物在低pH条件下具有较高的荧光强度。当pH为6.5时，5-HT和DA的响应值明显降低。尽管pH值小于6.0时Tau和GABA分离效果较好，但Asp、Glu和Hse的灵敏度较低。综合考虑，选择流动相pH=6.0作为测定条件。图1.3流动相pH对各分析物分离的影响：A(pH=5.0),B(pH=5.5),C(pH=6.0),D20 (pH=6.5)，E：流动相pH对各分析物峰面积的影响，1(Asp),2(Glu),3(IS),4(Gly),5(Tau),6(GABA),7(Trp),8(Met),9(5-HT),10(DA)Fig.1.3TheinfluenceofpHofthemobilephaseontheresolutionofanalytes:A(pH=5.0),B(pH=5.5),C(pH=6.0),D(pH=6.5),GraphEshowstheinfluenceofdifferentpHontheresponse(peakarea)ofanalytes.1(Asp),2(Glu),3(IS),4(Gly),5(Tau),6(GABA),7(Trp),8(Met),9(5-HT),10(DA).3.3.3衍生化反应溶液pH的选择考察了1.0mol·L-1碳酸钠不同体积（0，5μL，10μL和15μL）与各分析物色谱峰面积之间的关系，结果见图1.4。当加入碳酸钠溶液的体积为5μL时，反应液的pH≈7；当加入碳酸钠溶液的体积为10μL时，反应液的pH≈9；当加入碳酸钠溶液的体积为15μL时，反应液的pH≈12。由图1.4可知，当反应液pH大于9时，各衍生物的峰面积趋于稳定。但高碱性条件会缩短色谱柱的使用寿命。综合考虑，我们选择加入10μL1.0mol·L-1碳酸钠溶液来调节反应液的pH（pH≈9）。图1.4反应液pH对各分析物峰面积的影响Fig.1.4Influenceofthevolumeofsodiumcarbonateonpeakarea3.3.4衍生化后放置时间的考察在碱性和β-MEC存在下，OPA与所有伯氨基反应迅速。我们考察了在衍生化试剂加入后，反应液立即涡旋50s，室温放置不同时间（0min，1min,2min，3min和4min）进样测定，以考察不同放置时间对衍生物的响应值(峰面积)的影21 响。结果见图1.5。实验结果发现，放置时间长短对氨基酸类物质的OPA衍生物的荧光响应值几乎没有影响；但随着放置时间的延长，5-HT和DA衍生物的响应值逐渐降低。综合考虑后，我们选择在室温下放置1分钟即进样测定。图1.5反应液放置时间对各分析物峰面积的影响Fig.1.5InfluenceofplacementtimeofOPAonpeakarea3.4方法学验证3.4.1专属性空白溶液(A)（0.1mol/LHClO4，Na2CO3，OPA衍生溶液），混合对照品(B)，海马（C)，皮层（D），脑组织+内标（E），脑组织(F)和血浆（G）样品的色谱分离结果见图1.6。由图1.6可见，空白溶液中在各分析物的保留时间处未观察到干扰峰，9种分析物和内标分离良好，该色谱方法的专属性强。22 23 图1.6空白溶液(A)，混合对照品(B)，海马（C)，皮层（D），脑组织+内标（E），脑组织(F)，血浆（G）样品色谱图；1(Asp),2(Glu),3(IS),4(Gly),5(Tau),6(GABA),7(Trp),8(Met),9(5-HT),10(DA)Fig.1.6Chromatogramsofstandardsolutionandsamples:(A)blanksolution(containing0.1mol·L-1HClO4,Na2CO3andOPAderivatizingsolution);(B)mixedstandardsolution;(C)hippocampus;(D)cortex;(E)brainhomogenatesspikedwithinterstandard(IS);(F)brainhomogenateswithoutIS;(G)Plasma.1(Asp),2(Glu),3(IS),4(Gly),5(Tau),6(GABA),7(Trp),8(Met),9(5-HT),10(DA).3.4.2线性和范围分别取各对照品储备液配制成6个不同浓度的系列工作液，每个浓度平行3份，衍生化后进样测定。以各分析物的峰面积和内标峰面积比值Y对分析物浓度X进行线性回归，标准曲线的线性关系用相关系数（r2）表示，结果见表1-1，所有分析物标准曲线的线性r2≥0.9991，各分析物在测定浓度范围内线性关系良好。表1-1各分析物在测定浓度范围内的标准曲线Table1-1ThecalibrationcurvesofallanalytesBraintissuePlasmaCalibraCalibratAnaltionrangeEquationr2ionrangeEquationr2ytes(µg·mL-1)(µg·mL-1)24 Y=0.3525X+0.020.90.02-2.Y=0.0362X+0.0020.9Asp0.05-50599802993Y=0.3856X+0.040.9Y=0.04813X+0.000.9Glu0.1-150.03-30299806999Y=0.7993X+0.020.9Y=0.4062X+0.0270.9Gly0.05-50.1-84299458998Y=1.0293X-0.070.9Y=0.2600X+0.0330.9Tau0.25-80.5-15689933997GAY=0.9099X+0.090.9Y=0.2145X+0.0140.90.1-50.1-10BA219973999Y=0.2814X-0.000.9Y=0.0459X+0.0030.9Trp0.02-20.03-3209933991Y=0.5040X-0.000.9Y=0.09149X+0.000.9Met0.04-40.02-250998019995-HY=0.5182X+0.010.9Y=0.1017X+0.0010.90.1-100.1-4T049964997Y=0.5687X-0.010.9Y=0.1281X+0.0010.9DA0.04-40.1-45799409993.4.3检测限（LOD）和定量限(LOQ)检测限按信噪比S/N=3计，定量限按S/N=10计。由表1-2可知，各待测氨基酸类物质定量限≤11ng·mL-1，单胺类物质定量限低于30.5ng·mL-1。所有待测物的LOD≤10ng·mL-1。表明该方法灵敏度高，可用于检测脑组织和血浆中各待测物质的含量。表1-2各分析物的保留时间、检测限(LOD)和定量限(LOQ)Table1-2Retentiontime、LODandLOQforallanalytesinstandardsolutionTypesAspGluGlyTauGABATrpMet5-HTDAtR(min)4.656.3820.9327.4427.8829.4330.4633.3634.40LOQ(ng·mL-1)5.78.49.12.63.120.510.330.517.1LOD(ng·mL-1)1.72.52.70.80.96.23.19.25.13.4.4精密度和准确度的考察考察了各基质中，高、中、低浓度的质控样品（QC）的精密度和准确度（结果见表1-3和表1-4）。按照“2.2”项下方法配制QC样品。使脑组织中Asp,Glu,Gly,Tau,GABA,Trp,Met,5-HT,和DA的低浓度分别为0.10,0.20,0.10,0.20,25 0.10,0.04,0.08,0.20,0.08µg·mL-1；中浓度分别为0.50,1.00,0.50,0.50,0.50,0.20,0.40,0.50,0.40µg·mL-1；高浓度分别为2.50,5.00,2.50,1.00,2.50,1.00,2.00,1.00,2.00µg·mL-1。血浆中的低浓度为0.04,0.06,0.20,1.00,0.20,0.06,0.04,0.20,0.20µg·mL-1；中浓度为0.20,0.30,1.00,2.50,1.00,0.30,0.20,1.00,1.00µg·mL-1；高浓度为2.00,3.00,5.00,5.00,5.00,3.00,2.00,4.00,4.00µg·mL-1。每个浓度的QC样品平行处理5份，各基质中的内源性待测物浓度经测定后将其扣除。日内精密度以QC样品在第一天所测定浓度的相对标准偏差（RSD）表示，日间精密度以连续3天所测得浓度的相对标准偏差（RSD）表示。在脑组织中，日内和日间精密度的RSD分别不超过10.01%和9.70%。血浆中日内和日间精密度的RSD分别不超过9.58%和12.8%，表明该方法的精密度符合要求。准确度用相对回收率来表示，在高，中，低浓度中，脑组织中各待测物的相对回收率为82.58%-108.91%，血浆中各待测物的相对回收率为80.63%-111.11%，表明该方法的准确度符合要求。生物基质物基质中各对峰面积提取回收率的计算公式为：提取回收率（%）=×100%，同浓浓度对照品溶液的面积脑组织中9种待分析物的提取回收率为61.19%-100.83%。血浆中9种待分析物的提取回收率为77.79%-98.20%。内标的提取回收率为93.51%-96.73%。由此可见内标具有较好的提取回收率，不受基质中其他内源性物质的干扰。26 表1-39种待测物质在脑组织中的日内、日间精密度及提取回收率和方法回收率Table1-3Precision,accuracyandextractionrecoverymeasuredinspikedwithbraintissueConcentrationIntra-dayInter-dayRelativeExtractionCompoundsµg·mL-1(RSD,%)(RSD,%)recovery(%)recovery(%)0.14.049.7083.26±5.4299.97±3.83Asp0.54.843.4488.01±4.3290.76±3.932.51.100.83106.48±3.1100.83±2.550.23.715.9085.57±4.6699.83±3.36Glu110.019.0095.41±10.8894.47±9.7055.586.8797.78±4.9994.56±4.720.12.931.20103.46±3.1185.13±2.23Gly0.57.368.1891.25±6.2192.40±6.082.51.544.2483.64±1.1688.23±1.210.24.209.48107.39±4.0899.75±1.53Tau0.52.874.8292.25±8.6992.25±8.6914.873.7382.58±3.2769.04±3.010.13.808.74108.91±5.5596.03±9.86GABA0.57.149.0491.57±7.1488.07±5.622.53.404.8983.18±2.6596.89±2.950.046.106.0199.23±4.4577.50±4.23Trp0.23.144.1490.26±2.7388.63±2.7912.305.5288.80±1.8194.44±1.940.084.163.79106.82±3.5193.73±3.49Met0.43.585.0598.01±3.06100.28±3.2121.515.2996.47±1.2998.84±1.330.21.856.0187.39±3.0999.05±1.645-HT0.55.993.3496.26±7.3090.42±4.8413.441.87107.76±4.3994.06±3.230.083.847.6591.43±5.0861.19±5.22DA0.42.822.6984.60±1.9686.11±2.1721.521.4392.38±1.2497.27±1.32IS――――96.73±2.0927 