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麟禹：／：考＾２０１５２１００６９ＵＮＲＳＩＶＥＩＴＹＯＦＪＩＮＡＮ项士学位论文基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究作者刘媛媛指导教师马洪敏合作导师学科名称化学学位类别理学硕士…■韋 StudyonTheFabricationofDiseaseMarkerSensorsBasedonCarbon-richNanomaterialsByLIUYuanYuanUndertheSupervisionofMAHongMinAThesisSubmittedtotheUniversityofJinanInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofScienceUniversityofJinanJinan,Shandong,P.R.ChinaMay,2018 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研宄所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡。献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：曰期：鳳ｙ关于学位论文使用授权的声明本人完全了解济南大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借鉴；本人授权济南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。Ｑ公开□保密（年，解密后应遵守此规定）＿论文作者签名导师签名：曰期：ｉｍＵＪ 济南大学硕士学位论文目录第一章绪论....................................................................................................................11.1疾病标志物概述......................................................................................................11.1.1疾病标志物.....................................................................................................11.1.2疾病标志物的分类.........................................................................................11.1.3疾病标志物的常见检测手段..........................................................................21.2电化学发光传感器概述...........................................................................................31.2.1电化学发光基本原理.....................................................................................31.2.2电化学发光传感器的发展趋势......................................................................41.3富碳纳米材料的概述...............................................................................................41.3.1几种常见的富碳纳米材料.............................................................................41.3.2富碳纳米材料在疾病标志物检测中的应用...................................................61.4本论文研究内容及创新点.......................................................................................72+第二章基于PDANS猝灭MWCNTs-NH2@N/Ru(bpy)3构建的PSA电化学发光传感器...............................................................................................................................................92.1前言..........................................................................................................................92.2试剂与仪器..............................................................................................................92.3实验部分................................................................................................................102.3.1MWCNTs-NH2@N的制备............................................................................102.3.2PDANS的制备..............................................................................................102.3.3PDANS-Ab2的制备.......................................................................................102.3.4免疫传感器的制备.......................................................................................102.3.5ECL测试.......................................................................................................112.4结果和讨论............................................................................................................112.4.1MWCNTs-NH2@N的表征............................................................................112.4.2PDANS的表征..............................................................................................122.4.3免疫传感器的表征.......................................................................................132.4.4实验条件的优化...........................................................................................152.4.5传感器的性能分析.......................................................................................16I 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究2.4.6传感器的稳定性、重现性和选择性............................................................162.4.7实际样品测试...............................................................................................172.5本章小结................................................................................................................18第三章基于纳米探针PDANS@Ag/C-dots构建的凝血酶电化学发光适体传感器.......193.1前言........................................................................................................................193.2试剂与仪器............................................................................................................193.3实验部分................................................................................................................203.3.1Gr-Pt的制备..................................................................................................203.3.2PDANS@Ag的制备.....................................................................................203.3.3巯基化C-dots的制备...................................................................................213.3.4pDNA-PDANS@Ag/C-dots的制备...............................................................213.3.5电化学发光适体传感器的构建....................................................................213.3.6ECL测试.......................................................................................................213.4结果和讨论............................................................................................................223.4.1纳米材料的表征...........................................................................................223.4.2适体传感器的表征.......................................................................................243.4.3实验条件的优化...........................................................................................263.4.4适体传感器的性能分析...............................................................................273.4.5适体传感器的稳定性、重现性和选择性....................................................283.4.6实际样品测试...............................................................................................283.5本章小结................................................................................................................29第四章基于NiPd-DNAzyme双重猝灭C-g-C3N4构建的胰岛素电化学发光传感器....314.1前言........................................................................................................................314.2试剂与仪器............................................................................................................314.3实验部分................................................................................................................324.3.1C-g-C3N4的制备............................................................................................324.3.2NiPd的制备..................................................................................................324.3.3NiPd-DNAzyme-Ab2猝灭探针的制备..........................................................334.3.4免疫传感器的制备.......................................................................................334.3.5ECL测试.......................................................................................................34II 济南大学硕士学位论文4.4结果和讨论............................................................................................................344.4.1C-g-C3N4的表征............................................................................................344.4.2NiPd的表征..................................................................................................354.4.3传感器的表征...............................................................................................364.4.4实验条件的优化...........................................................................................384.4.5传感器的性能分析.......................................................................................394.4.6传感器的稳定性、重现性和选择性............................................................394.4.7实际样品测试...............................................................................................404.5本章小结................................................................................................................41第五章基于Pt/PdCu-3DGF构建的SCCA电化学免疫传感器......................................435.1前言........................................................................................................................435.2试剂与仪器............................................................