表1-49种待测物在血浆中的日内精密度、日间精密度及准确度Table1-4Precision,accuracyandextractionrecoverymeasuredinspikedwithplasmaConcentrationIntra-dayInter-dayRelativeExtractionAnalytesµg·mL-1(RSD,%)(RSD,%)recovery(%)recovery(%)0.043.596.0887.94±8.5097.07±3.49Asp0.27.174.91111.11±10.1093.06±6.6724.505.29103.28±4.7998.20±4.420.064.736.1589.78±5.2695.83±4.53Glu0.36.9010.5883.34±6.0485.78±5.9232.159.90102.70±2.2196.31±2.070.23.319.4982.46±3.8589.32±2.96Gly13.874.5351.544.2481.97±3.4484.17±3.2618.875.0789.67±9.0992.48±8.20Tau2.55.775.7381.40±4.9977.98±4.5051.722.7982.13±1.4681.17±1.400.24.236.0985.04±5.0196.57±4.09GABA17.363.5086.98±6.9086.86±6.4051.859.5777.61±1.4677.79±1.440.069.587.1388.69±20.0498.17±9.41Trp0.37.068.41101.98±8.9093.74±6.6236.2510.2081.59±5.2583.31±5.210.048.3912.881.21±8.1988.92±7.46Met0.25.699.1286.14±5.0988.39±5.0321.097.6780.63±0.8881.01±0.880.27.695.1186.97±7.2296.20±7.405-HT16.978.0885.44±6.0587.96±6.1343.256.9875.77±2.4776.37±2.480.26.947.2586.17±5.3385.52±5.55DA14.284.5380.87±3.4383.24±3.5643.095.7782.61±2.5482.60±2.55IS――――93.51±4.683.4.5稳定性本实验考察了QC样品在4℃冰箱中48h内的稳定性以及储备液在-20℃下两月内的稳定性。脑组织QC样品稳定性测定结果见表1-5，血浆QC样品稳定性测定结果见表1-6，对照品储备液的稳定性测定结果见表1-7。实验结果显示，在脑组织中Asp，Trp，Met，5-HT和DA在48h内稳定，Glu，Gly，Tau，GABA仅在24h内稳定。表1-5和表1-6的数据表明，整个实验过程包括样品预28 处理和测定最好在24小时内完成。表1-7中的数据表明，各待测物及内标的储备液，除Met外，所有的氨基酸和内标在60天内均较稳定，单胺类物质在30天内较稳定。表1-59种测物在脑组织中的稳定性Table1-5StabilityofnineanalytesinratbrainhomogenateConcentrationAnalytes0h,4℃24h,4℃(reduction,%)48h,4℃(reduction,%)µg·mL-10.10.05±0.000.05±0.01(-5.70)0.05±0.01(-4.55)Asp0.50.18±0.010.16±0.01(-8.31)0.16±0.01(-7.91)2.50.92±0.010.90±0.06(-1.59)0.92±0.02(0.15)0.20.11±0.000.10±0.01(-8.56)0.08±0.01(-27.41)Glu10.4±0.040.38±0.00(-6.59)0.29±0.04(-28.30)51.93±0.112.02±0.02(4.78)1.81±0.12(-5.95)0.10.19±0.010.18±0.00(-3.83)0.16±0.02(-15.41)Gly0.50.75±0.060.68±0.03(-9.14)0.68±0.03(-9.80)2.53.37±0.053.16±0.14(-6.21)3.30±0.03(-1.94)0.20.14±0.010.13±0.00(-5.19)0.08±0.03(-42.41)Tau0.50.37±0.010.40±0.03(9.53)0.36±0.09(-1.65)10.77±0.040.80±0.03(3.86)0.65±0.12(-15.91)0.10.19±0.010.20±0.01(5.98)0.23±0.08(24.30)GABA0.50.51±0.040.48±0.03(-5.87)0.62±0.05(22.59)2.51.98±0.072.06±0.01(3.94)2.21±0.07(11.22)0.040.01±0.000.01±0.00(-1.75)0.01±0.00(-7.21)Trp0.20.05±0.000.05±0.00(-1.42)0.05±0.00(-3.97)10.25±0.010.24±0.01(-1.23)0.27±0.00(9.54)0.080.04±0.000.04±0.00(1.37)0.04±0.00(-7.33)Met0.040.19±0.010.20±0.00(2.52)0.18±0.01(-5.16)20.97±0.011.04±0.01(7.94)1.06±0.01(9.55)0.20.02±0.000.02±0.00(0.60)0.02±0.00(9.18)5-HT0.50.04±0.000.04±0.00(2.52)0.04±0.00(4.60)10.07±0.000.07±0.00(0.49)0.07±0.01(3.12)0.080.03±0.000.03±0.00(2.97)0.03±0.00(2.35)DA0.40.18±0.000.18±0.00(1.63)0.18±0.00(3.33)21.04±0.021.04±0.02(0.54)1.04±0.02(0.93)29 表1-69种测物在血浆中的稳定性Table1-6StabilityofnineanalytesinplasmaConcentrationAnalytes0h,4℃24h,4℃(reduction,%)48h,4℃(reduction,%)µg·mL-10.040.00±0.000.00±0.00(-3.31)0.00±0.00(-33.27)Asp0.20.01±0.000.02±0.00(1.52)0.01±0.00(-12.89)20.08±0.000.08±0.00(8.15)0.09±0.01(12.02)0.060.00±0.000.00±0.00(-7.22)0.00±0.00(14.56)Glu0.30.01±0.000.01±0.00(7.23)0.01±0.00(-23.60)30.15±0.000.16±0.01(7.08)0.21±0.02(38.09)0.20.09±0.010.09±0.00(-8.10)0.12±0.01(23.63)Gly10.36±0.010.33±0.00(-8.25)0.42±0.01(17.63)51.10±0.95±0.14(-6.21)1.60±0.03(-1.94)10.27±0.020.24±0.02(-9.95)0.34±0.08(28.31)Tau2.50.56±0.010.22±0.02(-8.86)0.27±0.08(-15.78)50.77±0.021.04±0.03(-5.89)1.07±0.12(-3.09)0.20.05±0.000.05±0.01(3.78)0.04±0.01(-23.86)GABA10.20±0.010.20±0.01(9.79)0.22±0.01(35.98)50.85±0.020.79±0.13(-6.66)1.04±0.09(22.90)0.060.01±0.000.01±0.00(-1.26)0.00±0.00(-24.77)Trp0.30.02±0.000.02±0.00(4.08)0.02±0.00(-13.60)30.12±0.010.11±0.01(-13.00)0.09±0.00(-25.79)0.040.00±0.000.00±0.00(5.99)0.00±0.00(18.06)Met0.20.02±0.000.02±0.00(6.56)0.02±0.00(17.29)20.15±0.000.16±0.00(8.50)0.20±0.02(37.82)0.20.02±0.000.02±0.00(-4.86)0.02±0.00(-6.97)5-HT10.09±0.010.08±0.00(-7.07)0.08±0.00(-13.10)40.31±0.010.30±0.00(-2.97)0.28±0.04(-9.34)0.20.02±0.000.02±0.00(2.17)0.02±0.00(28.58)DA10.10±0.000.10±0.00(-5.33)0.10±0.00(-5.94)40.42±0.010.39±0.01(-6.55)0.31±0.05(-26.30)30 表1-7各待测物和内标储备液在-20℃下的稳定性Table1-7StabilityofnineanalytesandISinstocksolutionConcentrations0day-20℃30day-20℃60day-20℃Analytes(µg·mL-1)RSD%RE%RSD%RE%RSD%0.19.168.253.30-2.755.84Asp0.51.4110.631.85-7.672.332.52.98.701.22-8.303.530.25.08-0.948.48-9.625.19Glu12.29-2.112.54-8.274.4350.831.283.42-8.173.620.13.609.250.86-10.257.43Gly0.53.288.085.11-5.792.392.51.247.307.57-9.652.860.25.93-9.222.28-3.757.54Tau0.52.51-6.862.09-1.115.7911.378.476.77-2.171.350.13.864.806.90-0.87.29GABA0.54.832.953.352.578.782.50.33.689.03-7.934.290.046.19-9.466.84-61.761.22Trp0.22.867.502.66-21.883.6712.428.791.73-5.492.070.085.31-10.311.08-60.452.44Met0.041.76-1.673.47-18.830.4421.875.841.540.643.200.26.25-10.424.03-51.049.585-HT0.55.59-5.563.42-57.695.2511.99-10.895.06-59.198.020.085.17-5.223.6120.909.26DA0.42.13-1.063.7235.469.8223.514.508.4914.574.99IS2.00.46-9.391.09-11.232.2431 4.结论本部分建立了以邻苯二甲醛（OPA）为柱前衍生化试剂测定海马、皮层和血浆中9种氨基酸的HPLC-FLD法，该方法可在36min中内完成单次分析。该分析方法操作简便，灵敏度较好，准确度和精密度均满足方法学要求。可用于测定生物体内氨基酸类和单胺类神经递质的含量。32 第二部分大鼠脑组织和血浆中高半胱氨酸和半胱氨酸的HPLC-ECD测定方法研究1.材料和仪器1.1实验仪器高效液相色谱系统日本岛津公司C18色谱柱（4.6mm×250mm,5大连依利特公司µm）电化学检测器（ED723）日本岛津公司玻璃匀浆器重庆北碚化玻厂低温高速离心机美国Thermo公司超纯水机上海和泰仪器公司电子分析天平德国赛多利斯公司pH计上海仪电科学仪器公司台式离心机（TGL-16G）上海市安亭科学仪器厂超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司1.2材料与试剂名称厂家甲醇美国TEDIA公司醋酸钠上海维塔试剂公司柠檬酸成都市科龙化工试剂厂高氯酸上海维塔试剂公司1-辛烷磺酸钠盐北京百灵威科技有限公司DL-高半胱氨酸美国Sigma公司L-半胱氨酸上海阿拉丁公司香草酸上海麦克林公司四氢硼化钠成都市科龙化工试剂厂33 2.实验方法2.1溶液配制2.1.1对照品溶液配制分别精密称取Hcy，Cys和香草酸（内标）10mg溶于10mL0.1mol·L-1高氯酸溶液中，制备成浓度为1.0mg·mL-1的标准品储备液，分装后存放于-20℃冰箱中保存备用。临用前用0.1mol·L-1高氯酸稀释至所需浓度。2.1.2还原剂溶液的配制称取氢氧化钠0.40g，用适量超纯水溶解后，定容至10mL,配制成浓度为0.1mol·L-1的氢氧化钠溶液，低温（4℃）保存。称取四氢硼酸钠0.12g，加入1.5mL0.1mol·L-1的氢氧化钠溶液，待其完全溶解后充分涡旋，可得浓度为2mol·L-1的四氢硼酸钠溶液。2.2生物样品预处理2.2.1脑组织大鼠用乙醚麻醉后断头处死，剪开头皮，在冰盘上迅速分离大鼠海马和皮层，置于干净的EP管中，立即保存于-80℃冰箱中。临用时，海马和皮层解冻后称重，以1:3(m/v)的倍数加入超纯水，用玻璃匀浆器手动匀浆，充分匀浆后取100µL匀浆液加入10µL2mol·L-1的四氢硼酸钠溶液，涡旋30s，静置反应5min后，加入200µL0.4mol·L-1高氯酸（含内标香草酸2µg·mL-1），涡旋30s，于15000×g，4℃，离心15min，取上清液经0.22µm微孔滤膜过滤，滤液静置待测。2.2.2血浆大鼠断头处死，将血液收集于含肝素的EP管中，于6000×g，常温，离心10min，取出上清液（血浆）分装于EP管中，于-80℃保存。临用时，取出血浆，置于室温水浴锅中，待血浆融化后，取100µL血浆，加入10µL2mol·L-1的四氢硼酸钠溶液，涡旋30s，静置反应5min后，加入300µL0.4mol·L-1高氯酸（含内标香草酸2µg·mL-1）充分混匀后于15000×g，4℃，离心15min，上清液经0.22µm微孔滤膜过滤，滤液静置待测。2.3色谱条件34 高效液相色谱仪：日本岛津色谱仪(LC-20AD)，配有电化学检测器（ED723）。色谱柱：依利特C-118（4.6mm×250mm,5µm）。流动相为甲醇：缓冲液（30mmol·L醋酸钠，100µmol·L-1辛烷磺酸钠，pH=5.0）=0.1:99.9；缓冲液经0.22µm滤膜真空抽滤后超声脱气10min。分析时间为35min。检测电压：900mV。柱温设置为30℃。流速为0.7mL·min-1。进样体积为20µL。3.结果与讨论3.1分析方法的建立有文献[31]报道，将Hcy衍生化后测定。在碱性条件下，OPA与β-巯基乙醇联用与伯氨基反应生成异吲哚衍生物（1-硫代-2烷基异吲哚），该过程需要含巯基试剂的参与，否则衍生化反应无法进行。当测定含巯基的氨基酸时，氨基酸中的巯基会与β-巯基乙醇中的巯基竞争性的参与OPA的反应，因此很难定量测定含巯基的氨基酸。有学者采用过甲酸或过氧化氢将巯基氧化后再衍生[32]；或采用碘乙酸将巯基还原后再衍生[33]。我们曾采用30%的过氧化氢室温下氧化巯基，反应时间从10min到1h均未与OPA衍生成功。同样地，我们也尝试用碘乙酸将巯基还原后衍生，但都未成功。Hcy和Cys结构中均含有巯基，具有电化学活性，有文献报道采用电化学检测器[34-35]进行测定。传统的电化学检测器的工作电极为玻碳电极或多孔电极，使用时表面容易被污染，背景干扰大。本实验采用新型掺硼钻石电极，其化学稳定性高，背景干扰小，电化学活性增强。还原剂的选择：生物体内，Hcy和Cys大都是以二硫键与蛋白质结合，故在测定样品前，须用还原剂打开二硫键。有文献报道用β-巯基乙醇和三(2-羧乙基)膦(TCEP)作为还原剂[36]。我们选择四氢硼酸钠作为还原剂，在碱性条件下该还原剂有较高的还原效率，在酸性环境中其还原反应可立即停止。鉴于我们采用高氯酸沉淀蛋白质，加入高氯酸后还原反应即停止，不会对内标产生影响。因此，我们选择四氢硼酸钠作为还原剂。流动相的选择：我们选择含30mmol·L-1醋酸钠，100µmol·L-1辛烷磺酸钠的缓冲溶液（pH=5.0）作为水相。乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）和柠檬酸是电化学活性物质，可增强待测物的电化学响应信号。我们曾采用含醋酸钠、辛烷磺酸钠、乙二胺四乙酸二钠和柠檬酸的混合溶液作为流动相。实验发现，在极低比35 例的甲醇存在条件下，Hcy与Cys的分离效果并未显著提高，而且保留时间较短。如图2.1所示，当采用此混合体系时，在待测物保留时间附近的溶剂的响应信号显著增强。根据预实验结果，综合考虑，我们采用只含醋酸钠和辛烷磺酸钠的溶液作为水相。当仪器工作一段时间后，应钝化仪器以冲洗仪器管路中的金属离子，降低电化学本底噪音。检测电压的选择：预实验时，我们考察了不同检测电压（600-900mV）对待测物响应值的影响。如图2.2可知，检测电压对待测物的影响较大，各待测物的响应随着电压的增大而增大。虽然检测电压越大，溶剂的响应也越大，但相较于低检测电压条件下待测物的响应，900mV条件下待测物的响应显著提高。我们只考察到900mV是由于该检测器的检测电压不宜超过1000mV，为了避免仪器损耗，我们选择900mV作为检测电压。流动相pH的选择：我们考察了流动相的pH（3.0-6.0）对待测物分离的影响。如图2.3可知，流动相pH变化对待测物的保留时间和响应值有一定影响，当pH≥5.0时，Hcy和Cys的响应均较大，溶剂的响应也较大，且有机相比例为0.1%，pH=6.0时的保留时间有前移的现象，考虑到Cys的等电点为5.02，我们选择流动相的pH=5.0。图2.1流动相组成对待测物分离的影响。a:醋酸钠+辛烷磺酸钠体系；b:醋酸钠+辛烷磺酸钠+乙二胺四乙酸二钠+柠檬酸体系；1：Hcy；2：Cys。Fig.2.1Theinfluenceofcomponentsofmobilephase36 图2.2不同检测电压对分析物响应的影响.a：900mv；b：800mv；c：700mv；d：600mv。1：Hcy；2：Cys。Fig.2.2Theeffectofdifferentvoltagesonanalytes.a：900mv；b：800mv；c：700mv；d：600mv。1：Hcy；2：Cys。图2.3流动相不同pH对待测物的影响.a:pH=3；b：pH=4；c:pH=5；d:pH=6.1:Hcy；2:Cys.Fig.2.3TheeffectofdifferentpHonanalytes.a:pH=3;b：pH=4;c:pH=5;d:pH=6.1:Hcy；2:Cys.3.2方法学验证37 3.2.1专属性空白溶液（0.1mol·L-1高氯酸溶液）（A）、混合对照品溶液（B）、脑组织样品（C）、血浆样品（D）、脑组织+对照品（E）的色谱图见图2.4。Hcy、Cys和内标的保留时间分别为4.6min，5.2min和26.7min。由图2.4可知，高氯酸溶液对待测物和内标不存在干扰，各基质中的内源性物质不影响待测物的测定，方法的专属性好。38 图2.4空白溶液(A),混合对照品(B),脑组织(C),血浆(D),脑组织+对照品(E)色谱图；1：Hcy,2:Cys,3:香草酸Fig.2.4Chromatogramsofsamples:(A)blanksolution;(B)mixedstandardsolution;(C)brainhomogenates;(D)plasma;(E)brainhomogenateswithstandards.1：Hcy,2:Cys,3:Vanillicacid。3.2.2线性及范围、检测限和定量限分别取各对照品储备液配制成6个浓度的系列工作液，每个浓度平行3份，预处理后进样分析。用分析物的峰面积和内标峰面积比值Y对分析物浓度X进行线性回归，标准曲线的线性用相关系数（r2）表示。如表2-1所示，所有分析物标准曲线的线性r2≥0.9992，各分析物在测定浓度范围内的线性关系良好。检测限按信噪比S/N=3计，定量限按S/N=10计。由表2-1可知，Hcy的定量限为10ng·mL-1，Cys的定量限为20ng·mL-1，检测限均低于10ng·mL-1。该方法灵敏度较好，可用于检测脑组织和血浆中高半胱氨酸和半胱氨酸的含量。表2-1待测物的保留时间、检测限（LOD）、定量限（LOQ）及线性回归方程Table2-1Theretentiontime,LOD,LOQandcalibrationcurvesofanalytesAnaLODLOQPlasmaBraintissuelytes(ng·(ng·CaliCalibmL-1)mL-1)brationrationEquationr2Equationr2rangerange(µg·mL-)(µg·mL-1)Hcy5100.1-4.0Y=0.8499X+0.02880.99920.02-3Y=0.8553X+0.00180.9994Cys10200.1-4.0Y=0.5278X-0.00140.99910.02-3Y=0.5162X-0.00090.999239 3.2.3精密度本实验考察了各基质高、中、低浓度的质控样品（QC）的精密度（见表2-2、2-3）。按照“2.2”项下方法制备QC样品。使脑组织中Hcy和Cys的浓度分别为0.05，1.0，2.0µg·mL-1。使血浆中Hcy和Cys的低浓度分别为0.2，1.0和2.0µg·mL-1。每个浓度的QC样品平行处理5份，各基质中的内源性待测物浓度经测定后将其扣除。日内精密度以QC样品在第一天所测定浓度的相对标准偏差（RSD）表示，日间精密度以连续3天所测得浓度的相对标准偏差（RSD）表示。在脑组织中，日内和日间精密度的RSD分别不超过7.59%和9.13%。血浆中，日内和日间精密度的RSD分别不超过6.71%和9.96%，表明该方法的精密度符合要求。3.2.4方法回收率及提取回收率本实验考察了各基质高、中、低浓度的质控样品（QC）的方法回收率（见表2-2、2-3）。按“2.2”项下方法配制QC样品。使脑组织中Hcy和Cys的浓度分别为0.05，1.0，2.0µg·mL-1。使血浆中Hcy和Cys的低浓度分别为0.2，1.0和2.0µg·mL-1。每个浓度的QC样品平行处理5份，各基质中的内源性待测物浓度经测定后将其扣除。准确度用相对回收率来表示，脑组织中Hcy和Cys的高、中、低浓度对照品的方法回收率为79.82%-110.18%，血浆中Hcy和Cys的相对回收率为84.45%-109.47%，表明该方法的准确度符合要求。基质质中对照品峰面积测定值提取回收率按提取回收率（%）=×100%公式同浓浓度对照品溶液峰积进行计算。脑组织中分析物的提取回收率为90.87%-100.25%。血浆中分析物的提取回收率为84.26%-100.70%。内标的提取回收率为90.2%-97.29%。由此可见内标具有较好的稳定性，不受基质中其他内源性物质的干扰。