................................................445.3实验部分................................................................................................................445.3.1玻碳电极的预处理.......................................................................................445.3.2氧化石墨烯的制备.......................................................................................445.3.3CD-GN的制备..............................................................................................445.3.4Pt/PdCu-3DGF的制备...................................................................................455.3.5二抗标记物的制备.......................................................................................455.3.6免疫传感器的制备.......................................................................................455.3.7电化学测量...................................................................................................455.4结果和讨论............................................................................................................465.4.1CD-GN的表征..............................................................................................465.4.2Pt/PdCu-3DGF的表征...................................................................................475.4.3免疫传感器的表征.......................................................................................485.4.4实验条件的优化...........................................................................................495.4.5免疫传感器的性能分析...............................................................................505.4.6免疫传感器的选择性和重现性....................................................................505.4.7实际样品检测...............................................................................................515.5本章小结................................................................................................................51第六章结论与展望..........................................................................................................53III 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究参考文献.............................................................................................................................55致谢.................................................................................................................................69附录.................................................................................................................................71IV 济南大学硕士学位论文摘要疾病标志物在疾病的预防、诊断、治疗和预后中发挥着至关重要的作用，因此，设计高灵敏与高选择性的疾病标志物检测手段对相关疾病的诊断具有重要意义。其中电化学发光（ECL）传感器和电化学传感器在医学分析、食品安全、环境监测等研究中得到了广泛的应用。将具有良好的生物相容性和化学稳定性、优异的导电性等性质的富碳纳米材料应用到传感器的构建中，可以缩短响应时间，降低背景信号，提高检测的灵敏度。本文利用多种富碳纳米材料，构建了一系列疾病标志物传感器，为疾病标志物的临床检测和相关研究提供了方法基础。论文的研究内容及主要结果如下：（1）采用简单方法制备的仿生聚多巴胺纳米微球（PDANS）作为ECL猝灭剂用于构建夹心型免疫传感器。聚多巴胺纳米微球含有丰富的氨基，可连接检测抗体。氨基化多壁碳纳米管掺杂Nafion膜（MWCNTs-NH2@N）作为载体用于固定三联吡啶钌2+2+（Ru(bpy)3）和捕获抗体。聚多巴胺纳米微球具有醌类结构能够与Ru(bpy)3发生能量2+2+转移作用，阻碍Ru(bpy)3从激发态返回基态产生光发射，从而猝灭Ru(bpy)3的电化学-1-1发光。ECL猝灭效率与PSA浓度的对数在0.1pg·mL~20ng·mL范围呈线性关系，检-1测限为35fg·mL。此外，构建的ECL免疫传感器具有良好的稳定性、重复性和选择性。（2）基于碳点（C-dots）构建了一种新颖的电化学发光适体传感器用于检测凝血酶。银修饰的聚多巴胺纳米微球（PDANS@Ag）作为载体固载C-dots和探针DNA（pDNA）。PDANS具有大的比表面积和独特的粘附性，能负载大量的C-dots。银纳米粒子增强了C-dots的ECL发光效率，增强了ECL信号响应。铂纳米粒子功能化的石墨烯（Gr-Pt）作为传感平台固定捕获DNA（cDNA）。Gr-Pt的引入加速了电子的转移。通过cDNA和pDNA之间的杂交链反应，将探针pDNA-PDANS@Ag/C-dots引入到电极表面，从而产生强的电化学发光信号。当目标分析物凝血酶存在时，由于凝血酶特异性识别cDNA，使得pDNA-PDANS@Ag/GQDs脱离电极，引起ECL信号的降低，从而实现凝血酶的检测。在-1最佳实验条件下凝血酶浓度在0.00000~5nmol·L范围内呈现良好的线性关系，检测限-1为0.35fmol·L。该方法构建的电化学发光适体传感器简单并且具有良好的重现性和稳定性。（3）采用羧基功能化的氮化碳（C-g-C3N4）作为ECL发光体，中空的NiPd纳米粒子负载G-quadruplex/heminDNAzyme（NiPd-DNAzyme）作为双重猝灭探针构建一种猝灭型ECL免疫传感器用于胰岛素的检测。C-g-C3N4可以作为ECL发光体，在共反应剂H2O2V 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究的存在下展现出良好的ECL性能。中空的NiPd纳米粒子具有过氧化物酶的活性，此外它还可以连接G-quadruplex/hemin和Ab2。具有双重过氧化物酶性能的NiPd-DNAzyme复合物能够快速地催化还原H2O2，从而消耗了共反应剂H2O2，导致了ECL信号降低。胰岛素作为目标分析物，ECL信号强度的变化与其浓度的对数呈现良好的线性关系，检测限为-133fg·mL。（4）采用β-环糊精功能化的还原石墨烯（CD-GN）作为传感平台，三维石墨烯负载三元合金Pt/PdCu中空纳米立方体（Pt/PdCu-3DGF）作为二抗标记物构建一种新颖的夹心型免疫传感器用于鳞状癌细胞抗原（SCCA）的高灵敏检测。CD-GN具有大的比表面积，在水溶液中呈现出良好的分散性和稳定性。通过β-环糊精与抗体的主客体识别作用，实现捕获抗体的固定。利用溶剂热方法合成的Pt/PdCu-3DGF复合材料比表面积大，可以有效地捕获更多的检测抗体，而且还保留了良好的催化性能。在最佳实验条件下，-1-1-1构建的免疫传感器在0.0001~1ng·mL和1ng·mL~30ng·mL范围内有灵敏的响应，-1检测限为25fg·mL。关键词：富碳纳米材料；疾病标记物；电化学发光；石墨烯；碳点；氮化碳VI 济南大学硕士学位论文AbstractDiseasemarkersplayacrucialroleintheprevention,diagnosis,treatmentandprognosisofdiseases.Therefore,thedevelopmentofhighlysensitiveandhighlyselectivedetectionmethodsisofgreatsignificanceforthediagnosisofrelateddiseases.Electrochemiluminescence(ECL)sensorandelectrochemicalsensorarewellappliedinmedicalanalysis,foodsecurityandenvironmentmonitoring.Employmentthecarbon-richnanomaterials,withgoodbiocompatibility,chemicalstability,goodelectricalconductivityfortheconstructionofsensorscanshortentheresponsetime,reducebackgroundsignalandimprovethedetectionsensitivity.Inthispaper,weusedvariouscarbon-richnanomaterialstodevelopaseriesofdiseasemarkersensors.Themaincontentsandresultsareasfollowing:(1)Biomimeticpolydopaminenanosphere(PDANS)waseasilypreparedandwasfirstlyexploitedasanECLnanoquencherforthedevelopmentofasandwichtypeimmunosensor.ThePDANSswithabundantactivefunctionalgroupscanfacilelylabelthedetectionantibody.Theamino-modifiedmultiwallcarbonnanotubes/Nafion(MWCNTs-NH2@N)composite-filmwasadoptedasamatrixtoincorporatetheluminophor2+tris-(2,2’-bipyridine)ruthenium(Ru(bpy)3)andimmobilizethecaptureantibody.The2+quenchingmechanismisbelievedthattheexcitedstatesofRu(bpy)3canbeannihilatedbyquinoneunitsinPDANSsviaenergytransfer.TheECLquenchingefficiencywas-1logarithmicallyrelatedtotheconcentrationofthePSAintherangefrom0.1pg·mLto-1-120·ng·mLwithadetectionlimitof35fg·mL.Furthermore,theproposedECLimmunosensorpresentedgoodstability,repeatabilityandselectivity.(2)AnovelECLsignal-offaptasensorwasproposedforthedeterminationofthrombin(TB)basedoncarbondots(C-dots).Ag-decoratedpolydopaminenanospheres(PDANS@Ag)wasfirstlyexploitedasamatrixtocarryC-dotsandlabelprobingDNA(pDNA).ThePDANSwiththehighspecificsurfaceareaanduniqueadhesionabilitycouldloadalargenumberofC-dots.Agnanoparticles(AgNPs)couldenhancetheECLemissionefficiencyofC-dotsandpromotethesignalresponse.Theplatinumfunctionalizedgraphene(Gr-Pt)nanocompositewasusedtomodifytheelectrode,whichimprovedtheelectronictransmissionVII 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究rate.TheECLnanoprobePDANS@Ag/C-dotswasintroducedintotheelectrodeinterfaceviathehybridizationchainreactionbetweencDNAandpDNA,whichgenerateastrongECLsignal.ThetargetanalytesTBcanspecificallyrecognizethecDNA,leadingtothereleaseofthesignalprobefromtheelectrodesurfaceandthedecreaseofECLintensity.Alinear-6-1-1responserangefrom1.0×10to5.0nmol·Lwithadetectionlimitof0.35fmol·Lwasobtainedundertheoptimizedexperimentalconditions.Furthermore,theproposedECLaptasensorpresentedgoodstability,repeatabilityandselectivity.(3)AnefficientquenchingECLimmunosensorforhighlysensitivedetectionofinsulinwasconstructedusingcarboxyl-functionalizedg-C3N4(C-g-C3N4)asanECLemitterandhollowNiPdnanoparticlesloadingwithG-quadruplex/heminDNAzyme(NiPd-DNAzyme)asthedual-quenchingprobe.Inthisprotocol,theas-preparedC-g-C3N4servedasbothaluminophoreandthematrixtoimmobilizecaptureantibody(Ab1)byamidelinkage,whichexhibitingstrongECLactivityinthepresenceofthecoreactantH2O2.TheNiPdshowedgoodperoxidase-activityandloadingcapacityforbothG-quadruplex/heminDNAzymeanddetectionantibody(Ab2).Thedual-peroxidasenatureofNiPd-DNAzymecompositehighlypromotedthereductionofH2O2,resultingintheconsumptionofthecoreactantofC-g-C3N4andobviousECLquenching.Usinginsulinasamodelanalyte,thechangeofECLintensity-1waslogarithmicallyrelatedtotheconcentrationoftheinsulinintherangefrom0.1pgmLto-1-120.0ngmLwithadetectionlimitof33fgmL.