40 表2-2脑组织样品中待测物的回收率和精密度（均值±标准差）Table2-2TherecoveriesandprecisionsofanalytesinbraintissueAnalytesConcentrationPrecision(RSD%)RelativeExtractionµg·mL-1intradayinterdayrecovery(%)recovery(%)0.055.566.16102.79±7.1199.91±5.56Hcy16.379.1395.94±6.1990.87±5.7923.926.0899.91±3.9497.24±3.810.051.901.5879.82±1.8299.99±1.90Cys11.563.91110.18±1.73100.12±1.5621.677.50101.10±1.70100.25±1.68IS1.3-95.45±2.43表2-3血浆样品中待测物的回收率和精密度（均值±标准偏差）Table2-3TherecoveriesandprecisionsofanalytesinplasmaAnalytesConcentrationPrecision(RSD%)RelativeExtractionµg·mL-1intradayinterdayrecovery(%)recovery(%)0.25.393.0584.82±5.4995.41±5.1415.872.64109.47±6.6399.70±5.86Hcy24.569.9691.46±4.2589.61±4.090.26.713.8684.45±5.5893.12±6.2513.495.0191.68±3.1984.26±2.94Cys24.813.15105.28±5.0699.69±4.80IS1.5-90.20±1.183.2.4稳定性本实验考察了QC样品在4℃时48h内的稳定性以及储备液在-20℃下两月内的稳定性。脑组织QC样品稳定性见表2-4，血浆QC样品的稳定性见表2-5，41 对照品储备液的稳定性见表2-6。表2-4和表2-5的数据表明，整个过程包括样品预处理和测定最好在24小时内完成。表2-6中的数据表明，Hcy，Cys和IS储备液在30日内均较稳定。表2-4待测物在脑组织中的稳定性Table2-4TheStabilityofanalytesinratbraintissueConcentrationAnalytesµg·mL-10h,4℃24h,4℃(reduction,%)48h,4℃(reduction,%)0.050.0546±0.00300.0497±0.0012（-9.00）0.0428±0.0021（-21.54）Hcy10.8305±0.05290.7717±0.0120（-7.09）0.8923±0.089（7.44）21.7182±0.06731.6042±0.0391（-4.58）1.7571±0.0778(2.26)0.050.0247±0.00050.0248±0.0006（0.47）0.0324±0.0102(31.30)Cys10.5733±0.00900.5471±0.0573（-4.58）0.5198±0.0139(-9.33)21.0487±0.01750.7420±0.0738（-29.25）0.7675±0.0255(-26.81)表2-5待测物在血浆中的稳定性Table2-5StabilityofanalytesinplasmaConcentrationAnalytesµg·mL-10h,4℃24h,4℃(reduction,%)48h,4℃(reduction,%)0.20.1730±0.00930.1760±0.0079（1.74）0.1804±0.0040（4.27）Hcy10.9592±0.05631.0140±0.0181（5.71）0.9870±0.0628（2.89）21.5835±0.07221.9435±0.0753（22.73）2.0304±0.0296(28.22)0.20.0878±0.00590.0909±0.0077（3.56）0.8380±0.0096(-4.49)Cys10.4826±0.01680.5332±0.0366（10.48）0.5621±0.0248(16.47)21.1100±0.05340.9457±0.1288（-14.80）1.0113±0.0139(-8.90)42 表2-6待测物在血浆中的稳定性Table2-6StabilityofanalytesinplasmaAnalytesConcentration0day30day-20℃60day-20℃µg·mL-1-20℃RE%RSD%RE%RSD%0.26.35-3.735.39-19.295.16Hcy12.13-4.646.73-5.705.0129.146.576.99-12.861.010.23.200.662.87-9.203.80Cys17.13-9.372.60-14.811.6925.46-8.941.44-14.221.20IS1.37.63-4.542.89-12.331.984.结论本部分建立了测定脑组织和血浆中Hcy,Cys的HPLC-ECD法，该方法可在30min中内完成单次分析。该分析方法操作简便，灵敏度较好，准确度和精密度均满足测定要求。可用于测定生物样品中Hcy,Cys的含量。43 第三部分糖尿病模型及给药组大鼠海马、皮层和血浆中11种神经递质的含量测定1仪器与试剂1.1实验仪器高效液相色谱系统（Agilent1260）美国Agilent公司BDS色谱柱（4.6mm×250mm,5µm）大连依利特公司荧光检测器（G1321A）美国Agilent公司高效液相色谱系统日本岛津公司C18色谱柱（4.6mm×250mm,5µm）大连依利特公司电化学检测器（ED723）日本岛津公司玻璃匀浆器重庆北碚化玻厂低温高速离心机美国Thermo公司超纯水机上海和泰仪器公司电子分析天平德国赛多利斯公司pH计上海仪电科学仪器公司台式离心机（TGL-16G）上海市安亭科学仪器厂超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司1.2材料与试剂名称厂家甲醇美国TEDIA公司醋酸钠上海维塔试剂公司柠檬酸成都市科龙化工试剂厂高氯酸上海维塔试剂公司1-辛烷磺酸钠盐北京百灵威科技有限公司44 DL-高半胱氨酸美国Sigma公司L-半胱氨酸上海阿拉丁公司香草酸上海麦克林公司四氢硼化钠成都市科龙化工试剂厂邻苯二甲醛上海阿拉丁公司L-天冬氨酸上海阿拉丁公司DL-谷氨酸日本TCI公司L-甘氨酸上海麦克林公司L-牛磺酸上海阿拉丁公司γ-氨基丁酸上海麦克林公司L-色氨酸上海阿拉丁公司L-蛋氨酸上海麦克林公司5-羟色胺上海麦克林公司多巴胺上海阿拉丁公司L-高丝氨酸上海麦克林公司1.3实验动物SPF级雄性大鼠50只，初始体重80-100g，由重庆医科大学动物实验中心提供。2.实验方法2.1动物疾病模型的建立雄性SD大鼠50只，在进行实验前，大鼠自由摄食饮水，室温，正常通风的实验环境中，用SPF级基础饲料适应性喂养一周。50只大鼠随机分为对照组（10只）和模型组（40只）。对照组一直用SPF级基础饲料喂养，模型组给予高脂饮食（20%糖、10%猪油、10%蛋黄粉和60%基础饲料）。模型组大鼠高脂饲养4周后，禁食不禁水6h后一次性腹腔注射STZ30mg·kg-1体重诱导高血糖。模型组继续高脂饲养4周后测定空腹血糖，挑选出空腹血糖>16.7mmol·L-1的糖尿病大鼠，并进行分组。造模成功的糖尿病大鼠分为4组并分别给药：糖尿病组，45 胰岛素组，维格列汀组，二甲双胍组。所有大鼠均用SPF级基础饲料喂养8周。2.2生物样品的采集将大鼠断头处死，剪开头皮，在冰盘上迅速分离大鼠海马和皮层并分别置于EP管中，立即保存于-80℃冰箱中。将血液收集于含肝素的EP管中，于6000×g，常温，离心10min，血浆分装于EP管中，于-80℃条件下保存。2.3样品处理2.3.1HPLC-FLD测定大鼠脑组织和血浆中9种物质按照第一部分2.2项下，样品预处理方法同法处理脑组织，血浆。2.3.2HPLC-ECD测定大鼠脑组织及血浆中高半胱氨酸和半胱氨酸按照第二部分2.2项下，样品预处理方法同法处理脑组织，血浆。2.4色谱条件2.4.1HPLC-FLD测定大鼠脑组织和血浆中9种神经递质按照第一部分2.4项下，设定相同色谱条件。2.4.2HPLC-ECD测定大鼠脑组织及血浆中高半胱氨酸和半胱氨酸按照第二部分2.3项下，设定相同色谱条件。2.5统计学分析实验所得所有数据均采用spss16.0进行统计分析，用均值±标准偏差（Mean±SD）表示，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。3.结果与讨论采用本文第一部分和第二部分所建立的HPLC-FLD、HPLC-ECD方法对对照组(Con)、糖尿病组(DM)、胰岛素组(Ins)、维格列汀组(Vid)、二甲双胍组(MH)大鼠海马、皮层及血浆中11种神经递质进行定量测定，结果见表3-1，3-2，3-3和图3.1。大鼠皮层结果显示，与正常组比较，糖尿病模型组中Gly,GABA,Trp,Met,5-HT,Cys有显著性差异。除Hcy外，胰岛素对由糖尿病引起的各种神经递质含量变化均有抑制作用。并可将Gly,Trp,Cys含量恢复至正常水平。维格列汀可将Gly,GABA,Trp,5-HT,Cys含量恢复至正常水平。二甲双胍可将46 Gly,GABA,5-HT,Cys含量恢复至正常水平。结果提示，相较于其余2种药物而言，维格列汀对大鼠皮层中的神经递质含量的影响更大。大鼠海马结果显示，与正常组比较，糖尿病模型组中Glu,Trp,Met有显著性差异。胰岛素可将Glu,Trp,Met含量变化均有不同程度的抑制作用。维格列汀可将Met含量恢复至正常水平。二甲双胍可将Glu,Trp含量恢复至正常水平。结果提示，相较于其余2种药物而言，二甲双胍对大鼠海马中的神经递质含量的影响更大。大鼠血浆结果显示，与正常组比较，糖尿病模型组中Asp,Glu,Trp,DA有显著性差异。胰岛素可将Asp,Glu,DA含量恢复至正常水平。维格列汀可将DA含量恢复至正常水平。二甲双胍对Asp,Glu,DA含量变化均有不同程度的抑制作用。结果提示，相较于其余2种药物而言，胰岛素对大鼠海马中的神经递质含量的影响更大。47 表3-111种神经递质在给药组大鼠皮层中的含量（Mean±SD）Table3-1ThecontentofelevenanalytesincortexofratsgivenwithdrugsCon(µg·g-1)DM(µg·g-1)Ins(µg·g-1)Vid(µg·g-1)MH(µg·g-1)As258.67±18.92257.97±20.55179.48±25.2*#204.11±11.76*#235.61±15.82pGl975.43±93.661048.6±64.67956.71±64.91101.05±75.89*#1117.98±72.59*uGl138.49±13.17100.98±15.3*126.03±24.8115.31±29.27#110.57±23.8yTa433.63±38.63385.93±10.05567.14±93.32*#547.14±102.24*#451.76±68.17uGA297.12±25.47225.32±13.44*321.37±23.92#262.76±46.87241.99±48.79BA4.8±0.43.16±0.44*Trp4.5±0.35#4.22±0.51#3.89±0.57*Me8.64±0.754.71±0.5*5.00±1.26*5.71±0.77*#5.35±0.37*t5-8.48±1.154.3±0.87*10.94±1.30*#7.63±2.21#7.17±2.46#HT8.33±0.579.09±1.48DA5.85±2.32*#8.46±0.718.31±0.51Hc10.85±7.397.4±6.490.51±0.41*2.45±1.76*#0.85±0.51*yCy8.62±5.033.07±1.67*6.15±2.756.48±1.195.06±2.68#s*,p<0.05,VScontrolgroup.#,p<0.05,VSDMgroup.表3-211种神经递质在给药组大鼠海马中的含量（Mean±SD）Table3-1ThecontentofelevenanalytesinhippocapusofratsgivenwithdrugsCon(µg·g-1)DMµg·g-1)Ins(µg·g-1)Vid(µg·g-1)MH(µg·g-1)As196.77±24.13184.15±15.47109.34±7.82*#123.39±9.62*#134.61±35.59*#pGl787.4±27.38929.7±42.88*698.68±21.5*#839.66±45.23*#797.42±213.5uGl219.07±41.63185.42±28.82242.94±34.09#252.07±19.1#174.85±38.23yTa611.99±69.72600.87±74.081050.34±185.93*#1110.35±112.72*#695.38±282.13uGA432.72±78.40359.15±55.75369.34±18.47410.63±42.11349.46±64.4BA5.8±1.064.18±0.22*Trp7.3±0.95*#8.27±0.96*#7.78±0.847.71±1.444.5±0.4*Me5.19±0.72*#8.41±4.864.76±0.92*48 t5-13.08±3.3213.82±3.78_________HT7.52±0.777.88±0.5DA7.36±0.316.65±0.84#7.91±0.82Hc0.35±0.29__0.72±0.660.05±0.040.69±0.04yCy7.07±2.177.01±3.135.17±1.626.97±0.94.87±0.62s*,p<0.05,VScontrolgroup.#,p<0.05,VSDMgroup.表3-211种神经递质在给药组大鼠血浆中的含量（Mean±SD）Table3-1ThecontentofelevenanalytesinplasmaofratsgivenwithdrugCon(µg·mL-1)DMIns(µg·mL-1)Vid(µg·mL-1)MH(µg·mL-1)-1(µg·mL)As1.53±1.140.12±0.08*0.45±0.05#0.13±0.12*0.28±0.25*pGl14.79±6.076.26±1.90*8.91±3.164.45±0.7*7.85±1.89*uGl15.51±1.2817.04±2.7416.45±2.4515.18±3.1815.35±4.13yTa29.29±8.0322.11±4.3129.49±8.0015.27±4.78*15.03±13.69uG22.26±2.9624.62±5.5723.79±5.3120.75±4.8841.33±8.10*#ABATr0.17±0.118.38±2.21*9.31±2.32*7.16±1.238.43±1.67*pM2.85±3.675.92±0.65.00±0.974.89±0.996.09±0.49et5-0.16±0.100.37±0.2______HTD3.70±1.549.06±2.21*4.37±1.34#6.02±2.416.93±1.01*AHc5.47±1.456.36±1.786.26±1.038.28±2.475.24±1.64yCy2.31±1.213.40±0.92.63±0.562.48±0.292.49±0.72s*,p<0.05,VScontrolgroup.#,p<0.05,VSDMgroup.49 50 图3.111种神经递质在给药组大鼠样品中的含量.A:皮层；B：海马；C：血浆。Fig3.1Thecontentofelevenanalytesinplasmaofratsgivenwithdrug.A:Cortex;B:Hippocapus;C:Plasma.51 4.结论采用本文第一和第二部分建立的方法测定正常组，糖尿病大鼠模型组及各给药组大鼠皮层，海马，血浆中11中物质的含量。采用独立样本t检验统计方法分析了正常组，糖尿病组，胰岛素组，维格列汀组，二甲双胍组模型中物质的浓度水平。结果显示，与正常组比较，在皮层中，糖尿病模型组中Gly,GABA,Trp,Met,5-HT显著性上升，Cys显著性降低；在海马中，糖尿病模型组中Trp,Met呈显著性降低，Glu显著性升高；在血浆中，糖尿病模型组中Asp,Glu,显著性降低，Trp,DA显著性上升；这11种物质浓度水平均有不同程度的改变，这提示这11种物质与糖尿病的并发症有关。且三组给药组均能一定程度的将其恢复至正常水平。与正常组比较，Trp在神经中枢与外周均有显著性差异。这提示，糖尿病的并发症可能与Trp在体内的浓度水平变化有较大联系。52 全文总结1.建立了同时测定氨基酸和单胺类物质的高效液相方法。9种物质采用柱前衍生HPLC-FLD测定。优化了流动相pH、OPA的用量、衍生反应时间及衍生反应溶液的pH等色谱条件。最终确定的色谱条件为：流动相A为35mmol·L-1醋酸钠，5mmol·L-1柠檬酸，pH=6；流动相B为甲醇。梯度洗脱程序为：0-23min：28%B；23.01min:60%B。激发波长为335nm，发射波长为460nm。柱温设置为30℃。各方法学参数均满足要求。2.建立了同时测定高半胱氨酸和半胱氨酸的HPLC-ECD法。优化了还原剂的类型、流动相的组成及pH、检测电压等色谱条件。最终确定的色谱条件为：流动相为甲醇：缓冲液（30mmol·L-1醋酸钠，100µmol·L-1辛烷磺酸钠，pH=5.0）=0.1：99.9。检测电压为900mv。柱温设置为30℃。流速为0.7mL/min。香草酸为内标。各方法学参数均满足要求。3.采用本文建立的HPLC-FLD、PHLC-ECD法测定糖尿病模型大鼠皮层、海马、血浆中11种物质的含量。结果显示：在皮层中，与正常组比较，糖尿病模型组中Gly、GABA、Trp、Met和5-HT的浓度显著性增加，Cys显著性降低；Glu和DA有上升趋势，而Tau和Hcy呈下降趋势。大鼠海马中，与正常组比较，糖尿病模型组中Trp和Met浓度呈显著性降低趋势，Glu显著性升高；Gly、Tau和GABA呈下降趋势。大鼠血浆中，与正常组比较，糖尿病模型组中Asp和Glu,显著性降低，Trp和DA显著性上升；Gly、GABA、Met、5-HT、Hcy和Cys呈上升趋势，Tau呈下降趋势。三组给药组均能一定程度的将各待测物质的浓度恢复至正常水平。Glu在大鼠脑组织（尤其是海马）中均有上升趋势，而起保护作用的Tau则在三种基质中均呈下降趋势，表明高血糖条件会增加Glu的毒性，糖尿病对海马区域的毒性更大。值得注意的是，Trp在三种基质中均表现出显著性差异，这提示可进一步探讨其在糖尿病中的作用。上述结果提示这些物质在体内含量的变化可能与糖尿病并发症有关。53 参考文献[1]BiesselsGJ,DearyLJ,RyanCM.Cognitionanddiabetes:alifespanperspective[J].LancetNeurology.2008,7(2):184-190.[2]McCallAL.Cerebralglucosemetaabolismindiabtesmellitus[J].EuropeanJournalofPharmacology.2004,490:147-158.[3]RoosenP,Nawrot,PP,KingG,etal.Theroleofoxidativesttressinonsetandprogressionofdiabetesanditscomplications:asummaryofacongressseriessponsoredbyUNESCO-MCBN,theAmericanDiabetesAssociation,andtheGermanDiabetesSociety[J].Diabetes-MetabolismResearchandReviews.2001,17(3):189-212.[4]VlassaraH.Recentprogressinadvancedglycationendproductsanddiabeticcomplications[J].Diabetes.1997,46(46Suppl2):S19-S37.[5]NegiG,KumarA,SharmaSS.Melatoninmodulatesneuroinflamationandoxidativestressinexperimentaldiabeticneuropathy:effectsonNF-kappaBandNrf2cascades[J].JournalofPinealResearch.2011,50(2):124-131.[6]ZhouXY,ZhuQX,YinXX,etal.Quantitative-profilingofneurotransmitterabnormalitiesinthediseaseprogressionofexperimentaldiabeticencephalopathyrat[J].Canadianjournalofphysiologyandpharmacology.2015,93(11):1007-1013.[7]ArafaNMS,MarieMAS,AlazimiSAM.Effectofcanagliflozinandmetforminoncorticalneurotransmittersinadiabeticratmodel[J].Chemico-BiologicalInteractions.2016,258:79-88.[8]KamalA,BiesselsGJ,RamakersGM.Synaptictransmissionchangesinthepyramidalcellsofthehippocampusinstreptozotocin-induceddiabetesmellitusinrat[J].BrainResearch.2006,1073-1074(1):276-280.[9]LunkesaGI,StefanellobF,LunkesaDS,etal.Serumcholinesteraseactivityindiabetesandassociatedpathologies[J].DiabetesResearchandClinicalPractice.2006,72(1):28-32.[10]ZeiselSH,DaCostaKA.Choline:Anessentialnutrientforpublichealth[J].54 NutritionReviews.2009,67(11):615-623.[11]UelandPM,HolmPI,HustadS.Betaine:Akeymodulatorofone-carbonmetabolismandhomocysteinestatus[J].ClinicalChemistryLaboratoryMedicine.2005,43(10):1069-1075.[12]FarberNB,NewcomerJW,OlneyJW.Theglutamatesynapseinneuropsychiatricdisorders,FocusonschizophreniaandAlzheimer’sdisease[J].ProgressinBrainResearch.1998,116:421–437.[13]KishPE,Fischer-BovenkerkC,UedaT.Activetransportofgamma-aminobutyricacidandglycineintosynapticvesicles[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences.1989,86(10):3877–3881.[14]MohammedAHH,BarraRR,BhaskarpillaiSK,etal.Cognitiveimpairmentintype2diabetesmellitus[J].InternationalJournalofDiabetesMellitus.2015,3(1):19-24.