(4)Anovelandultrasensitivesandwich-typeelectrochemicalimmunosensorwasdesignedforthequantitativedetectionofSCCAbasedontheβ-cyclodextrinfunctionalizedgraphenenanosheet(CD-GN)andtheternaryhollowPt/PdCunanocubeanchoredonthree-dimensionalgrapheneframework(Pt/PdCu-3DGF).CD-GNexhibitedhighspecificsurfaceareaandgooddispersibilityandstabilityinwater,whichwerebeneficialtofixcapturedantibodies(Ab1)throughthesupramolecularhost-guestinteractionbetweenCDandAb1.ThespecificsurfaceareaofPt/PdCu-3DGFsynthesizedbysolvothermalmethodislarge,andmoredetectionantibodiescanbeeffectivelycaptured.Furthermore,theternarymetalnanoparticlesexhibitedhighelectrocatalyticactivitytowardthereductionofhydrogenperoxide.Underoptimalconditions,thefabricatedimmunosensorshowedasensitiveresponseVIII 济南大学硕士学位论文-1-1toSCCAwithtwolinearranges.Thelinearrangesare0.0001ng·mLto1ng·mLand1-1-1-1ng·mLto30ng·mLwithadetectionlimitof25fg·mL.KeyWords:diseasemarker;carbon-richnanomaterials;electrochemiluminescencegraphene;g-C3N4IX 济南大学硕士学位论文第一章绪论1.1疾病标志物概述1.1.1疾病标志物疾病标志物是指与病理生理过程相联系的可监测的物质，任何一种疾病在可见症状发生之前，可能体内某些正常的代谢过程己经发生紊乱，在尿液、血浆、组织提取液等体液中有可能出现一些浓度异常的相关的疾病标志物，如果能够测定这些疾病标志物，并建立一种相关性，就有可能在最早阶段对潜在的疾病进行诊断。疾病标志物的含量可以给病人提供前瞻性的疾病相关信息，使治疗更加有针对性，避免不必要的花费和降低治疗所带来的毒副作用。寻找疾病标志物一直是医学界探索研究的方向。新近研究发现：间皮素是一种细胞表面蛋白质，通常存在于在胸膜和腹膜中，在超过三分之一小儿科急性骨髓性白血病患者体内间皮素含量异常增多，而有正常造血功能的人体内间皮素含量[1]正常，因此间皮素成为一个理想的诊断急性骨髓性白血病的标志物。1.1.2疾病标志物的分类从疾病标志物的定义可以看出，疾病标志物涵盖的范围广泛，人们从不同的角度对它进行了分类。从自然属性的角度，则可将其分为小分子物质、核酸（DNA，RNA）类、蛋白类、糖类等不同类型。（1）小分子物质小分子化合物种类繁多，比如氨基酸、维生素、核苷酸、无机盐等，它们既是维系机体生命活动和生化代谢的物质基础，同时某些小分子物质在机体内发生的特征性变化，如浓度改变、异常出现或消失等，对机体造成损害。因此，可作为检测疾病的指标。LenkaBorska等人研究发现斑块状银屑病病人在经过格克曼疗法治疗之后，血液中8-羟基鸟嘌[2]呤核苷的含量明显增多，其可作为检测治疗效果的生物标志物。（2）核酸核酸类物质包括DNA和RNA，DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，某些重要基因的突变或修饰通过使相应基因的功能发生缺失或获得，从而引起信号通路1 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究持续激活或灭活，导致机体功能紊乱甚至发生严重疾病。RNA起着携带和转移活化氨基酸的作用，最新研究表明，血清中循环微小RNA是一种稳定性、重复性较好的非侵入性标志物，可用于诊断神经退行性疾病等。例如，阿尔茨海默病患者体内microRNA（miR-27a、miR-29a、miR-29b、miR-125b）水平异常，因此microRNA可作为判断阿尔[3]茨海默病的生物标志物。（3）蛋白类蛋白质作为生命活动的直接执行者，参与生命的几乎所有过程，包括免疫反应、细胞骨架形成、基因表达调控、新陈代谢和物质运输等。因此，蛋白质可作为客观评价正常生理功能或病理状态的指示物。PSA在临床上用于前列腺癌诊断和预后判断，通过检测血清中PSA的浓度可以判断有无患前列腺癌的风险，Li等人用KNbO3-AuNPs@Bi2S3修饰的电极，采用ECL方法检测血清样品中的PSA含量，为PSA的临床诊断提供了可靠[4]的方法。凝血酶在人的生命过程中起着重要的作用，与心血管疾病、炎症反应以及抗凝血治疗过程中扮演者重要的角色，因此在临床研究和诊断中对凝血酶准确定量检测至关重要。Fan等运用光致电传感手段研究了血清样品中凝血酶的含量，检测限达到-13-1[5]1.210mol·L。（4）糖类和脂类机体中糖类和脂类物质在生命活动中发挥着重要作用，包括细胞识别、物质代谢和[6]机体免疫等。Biskup等人通过对比33例健康妇女和63例原发性卵巢癌患者血清中11种N-糖链含量，证明它们可作为诊断原发性卵巢癌的标志物。此外，根据疾病标志物检测疾病的类别，可以将疾病标志物分为肿瘤标志物、内分泌疾病标志物、血液和心血管疾病标志物、呼吸道传染疾病标志物等。1.1.3疾病标志物的常见检测手段疾病标志物的覆盖范围广，其研究技术也是多种多样。几乎所有可用于研究蛋白质、核酸、糖类、脂类等生物分子的技术都能用于疾病标志物的研究检测上。对于抗体、多肽类的疾病标志物可以使用电化学分析方法、荧光分析法、高效液相色谱分析、双向电泳、蛋白芯片以及液质联用等；对于核酸类的疾病标志物，可用测序或基因芯片等技术检测；对于糖类和脂类疾病标志物也可采取上述的一些方法检测。2 济南大学硕士学位论文1.2电化学发光传感器概述1.2.1电化学发光基本原理电化学发光（ECL）是融合电化学与化学发光的一种检测技术，当在电极上施加一定的电压使物质发生电化学反应，在这过程中生成中间体，当激发态的物质跃回基态时，产生发光信号。ECL机理主要分为两种类型，分别是湮灭型和共反应剂型。（1）湮灭型当对电极施加双阶跃正负脉冲电位时，物质A在电极表面分别生成氧化态自由基离+-子A和还原态自由基离子A，这两种物质再进一步发生反应，生成基态物质A和激发*态物质A，激发态物质返回到基态以光的形式释放能量，这种方法就叫做湮灭反应。基于这种反应机理的反应物大多数是芳香族化合物，以红荧烯（rubrene，RUB）为例，其反应机理如下：+RUB-e-→RUBRUB+e-→RUB∙-+∙-*RUB+RUB→RUB+RUB*RUB→RUB+hv（2）共反应剂型共反应剂型是ECL体系中常用的反应机理，它只需在电极上施加单一方向的电位，通常在反应体系中加入一种共反应剂，它在氧化或还原时可以产生具有强还原性和强氧化性的中间体物质，中间体物质能和ECL体系中的发光体反应生成激发态。根据化学反应的不同，可将共反应剂分为氧化-还原型共反应剂和还原-氧化型共反应剂。TPrA在氧化后可产生强还原性中间体，反应过程如下：2+-3+Ru(bpy)3-e→Ru(bpy)3•+•TPrA-e-→[TPrA]→TPrA+H+•3+2+*Ru(bpy)+TPrA→Ru(bpy)+产物332+*2+Ru(bpy)→Ru(bpy)+hv332-过硫酸根离子（S2O8）是常用的还原-氧化型共反应剂，其反应过程如下：•SO2-+e-→SO2-+SO-2844•g-CN+e-→g-CN-34343 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究••--*2-g-C3N4+SO4→g-C3N4+SO4*g-C3N4→g-C3N4+hv1.2.2电化学发光传感器的发展趋势由于ECL的优良性能，ECL被认为是一种良好的分析技术，广泛应用于分析检测。在过去几十年中，科研工作者建立了大量的ECL生物测定方法，用于检测各种目标分析物。构建的ECL检测方法一般可以分为五大类：一、通过能量转移或电子转移的机理抑制或增强目标分析物对ECL反应的影响；二、通过氧化还原反应或表面结合/分离来增补或分解ECL发光体；三、通过生成或消耗的共反应剂来改变ECL信号的发射，这一策略大多是通过酶促反应实现；四、基于生物识别或目标物诱导沉积引起的位阻变化构建一种信号减弱型ECL传感体系；五、基于共振能量转移原理发展一种有效的检测策略，其中一种物质作为供体，另一种作为受体。基于以上构建方法，选用具有优良性能的基底纳米材料尤为重要。目前为止，不同种类的纳米材料已经应用于ECL信号放大策略，如石墨烯、碳纳米管、金属纳米材料、半导体纳米材料等。许多研究者目前正在积极探索寻找一些新颖的发光材料，Ma等报道了一种MOF材料（Pb-β-CD）在[7]K2S2O8作共反应剂的条件下具有良好的ECL性能，并将其应用于胰岛素的检测。ECL检测通常是基于单一信号强度的变化，由于仪器或环境因素，假阳性或假阴性可能会干扰某些痕量分析物的检测。最近比率分析引起了广泛关注，所谓比率就是量化取决于两个信号的比值而不是绝对值，这种方法通过自身校正有效抑制了干扰因素。例如，Zhao等利用石墨烯量子点与鲁米诺建立了双电位比率型ECL传感器检测蛋白激酶的[8]活性。因此，不断发展新方法是ECL向前发展的必然途径。1.3富碳纳米材料的概述1.3.1几种常见的富碳纳米材料富碳纳米材料包括碳基纳米材料，曾主要作为金属催化剂的载体，随着科学家们对[9,10]高性能非金属催化剂的追求，富碳纳米材料自身的一些优良性能逐渐被开发出来，尤其是富碳纳米材料与金属纳米颗粒、过渡金属氧化物、硫族化合物、新型二维材料等形成的复合纳米材料在电子器件、新能源开发、环境保护、生物医学等诸多领域呈现出4 济南大学硕士学位论文巨大的发展潜力。随着富碳纳米材料研究的不断深入，家族成员不断扩大，制备方法更加简单，结构和形貌趋于精确控制，物理化学性质不断取得突破，呈现出其他材料无法比拟的优势，如结构的多样性和可裁剪性、来源的广泛性、良好的加工性、成本低廉、可大量制备等。富碳纳米材料包括碳纳米管（CNT）、石墨烯（GS）、全碳气凝胶等，还包括氮、磷、硫、硼等杂原子杂化的碳纳米材料，以及非金属半导体石墨相氮化碳（g-C3N4）和含氧官能团丰富的碳点（C-dot）、石墨烯量子点（GQD）、氮化碳量子点等。（1）碳纳米管碳纳米管（CNT）是由单层或多层石墨片围绕同一中心轴按一定的螺旋角卷曲而成2的纳米级管结构。一个碳原子通过sp杂化与周围3个碳原子完全键合后构成六边形网络[11]平面，平面所围成的圆柱面构成每层纳米管的管壁。CNT作为重要代表性的一维纳米材料，具有多方面优异的性能，使其在很多领域有较好的应用前景，比如在储能（燃料[12][13][14,15]电池和锂电池）、复合材料、催化等领域。（2）石墨烯石墨烯（GS）作为凝聚态物理和材料科学领域的明星材料，广泛引起物理、化学、2材料领域研究者的巨大关注。GS是由单层sp杂化碳原子紧密堆积成的六方晶格结构[16,17][18][19][20]，高的室温电荷转移率和机械强度、优异的导电性以及大的比表面积。目前，[21]GS主要是通过化学方法制备的，一般是利用改进的Hummers法，将疏水性石墨原料氧化成带有大量含氧官能团的亲水性氧化GS，然后通过机械剥离形成能够分散在水或有机溶剂中的单层氧化GS。通常，氧化GS在还原过程中由于范德华力作用形成不可逆转的堆叠，从而丢失大量的含氧官能团，科学家通过对氧化GS的改性来解决这一问题，例[22]如汪尔康院士课题组将β-环糊精引入GS，提高了GS在极性溶剂中的水溶性和稳定性。（3）g-C3N4石墨相氮化碳（g-C3N4），是一类由C、N元素组成的聚合材料。g-C3N4在室温下非常稳定，作为一种有机半导体材料，g-C3N4能够吸收可见光，其禁带宽度约为2.7eV，[23,24]最大吸收边带在460nm左右。由于g-C3N4特殊的电子性能，光学性能，生物相容性[25-27]等良好的性能，它已经被广泛地应用于光催化，生物传感器，环境监测等领域，具有非常可观的应用前景，例如，Wang等报道了羧基功能化的g-C3N4与聚乙烯亚胺通过酰[28]胺键结合，提高了g-C3N4的ECL效率和稳定性，用于有机磷酸酯类农药的检测。（4）碳点[29]2004年Xu等在美国化学会志（JACS）上首次报道了碳点（C-dot），他们在分离5 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究和纯化单壁碳纳米管的时候意外发现了C-dot的存在。C-dot是一种新型的以碳为骨架结[30]构的纳米材料，是具有一定分散性的类球形纳米颗粒，尺寸小于10nm。与金属量子点不同的是，它具有良好的生物相容性、高的光稳定性、低毒性以及易得、廉价等优点[31,32]。C-dot的制备过程容易操作，需要的成本比较低，目前合成C-dot的方法有很多种，[33][34][35][36]例如水热法、裁剪法、微波辅助法、电化学法等。众所周知，半导体纳米晶[37,38][39]体具有电化学发光现象，而C-dot也具有这一特性，这一点尤为引人瞩目。Li等人2-通过电化学氧化碳粉的方法合成C-dot，由于C-dot和S2O8的相互作用从而获得了稳定、高强度的电化学发光。（5）石墨烯量子点石墨烯量子点（GQD）是一种零维的纳米材料，它所有的特性来源于GS与C-dot，[40,41]或者可以认为是特殊的小的GS碎片。GQD由于明显的边界效应和量子限制效应，其表现出优异的水溶性、生物低毒性、稳定的光致发光特性、化学惰性，吸引了研究者[40,42-44]的研究兴趣，使得GQD在传感器、光电设备、成像和生物标记等领域备受关注。尽管GQD和C-dot都具有优异的表现，甚至把GQD当作是C-dot的一种，但是需要指出的是GQD和C-dot还是存在一些差异的。首先，C-dot往往是无定形的，而GQD由于多是从[45-47]以石墨烯为基础的碳材料中制备获得，因此在GQD中可以清晰地看到晶格结构。其次，由于尺寸效应，荧光C-dot是一种离散的、准球形的、大小在10nm以下的碳纳米颗[48]粒，而GQD是横向大小可在100nm以下，纵向在几个纳米以下的类石墨烯结构。再[49]者，C-dot多发出绿色荧光，而GQD多以明亮的蓝色荧光为主。1.3.2富碳纳米材料在疾病标志物检测中的应用富碳纳米材料由于具有良好的生物相容性和化学稳定性，已被广泛地应用于疾病标志物的检测。石墨烯与碳纳米管一直是比较受欢迎的富碳纳米材料，他们可以用来修饰电极提高电子转移能力，例如Miodek等人用聚酰胺修饰的多壁碳纳米管复合材料修饰[50]电极用于测定人类细胞朊蛋白；Gao等人用β-环糊精功能化的石墨烯修饰电极，展示[51]了卓越的导电性，促进了电子转移，将其应用于癌胚抗原的检测。g-C3N4、GQD以及C-dot具有半导体特性，已被用来构建电化学发光传感器以及光致电传感器检测疾病标志物，例如，Zhang等人报道了GQD与苝四羧酸通过π-π作用堆叠又与Au@Fe3O4[52]形成复合物，将其修饰在电极上，用于分析检测MicroRNA。随着富碳纳米材料研究的不断深入，其优良性能不断被发掘，使疾病标志物的检测进入一个新的研究阶段。6 济南大学硕士学位论文1.4本论文研究内容及创新点本论文利用MWCNTs-NH2@N、C-dots、C-g-C3N4、Pt/PdCu-3DGF等富碳纳米材料的优良性能，设计了四种检测疾病标志物的传感器。2+（1）利用MWCNTs-NH2@N作为载体固定Ru(bpy)3和捕获抗体。PDANS含有的2+2+醌类结构能够与Ru(bpy)3发生能量转移作用，阻碍Ru(bpy)3从激发态返回基态产生光2+发射，从而猝灭Ru(bpy)3的电化学发光。（2）PDANS@Ag作为载体固载C-dots和pDNA。Gr-Pt作为传感平台固定捕获cDNA，通过cDNA和pDNA之间的杂交链反应，将探针pDNA-PDANS@Ag/C-dots引入到电极表面，产生强的ECL信号。当目标分析物凝血酶存在时，由于凝血酶特异性识别cDNA，使得pDNA-PDANS@Ag/GQDs脱离电极，引起信号的变化，实现凝血酶的检测。（3）C-g-C3N4可以作为ECL发光体，在共反应剂H2O2的存在下展现出良好的ECL性能。中空的NiPd纳米粒子连接G-quadruplex/hemin和Ab2，具有双重过氧化物酶性能，能够快速地催化还原H2O2，从而消耗了共反应剂H2O2，导致了ECL信号降低，实现胰岛素的检测。（4）CD-GN通过β-环糊精与抗体的主客体识别作用，实现捕获抗体的固定。利用溶剂热方法合成的Pt/PdCu-3DGF复合材料比表面积大，可以有效地捕获更多的检测抗体，而且还保留了良好的催化性能。7 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究8 济南大学硕士学位论文2+第二章基于PDANS猝灭MWCNTs-NH2@N/Ru(bpy)3构建的PSA电化学发光传感器2.1前言[53,54]前列腺特异性抗原（PSA）是一种单链糖蛋白，参与精液液化过程。在良性和[55]恶性前列腺疾病的诊断中，PSA是一个重要的指标。对血清中前列腺特异性抗原的早期快速、灵敏检测具有非常重要的临床价值和意义，能够在最大程度降低前列腺癌的死亡率，延长前列腺癌患者的生存期限，为患者争取更多的治疗机会。因此，对PSA高灵敏、特异性的检测已成为一项重要的研究课题。电化学发光（ECL）是一种强大的分析技术，因为它具有动态响应范围宽，易于控[56-60]2+制，设备简单，背景信号低且灵敏度高等优点。三联吡啶钌（Ru(bpy)3）与共反[61-66]应剂三丙胺（TPrA）形成的电化学发光体系已广泛应用于样本检测。氨基化多壁碳2+纳米管掺杂到Nafion膜中作为矩阵来固定Ru(bpy)3（MWCNTs-NH2@N），此复合膜2+具有更开放的结构和更大的比表面积，使得Ru(bpy)3在膜中更快扩散，从而更好地将2+Ru(bpy)3固定在电极表面。聚多巴胺纳米微球（PDANS）是一种具有粘附性的仿生聚合物，它由多巴胺氧化聚[67][68]合而成，合成方法简单且成本低廉。PDANS在生物体内可以通过生物代谢降解。[69]由于它具有高效的荧光猝灭能力和生物可降解性，已被广泛应用于三磷酸腺苷、适配[70][71]体、miRNA等生物分子的检测。到目前为止，科学家们确认PDANS含有羟基吲哚、[72,73]2+醌类和多巴胺单体结构。我们发现PDANS可以猝灭Ru(bpy)3的电化学发光，经2+过实验探究，聚多巴胺纳米微球含有的醌类结构能够与发光试剂Ru(bpy)3发生能量转2+2+移作用，阻碍Ru(bpy)3从激发态返回基态产生光发射，从而猝灭Ru(bpy)3的电化学发光。由此，我们构建了一种猝灭夹心型的免疫传感器用于检测PSA。2.2试剂与仪器PSA，PSA抗体（Ab1和Ab2）购买于北京鼎国昌盛生物科技有限公司；盐酸多巴胺（纯度：99%）购买于ACROS（美国）；牛血清白蛋白（BSA，96%-99%）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-乙基-3（-3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）均购于Sigma-Aldrich公司；PBS缓冲溶液（PBS,1/15mol/LKH2PO4，1/15mol/LNa2HPO4）。所有试剂均为9 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究分析纯，实验用水为超纯水。