[15]SaransaariP,OjaSS.Taurineandneuralcelldamage[J].AminoAcids.2000,19(3-4):509–526.[16]NussP.AnxietydisordersandGABAneurotrnsmission:adisturbanceofmodulation[J].NeuropsychiatricDiseaseandTreatment.2015,11:165-175.[17]SaundersA,GrangerAJ,SabatiniBL.CoreleaseofacetylcholineandGABAfromcholinergicforebrainneurons[J].Elife.2015,4:13pages.[18]GrangerAJ,MulderN,SaundersA,etal.CotransmissionofacetylcholineandGABA[J].Neuropharmacology.2016,100:40-46.[19]EzzeldinE,SourorWAH,ShahatAA,etal.BiochemicalandNeurotransmittersChangsAssociatedwithTramadolinStreptozotocin-InducedDiabetesinRats[J].BioMedResearchInternational.2014,2014(5):9pages..[20]GallegoM,SetienR,IaquierdoMJ,etal..Diabetes-InducedBiochemicalChangesinCentralandPeripheralCatecholaminergicSystems[J].PhisiologicalResearch.2003,52(6):735-741.[21]WolfensbergerM,AmslerU,CanzekV,etal.Gaschromatographicmethodforthedeterminationoftraceamountsofputativeaminoacidneuro-transmitters55 frombrainperfusatescollectedinvivo[J].JournalofNeuroscienceMethods.1982,5(3):253–260.[22]LorenzoMP,NavarreteA,BalderasC,etal.OptimizationandvalidationofaCE-LIFmethodforaminoaciddeterminationinbiologicalsamples[J].JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis.2013,73(2):116–124.[23]ZhangM,FangC,SmaginG.DerivatizationforthesimultaneousLC/MSquantificationofmultipleneurotransmittersinextracellularfluidfromratbrainmicrodialysis[J].JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis.2014,100(21):357–364.[22]DaiZ,WuZ,JiaS,etal.Analysisofaminoacidcompositioninproteinsofanimaltissuesandfoodsaspre-columno-phthaldialdehydederivativesbyHPLCwithfluorescencedetection[J].JournalofChromatographyB-AnalyticalTechnologiesintheBiomedicalandLifeScience.2014,964:116–127.[24]SharmaG,AttriSV,BehraB,etal.Analysisof26aminoacidsinhumanplasmabyHPLCusingAQCasderivatizingagentanditsapplicationinmetaboliclaboratory[J].AminoAcids.2014,46(5):1253-1263.[25]ShiTY,TangT,QianK,etal.High-performanceliquidchromatograghicmethodfordeterminationofaminoacidsbyprecolumnderivatizationwith4-chloro-3,5-dinitrobenzotrifluoride[J].AnalyticaChimicaActa.2009,654,:154-161.[26]WuX,WangR,JiangQ,etal.DeterminationofaminoacidneurotransmittersinrathippocampibyHPLC-UVusingNBD-Fasaderivative[J].BiomedicalChromatography.2013,28(4):459–462.[27]BattagliaA,BertoluzzaB,CalbucciF.High-performanceliquidchromatographicanalysisofphysiologicalaminoacidsinhumanbraintumorsbypre-columnderivatizationwithphenylisothiocyanate[J].JournalofChromatographyB.1999,730(1):81–93.[28]CanevariL,VieiraR,AldegundeM,etal.High-PerformanceLiquidChromatographicSeparationwithElactrochemicalDetectionofAminoAcidsFocusingonNeurochemicalApplication[J].AnalyticalBiochemistry.1992,56 205(1):137-142.[29]Jacob,WA.O-phthalaldehyde-sulfitederivatizationofprimaryaminesforliquidchromatography-electrochemistry[J].JournalofChromatography.1987,392(6):435-441.[30]Monge-AcunaAA,Fornaguera-TriasJ.Ahighperformanceliquidchromatographymethodwithelectrochemicaldetectionofgamma-aminobutyricacid,glutamateandglutamineinratbrainhomogenaes[J].JournalofNeuroscienceMethods.2009,183:176-181.[31]郭健，肖飞，唐志毅.高效液相色谱法测定血浆同型高半胱氨酸[J].中华医学检验杂志.2000,23(4):217-219.[32]HirsCHW.Performicacidoxidation[J].MethodsEnzymol.1967,11(1):197.[33]GurdFRN.Carboxymethylation[J].MethodsEnzymol.1972,25(1):424.[34]HouzeP,GamraS,MadelaineI,etal.SimultaneousDeterminationofTotalPlasmaGlutathione,Homocysteine,Cysteinylglycine,andMethioninebyHigh-PerformanceLiquidChromatographyWithElectro-chemicalDetection[J].JournalofClinicalLaboratoryAnalysis.2001,15(3):144-153.[35]StevenC,WilliamA,AlanF.MeasurementofPlasmaTotalHomocysteinebyHPLCwithCoulometricDetection[J].ClinicalChemistry.1999,45(1):150-152.[36]丁敏，何俊，叶炼，等.高效液相色谱紫外检测法测定血浆中总半胱氨酸[J].重庆大学学报.2005,28(5):116-119.57 文献综述糖尿病引起神经病变的研究糖尿病（DiabetesMellitus,DM）是一种以血糖升高为特征,并伴有多饮、多食、少尿等症状的全身性、代谢性疾病。近年来，我国糖尿病患病率正显著增加[1]。糖尿病常见的慢性并发症主要有三种：大血管病变（心脏病，高血压，下肢血管病变等）、微血管病变（糖尿病视网膜病变，糖尿病肾病等）、神经病变（周围神经病变，中枢神经病变，自主神经病变）[2]。糖尿病神经病变的病理学机制包括微血管损伤、代谢紊乱、神经元与免疫系统之间相互作用的变化。糖尿病周围神经病变(DiabeticPeripherialNeuropathies,DPN)是糖尿病引起神经病变的常见并发症之一。糖尿病所引起的神经病变病因及发病机制尚不明确，因此本文就糖尿病所引起的周围神经病变发病机制作如下综述。1.糖尿病周围神经病变DPN主要临床特征为远端神经感觉、运动障碍，表现为感觉丧失、足溃疡、灼烧痛、刺痛、坏疽等。DNP可增加患者的病死率和死亡率。DPN的主要发病机制被认为与以下因素有关：1.1氧化应激途径糖尿病患者体内氧自由基增加，导致过量的活性氧簇（ROS）堆积，氧化/抗氧化平衡失调，可促进氧化应激的发生。ROS不仅可直接损伤胰岛β细胞，还可以激活生长因子、应激反应元件细胞凋亡通路，加重胰岛β细胞的凋亡[3]。高血糖环境下线粒体中的电子传递链被增强，产生过多的超氧化物。超氧化物通过PARP介导的NADH+消耗可直接或间接的抑制磷脂甘油醛脱氢酶(GAPDH)，ROS对GADPH的抑制可导致糖酵解途径的中间体累积，使得AGEs在体内累积。有学者认为线粒体电子传递链组分功能上的缺陷影响了ATP的生成并增加了自由基的生成，产生的自由基对线粒体DNA和核DNA造成损害，这又反过来加重线粒体损伤，导致神经元受损[4]。此外，氧化应激还可破坏各种神经营养因子、影响浆轴运输、减弱受损神经纤维的再生能力。1.2多元醇通路途径59 在多元醇途径中，醛糖还原酶将葡萄糖转化为山梨糖醇；NAD+作为辅助因子，山梨醇脱氢酶将山梨糖醇氧化成果糖。在此代谢过程中有两个关键酶：醛糖还原酶、山梨醇脱氢酶[5].正常状态下，大部分葡萄糖经糖酵解途径代谢；高血糖状态下，多元醇通路活性增强，造成山梨醇和果糖大量累积于周围神经，使神经细胞渗透压升高，可引起神经细胞变性、坏死等。在严重的糖尿病状况下，伴随其神经末梢的丢失，较长的神经纤维的神经传导速度受到影响。神经末梢受损是造成刺痛感的原因，感觉和反射的消失通常首先在足部得到观察[6]。在高血糖的情况下，山梨糖醇的累积和NADPH（还原型谷胱甘肽再生的辅助因子）的间接消耗均可促进氧化应激[7]。1.3蛋白激酶C途径蛋白激酶C（PKC）是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，主要分为三大类：传统型PKC（α、βI、βⅡ和γ）、新型PKC（δ、ε、η和θ）、非典型PKC（ζ和λ）。高血糖情况下，PKC通路的激活可能主要是由于甘油二酯（DAG）的增加[8]。糖尿病状态下DAG水平的增加可以通过多种途径形成：磷脂酰肌醇的水解、磷脂酰胆碱的代谢过程、或DAG的从头合成[9]。