扫描电子显微镜（SEM，日本JSM-6700F）用来对产物的形貌和微观结构进行表征；红外分光光度计（FT-IR，FT-IR-410）用于红外表征；紫外可见分光仪（UV，lambda35），用于紫外可见光谱的检测；用MPI-F型流动注射化学发光仪进行化学发光测量（西安瑞迈电子科技有限公司）；用CHI760D电化学工作站进行电化学测量（上海辰华）；三电极体系：4mm玻碳电极（GCE）作为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极。2.3实验部分2.3.1MWCNTs-NH2@N的制备[74]根据文献报告首先合成羧基化MWCNTs，而MWCNTs-NH2是由羧基和氨基的缩[75]合反应合成。0.4g二环己基碳二亚胺和20mg的羧基化MWCNTs加入到2.5mL乙二胺中。在120˚C下搅拌4天，得到的产物通过离心分离，并用超纯水洗涤三次，将产物置于35˚C真空干燥箱中干燥。将0.2mgMWCNTs-NH2样品分散在0.4mL、0.5wt%Nafion（N）溶液中，超声处理20min，最后得到MWCNTs-NH2@N复合物。2.3.2PDANS的制备[76]根据文献，将100mg盐酸多巴胺（DA）加入到100mLpH=8.8的Tris-HCl缓冲溶液与50mL异丙醇的混合液中，在室温下避光搅拌24h，将产品离心分离（9000rpm、20min），超纯水离心洗涤五次，之后将产物分散到5mL超纯水中。2.3.3PDANS-Ab2的制备-1-1向990μL、100μg·mL的PSA抗体溶液中加入新鲜配制的5μL、8mg·mLEDC-1溶液和5μL、22mg·mLNHS溶液，室温下震荡15min，之后加入1mL制备好的PDANS，4˚C下震荡12h，超纯水离心洗涤三次，得到PDANS-Ab2。2.3.4免疫传感器的制备将直径4mm的玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm氧化铝抛光粉做抛光处理，然后分别用超纯水和无水乙醇超声洗涤，再用超纯水冲洗电极表面，除去电极表面吸附10 济南大学硕士学位论文-1的物质；在电极表面滴涂6μL、0.5mg·mL的MWCNTs-NH2@N溶液，在室温下晾干-12+后将电极浸入1mmol·L的Ru(bpy)3溶液中30min，然后用超纯水冲洗电极表面；滴-1加6µL、10µg·mL的PSA抗体溶液，4˚C冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；滴加3µL、1wt%的BSA溶液，4˚C冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；滴加6µL、0.0001-1~20ng·mL的一系列不同浓度的PSA溶液，4˚C冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；将电极浸入PDANS-Ab2溶液3h后取出并置于4˚C冰箱中晾干，之后用超纯水冲洗电极表面，制得免疫传感器。制备过程如图2.1所示。图2.1免疫传感器制备过程示意图2.3.5ECL测试使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所修饰的电极为工作电极，将光电倍增管的高压设置为600V，循环伏安扫-1-1描电位范围为0~1.2V，扫描速率为0.1V·s；在10mL、pH=7.4的含浓度为15mmol·LTPrA的PBS缓冲溶液中，通过ECL系统，检测对不同浓度的PSA产生的ECL信号强度。2.4结果和讨论2.4.1MWCNTs-NH2@N的表征图2.2A为MWCNTs-NH2/@N的SEM图，从图中可以观察到碳纳米管是细长的管状，多管堆叠缠绕形成网状结构。采用循环伏安法（CV）来探究MWCNTs-NH2/@N固2+-12+定Ru(bpy)3之后的电化学性能。在含有0.1mmol·LRu(bpy)3的PBS缓冲溶液（pH=7.5）中测试不同修饰电极的CV曲线。如图2.2B所示，GCE（曲线a）几乎没有峰，然而GCE/Nafion（曲线b）在1.09V的位置出现了一个较大的峰，这表明Nafion是一种11 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究2+有效的介质，通过离子交换作用固定Ru(bpy)3。GCE/MWCNTs-NH2@N（曲线c）的2+CV曲线显示更大的峰电流，这可能是由于Ru(bpy)3在MWCNTs-NH2/@N复合物膜中能够快速扩散，且MWCNTs-NH2具有良好的导电性。图2.2C展示了不同修饰电极在2+PBS缓冲溶液（pH=7.5）中测试的CV曲线：GCE（曲线a），没有浸入Ru(bpy)3溶-12+液的GCE/MWCNTs-NH2@N（曲线b），（c）浸入0.1mmol·LRu(bpy)3的GCE/MWCNTs-NH2@N（曲线c）。从图中可以看出GCE没有电化学响应，而没有浸2+入Ru(bpy)3溶液的GCE/MWCNTs-NH2@N有明显的峰电流，这是由于MWCNTs-NH2-12+增强了电极的导电性。然而浸入0.1mmol·LRu(bpy)3的GCE/MWCNTs-NH2@N在2+1.14V出现了一个大的氧化峰，这个峰代表了Ru(bpy)3的氧化还原反应。以上实验证2+明了MWCNTs-NH2@N复合物可以作为一种有效的矩阵固定Ru(bpy)3。-12+图2.2MWCNTs-NH2@N的SEM图（A）；在含有0.1mmol·LRu(bpy)3的PBS缓冲溶液（pH=7.5）检测的CV曲线（B）：（a）GCE，（b）GCE/Nafion，（c）GCE/MWCNTs-NH2@N；在PBS缓冲2+溶液（pH=7.5）中测得CV曲线（C）：（a）GCE，（b）GCE/MWCNTs-NH2@N（没有浸入Ru(bpy)3-12+溶液），（c）GCE/MWCNTs-NH2@N（浸入0.1mmol·LRu(bpy)3）2.4.2PDANS的表征大量的文献报道PDANS含有二羟基吲哚、醌类和多巴胺单体，如图2.3A所示。图2.3B为PDANS的SEM图，从图中可以看出PDANS呈单分散状态，平均直径约为195nm。从图2.3C可以看出无色透明的DA聚合之后形成了黑棕色的PDANS，溶液分散均匀。图2.3D为红外光谱图，曲线a为DA的红外光谱，曲线b为PDANS的红外光谱。-1-1[77]从图中可以看出DA自聚合之后在1540cm和400cm之间的峰消失了。曲线b在-1-1-13200-3500cm（O-H和N-H的伸缩振动）、2940cm（C-H的伸缩振动）、1585cm（杂环面内N-H变形呼吸振动）处有特征吸收峰，与文献报道的PDANS有一致的特征吸收峰，因此证明PDANS被成功合成。从图2.3E的紫外吸收图谱中可以看出PDANS[78]有一个宽的吸收带。12 济南大学硕士学位论文图2.3DA聚合成PDANS的简化示意图（A）；PDANS的SEM图（B）；DA溶液和PDANS溶液的照片（C）；红外图谱（D）：（a）DA，（b）PDANS；PDANS的紫外吸收光谱（E）2.4.3免疫传感器的表征-1采用ECL强度-电势曲线来验证电极的修饰过程，修饰电极均是在含有15mmol·L的TPrA的PBS缓冲溶液中测量。如图2.4A所示，曲线a没有ECL信号，当复合物2+MWCNTs-NH2@N/Ru(bpy)3修饰到电极上时，出现了一个很强的ECL发射，发光电位在1.12V（曲线b）。当Ab1（曲线c）、BSA（曲线d）和PSA（曲线e）依次修饰到电极2+上时，ECL信号强度依次降低，这是由于这些大分子蛋白质阻碍了TPrA与Ru(bpy)3之间的电子传递。当共轭物PDANSs-Ab2修饰到电极上时，ECL信号强度显著降低，表明2+PDANS猝灭了Ru(bpy)3的电化学发光。电化学交流阻抗（EIS）常用来研究表面修饰电极的界面特性和传感器修饰过程的-1-13-4-成功与否。0.1mol·LKCl和2.5mmol·LFe(CN)6/Fe(CN)6作为检测底液，如图2.4B[79]所示，高频区半圆部分代表电荷转移阻抗值，因此通过半圆的大小反映了阻抗的大小。2+GCE（曲线a）显示了一个极小的半圆，当电极依次修饰MWCNTs-NH2@N/Ru(bpy)3（曲线b）、Ab1（曲线c）、BSA（曲线d）、PSA（曲线e）和PDANSs-Ab2（曲线f），阻抗值依次增大。通过以上电阻的变化可以看出传感器层层修饰成功。13 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究2+图2.4ECL强度-电势曲线（A）和EIS（B）：（a）GCE,（b）GCE/MWCNTs-NH2@N/Ru(bpy)3，（c）2+2+GCE/MWCNTs-NH2@N/Ru(bpy)3/Ab1，（d）GCE/MWCNTs-NH2@N/Ru(bpy)3/Ab1/BSA，（e）2+MWCNTs-NH2@N/Ru(bpy)3/Ab1/BSA/PSA，（f）2+MWCNTs-NH2@N/Ru(bpy)3/Ab1/BSA/PSA/PDANSs-Ab2；为了验证PDANSs的猝灭能力，实验测定了不同修饰电极的ECL信号，如图2.5所示，2+MWCNTs-NH2@N/Ru(bpy)3/Ab1/BSA/PSA/Ab2修饰的电极展示了一个强的ECL信号发2+射，然而MWCNTs-NH2@N/Ru(bpy)3/Ab1/BSA/PSA/PDANSs-Ab2修饰的电极ECL信号2+强度显著降低，这表明PDANS能有效地猝灭Ru(bpy)3的电化学发光。ECL猝灭机制可以用以下公式来解释。当电极从0V扫描到1.2V时，TPrA被氧化为•+•2+TPrA，之后迅速失掉一个质子变为还原态TPrA（反应式1）。与此同时Ru(bpy)3在电3+3+•极表面氧化形成氧化态Ru(bpy)3（反应式2）。氧化态Ru(bpy)3进一步与还原态TPrA2+*2+*反应生成激发态Ru(bpy)3（反应式3）。当Ru(bpy)3从激发态回到基态时，产生光信2+*号（反应式4）。同时，PDANS通过能量转移作用阻碍Ru(bpy)3产生ECL信号（反应式5）•+•TPrA-e-→[TPrA]→TPrA+H+（1）Ru(bpy)2+-e-→Ru(bpy)3+（2）33•3+2+*Ru(bpy)+TPrA→Ru(bpy)+产物（3）332+*2+Ru(bpy)→Ru(bpy)+hv（4）332+*3+Ru(bpy)+→Ru(bpy)+（5）3314 济南大学硕士学位论文2+图2.5ECL强度-时间曲线：（a）MWCNTs-NH2@N/Ru(bpy)3/Ab1/BSA/PSA/Ab2，（b）2+MWCNTs-NH2@N/Ru(bpy)3/Ab1/BSA/PSA/PDANSs-Ab22.4.4实验条件的优化混入Nafion溶液的MWCNTs-NH2起着非常重要的作用，因此我们探究了MWCNTs-NH2的浓度对免疫传感器的影响。如图2.6A所示，ECL信号强度随着-1-1MWCNTs-NH2浓度的增加而增大（0.1~0.5mg·mL）。当浓度超过0.5mg·mL时信号强度有所下降，这大概是由于MWCNTs-NH2的浓度达到饱和状态，而过多的2+-1MWCNTs-NH2会阻碍Ru(bpy)3的扩散。因此，MWCNTs-NH2的最佳浓度为0.5mg·mL。检测溶液的pH值也是影响传感器性能的一个重要参数，如图2.6B所示，随着pH值从6增加到7.5，ECL信号强度逐渐增大，当pH高于7.5时，信号呈下降趋势，这可能是由于抗原和抗体在中性条件下才能表现出良好的活性。因此，最佳pH值为7.5。图2.6C-1显示的是检测底液中TPrA的浓度对传感器的影响，ECL信号在5~15mmol·L范围内-1是逐渐增大的，当TPrA浓度高于15mmol·L，ECL信号强度呈下降趋势。因此，TPrA-1的最佳浓度为15mmol·L。图2.6MWCNTs-NH2的浓度对免疫传感器的影响（A）；体系pH对免疫传感器的影响（B）；TPrA的浓度对免疫传感器的影响（C）15 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究2.4.5传感器的性能分析在最佳实验条件下，探讨了ECL信号强度与PSA浓度的关系。如图2.7所示，从0-1到20ng⋅mL浓度范围内，ECL信号强度随着PSA浓度的增大而减小。ECL猝灭效率与PSA浓度的对数之间存在线性关系，校正曲线方程为：ΔI/I0=0.52+0.10log[c]（R=0.990），其中ΔI=I0-I，I0为PSA浓度为0时测得的ECL信号强度。检测范围为0.0001-1-1-1ng⋅mL到20ng⋅mL，检测限为35fg⋅mL（S/N=3）。检测结果与其他方法对比具有优越性，该传感器与其他方法的比较列于表2.1中。图2.7传感器检测不同浓度PSA的ECL响应图：浓度a~l分别为0、0.0001、0.001、0.01、0.05、0.1、-10.5、1、5、10、15、20ng⋅mL；插图为传感器对不同浓度PSA的工作曲线表2.1与报道的检测PSA的传感器结果对比LinearrangeDetectionmethodDetectionlimitReferences-1(ng⋅mL)-1[80]DPV0.001-300.78pg⋅mL-1[81]LSV1-350.76ng⋅mL-1[82]Amperometric0.4-150.25ng⋅mL-1[83]ECL0.001-100.001ng⋅mL-1[84]ECL0.01-88pg⋅mL-1ECL0.0001-2035fg⋅mLThiswork2.4.6传感器的稳定性、重现性和选择性-1传感器的稳定性是精确检测PSA的重要因素。在含15mmol⋅LTPrA的PBS缓冲-1溶液中（pH7.5）中连续扫描14圈，扫描电压范围为0~1.2V，扫描速率为0.1V⋅s，16 济南大学硕士学位论文如图2.8A所示，ECL-t图没有显著变化，相对标准偏差（RSD）为0.82%，表明该传感器具有良好的稳定性。如图2.8B所示，在相同条件下制备六根相同的电极并对其进行重现性测试，测量的RSD为1.2%。结果表明，传感器具有良好的重现性。为了检验传感器的选择性。本实验选取癌胚抗原（CEA）、鳞状癌细胞抗原（SCCA）、甲胎蛋白（AFP）-1和人免疫球蛋白（HIgG）作为干扰物质进行测试。在相同的实验条件下测试了10ng⋅mL-1PSA与100ng⋅mL干扰物质的混合物，测试结果如图2.8C，测试的RSD为2.6%，表明该方法具有良好的选择性。-1-1图2.8传感器的稳定性（A）；传感器的重现性（B）；传感器的选择性（C）：10ng⋅mLPSA，10ng⋅mL-1-1-1-1-1PSA+100ng⋅mLCEA，10ng⋅mLPSA+100ng⋅mLSCCA，10ng⋅mLPSA+100ng⋅mLAFP，-1-110ng⋅mLPSA+100ng⋅mLHIgG2.4.7实际样品测试-1为了评价所制备的免疫传感器的可行性，用适当体积的0.1mol⋅L的PBS缓冲溶液（pH＝7.5）对血清样品进行稀释，然后采用标准加入法检测实际样品。如表2.2所示，将不同浓度的PSA分别加入到血清样本中，回收率在98.5-100.5%范围内，RSD在1.40-1.84%范围内，结果表明所制备的免疫传感器能够应用到实际样品的检测。表2.2血清样本中PSA的检测结果ContentTheadditionThedetectioncontentRSDRecoveryofPSAcontentintheserum(ng⋅mL-1,n=5)(%,n=5)(%)-1-1(ng⋅mL)(ng⋅mL)0.500.79,0.83,0.81,0.80,0.811.8498.50.321.001.33,1.35,1.29,1.31,1.311.7399.82.002.31,2.34,2.37,2.35,2.291.40100.517 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究2.5本章小结本文构建了一种检测PSA的猝灭型电化学发光免疫传感器，利用MWCNTs-NH2@N2+2+复合物固载电化学发光物质Ru(bpy)3和抗体，PDANS作为二抗标记物猝灭Ru(bpy)32+的电化学发光，其猝灭机理是PDANS含有的醌类结构能够与发光试剂Ru(bpy)3发生2+2+能量转移作用，阻碍Ru(bpy)3从激发态返回基态产生光发射，从而猝灭Ru(bpy)3的电-1化学发光。ECL猝灭效率与前列腺特异抗原（PSA）浓度的对数在浓度范围0.1pg·mL-1-1-20ng·mL呈线数关系，检测限为35fg·mL。18 济南大学硕士学位论文第三章基于纳米探针PDANS@Ag/C-dots构建的凝血酶电化学发光适体传感器3.1前言凝血酶（TB）是血液中的一种丝氨酸蛋白酶，能将可溶性纤维蛋白原转化为不溶性[85]纤维蛋白，促进血液凝固。它在各种生命过程起着重要的作用，与血栓性疾病、炎症[86,87]反应、心血管疾病、抗凝血治疗等许多疾病有关联。因此，血液中凝血酶的高灵敏测定在临床研究和诊断中具有重要意义。适配体通过SELEX筛选获得的一种功能性寡核苷酸，可以结合特定的目标分子，如小的有机化合物、金属离子、蛋白质、代谢物等，[88,89]具有很高的选择性。由于核酸适配体表现出许多优势，包括长期储存稳定性，易于[90,91]合成，高的特异性和亲和力，因此它已经被广泛应用到生物传感器的构建。在本体系中，我们将适配体与电化学发光（ECL）技术结合，构建了一种适体ECL传感器。[92-94]近年来，碳点（C-dots）以其独特的光学和电子性能引起了广泛的关注。与其它金属半导体量子点相比，C-dots是一种具有良好的生物相容性和稳定性的环保无毒材料。然而，C-dots难以固定在电极表面，且C-dots的发光效率较低，这限制了其在ECL分析中的应用。基于C-dots存在的问题，许多研究工作者把精力集中在固定C-dots和提高C-dots的发光效率上。一些研究人员发现，在适当的载体上负载量子点可以大大提[95][96]高基于量子点构建的ECL分析方法的灵敏度。这些载体包括二氧化硅，石墨烯，[97][98]碳纳米管，贵金属纳米颗粒等。聚多巴胺纳米微球（PDANS）是一种仿生聚合物，[76,99]它具有优良的生物相容性、生物可降解性。此外，PDANS还具有大的比表面积和独特的粘附能力，其表面含有大量功能基团-NH2。基于这些优良的性质，我们将PDANS作为载体用于负载C-dots。银纳米粒子能够增大具有半导体性质的ECL发光体和工作[100]电极之间的电子传递速率。因此，为了进一步实现信号放大，本实验用银纳米粒子修饰的PDANS（PDANS@Ag）负载C-dots（PDANS@Ag/C-dots）作为信号探针。3.2试剂与仪器TB和适配体（cDNA:5′-NH2-(CH2)6-GGTTGGTGTGGTTGG-3′；pDNA:5′-NH2-(CH2)6-CCAACCACACCAACC-3′）均购买于生工生物工程（上海）股份有限19 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究公司；牛血清白蛋白（BSA，96%-99%）、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺（EDC）均购于Sigma-Aldrich公司；H2PtCl66H2O和柠檬酸均购买于上海阿拉丁生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS,1/15mol/LKH2PO4，1/15mol/LNa2HPO4）。所有试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。透射电子显微镜（TEM，日本JEOL-1400）用来对物质的内部和表面进行表征；扫描电子显微镜（SEM，日本JSM-6700F）用来对产物的形貌和微观结构进行表征；红外分光光度计（FT-IR，FT-IR-410）用于官能团的表征；X-射线衍射仪（XRD，德国BrukerD8）用于对物质的鉴定；紫外可见分光仪（UV，lambda35），用于紫外可见光谱的检测；化学发光测量用MPI-F型流动注射化学发光仪（西安瑞迈电子科技有限公司）；电化学测量用CHI760D电化学工作站（上海辰华）；三电极体系：4mm玻碳电极（GCE）作为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极。3.3实验部分3.3.1Gr-Pt的制备[101]根据文献，称取0.0090g氧化石墨烯置于烧杯中，加入20mL超纯水，超声30-1min，形成均相溶液；加入3.18mL、8.5g·LH2PtCl66H2O，用氨水调节pH到10；在-1搅拌的条件下缓慢加入3mL、2g·LNaBH4溶液，室温下反应12h，用超纯水离心洗涤三次，将产物置于35˚C真空干燥箱中干燥。3.3.2PDANS@Ag的制备-1首先制备0.01mol·L的Tris-盐酸缓冲溶液，准确称取0.1211g三羟甲基氨基甲烷于烧杯中，用蒸馏水溶解。然后用盐酸调节pH至8.8，定容于100.0mL容量瓶；100mg盐酸多巴胺加入到100mLpH=8.8的Tris-盐酸缓冲溶液与50mL异丙醇的混合液中，在室温下避光反应24h，将产品离心分离并用超纯水洗涤五次，之后将产物分散到5mL超纯水中备用；取1mLPDANS稀释到5mL超纯水中，在搅拌的条件下依次加入600mg-1柠檬酸三钠、20mLAgNO3（0.025mol·L）溶液，通入N2除氧，避光条件下搅拌反应3.5h；反应完成后，将产物离心分离，并用超纯水洗涤三次，最后产物35˚C下真空干燥。20 济南大学硕士学位论文3.3.3巯基化C-dots的制备称取2g柠檬酸置于100mL烧杯中，将烧杯置于200˚C鼓风干燥箱中，5min后柠檬酸开始熔解，随后液体的颜色从无色变到浅黄色，30min之后变成橘黄色，表明C-dots-1的生成，之后用100mL左右的10mg·L的NaOH溶液调节至中性，制得淡黄色C-dots[48]溶液；分别将15.4mg巯基乙胺、95.8mgEDC加入到20mLC-dots溶液中，室温下振荡反应24h，将反应后的溶液用透析袋（MW：1000Da）透析两天，制得巯基化C-dots。3.3.4pDNA-PDANS@Ag/C-dots的制备-1将2mL巯基化C-dots溶液与2mL浓度为2mg·LPDANS@Ag溶液混合，室温下-1震荡12h，离心洗涤，得到PDANS@Ag/C-dots；200μL、2.5μmol·LpDNA加入到制备好的PDANS@Ag/C-dots溶液中，4˚C下震荡反应12h，用超纯水离心洗涤，于4˚C冰箱中储存备用。3.3.5电化学发光适体传感器的构建首先将玻碳电极（Φ=4mm）依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm氧化铝粉末抛光，然后分别用超纯水和无水乙醇超声洗涤，再用超纯水冲洗电极表面，除去电极表面吸附的物质。在处理好的的玻碳电极的表面首先滴涂一层6μLGr-Pt溶液，室温下自然晾干；-1再滴加6μL、1.5μmol·LcDNA，在室温下自然晾干，用超纯水洗涤，晾干；滴加3μL质量分数为1%的BSA溶液用于封闭非特异性活性位点，在室温下晾干，用超纯水洗涤，晾干；然后将电极浸入pDNA-PDANS@Ag/C-dots溶液中，在37˚C下孵化2h。用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干。最后，将电极浸入一系列不同浓度的TB溶液中，在37˚C下孵化40min，用超纯水冲洗电极，将电极置于4˚C冰箱中备用。制备过程如图3.1所示。3.3.6ECL测试实验过程采用电化学发光法对制备的电极进行检测，电解液选用pH=7.5的PBS-1缓冲溶液，以50mmol⋅L的K2S2O8溶液为共反应剂，扫描电位范围为-1.8~0V，扫速-1为0.1V⋅s，光电倍增管高压为800V。采用修饰好的电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl作为参比电极的三电极系统。21 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究图3.1pDNA-PDANS@Ag/C-dots制备示意图（A）电化学发光适体传感器构建过程示意图（B）3.4结果和讨论3.4.1纳米材料的表征对基底材料Gr-Pt分别运用了SEM、TEM、XRD以及EDS手段进行了表征。由图3.2A的SEM和3.2B的TEM图可以看出大量的Pt纳米粒子均匀地分布在石墨烯纳米片[102]层上。图3.2C的XRD图证实了Gr-Pt的组分分布。在24.5º出现的宽峰属于石墨，[103]在40.2º、46.5º和67.8º出现的衍射峰表明Pt纳米粒子是面心立方晶相。图3.2D为Gr-Pt的EDS谱图，图中表明Gr-Pt主要含有C、O和Pt元素，从图中可看出该材料成功合成。如图3.3A所示，TEM图中C-dots粒径在9~10nm范围内。图3.3B为PDANS的SEM图，从图中可看出单分散PDANS粒径大约为180nm。图3.3C显示的是PDANS@Ag的SEM图，银纳米粒子均匀的分布在PDANS表面，且保持了PDANS的形态，说明银纳米粒子成功地修饰在了PDANS上。图3.3D是该复合物的TEM图，同样表明银纳米粒子成功修饰在PDANS上。紫外-可见光谱分析证实了C-dots成功固定在PDANS@Ag上。如图3.4所示，曲线a为PDANS的吸收图谱，它是一条单调的宽带吸收光谱。从插入的照片来看，PDANS@Ag的吸收光谱（曲线b）在410nm处有一个特征峰，表明银成功修饰到了PDANS上。C-dots的紫外吸收光谱（曲线c）在345nm处有明显的吸收峰。PDANS@Ag/C-dots的吸收光谱（曲线d）出现了银和C-dots的特征峰，这表明PDANS@Ag/C-dots纳米复合材料被成功合成。22 济南大学硕士学位论文图3.2Gr-Pt的SEM图（A）、TEM图（B）、XRD图（C）和EDS图（D）图3.3C-dots的TEM图（A）；PDANS的SEM图（B）；PDANS@Ag的SEM图（C）和TEM图（D）23 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究图3.4紫外吸收光谱：（a）PDANS，（b）PDANS@Ag，（c）C-dots，（d）PDANS@Ag/C-dots3.4.2适体传感器的表征为了证明pDNA和PDANS@Ag偶联成功，本实验对不同修饰电极的ECL强度做了-1测试，结果如图3.5A所示，该测试过程是在pH=7.5的含有50mmol·LK2S2O8电解液中进行。如图所示GCE/PDANS@Ag电极出现了一个微不足道的ECL峰（曲线a），GCE/PDANS@Ag/C-dots电极在-1.75V处有很强的ECL信号（曲线b），这表明PDANS@Ag/C-dots与共反应剂K2S2O8反应生成光信号。相比之下，GCE/pDNA-PDANS@Ag/C-dots电极信号有所减小，这是由于pDNA阻碍了PDANS@Ag/C-dots与K2S2O8之间的电子转移，这表明pDNA成功连接到PDANS@Ag/C-dots上。采用循环伏安法（CV）对不同修饰步骤下的电极进行了电化学表征，如图3.5B所示。曲线a为GCE的CV图，当Gr-Pt复合物修饰到电极表面后，可观察到峰电流增加（曲线b），说明Gr-Pt复合纳米材料能加速电子转移。当cDNA组装到电极上之后，进一步阻碍了电子转移，所以峰电流有所降低（曲线c）；当BSA（曲线d）、pDNA-PDANS@Ag/C-dots（曲线e）依次修饰到电极上，峰电流逐渐降低，这是由于大分子蛋白质会阻碍电子传递，表明传感器构建成功。为了进一步表征所制备的电化学发光适体传感器，使用电化学阻抗图谱（EIS）对电极不同的修饰过程进行表征。如图3.5C所示，图中曲线a近乎一条直线，在高频区没有出现半圆部分，表明电极上不存在阻碍电子传递的物质。当Gr-Pt被修饰在电极表面之后，曲线b显示了一个小的半圆，原因是材料具有良好的电子传递能力。当依次修饰cDNA（曲线c）、BSA（曲线d）、pDNA-PDANS@Ag/C-dots（曲线e）半圆逐渐增大，阻抗值依次增加，这表明传感器构建成功。24 济南大学硕士学位论文为了探索在PDANS负载C-dots的效果和银纳米颗粒的掺杂对ECL信号的影响。在相同的实验条件下，将三种不同的信号探针修饰在电极上，制备的电极包括：（a）GCE，（b）GCE/C-dots，（c）GCE/PDANS/C-dots，（d）GCE/PDANS@Ag/C-dots。如图3.5D所示，PDANS/C-dots的ECL信号高于单纯的C-dots。ECL信号的增强可能是由于PDANS是个合适的支撑材料。然而PDANS@Ag/C-dots有更强的ECL信号，这表明银纳米颗粒可以提高C-dots的电化学发光效率。ECL机制可以用以下公式来描述。当电极从-1.8V扫描到0V时，C-dots被还原为•-2-•-2-C-dots（反应式1），当电势足够负时，S2O8被还原为SO4和SO4（反应式2），强氧化剂SO•--*4通过水溶液中电子的转移与C-dots反应产生激发态C-dots（反应式3）。当*C-dots从激发态回到基态时，产生光信号（反应式4）。·-C-dots+e-→C-dots（1）SO2-+e-→SO2-+SO·-（2）2844·-·-*2-C-dots+SO4→C-dots+SO4（3）*C-dots→C-dots+hv（4）图3.5ECL强度-电势曲线（A）:（a）GCE/PDANS@Ag，（b）GCE/PDANS@Ag/C-dots，（c）GCE/pDNA-PDANS@Ag/C-dots；CV曲线（B）和EIS（C）：（a）GCE，（b）GCE/Gr-Pt，（c）GCE/Gr-Pt/cDNA，（d）GCE/Gr-Pt/cDNA/BSA，（e）GCE/Gr-Pt/cDNA/BSA/pDNA-PDANS@Ag/C-dots；ECL强度-电势曲线（D）：（a）GCE，（b）GCE/C-dots，（c）GCE/PDANS/C-dots，（d）GCE/PDANS@Ag/C-dots25 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究3.4.3实验条件的优化为了获得最佳测试条件，我们对检测溶液的pH、K2S2O8的浓度、Gr-Pt的浓度以及TB溶液的孵化时间进行了最优条件的选择。图3.6A为不同pH值的检测底液对适体传感器的影响，从图中可以看出，当pH值从6.0增大到7.5时，ECL信号不断增大，而当pH值从7.5到8.5时，适体传感器的ECL信号不断减小。实验结果表明，最佳pH值为7.5。图3.6B展示了K2S2O8的浓度对ECL信号的影响，当K2S2O8的浓度从10-1-1mmol·L增加到50mmol·L时，因为产生了大量的激发态量子点，发光强度显著增加。-12-当K2S2O8的浓度大于50mmol·L时，发光强度逐渐降低，这是由于过量S2O8会抑制•--1激发态C-dots的生成。因此，50mmol·L为最佳K2S2O8浓度。如图3.6C所示，当Gr-Pt-1-1浓度在0.2~0.8mg⋅mL范围内，ECL信号强度逐渐增加，当Gr-Pt浓度高于0.8mg⋅mL-1时，发光强度降低，这主要是因为Gr-Pt的厚度增大会阻碍电子转移。因此，0.8mg⋅mL为Gr-Pt的最佳浓度。此外，TB的孵化时间也对适体传感器有影响。如图3.6D所示，随着孵化时间的延长，ECL强度逐渐降低，在40min的时候达到稳定状态，因此选择40min作为最佳孵化时间。图3.6底液pH值（A）、K2S2O8浓度（B）、Gr-Pt的浓度（C）以及TB孵化时间（D）对适体传感器性能的影响26 济南大学硕士学位论文3.4.4适体传感器的性能分析-1在最优检测条件下，不同浓度TB的ECL响应如图3.7A所示，从0到5nmol⋅L浓度范围内，ECL信号强度随着TB浓度的增大而减小。图3.7B展示了校正曲线方程，-1ΔIECL=966.30log[c/nmol⋅L]+6460.53（R=0.994），其中ΔIECL=I0-I，I0为修饰电极没有在TB溶液孵化所测试的信号强度，I为在TB溶液孵化后所测试的信号强度。检测-6-1-1-1范围为1.0×10nmol⋅L到5nmol⋅L，检测限为0.35fmol⋅L（S/N=3）。结果表明，本文构建的传感器性能优异，与其它报道的传感器相比，本文构建的传感器检测限较低，对比结果如表3.1所示。-6-1图3.7适体传感器检测不同浓度TB的ECL响应图（A）：浓度a~j分别为0，1×10nmol⋅L，1×-5-1-4-1-3-1-2-1-1-1-110nmol⋅L，1×10nmol⋅L，1×10nmol⋅L，1×10nmol⋅L，0.1nmol⋅L，1nmol⋅L，2nmol⋅L，-15nmol⋅L；适体传感器对不同浓度TB的工作曲线（B）表3.1与报道的检测TB的传感器结果对比LinearDetectionMaterialDetectionmethodrangelimitRef.-1-1(nmol⋅L)(nmol⋅L)-4-5[104]G-quadruplex/hemin/Voltammetric1.0×10-2.0×10HRP/AuPd20.0[105]Silver-coatedFluorescence0.3-6.50.082glass/glucoseoxidase-5-5[106]CdTeQDsFluorescence5.0×10-1.5×1010.0-4-5[107]PANI-MWCNTsAmperometric1.0×10-8.0×104.0-6-6[108]CS@Fe3O4@GO@T-AptChemiluminescence5.0×10-1.5×10@HM0.25-6-7PDANS@Ag/C-dotsElectrochemiluminescence1×10-53.5×10Thiswork27 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究3.4.5适体传感器的稳定性、重现性和选择性-1稳定性是考察传感器是否可以应用于实际检测的一个重要指标。在含有0.1mol⋅L-1KCl和50mmol⋅LK2S2O8的PBS（pH=7.5）缓冲溶液中连续扫描13圈，扫描电压范-1围为-1.8~0V，扫描速率为0.1Vs，如图3.8A所示，ECL-t图没有显著变化，这表明所制备的传感器具有良好的稳定性。为了探究本实验所构建的适体传感器的重现性，在-1同等条件下修饰6根相同电极，检测0.1nmol⋅L浓度的TB。实验结果如图3.8B所示，检测6根电极的相对标准偏差（RSD）为1.74%。结果表明本实验所构建的电化学发光适体传感器具有良好的重现性。为了探究所构建的传感器的抗干扰能力，选用前列腺特异性抗原（PSA）、人免疫球蛋白（HIgG）、葡萄糖作为干扰物质。图3.8C所示，这三种干扰物质没有引起信号的降低，表明这三种物质不能使纳米探针脱离电极。当只有0.1-1-1-1nmol⋅LTB存在或0.1nmol⋅LTB与1nmol⋅L其他干扰物质混合，信号明显降低，说明该传感器不受干扰物质影响，选择性良好。图3.8适体传感器的稳定性（A）；适体传感器的重现性（B）；适体传感器的选择性（C）：（a）空白，-1-1-1-1（b）1nmol⋅LPSA，（c）1nmol⋅LHIgG，（d）1nmol⋅L葡萄糖，（e）0.1nmol⋅LTB，（f）-1-1-1-1-10.1nmol⋅LTB+1nmol⋅LPSA，（g）0.1nmol⋅LTB+1nmol⋅LHIgG，（h）0.1nmol⋅LTB+1-1nmol⋅L葡萄糖3.4.6实际样品测试为了验证本实验构建的适体传感器的准确度和分析可靠性，采用标准加入法检测实际样品。如表3.2展示，将不同浓度的凝血酶分别加入到血清样本中，回收率在99.7-105.0%范围内，相对标准偏差在2.1-3.9%范围内，结果表明本方法准确可靠。28 济南大学硕士学位论文表3.2血清样本中TB的检测结果SerumAddedthrombinFoundthrombinRSD(%)Recovery-1-1samples(nmol⋅L)(nmol⋅L,n=3)(%)-4-4110(1.04,1.09,1.02)×103.4105.0-3-4210(9.74,10.13,10.05)×102.199.7-2-3310(10.09,10.27,9.82)×102.3100.6-1-2410(10.69,9.89,10.40)×103.9103.33.5本章小结本文基于纳米探针PDANS@Ag/C-dots构建了一种检测凝血酶的电化学发光适体传感器。采用Gr-Pt复合材料作为传感平台用于固定cDNA，通过cDNA和pDNA之间的杂交链式反应，将探针pDNA-PDANS@Ag/C-dots引入到电极表面，从而产生强的电化学发光信号。当目标分析物凝血酶存在时，由于凝血酶特异性识别cDNA，使得pDNA-PDANS@Ag/C-dots脱离电极，引起信号的变化，从而实现凝血酶的检测。该传感器对凝血酶检测范围宽，检测限低，且有良好的稳定性、重现性和选择性。29 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究30 济南大学硕士学位论文第四章基于NiPd-DNAzyme双重猝灭C-g-C3N4构建的胰岛素电化学发光传感器4.1前言[109]胰岛素是胰腺β细胞分泌的一种重要的蛋白质激素。它对糖类代谢与糖尿病及[110,111]相关疾病起着关键的作用。同时，考虑到胰岛素可以维持正常的血糖水平，胰岛[112]素的缺乏会导致各种糖尿病。因此，高选择性、高灵敏检测人血清中胰岛素在临床诊断和疾病监测中具有重要的意义。电化学发光（ECL）分析方法引起了广泛的关注，它具有稳定性好、灵敏度高、设[113,114]备简单易安装、背景信号低、可控性好等优点。虽然ECL方法已经显现出巨大的优势，但是对胰岛素特异性和高灵敏检测的需求不断增加，因此必须进一步提高检测灵敏度。近年来，一些灵敏的ECL生物传感器利用生物酶作为探针，例如辣根过氧化物[115,116]酶和葡萄糖氧化酶。