当DAG在体内累积时可激活大量PKC。PKC的激活会引起一些异常变化：血流改变，基底膜增厚，细胞外基质扩张，血管渗透性，血管生成等[10]以及导致胰岛素抵抗的发生[11]。几种PKC亚型的持续性过度激活会引起由糖尿病诱导生成的ROS对组织造成损伤[12]。PKC通路的激活还可引起Na+-K+-ATP酶活性降低，这导致神经传导速度下降、神经轴突和Swhann细胞发生退行性改变[13]。有学者认为PKC通路激活对糖尿病周围神经病变的影响可能主要是通过其对血管和微血管的影响，而并非直接损伤神经细胞[14]。1.4己糖胺途径正常情况下，大多数葡萄糖通过糖酵解途径为生物体提供能量。糖尿患者体内，由高血糖诱导的线粒体超氧化物的累积可抑制甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）活性并激活己糖胺途径，即糖酵解途径中的上游产物6-磷酸果糖在6-磷酸果糖肽基转移酶（GFAT）的作用下转化为6-磷酸葡萄糖胺。后者在特异性N-乙酰氨基葡萄糖胺（O-GlcNAc）转移酶的作用下转化为尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)[15]。研究表明，GFAT和O-GlcNAc转移酶的过度表达会导致胰岛6060 素抵抗[16]。既往资料表明高糖或GFAT过度表达条件下会刺激主动脉内皮细胞转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达，及增强纤溶酶原激活物抑制剂-1（API-1）启动子的活性[17]。高血糖导致转录因子特异蛋白1(SP1)的N-乙酰糖基化增加4倍，SP1介导API-1启动子的激活。研究表明，在大肠杆菌中经过糖基化的SP1比未经糖基化SP1的活化转录高3-5倍[18]。API-1和TGF-β1的激活引起细胞外基质的集聚，这可能导致与糖尿病神经病变相关的神经炎症[19]。己糖胺途径在糖尿病期间的许多组织中被活化，并且可以通过抑制戊糖分流途径来促进氧化应激，由此减少细胞抗氧化剂还原型谷胱甘肽（GSH）的产生。1.5糖基化终末产物途径糖基化终末产物（AGEs）是蛋白质的氨基在非酶促条件下，与还原性糖的醛基发生的糖基化反应所生成的一系列不可逆终产物的总称。在高血糖环境下AGEs大量累积，其主要通过三种机制破坏靶细胞：AGEs可修饰细胞内蛋白质进而改变他们的功能；AGEs修饰细胞外基质成分，使之与细胞上的机制受体异常作用；AGEs与其受体（RGAE）结合，诱导受体介导的ROS产生，AGEs和RAGE的结合过程激活核转录因子（NF-Kβ），导致促炎基因的表达[20]。NF-Kβ的活化可增加促凝血组织因子、黏附因子等的基因表达，使血管通透性，内皮细胞促凝能力改变，使血流调节受损。AGEs/RAGE可扰乱神经微循环血管舒缩功能的平衡，导致神经组织血流灌注减少[21]。AGEs的堆积可造成神经细胞进行性脱纤维、神经纤维萎缩和退化，而NF-κB的活化会诱导神经元细胞凋亡[22]。1.6炎症途径以上所有途径：多元醇途径、PKC途径、AGEs途径等均可直接或间接促进炎症反应。上述途径及NF-κB的活化可促进IL-1β，IL-2，IL-6，IL-8，TNF-α，CCL2，CXCL1等细胞因子和趋化因子的表达。研究表明细胞因子和趋化因子不仅可增强现有的炎症和免疫反应，还能促进细胞氧化/亚硝化应激反应，造成更多的神经元损伤[23]。COX是花生四烯酸代谢过程中的限速酶，在组织损伤和炎症条件下表达增强。动物实验表明：COX-2在周围神经中的表达上调[24]。受NF-κB介导的TNF-α可诱导COX-2的过度表达及促分裂员活化蛋白激酶的激活，该过程均涉及糖尿病诱导的促炎反应和神经病变。1型糖尿病动物实验表明：动物坐骨神经中TNF-α61 水平显著升高，通过COX-2基因失活或COX-2选择性抑制剂可治疗上述改变[25]。1.7脑内代谢异常脑内的神经营养因子，生长因子，氨基酸等多种物质共同维护脑内的正常代谢活动。资料表明，在糖尿病小鼠中多种物质代谢异常。谷氨酸（Glu）是脑内兴奋性神经递质，实验证实，血糖升高时，认知功能损害的海马组织中谷氨酸含量明显升高，表明高糖环境可能回增加谷氨酸的神经毒性，从而损伤神经元，造成认[26]知功能障碍。5-羟色胺（5-HT）,去甲肾上腺素（NE），多巴胺（DA）等物质在学习和记忆中的作用复杂。糖尿病小鼠脑组织代谢物中，丙氨酸（Ala）,天冬氨酸（Asp），谷氨酰胺（Gln），琥珀酸（Suc）,甘氨酸（Gly）等物质含量有明显变化。有学者认为，糖尿病对认知功能的损伤可能是由于，在高血糖状态下，正[27-28]常的糖酵解途径受阻，激发了多元醇通路。葡萄糖代谢为多元醇，而多元醇在细胞内堆积，造成高渗状态，为维持内环境稳定，其他物质如肌醇（MI），牛磺[29]酸（Tau）等物质会减少。有实验表明，在2型糖尿病患者脑内不同区域发现N-乙酰天冬氨酸（NAA），肌酸（Cr），肌醇（MI），胆碱（Cho）之间的比值有变[30-31]化，在DE患者脑内是否有此变化，目前报道较少。有学者认为，胰岛素抵抗[27]所导致的认知功能障碍可能与下丘脑—垂体—肾上腺轴功能失调有关。1.8其他因素凋亡是细胞程序性死亡，在此过程中，Bcl2家族和半胱氨酸家族酶起重要作[32-33][34-35]用。脑内的肽类，激素等可作为保护因子，延缓神经元的凋亡。链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠脑组织中，神经营养因子，神经生长因子表达减少。神经肽Y，P物质等在糖尿病小鼠中的代谢和传递均存在异常。糖尿病神经病变的发病是多种物质共同作用的结果，糖尿病对学习记忆功能的影响涉及到多种信号转导系统，相应受体及神经递质等，其相互作用及其复杂。而糖尿病神经病变的具体发病机制更有待深入了解。2.糖尿病神经病变的治疗针对糖尿病引起的神经病变的治疗，有资料建议改善代谢紊乱（如高血糖、肥胖、高血压、血脂异常）及改善微循环等[36]。目前，糖尿病神经病变研究得最好的是由其引起的疼痛方面的治疗。常用的抗疼痛药物有一下几类：62 2.1三环类抗抑郁药物（TCAs）TCAs是临床治疗糖尿病神经疼痛的一线药物。其具体机制尚不清楚，有学者认为TCAs是通过提高疼痛的阈值，并阻止受损神经冲动而起止痛作用。常用的TCAs类有：氯丙咪嗪，阿米替林，米那普仑，曲唑酮，氯米帕明，地昔帕明等[36]。有研究表明慢性腹腔注射米那普仑的镇痛作用可能与腺苷水平升高有关[37]。2.2抗惊厥类药物目前常用的抗惊厥药物有加巴喷丁和普瑞巴林。这些药物的抗痛觉过敏和镇痛作用可能涉及配体与CaV2.X的α2δ-1亚基的结合，使细胞膜的不应期延长，受损神经元的动作电位放电频率减慢，从而减轻症状[36,38]。动物实验表明，由STZ诱导的糖尿病大鼠模型中，使用钠离子通道抑制剂如利多卡因，美西律有镇痛作用[39]。研究表明，三环类抗抑郁药如阿米替林，去甲替林，丙咪嗪，地昔帕明和马普替林等许多抗抑郁药通过钠通道阻断产生作用，从而促进了这些化合物的抗痛觉过敏效应[40]。2.35-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂（SNRIs）5-HT和NE再摄取抑制剂（SNRIs）也用于临床，抗抑郁药物度洛西汀可有效缓解糖尿病神经病变引起的疼痛，且阿米替林和度洛西汀之间的镇痛效果无显着差异[38]。本品对糖尿病神经病变的作用机理尚未完全阐明，但其作用可能与抑制神经元突触前膜对5-HT和NE的再摄取，提高中枢神经系统的5-HT和NE的水平有关。2.4阿片类阿片类镇痛药，如他喷他多，羟考酮或吗啡也可用于缓解糖尿病神经病理性疼痛。鉴于该类药物易成瘾，一般仅供临时使用。3.总结糖尿病神经病变是糖尿病的慢性并发症，且发生率高，其可影响神经系统的任何部位。因此尽早识别并控制病情对糖尿病病人有较好的临床意义。糖尿病神经病变涉及多种机制，随着对其认识的加深，临床治疗也具有更好的选择性。在治疗DPNs所致的疼痛时，加巴喷丁、普瑞巴林、文拉法辛、度洛西汀等被推荐为63 一线用药，阿片类镇痛药和曲马多被推荐为二线用药。治疗时，首先选择一线药物，若一线药物不能有效缓解疼痛，可改换其他一线药物或联合治疗。参考文献[1]YangW,LuJ,WengJ,etal.Chinanationaldiabetesandmetabolicdisordersstudygroupprevalenceofdiabetesamongmenandwomeninchina[J].NewenglandJournalofMedicine.2010,362(25):1090-1101.[2]HuizingaMM,PeltierA.“Painfuldiabeticneuropathy:amanagement-centeredreview,”[J].ClinicalDiabetes.2007,25(1):6–15.[3]PitoccoD,TesauroM,Alessandro.R.,Ghirlanda.G.,Cardillo.C.OxidativeStressinDiabetes:ImplicationsforVascularandOtherComplications[J].InternationalJournalofMolecularSciences.2013,14(11):21525-21550[4]FernyhoughP,HuangTJ,VerkhratskyA.Mechanismofmitochondrialdysfunctionindiabeticsensoryneuropathy[J].JournalofthePeripheralNervousSystem.2003,8(4):227–235.[5]SandireddyR,YerraVG,AretiA,etal.NeuroinflammationandOxidativeStressinDiabeticNeuropathy:FuturisticStrategiesBasedonTheseTargets[J].InternationalJournalofEndocrinology.2014,2014(1).[6]VinikAI,MehrabyanA.Diabeticneuropathies[J].MedicalClinicsofNorthAmerica.2004，88;947–999.[7]ChungSSM,LamKSL,ChungSK,etal.Contributionofpolyolpathwaytodiabetes-inducedoxidativestress[J].JournaloftheAmericanSocietyofNephrology.2003,14(3):S233–S236.[8]CameronNE,CotterMA,JackAM,etal.ProteinkinaseCeffectsonnervefunction,perfusion,Na+,K+-ATPaseactivityandglutathionecontentindiabeticrats[J].Diabetologia.1999,42(9):1120–1130.[9]CravenPA,DavidsonCM,DeRubertisFR.Increaseindiacylglycerolmassinisolatedglomerulibyglucosefromdenovosynthesisofglycerolipids[J].Diabetes.1990,39(6):667–674.[10]EvcimenND,GeorgeLK.TheroleofproteinkinaseCactivationandthevascular64 complicationsofdiabetes[J].PharmacologicalResearch.2007,55(6)：498–510.[11]IkedaY,OlsenGS,HansenLL,etal.CellularMechanismofNutritionallyInducedInsulinResistanceinPsammomysObesusOverexpressionofProteinKinaseCεinSkeletalMusclePrecedestheOnsetofHyperinsulinemiaandHyperglycemia[J].Diabetes.2001,50(3):584-592.[12]LeeHB,Yu.MR,SongJS,etal.ReactiveoxygenspeciesamplifyproteinkinaseCsignalinginhighglucose-inducedfibronectinexpressionbyhumanperitonealmesothelialcells[J].KidneyInternational.2004,65(4):1170–1179.[13]GreeneDA,SimaAAF,StevensMJ,etal.Complications:neuropathy,pathogeneticconsiderations[J].DiabetesCare.1992,15(12):1902-1925.[14]GeraldesP,KingGL.ActivationofProteinKinaseCIsoforms&ItsImpactonDiabeticComplications[J].CirculationResearch.2010,106(8):1319–1331[15]DuXL,EdelsteinD,RossettiL,etal.Hyperglycemia-inducedmitochondrialsuperoxideoverproductionactivatesthehexosaminepathwayandinducesplasminogenactivatorinhibitor-1expressionbyincreasingSp1glycosylation[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences.2000,97(22):12222–12226.[16]BuseMG.Hexosamines,insulinresistanceandthecomplicationsofdiabetes:currentstatus[J].AmericanJournalofPhysiology.EndocrinologyandMetabolism.2006,290(1):E1–E8.[17]Kolm-LittyV,SauerU,NerlichA,etal.HighGlucose-inducedTransformingGrowthFactorb1ProductionIsMediatedbytheHexosaminePathwayinPorcineGlomerularMesangialCells[J].JournalofClinicalInvestigation.1998,101(1):160-169.[18]JacksonSP,TjianR.O-glycosylationofeukaryotictranscriptionfactors:implicationsformechanismsoftranscriptionalregulation[J].Cell.1988,55(1):125-133.[19]GiaccoF,BrownleeM.Oxidativestressanddiabeticcomplications[J]CirculationResearch.2010,107(9):1058–1070.[20]SinghR,KishoreL,KaurN.Diabeticperipheralneuropathy:Currentperspective65 andfuturedirections[J].PharmacologicalResearch.2014,80(1):21-35.[21]RosenP,NawrothPP,KingG,etal.Theroleofoxidativestressintheonsetandprogressionofdiabetesanditscomplications:asummaryofacongressseriessponsoredbyUNESCO-MCBN,theAmericanDiabetesAssociationandtheGermanDiabetesSociety[J]．Diabetes-metabolismResearchandReviews.2001,17(3):189-212.[22]MastrocolaR,RestivoF,VercellinattoI,etal.Oxidativeandnitrosativestressinbrainmitochondriaofdiabeticrats[J].JournalofEndocrinology.2005,187(1):37–44.[23]VincentAM.Biologyofdiabeticneuropathy[J].HandbClinNeurol.2013,115:591–606.[24]KelloggAP,Pop-BusuiR.PeripheralNerveDysfunctioninExperimentalDiabetesIsMediatedbyCyclooxygenase-2andOxidativeStress[J].AntioxidRedoxSignal.2005,7(11-12):1521-1529.[25]KelloggAP.Protectiveeffectsofcyclooxygenase-2geneinactivationagainstperipheralnervedysfunctionandintraepidermalnervefiberslossinexperimentaldiabetes[J].Diabetes.2007,56(12):2997–3005.[26]王璐璐.2型糖尿病认知功能障碍的中西医研究[D].北京：北京中医药大学,2015.[27]MohammedAHH,BarraRR,NaziaU,etal.Cognitiveimpairmentintype2diabetesmellitus[J].InternationalJournalofDiabetesMellitus.2015,3(1):19-24.[28]刘新林.宋滇平.2型糖尿病认知功能障碍的相关影响因素及可能发病机制[J].中华临床医师杂志.2012,6(24):8227-8229.[29]蔡洁,董继宏,汪昕.糖尿病周围神经病变发病机制的研究进展[J].中国临床医学.2007,14(3):302-305.[30]SinhaS,EkkaM,SharmaU,etal.Assessmentofchangesinbrainmetabolitesinindianpatientswithtype-2diabetesmellitususingprotonmagneticresonancespectrscopy[J].BmcResearchNotes.2014,7(1):1-7.[31]SahinI,AlkanA,KeskinL,etal.Evaluationofinvivocerebralmetabolismon66 protonmagneticresonancespectroscopyinpatientswithimpairedglucosetoleranceandtype2diabetesmellitus[J].JournalofDiabetesandItsComplications.2005,22(4):254-260.[32]陈莲珍,李林,王玉琴.糖尿病认知功能障碍发病机制研究的进展[J].中华老年心血管病志.2005,7(3):213-214.[33]YuXH,LeiJ,PengZ,etal.Neuroprotectionofaucubininprimarydiabeticencephalopathy[J].ScienceinChinaSeriesC:LifeScience.2008,51(6):495-502.[34]尹国平,陈丽.神经营养因子与糖尿病脑病[J].国际内分泌代谢杂志.2006,26(2):119-121.[35]PesaresiM,MaschiO,GiattiS,etal.Sexdifferencesinneuroactivesteroidlevelsinthenervoussystemofdiabeticandnon-diabeticrats[J].HormonesandBehavior.2010,57(1)：46-55.[36]陆祖谦,丁维.糖尿病周围神经病变诊治进展.药品评价.2013.10(17):35-42.[37]KuhadA,BishnoiM,ChopraK.Anti-nociceptiveeffectofduloxetineinmousemodelofdiabeticneuropathicpain[J].IndianJExpBiol.2009.47(3):193–197.[38]ZychowskaM,RojewskaE,PrzewlockaB,etal.Mechanismsandpharmacologyofdiabeticneuropathy-experimentalandclinicalstudies[J].PharmacologicalReports.2013.65(6):1601-1610.[39]DickIE,BrochuRM,PurohitY,etal.Sodiumchannelblockademaycontributetotheanalgesicefficacyofantidepressants[J].JournalofPain.2007.8(4):315–324.[40]MikaJ,OsikowiczM,RojewskaE,etal.Differentialactivationofspinalmicroglialandastroglialcellsinamousemodelofperipheralneuropathicpain[J].EuropeanJournalofPharmacology.2009.623(1):65–72.67 致谢感谢我的导师蒋心惠教授三年来在学习上的指导，您严谨的求知态度及科研精神给学生树立了永远的榜样。同时，也非常感谢您在生活上对我的照顾和包容，您的关心及乐观的生活态度对学生而言是极大的鼓励。同时也非常感谢百忙之中抽出宝贵时间评审我的论文的各位专家和评委。感谢我的家人一直以来对我的支持和陪伴；感谢我的同学，师妹等给予我生活和学习上的帮助和支持，感谢药学院的全体老师对我的关心和帮助。68 攻读硕士期间发表的论文[1]DanHuang,Na-naWang,Xin-huiJiang,etal.DevelopmentandvalidationofanHPLC-UVmethodfortheseparationofentecaviropticalisomers.JournalofChinesePharmaceuticalSciences.2018.27(3):201-208.[2]蒋心惠.一种大鼠血浆中高半胱氨酸和半胱氨酸的检测方法[P].中国专利：201711006838.1，2018-04-13.[3]DanHuang,Ting-tingDu,Xin-huiJiang,etal.SimultaneousdeterminationofnineanalytesrelatedtothepathogenesisofdiabeticencephalopathyindiabeticratcortexandhippocampusbyHPLC-FLD[J].BiomedicalChromatography.(已修回)69