G-四连体-氯高铁血红素-脱氧核酶（G-quadruplex/heminDNAzyme）具有过氧化物酶的活性，由于它易组装、稳定性好以及成本低的特性引起[117,118]了人们的广泛关注。这种DNAzyme是由单链DNA和hemin组成，对H2O2有明显的催化活性。为了实现信号放大，找到合适的纳米载体是必不可少的。中空的镍钯纳[119]米粒子（NiPd），以Ni为模板，通过置换反应制得，它是一种人工模拟酶，具有过氧化物酶活性，能够催化还原H2O2。鉴于NiPd的过氧化物酶活性以及它的负载能力，用它来连接DNAzyme实现信号的放大。[120][121]非金属半导体石墨相氮化碳（g-C3N4）已广泛应用于光化学、电催化、荧光[122][123]等领域。羧基化g-C3N4（C-g-C3N4）在水溶液中具有较好的导电性和溶解度，当H2O2作为共反应剂时产生稳定且信号强的光发射。本文利用NiPd-DNAzyme作为一种具有高效过氧化物酶活性的猝灭探针，通过酶促反应消耗共反应剂H2O2从而猝灭C-g-C3N4的ECL发射，通过对共反应剂的双重消耗实现胰岛素的高灵敏检测。4.2试剂与仪器适配体5′-NH2-C6-AAAAAAGGGTTGGGCGGGATGGGT-3′购买于生工生物工程（上海）股份有限公司；胰岛素，胰岛素抗体（Ab1和Ab2）购买于北京鼎国昌盛生物科技有限公司；三聚氰胺、3,3',5,5'-四甲基联苯胺、2,2'-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）31 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究二铵盐、邻苯二胺、NiCl2、柠檬酸钠均购买于上海阿拉丁生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA，96%-99%）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）均购于Sigma-Aldrich公司；磷酸盐缓冲液（PBS,1/15mol/LKH2PO4，1/15mol/LNa2HPO4）；其他化学试剂均购自国药公司，均为分析纯；实验用水为超纯水。扫描电子显微镜（SEM，日本JSM-6700F）用来对产物的形貌和微观结构进行表征；透射电子显微镜（TEM，日本JEOL-1400）用来对物质的内部和表面进行表征；红外分光光度计（FT-IR，FT-IR-410）用于红外表征；X-射线衍射仪（XRD，德国BrukerD8）用于对物质的鉴定；紫外可见分光仪（UV，lambda35）用于紫外可见光谱的检测；荧光分光光度计（FL，LS-55）用于荧光光谱分析；MPI-F型流动注射化学发光仪用于化学发光测量（西安瑞迈电子科技有限公司）；电化学测量用CHI760D电化学工作站（上海辰华）；三电极体系：4mm玻碳电极（GCE）作为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极。4.3实验部分4.3.1C-g-C3N4的制备称取5g三聚氰胺置于氧化铝坩埚中，加上盖子，将坩埚放入马弗炉中，升温速率为5˚C/min，在550˚C下保持4h。之后将得到的黄色固体研磨成粉末，将粉末再在550˚C-1下煅烧3h。反应完成后称取1g固体置于三口烧瓶中，加入100mL、5mol·LHNO3溶液，在124˚C下回流24h。将所得物通过离心分离并用超纯水将产物洗至中性。最后将产物置于35˚C真空干燥箱中干燥。4.3.2NiPd的制备[124]根据文献，依次称取51.6mg柠檬酸钠和13.5mgNiCl2并在强力搅拌下溶于100-1mL超纯水中，将完全溶解的溶液通入N230min除去溶解氧，之后取10mL、2mg·mL-1新鲜配制的NaBH4溶液逐滴加入到混合溶液中去，10min后加入0.75mL、56.4mol·LH2PdCl4溶液，在搅拌的条件下反应10min，将所得混合物通过离心分离（9000rpm、15min），并用超纯水离心洗涤五次，将最后所得产物重新分散到5mL水中，备用。32 济南大学硕士学位论文4.3.3NiPd-DNAzyme-Ab2猝灭探针的制备-1将100μL、1mg·mL的胰岛素抗体加入到1mL上述制备的NiPd溶液中，在4˚C下震荡过夜，之后加入氨基功能化的G-四连体DNA，在4˚C下震荡16h，然后加入适量的0.1-1-1mol·L饱和NaCl溶液。之后加入含有0.1mol·LKCl和10%BSA的PBS缓冲溶液（pH=7.5），在4˚C下震荡2h后通过离心分离（12000rpm、30min）去除未连接的抗体和DNA。-1剩下的产物重新分散到PBS缓冲溶液中，加入0.5mL、5μmol·L的hemin，在4˚C下震荡-12h。多余的Hemin通过离心分离去除，余下的产物重新分散到含有0.01mol·LKCl的PBS缓冲溶液中。图4.1NiPd-DNAzyme-Ab2制备示意图（A）免疫传感器构建过程示意图（B）4.3.4免疫传感器的制备将直径4mm的玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，然后分别用超纯水和无水乙醇超声洗涤，再用超纯水冲洗电极表面，除去电极表-1面吸附的物质；首先在电极表面滴涂6μL、1.8mg·mL的C-g-C3N4溶液，在室温下晾-1干后滴加3μL新鲜配制的EDC/NHS溶液；然后滴加6µL、10µg·mL的Ab1溶液，4˚C33 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；滴加3µL、1wt%的BSA溶液，4˚C冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；将电极浸入到一系列不同浓度的胰岛素抗原溶液2h，用超纯水冲洗电极表面；将电极浸入NiPd-DNAzyme-Ab2溶液30min，置于4˚C冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面，制得免疫传感器。制备过程如图4.1所示。4.3.5ECL测试测试过程采用电化学发光法对制备的电极进行检测，电解液选用pH=7.5的PBS-1缓冲溶液，以1mmol⋅L的H2O2溶液为共反应剂，扫描电位范围为-1.6~0V，扫速为-10.1V⋅s，光电倍增管高压为800V。采用修饰好的电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl作为参比电极的三电极系统。4.4结果和讨论4.4.1C-g-C3N4的表征作为传感器的基底层，对分析物的检测有重大影响。利用SEM和TEM技术对C-g-C3N4的形态进行了表征。从SEM图（图4.2A）可以看出C-g-C3N4紧密排列。图4.2B的TEM图显示了C-g-C3N4是二维片状结构，可以清楚地观察到典型的超薄透明纳米片结构。图4.3是C-g-C3N4的紫外吸收光谱和荧光发射光谱图，从图中可以看出在296nm处有紫外吸收峰，最大的荧光发射波长在434nm。利用红外表征来证明C-g-C3N4-1[24]成功制备，如图4.2C所示，g-C3N4（曲线a）在3163cm（N-H的伸缩振动）、1409-1-1-1-1cm/1464cm/1644cm（C-N和C=N的伸缩振动）、810cm（三嗪基的振动）处有特[125]征吸收峰，与文献报道的g-C3N4有一致的特征吸收峰。与g-C3N4的红外光谱对比，C-g-C3N4的红外光谱发生了改变，这是由于羧基被引入到g-C3N4上。C-g-C3N（曲线4b）-1-1-1在1727cm（C=O弯曲振动）、1575cm/1383cm（-COO吸收带）有特征峰，这表明C-g-C3N4被成功合成。图4.2D为XRD图，从图中可以看出g-C3N4（曲线a）有两个特征峰，分别位于27.54º和12.59º，在27.54º出现的强的衍射峰是由于芳香环共轭系统的平面间堆叠，属于石墨材料（002）面。峰值为12.59º的峰可以分配给均三嗪结构的面内顺序。C-g-C3N4（曲线b）在12.59º峰值有所减弱，但两个特征峰的位置没有发生变化，表明羧基的引入不会破坏g-C3N4的晶格结构。34 济南大学硕士学位论文图4.2C-g-C3N4的SEM图（A）、TEM图（B）；红外图谱（C）：（a）g-C3N4、（b）C-g-C3N4；XRD图（D）：（a）g-C3N4、（b）C-g-C3N4图4.3C-g-C3N4的紫外吸收光谱和荧光发射光谱4.4.2NiPd的表征图4.4A是NiPd的TEM图，从图中可以很清楚地观察到NiPd的中空结构，这些纳米颗粒的平均粒径为20nm，NiPd壳的厚度约为3.5nm。从EDX图（图4.4B）可以看出NiPd主要有Ni和Pd两种元素。为了探究NiPd的类过氧物酶活性，在H2O2存在下催化过氧物酶基底物质TMB、ABTS、OPD，NiPd可以快速的催化这些物质使其产生不同的颜色，如图4.4A所示，在H2O2存在的时候NiPd能够催化氧化TMB形成典型的深[126]+蓝色，这是由于生成了TMB二亚胺。NiPd能催化ABTS生成自由基正离子ABTS，35 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究[127]ABTS的氧化产物是绿色，特征吸收峰在418nm。同样的，在H2O2存在下NiPd也[128]能快速地氧化OPD产生典型的黄色，且吸收峰在444nm。图4.4D为依赖时间的紫外吸光度测试，在652nm处的吸光度随着时间的增加而增大，这是由于TMB的氧化。然而，这个反应在缺少NiPd（曲线a）或缺少H2O2（曲线b）的情况下都不会发生，表明这两种物质是缺一不可的。图4.4NiPd的TEM图（A）和EDX图（B）；在H2O2存在下NiPd催化氧化TMB（a）、ABTS（b）、OPD（c）产生不同的颜色反应（C）；在波长652nm处按时间改变的紫外吸光度曲线（D）：TMB-1+H2O2（a）、TMB+NiPd（b）、TMB+NiPd+H2O2（c），反应条件为100mmol·LHAc-NaAc（pH-1-1-1=5.0）缓冲溶液中含有0.25mmol·LTMB、4.5μg·mLNiPd、5mmol·LH2O24.4.3传感器的表征采用ECL强度-电势曲线来验证电极的修饰过程。如图4.5A所示，曲线a有极小的ECL信号，当C-g-C3N4修饰到电极上时，出现了一个很强的ECL发射，发光电位在-1.57V（曲线b）。当Ab1（曲线c）、BSA（曲线d）和胰岛素抗原（曲线e）依次修饰到电极上时，ECL信号强度依次降低，这是由于这些物质是非电活性物质，阻碍电子转移。当NiPd-DNAzyme-Ab2（曲线f）猝灭探针修饰到电极上时，ECL信号强度显著降低，说明NiPd-DNAzyme消耗了共反应剂，猝灭了C-g-C3N4的电化学发光。为了进一步表征所制备的免疫传感器，使用电化学阻抗图谱（EIS）对电极不同的修饰过程进行表征。如图4.5B所示，图中曲线a近乎一条直线，在高频区没有出现半圆部分，表明电极上不存在阻挡电子传递的物质。当C-g-C3N4修饰在电极表面之后，曲线36 济南大学硕士学位论文b显示了一个小的半圆，原因是材料具有良好的电子传递能力。当依次修饰Ab（曲线1c）、BSA（曲线d）、胰岛素抗原（曲线e）和NiPd-DNAzyme-Ab2（曲线f），半圆逐渐增大，阻抗值依次增加，这表明传感器构建成功。为了验证NiPd-DNAzyme双重猝灭能力，实验测定了不同修饰电极的ECL信号，如图4.5C所示，C-g-C3N4/Ab1/BSA/Insulin/Ab2修饰的电极展示了一个强的ECL信号，C-g-C3N4/Ab1/BSA/Insulin/Ab2-NiPd修饰的电极产生的ECL相对降低，而C-g-C3N4/Ab1/BSA/Insulin/Ab2-NiPd–DNAzyme修饰的电极ECL降低更加明显，这表明NiPd–DNAzyme能有效地猝灭C-g-C3N4的电化学发光。为了验证NiPd-DNAzyme复合物的电催化性能，将NiPd和NiPd-DNAzyme分别修饰到电极上，用CV法和计时电流法分别测试他们的催化性能。CV测试底液为含有5-1-1mmol·LH2O2的PBS缓冲溶液（pH=7.5），扫描速率为0.1V·s，如图4.5D所示NiPd-DNAzyme对H2O2的催化性能更好。如图4.6所示，NiPd-DNAzyme对H2O2的催化能力是NiPd的两倍，表明NiPd-DNAzyme复合物具有良好的电催化能力。图4.5ECL强度-电势曲线（A）和EIS（B）：（a）GCE，（b）GCE/C-g-C3N4，（c）GCE/C-g-C3N4/Ab1，（d）GCE/C-g-C3N4/Ab1/BSA，（e）GCE/C-g-C3N4/Ab1/BSA/Insulin，（f）GCE/C-g-C3N4/Ab1/BSA/Insulin/NiPd-DNAzyme-Ab2；ECL强度-电势曲线（C）：（a）C-g-C3N4/Ab1/BSA/Insulin/Ab2，（b）C-g-C3N4/Ab1/BSA/Insulin/Ab2-NiPd(curveb)，（c）C-g-C3N4/Ab1/BSA/Insulin/Ab2-NiPd–DNAzyme；CV（D）：（a）GCE/NiPd，（b）GCE/NiPd-DNAzymeECL猝灭机制可以用以下公式来描述。当电极从-1.6V扫描到0V时，C-g-C3N4被•--••还原为C-g-C3N4（反应式1），同时，H2O2被还原为OH和OH（反应式2），OH通过37 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究•-**水溶液中电子的转移与C-g-C3N4反应产生激发态C-g-C3N4（反应式3）。当C-g-C3N4从激发态回到基态时，产生光信号（反应式4）。当NiPd-DNAzyme连接到电极上时，NiPd和DNAzyme催化还原H2O2，从而消耗H2O2，引起ECL信号的减小（反应时5-7）。·-C-g-CN+e-→C-g-CN（1）3434•HO+e-→OH-+OH（2）22•·-*-OH+C-g-C3N4→C-g-C3N4+OH（3）*C-g-C3N4→C-g-C3N4+hv（4）Fe(III)DNAzyme+e-→Fe(II)DNAzyme（5）-2Fe(II)DNAzyme+H2O2→2Fe(III)DNAzyme+2OH（6）12-NiPd+H2O2→NiPd+2OH（7）图4.6计时电流：（a）GCE/NiPd，（b）GCE/NiPd-DNAzyme4.4.4实验条件的优化为了获得最佳测试条件，本实验系统地研究了pH、C-g-C3N4的浓度和孵化时间对传感器的影响。如图4.7A，ECL信号强度在pH5.5~7.0范围内是逐渐增加的，在7.0~8.0范围内达到了一个平稳的状态，随后，当pH大于8.0，ECL信号强度显著降低，这是由于抗原和抗体在中性的环境中有良好的活性，因此选择pH=7.5作为最佳pH值。C-g-C3N4的浓度是影响传感器性能的一个重要参数，如图4.7B，ECL信号强度在0.3~1.8-1-1mg·mL浓度范围内是逐渐增加的，当浓度超过1.8mg·mL时信号有轻微下降趋势，这-1可能是因为增加C-g-C3N4的厚度会阻碍电子转移，因此1.8mg·mL为最佳C-g-C3N438 济南大学硕士学位论文浓度。图4.7C显示的是孵化时间对传感器的影响，如图所示，将把修饰过胰岛素抗原的电极浸入到NiPd-DNAzyme-Ab2溶液中30min时，ECL信号达到了一个平稳状态，因此孵化时间为30min最为合适。图4.7底液pH值（A）、C-g-C3N4的浓度（B）以及孵化时间（C）对传感器性能的影响4.4.5传感器的性能分析为了进一步探索该传感器的定量准确度，在最佳实验条件下将传感器应用于胰岛素-1的定量检测。不同浓度胰岛素的ECL响应如图4.8A所示，从0到20ng·mL浓度范围内，ECL信号强度随着胰岛素浓度的增大而减小。图4.8B显示出ΔIECL与胰岛素浓度的-1对数有良好的线性关系，校正曲线方程为ΔIECL=6831.52+1046.05log[c/ng·mL]（R=0.996），其中ΔIECL=I0-I，I0为修饰电极没有连接胰岛素抗原的信号强度，I为修饰电-1-1极连接胰岛素抗原的信号强度。检测范围为0.0001ng·mL到20ng·mL，检测限为33-1fg·mL（S/N=3）。图4.8传感器检测不同浓度胰岛素的ECL响应图（A）：浓度a~n分别为0、0.0001、0.001、0.01、-10.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、15、20ng·mL；传感器对不同胰岛素的工作曲线（B）4.4.6传感器的稳定性、重现性和选择性-1稳定性是评价传感器可行性的一个重要因素。在0.1mol·LPBS缓冲溶液中对修饰电极连续扫描10个周期，扫描电位为-1.6~0。如图4.9A，ECL信号连续且平稳，测得39 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究信号的相对标准偏差（RSD）为1.55%，这说明该传感器具有良好的稳定性。此外，重现性也是影响传感器性能的另一个重要因素。在相同条件下制备六根相同工作电极，测试其重现性，如图4.9B所示，测得RSD为1.87%，表明该传感器的稳定性良好。为了探究所构建传感器的抗干扰能力，选用癌胚抗原（CEA）、前列腺特异性抗原（PSA）、人免疫球蛋白（HIgG）、甲胎蛋白（AFP）作为干扰物质。在相同的实验条件下测试了-1-12ng⋅mL胰岛素与20ng⋅mL干扰物质的混合物，如图4.9C所示，测得的信号没有明显差异，表明该传感器具有良好的选择性。-1-1图4.9传感器的稳定性（A）；传感器的重现性（B）；传感器的选择性（C）：2ng·mL胰岛素，2ng·mL-1-1-1-1-1胰岛素+20ng·mLCEA，2ng·mL胰岛素+20ng·mLPSA，2ng·mL胰岛素+20ng·mLHIgG，-1-12ng·mL胰岛素+20ng·mLAFP4.4.7实际样品测试为了验证所构建传感器的准确度和分析可靠性，采用标准加入法检测实际样品。如表4.1展示，将不同浓度的胰岛素分别加入到血清样本中，回收率在98.84-100.43%范围内，相对标准偏差在1.95-3.16%范围内，结果表明本传感器检测准确。40 济南大学硕士学位论文表4.1血清样本中胰岛素的检测结果InitialinsulinAdditionThedetectionRSDRecoveryindiabeticsamplecontent-1-1content(ng·mL,n=5)(%,n=5)(%)(ng·mL)(ng·mL-1)1.002.47,2.53,2.67,2.52,2.562.9298.841.581.503.01,3.14,3.21,3.03,2.983.1699.813.004.68,4.53,4.64,4.67,4.481.95100.434.5本章小结基于对C-g-C3N4双重猝灭的探针NiPd-DNAzyme构建了一种高灵敏的ECL免疫传感器，实现了胰岛素的快速、灵敏检测。C-g-C3N4在H2O2作为共反应剂的情况下能够产生稳定且较强的ECL信号。NiPd-DNAzyme作为ECL猝灭探针具有较好的电催化活性，能够催化还原H2O2，因此导致ECL信号降低。ECL信号强度的变化与胰岛素浓度-1-1的对数在浓度范围0.0001-20ng·mL呈对数关系，检测限为33fg·mL。此外，所构建的免疫传感器具有良好的稳定性、重现性和选择性。41 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究42 济南大学硕士学位论文第五章基于Pt/PdCu-3DGF构建的SCCA电化学免疫传感器5.1前言鳞状癌细胞抗原（SCCA）是一种TA-4的亚型并且属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中[129]的一员。大量的研究表明，随着SCCA水平的增加，子宫颈鳞状上皮细胞癌的发病[130]率从12%增加到90%。因此，SCCA被用作子宫颈鳞状上皮细胞癌的一种肿瘤标志物，在诊断发生在鳞状细胞中的癌症起重要作用。尤其是针对宫颈鳞状细胞癌的诊断。在治疗前期，SCCA的检测率是87.7%，远远高于其他肿瘤标志物。具有高SCCA值的术前患者的复发率比普通患者会增加三倍。检测宫颈鳞状细胞癌的复发率可以通过测定血清中SCCA的浓度的方法来实现。因此，在宫颈鳞状细胞癌的临床诊断和预警领域，一个快速、高效和超灵敏的检测SCCA浓度的电化学免疫分析方法具有潜在的应用价值。三维石墨烯是一种由石墨烯片层构成骨架的多孔材料，拥有超大的比表面积，能够[131,132]同时将石墨烯的优异化学、电学、热学性能与多孔材料的诸多优异性能有机的结合起来，而且三维石墨烯表面富有大量含氧官能团，能够提供更多的活性位点去结合贵[133,134]金属纳米复合材料，从而进一步放大电化学信号。贵金属纳米粒子，由于它对H2O2[135]的氧化还原具有优越的电化学催化特性，已经被广泛的应用于电化学传感器中。尤[136-138]其是铂纳米粒子（Pt）展现出较高的电催化活性和稳定性。但是，考虑到成本问题，人们将研究重点放在了Pt基复合纳米材料上，并在采取相关措施提高复合纳米材[139,140]料的催化活性的同时，降低Pt的含量。钯纳米材料（Pd）和钯基纳米复合材料催[141]化剂，储量丰富、价格低廉，是作为免疫传感器很好的候选材料。但是，若将具有化学惰性的钯纳米粒子直接暴露在电化学环境中，表面的钯原子会发生解离和迁移，会[142]使得Pd纳米粒子发生团聚，影响其电催化活性。为了减少成本并保留贵金属原有的电催化活性，该研究利用Cu、Pd和Pt三种金属形成了一种内部中空的纳米立方体复合材料。基于此，本实验成功构建了一种基于三维石墨烯（3DGF）负载三元合金Pt/PdCu（Pt/PdCu-3DGF）中空纳米立方体标记的夹心型电化学免疫传感器用于鳞状癌细胞抗原的检测。43 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究5.2试剂与仪器SCCA，SCCA抗体（Ab1和Ab2）购买于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；PdCl2、H2PtCl6·6H2O、β-环糊精购买于上海阿拉丁试剂有限公司；牛血清白蛋白（BSA，96%-99%）-1-1购于Sigma-Aldrich公司；PBS缓冲溶液（PBS,1/15mol·LKH2PO4，1/15mol·LNa2HPO4）。所有试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。电化学测试采用CHI-760D电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；透射电镜由JEOL-1400透射电子显微镜（TEM，日本电子株式会社）获得；扫描电镜由JSM-6700F扫描电子显微镜（SEM，日本电子株式会社）；红外由FT-IR-410傅里叶变换红外光谱仪（JASCO，日本）获得。5.3实验部分5.3.1玻碳电极的预处理玻碳电极（Φ=4mm）经1.0μm、0.3μm和0.05μm的A12O3粉末依次抛光后用超纯水冲洗干净，再用超纯水和无水乙醇依次超声洗涤，用超纯水冲洗干净，晾干备用。5.3.2氧化石墨烯的制备[101]根据文献，称取0.3g石墨、1.8g高锰酸钾放入250mL三口烧瓶中，加入40mL体积比为9:1的浓硫酸和磷酸的混合液，将三口烧瓶放入油浴，加热到50˚C，反应12h。将40mL超纯水放到250mL烧杯中，放入冰箱冻成冰块。反应结束之后，将样品倾倒到40mL冰块上，在磁力搅拌下加入300µL的过氧化氢。冰逐渐融化，磁力搅拌0.5h。-1反应结束后，将得到的混合物离心（8000rpm、0.5h），然后分别用盐酸（0.2mol·L），无水乙醇，乙醚分别洗涤离心三次，弃去上清液，最后得到的固体样品放真空干燥箱35˚C干燥。5.3.3CD-GN的制备-1将氧化石墨烯溶液（20mL、0.5mg·mL），β-环糊精（80mg）和氨水（300µL）混合均匀，加入水合肼（20µL），强力搅拌10min后，放入60˚C的水浴中加热3.5h，反应完成后离心（13000rpm、15min），用超纯水洗涤三次，将得到的物质放入50˚C44 济南大学硕士学位论文的真空干燥箱中干燥。5.3.4Pt/PdCu-3DGF的制备[143]-1根据文献，取分散均匀的PdCl2溶液（1.5mL、6.7mg·mL）、氧化石墨烯溶液-1（3.2mL、8.0mg·mL）、CuSO4·5H2O（15mg）、谷氨酸盐（50mg）置于250mL烧杯中，再加入40mL乙二醇作为溶剂，超声使其形成混合均匀的溶液，磁力搅拌2h。在磁力搅拌下，用8wt%KOH/乙二醇溶液调节pH到13左右。之后将混合溶液移入50mL高压反应釜中，将反应釜放入鼓风干燥箱，160˚C条件下加热7h。待反应完成后，取出反应釜置于通风处冷却至室温。此时，获得胶体状物质，将所得物质移入含有谷氨酸-1盐（20mg）、H2PtCl6·6H2O（0.9mL、3.0mg·mL）的乙二醇溶液的烧杯中，用同样的方法将混合后的溶液调节pH到13左右，然后移至反应釜，在160˚C下反应3h。反应完成后，用超纯水洗涤几次，将洗涤后的物质放入冰箱中冷冻结冰，最后用冷冻干燥机干燥。5.3.5二抗标记物的制备称取1mgPt/PdCu-3DGF置于1mL超纯水，超声0.5h，加入Ab2（200μL、100-1µg·mL），在4˚C的恒温震荡箱中反应过夜。反应完成后，离心（9000rpm、5min）弃去上层液，将所得物质用PBS溶液（pH=7.0）洗涤离心一次，重新分散到1mLPBS溶液中，制得二抗标记物Ab2-Pt/PdCu-3DGF。5.3.6免疫传感器的制备-1取6μL1.0mg·mLCD-GN溶液，滴加到电极表面，室温下晾干。晾干后滴加6µL、-110µg·mL的SCCA抗体。晾干后滴加3µL质量分数为1%的BSA溶液用以封闭电极表面上非特异性活性位点。用超纯水冲洗电极表面，然后滴加6μL一系列不同浓度的SCCA抗原。晾干后滴加6µLAb2-Pt/PdCu-3DGF溶液，室温下晾干后，用超纯水清洗电极表面。制备过程如图5.1所示。5.3.7电化学测量本实验采用三电极体系，其中工作电极是上述已经修饰好的玻碳电极，参比电极是饱和甘汞电极，对电极是铂丝电极。整个实验过程都是在PBS（pH=7.0）缓冲溶液中45 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究-1进行的。以0.1V·s的扫速在PBS（pH=7.0）缓冲溶液中测定工作电极的循环伏安图。当工作电极进行时间-电流测定时，设置电位为-0.4V，时间为300s，当背景电流趋于稳-1定时，在磁力搅拌的条件下，将10μL的H2O2（5mol·L）加入到10mLPBS（pH=7.0）缓冲溶液中，记录电流随时间的变化。图5.1免疫传感器制备过程示意图5.4结果和讨论5.4.1CD-GN的表征图5.2A分别表示的是石墨烯、β-环糊精、CD-GN的红外光谱图。从图中可知，纯-1-1的石墨烯（曲线a）的吸收带出现在1074cm（C-C/C-O的伸缩振动），1120cm（O-H-1弯曲振动）和3429cm（O-H的伸缩振动）。石墨烯的主要吸收峰与环糊精功能化的石-1墨烯的吸收峰（曲线c）出现在相同的位置。另外，CD-GN在946cm（骨架振动），-1-1-1756cm（环呼吸振动），707cm（吡喃糖环振动）和578cm（吡喃糖环振动）处有吸收峰，它与β-CD（曲线b）有一致的特征吸收峰。因此，这充分的证明了环糊精与-1石墨烯复合成功。图5.2B为用CD-GN溶液修饰的玻碳电极在0.1V·s的扫速下连续扫描20圈的CV曲线图，从图中我们可以看到氧化还原峰没有明显变化，这说明环糊精有效地阻止了石墨烯的堆叠。图5.2C为CD-GN的SEM图，从图中可以看出CD-GN的表面显示出无序的折叠多层结构。图5.2D为CD-GN的TEM图，图中展示出了CD-GN46 济南大学硕士学位论文的薄片状结构并伴有明显的褶皱。图5.2CD-GN的红外图谱（A）；CD-GN修饰的玻碳电极在0.1V扫速下扫描20圈的CV曲线图（B）；CD-GN的SEM图（C）和TEM图（D）5.4.2Pt/PdCu-3DGF的表征为了证明三维石墨烯负载Pt/PdCu纳米立方块的这种特殊结构，图5.3A为Pt/PdCu-3DGF的SEM图，从图中我们可以看出纳米立方体均匀的分散在三维石墨烯片层上。图5.3B为Pt/PdCu-3DGF的TEM图，从图中可看出Pt/PdCu纳米立方体的中空结构，且纳米粒子尺寸均匀，约50nm。图5.3C为Pt/PdCu-3DGF的电子能谱图（EDS），从图中明显的看出Pt、Pd、Cu这三种元素存在于复合物中，说明Pt/PdCu三元复合物被成功合成。为了证明三元合金Pt/PdCu中空纳米立方体的高催化性能，我们分别合成了三维石墨烯负载Pt、三维石墨烯负载PdCu、三维石墨烯负载Pt/PdCu，并用三种材料分别测试其对H2O2的催化性能，如图5.3D所示，从图中我们可以看出Pt/PdCu-3DGF对H2O2的催化性能最好，有利于传感信号放大。47 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究图5.3Pt/PdCu-3DGF的SEM图（A）和TEM图（B）；Pt/PdCu-3DGF的EDS图（C）；不同修饰电极对应的计时电流响应图（D）：（a）Pt-3DGF，(b)PdCu-3DGF，(c)Pt/PdCu-3DGF5.4.3免疫传感器的表征通过电化学交流阻抗法（EIS）来验证传感器是修饰成功。如图5.4A所示，半圆的直径可以看做电子传递的阻抗，由图5.4A可知，阻抗值是随着电极的逐层修饰而变化的。裸玻碳GCE的交流阻抗曲线（曲线a），在低频区近似为一条直线，高频区则有一个直径很小的半圆型，说明电子传到电极表面受扩散的控制，探针很容易到达电极的表面发生反应。当CD-GN修饰到电极表面后（曲线b），得到的半圆有所增大，这是因为CD-GN显著提高了导电性，表明CD-GN可以加速电子传递。同样，随着Ab1（曲线c），BSA（曲线d），抗原（曲线e），Ab2-Pt/PdCu-3DGF（曲线f）逐层修饰，半圆进一步增加，因为这些修饰物阻碍了氧化还原电位测试探针的电子转移。上述结果表明，该传感器构建成功。用线性扫描循环伏安法（CV）进一步证明传感器修饰成功，如图5.4B所示，当CD-GN修饰到电极表面后（曲线b），峰电流比裸玻碳GCE的峰电流大（曲线a），这表面CD-GN加速了电子传递。随着Ab1（曲线c），BSA（曲线d），抗原（曲线e），Ab2-Pt/PdCu-3DGF（曲线f）逐层修饰，峰电流逐渐下降，这是由于蛋白质阻碍了电子传递，表明传感器构建成功。48 济南大学硕士学位论文图5.4传感器交流阻抗图（A）和CV曲线图（B），(a)GCE,(b)GCE/CD-GN,(c)GCE/CD-GN/Ab1,(d)GCE/CD-GN/Ab1/BSA,(e)GCE/CD-GN/Ab1/BSA/SCCA,(f)GCE/CD-GN/Ab1/BSA/SCCA/Ab2-Pt/PdCu-3DGF5.4.4实验条件的优化为了获得SCCA的最佳分析性能，对实验的检测条件进行了优化。检测溶液的pH值对传感器性能有明显的影响。强酸或强碱会破坏抗原和抗体的活性。为了选择最优pH值，选择一系列PBS缓冲溶液，pH范围从5.5-8.0。如图5.5A所示，当pH在5.5-7.0之间，响应电流急剧增加，当pH在7.0-8.0之间响应电流有所减小。在pH=7.0时，获得了最佳电流响应。制备免疫传感器的CD-GN浓度是影响信号读出的一个重要参数。随着CD-GN浓度的增大，响应电流逐渐增加，能尽可能多的捕获Ab1，从而使得抗体捕获更多的抗原、二抗和二抗标记物。当进一步增大CD-GN的浓度则阻碍了电子转移，-1使得响应电流慢慢下降。如图5.5B所示，当CD-GN的浓度为1.0mg·mL时，获得最-1大的电流响应值。因此，1.0mg·mL的CD-GN是选择出的最佳浓度。Pt/PdCu-3DGF的量也是影响免疫传感器灵敏度的一个重要参数。二抗标记物的浓度较高或较低都会对H2O2的催化性能产生影响。如图5.5C所示Pt/PdCu-3DGF浓度的选择范围为0.5-3.0-1-1mg·mL。当Pt/PdCu-3DGF的浓度为1.5mg·mL时有最大响应电流。图5.5体系pH对免疫传感器的影响（A）；CD-GN的浓度对免疫传感器的影响（B）；Pt/PdCu-3DGF的浓度对免疫传感器的影响（C）49 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究5.4.5免疫传感器的性能分析-1在最优条件下，响应电流随SCCA浓度的增加而增加，在0.0001-1ng·mL和1-30-1ng·mL的浓度范围内，响应电流与SCCA抗原浓度呈线性关系。如图5.6A和5.6B所示，计时电流随着抗原浓度的增加而增加。如图5.6C和5.6D所示的校正曲线，当抗原-1浓度在0.0001-1ng·mL范围内时，回归方程为Y=12.86+67.03X，线性回归系数为r-1=0.995；当浓度超过1ng·mL时，回归方程为Y=68.30+7.89X，线性回归系数为r=-10.999。检出限为25fg·mL。图5.6不同浓度的SCCA抗原对免疫传感器的计时电流响应曲线（A）和（B）；不同浓度范围内的-1-1工作曲线：0.0001-1ng·mL（C），1-30ng·mL（D）5.4.6免疫传感器的选择性和重现性衡量免疫传感器的特异性和抗干扰能力的一个重要指标就是选择性，选用癌胚抗原（CEA），甲胎蛋白（AFP），前列腺特异性抗原（PSA），牛血清白蛋白（BSA）和葡萄-1糖为干扰物质对免疫传感器选择性进行了测试。图5.7A中记录了包含100ng·mL不同-1干扰物质和1ng·mL的SCCA的电流响应值。由于干扰物质的电流变化小于无干扰的5%，表明免疫传感器的选择性是可以接受的。取同一批次的五根在相同条件下修饰好的电极测定计时电流，如图5.7B所示，结果表明，相对标准偏差为2.9%。表明了该免疫传感器具有良好的重现性。50 济南大学硕士学位论文-1-1-1图5.7干扰离子柱状图（A）。1ng·mLSCCA+50ng·mL的癌胚抗原（1）；1ng·mLSCCA+50-1-1-1-1ng·mL甲胎蛋白（2）；1ng·mLSCCA+50ng·mL的前列腺特异性抗原（3）；1ng·mLSCCA+50-1-1-1ng·mL的牛血清蛋白（4）；1ng·mLSCCA+50ng·mL的葡萄糖（5）；免疫传感器的重现性图（B）5.4.7实际样品检测为了验证免疫传感器在实际应用中的可行性，采用加标回收法检测不同浓度的血清-1-1-1SCCA的样品回收率。实验将浓度为0.5ng·mL，1.0ng·mL和2.0ng·mL的SCCA分别加入到血清样本中。如表5.1所示，结果表明，人体血清样本中SCCA的相对标准偏差小于3.7%，回收范围是91.8%-102.1%，说明样品的检测方法准确性好。表5.1血清样本中SCCA的检测结果稀释血清样品添加量检测量相对标准偏差回收率-1-1-1（ng·mL）（ng·mL）（ng·mL，n=5）（%，n=5）（%）0.50.68，0.65，0.69，0.71，0.692.2102.10.171.01.12，1.08，1.02，1.06，1.093.791.82.02.18，2.22，2.15，2.24，2.183.6101.15.5本章小结利用三维氧化石墨烯负载Pt/PdCu纳米立方体作为标记物，实现信号放大，并用β-环糊精功能化的石墨烯作为传感器平台，设计出了一种鳞状癌细胞抗原分析传感器。线-1-1性范围是0.0001-30ng·mL，检出限为25fg·mL。此传感器具有灵敏度高、响应速度快、选择性好、线性范围宽、重现性好等优点。制备的传感器为临床诊断提供了广阔的应用前景。51 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究52 济南大学硕士学位论文第六章结论与展望本文制备了多种富碳纳米材料，并用其构建疾病标志物传感器。（1）所制备的2+MWCNTs-NH2@N/Ru(bpy)3复合物产生稳定的ECL信号，利用PDANS通过能量转移作用猝灭其电化学发光，因此实现对PSA的高灵敏检测。（2）制备PDANS@Ag/C-dots纳米探针，通过对C-dots的高效负载，使其具有很强的电化学发光效率，基于此构建了一种新颖的信号减弱型ECL适体传感器用于检测凝血酶。（3）合成C-g-C3N4纳米材料，利用NiPd-DNAzyme对共反应剂的双重消耗，从而猝灭C-g-C3N4的电化学发光，实现胰岛素的检测。（4）利用CD-GN作为传感平台，Pt/PdCu-3DGF作为二抗标记物，Pt/PdCu-3DGF对H2O2有良好的催化性能，实现对SCCA的高灵敏检测。以上富碳纳米材料各具优点，在疾病标志物的检测中具有应用价值。虽然初步取得了一些研究成果，但仍然存在一些需要继续深入的研究问题，如：1、不断地研究制备新型复合富碳纳米材料，碳量子点和石墨烯量子点的电化学发光效率不高，需要设计合成方法简单、发光效率高的量子点。2、分析设备小型化、微型化、市场化。发展手持即测、小巧廉价的传感设备是未来检测疾病标志物发展的方向。3、通过筛选富碳纳米材料形成复合体系，构建具有协同识别能力的传感界面，可以建立直接、简便、易行的分析策略。4、与其他技术的结合、仪器设备的联用创新，生物传感技术与生物科学、纳米材料技术等都已经有非常好的结合应用，而与其他学科如物理、数学、计算机等的结合将进一步提高传感技术。53 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究54 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济南大学硕士学位论文[116]JiangXY,ChaiYQ,WangHJ,etal.Electrochemiluminescenceofluminolenhancedbythesynergeticcatalysisofheminandsilvernanoparticlesforsensitiveproteindetection[J].BiosensorsandBioelectronics,2014,54(8):20-26.[117]PelossofG,Tel-veredR,ElbazJ,etal.Amplifiedbiosensingusingthehorseradishperoxidase-mimickingDNAzymeasanelectrocatalyst[J].AnalyticalChemistry,2010,82(11):4396-4402.[118]PelossofG,TelveredR,WillenrI.Amplifiedsurfaceplasmonresonanceandelectrochemical2+2+detectionofPbionsusingthePb-dependentDNAzymeandhemin/G-quadruplexasalabel[J].AnalyticalChemistry,2012,84(8):3703-3709.[119]ShangCS,HongW,WangJ,etal.Carbonsupportedtrimetallicnickel-palladium-goldhollownanoparticleswithsuperiorcatalyticactivityformethanolelectrooxidation[J].JournalofPowerSources,2015,285:12-15.[120]WanWC,YuS,DongF,etal.EfficientC3N4/grapheneoxidemacroscopicaerogelvisible-lightphotocatalyst[J].JournalofMaterialsChemistryA,2016,4(20):7823-7829.[121]ZhengY,JiaoY,ChenJ,etal.Nanoporousgraphitic-C3N4@carbonmetal-freeelectrocatalystsforhighlyefficientoxygenreduction[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2011,133(50):20116-20119.[122]RahbarNa,SalehnezhadZe,HatamieA,etal.Graphiticcarbonnitridenanosheetsasafluorescentprobeforchromiumspeciation[J].MicrochimicaActa,2018,185(2):101.[123]PangXH,PanJH,GaoPC,etal.AvisiblelightinducedphotoelectrochemicalaptsensorconstructedbyalignedZnO@CdTecoreshellnanocablearrays/carboxylatedg-C3N4forthedetectionofproproteinconvertasesubtilisin/kexintype6gene[J].BiosensorsandBioelectronics,2015,74:49-58.[124]WangQQ,ZhangLL,ShangCS,etal.Triple-enzymemimeticactivityofnickel-palladiumhollownanoparticlesandtheirapplicationincolorimetricbiosensingofglucose[J].ChemicalCommunications,2016,52(31):5410-5413.[125]OuX,TanXR,LiuXF,etal.Asignal-onelectrochemiluminescencebiosensorfordetectingConAusingphenoxydextran-graphite-likecarbonnitrideassignalprobe[J].BiosensorsandBioelectronics,2015,70:89-97.65 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究[126]TianZM,LiJ,ZhangZY,etal.Highlysensitiveandrobustperoxidase-likeactivityofporousnanorodsofceriaandtheirapplicationforbreastcancerdetection[J].Biomaterials,2015,59:116-124.[127]WanLJ,LiuJH,HuangXJ.Novelmagneticnickeltelluridenanowiresdecoratedwiththorns:synthesisandtheirintrinsicperoxidase-likeactivityfordetectionofglucose[J].ChemicalCommunications,2014,50(88):13589-13591.[128]HeWW,JiaHM,LiXX,etal.UnderstandingtheformationofCuSconcavesuperstructureswithperoxidase-likeactivity[J].Nanoscale,2012,4(11):3501-3506.[129]WillamsM,SwampillaiA,OsborneM,etal.Squamouscellcarcinomaantigen:apotentiallyusefulprognosticmarkerinsquamouscellcarcinomaoftheanalcanalandmargin[J].Cancer,2013,119(13):2391-2398.[130]KatoH.Squamouscellcarcinomaantigen,humanapress[Z].1992,42(1):437-451.[131]ChenWF,LiSR,ChenCH,etal.Self-assemblyandembeddingofnanoparticlesbyinsitureducedgrapheneforpreparationofa3Dgraphene/nanoparticleaerogel[J].AdvancedMaterials,2011,23(47):5679-5683.[132]ShaoYL,WangHZ,ZhangQH,etal.High-performanceflexibleasymmetricsupercapacitorsbasedon3Dporousgraphene/MnO2nanorodandgraphene/Aghybridthin-filmelectrodes[J].JournalofMaterialsChemistryC,2013,1(6):1245-1251.[133]XinYC,LiuJG,ZhouY,etal.PreparationandcharacterizationofPtsupportedongraphenewithenhancedelectrocatalyticactivityinfuelcell[J].JournalofPowerSources,2011,196:1012-1018.[134]XuC,WangX,ZhuJW.Graphene-metalparticlenanocomposites[J].JournalofPhysicalChemistryC,2008,112(50):19841-19845.[135]WuD,FanHX,LiYY,etal.Ultrasensitiveelectrochemicalimmunoassayforsquamouscellcarcinomaantigenusingdumbbell-likePt-Fe3O4nanoparticlesassignalamplification[J].BiosensorsandBioelectronics,2013,46(4):91-96.[136]MuYY,LiangHP,HuJS,etal.ControllablePtnanoparticledepositiononcarbonnanotubesasananodecatalystfordirectmethanolfuelcells[J].JournalofPhysicalChemistryB,2005,109(47):22212-22216.[137]MatsuyamaY,SuzukiM,ArimaC,etal.Enhancedelectrocatalysisofoxygenreductiononplatinumalloysinprotonexchangemembranefuelcells[J].JournalofElectroanalyticalChemistry,1993,357(1-2):201-224.66 济南大学硕士学位论文[138]SteigerwaltES,DelugaGA,LukehartCM.ChemInformabstract:Pt—Ru/Carbonfibernanocomposites:synthesischaracterization,andperformanceasanodecatalystsofdirectmethanolfuelcells.Asearchforexceptionalperformance[J].Cheminform,2002,33(4):760-766.[139]ZhangH,JinMS,XiaYN.EnhancingthecatalyticandelectrocatalyticpropertiesofPt-basedcatalystsbyformingbimetallicnanocrystalswithPd[J].Cheminform,2013,44(13):8035-8049.[140]DemarconnayL,BrimaudS,CoutanceauC,etal.Ethyleneglycolelectrooxidationinalkalinemediumatmulti-metallicPtbasedcatalysts[J].JournalofElectroanalyticalChemistry,2007,601(1-2):169-180.[141]GaoJ,DuB,ZhangXY,etal.Ultrasensitiveenzyme-freeimmunoassayforsquamouscellcarcinomaantigenusingcarbonsupportedPd-Auaselectrocatalyticlabels[J].AnalyticaChimicaActa,2014,833:9-14.[142]YangSB,FengXL,IvanoviciS,etal.Fabricationofgraphene-encapsulatedoxidenanoparticles:towardshigh-performanceanodematerialsforlithiumstorage[J].AngewandteChemie,2010,49(45):8408-8411.[143]HuCG,ChengHH,ZhaoY,etal.Newly-designedcomplexternaryPt/PdCunanoboxesanchoredonthree-dimensionalgrapheneframeworkforhighlyefficientethanoloxidation[J].AdvancedMaterials,2012,24(40):5493-5498.67 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究68 济南大学硕士学位论文致谢三年的研究生生活即将画上一个句号，在这三年中我学到了很多专业知识和生活经验，这三年是我人生中最宝贵的时光。回首过去，感慨良多，有迷茫、有挫折，但更多的是收获与喜悦。一悉细数，心中满溢感恩之情，首先我要感谢我的导师马洪敏老师，在科研工作中，他给予我莫大的帮助和支持。在他的悉心指导下，我的科研能力不断提升，工作态度也不断端正。他渊博深厚的知识、严谨治学的作风、认真的工作态度给我树立了最好的学习榜样。马老师表面看上去严肃，但他非常关心学生。本论文从选题到完成，每一步都是在马老师的悉心指导下完成的，在此表示衷心的感谢。此外，我要感谢魏琴老师为我们提供了一个优秀的实验平台，她就像一个大家长带领着我们，为我们指引方向，我被魏老师身上散发的人格魅力深深折服，她吃苦耐劳，任劳任怨，为人随和，从为人处世到科研工作，我在魏老师身上学到很多东西。感谢实验室年轻老师张勇老师、范大伟老师、吴丹老师、孙旭老师、庞雪辉老师、胡丽华老师对我的帮助和指导。感谢与我同级的朱文娟、王雪萍、魏贻成、李京帅的陪伴与帮助。感谢已经毕业的高健、高亮、郭占魁、韩健师兄对我的帮助，尤其是高健师兄，我刚进实验室的时候对科研是比较陌生的，是高健师兄耐心指导，使我对科研产生兴趣。感谢李小建、王耀光、王欢、任祥、李悦源等师兄师姐的帮助，感谢赵彦华、杨磊、张益峰、李相宏等师弟师妹的帮助。感谢我的爸爸妈妈，焉得谖草，言树之背，养育之恩，无以回报，你们永远健康快乐是我最大的心愿。最后，衷心的祝愿我最敬爱的马老师工作顺利！祝愿我们课题组在魏老师的带领下取得更辉煌的成绩！2018年5月69 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究70 济南大学硕士学位论文附录一、在校期间发表的学术论文与授权专利1.LiuYuanYuan,Ma*HongMin,GaoJian,etal.UltrasensitiveelectrochemicalimmunosensorforSCCAdetectionbasedonternaryPt/PdCunanocubeanchoredonthree-dimensionalgrapheneframeworkforsignalamplification.BiosensorsandBioelectronics,2016,79:71-78.(SCI,IF7.780)(第一作者)2.LiuYuanYuan,ZhaoYanHua,ZhuZongWei,etal.Ultrasensitiveimmunosensorforprostatespecificantigenusingbiomimeticpolydopaminenanospheresasanelectrochemiluminescencesuperquencherandantibodycarriers.AnalyticaChimicaActa,2017,963:17-23.(SCI,IF4.950)(第一作者)3.LiuYuanYuan,ZhaoYanHua,KhanSaddamMalik,etal.Aptamerbasedelectrochemiluminescentthrombinassayusingcarbondotsanchoredontosilver-decoratedpolydopaminenanospheres.MicrochimicaActa,2018,185(2):85.(SCI,IF4.580)(第一作者)4.MaHongMin,LiuYuanYuan,ZhaoYanHua,etal.Ultrasensitiveimmunoassayofinsulinbasedonhighlyefficientelectrochemiluminescencequenchingofcarboxyl-functionalizedg-C3N4throughcoreactantdual-consumptionbyNiPd-DNAzyme.JournalofElectroanalyticalChemistry,2018,818:168-175.(SCI,IF3.012).(第二作者)5.MaHongMin,ZhaoYanHua,LiuYuanYuan,etal.Acompatiblesensitivityenhancementstrategyforelectrochemiluminescenceimmunosensorsbasedonthebiomimeticmelanin-likedeposition.AnalyticalChemistry,2017,89:13049-13053.(SCI,IF6.320)(第三作者)6.ZhaoYanHua,LiuYuanYuan,LiXiaoJian,etal.Label-freeECLimmunosensorfortheearlydiagnosisofrheumatoidarthritisbasedonasymmetricheterogeneouspolyaniline-goldnanomaterial.SensorsandActuatorsB:Chemical,2018,257:354-361.(SCI,IF5.401)(第二作者)71 基于富碳纳米材料构建的疾病标志物传感器的研究7.刘媛媛,马洪敏,魏琴等.一种基于Pt/PdCu-三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备及应用（发明专利已授权）,专利号ZL201510837818.3.（第一发明人）8.刘媛媛、马洪敏、魏琴等.一种基于聚多巴胺纳米微球的电致化学发光传感器的制备方法（发明专利已授权）,专利号ZL201610909086.9.（第一发明人）9.刘媛媛,赵彦华,诸宗伟等.一种基于聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点的电化学发光生物传感器的制备方法（发明专利已授权）,专利号ZL201710082787.4.（第一发明人）二、在校期间参加的项目参与国家自然科学基金（21675063）、山东省高等教育科技规划项目（J16LC23）及中国博士后科学基金（2016M590609）的研究工作。三、在校期间获奖情况2015-2016学年：校二等奖学金、校优秀学生2016-2017学年：校二等奖学金、校优秀学生、雅舍评比二等奖、第十五届“挑战杯”海尔山东省大学生课外学术科技作品特等奖2017-2018学年：校二等奖学金、第十五届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛二等奖72 单位代码：ＨＭ２７密级：公开議＿｜＿滅似＾画ＵＮＩＶＥＲＳＦＪＩＴＹＯＩＮＡＮｍ＿蠢
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