基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌

《基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

学校编码１０３９０分类号Ｑ８１学号２０１３１１７１００１９密级硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌指导教师：林鹏教授作者姓名：辛甜甜申请学位级别：硕士学科专业：生物学研究方向：生物化学与分子生物学论文提交日期：２０１６年０５月０３日论文答辩日期：２０１６年０６月０６日学位授予单位：集美大学学位授予日期：２０１６年０６月２３日答辩委员会主席：柯才焕教授论文评阅人： 硕士学位论文Time-resolvedfluoroimmunoassaybasedonnanoparticlesfordetectingpathogensofaquaculture学科门类：理学作者姓名：辛甜甜指导教师：林鹏教授学科专业：生物学研究方向：生物化学与分子生物学学位授予单位：集美大学论文答辩日期：2016年06月06日 学术诚信声明兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研宄成果。本人依法享有和承担由此■论文产生的权利和责任。＃却扭声明人（签名：）时间：ｈｉｍ保护知识产权声明＇？本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定，即．学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。？作者（签名）：罕無Ｉ导师（签名）：ｎ？时间：ｔＳ．Ｌｉｌ 基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌摘要我国水产养殖业发展迅速，但细菌疾病的爆发，给水产养殖业带来了巨大的经济损失，而传统的酶联免疫分析法、荧光抗体法等免疫检测方法均存在灵敏度低、背景荧光高等缺陷。时间分辨荧光免疫法可有效降低背景荧光，是一种灵敏、高效的检测手段，已在致病菌、有毒化合物等免疫检测上得到了广泛地应用。纳米粒子可与多种生物大分子结合包括抗体，且不影响其生物活性，本研究建立了一种基于纳米粒子的TRFIA检测水产养殖致病菌，研究内容如下：（1）建立了直接纳米粒子TRFIA法检测嗜水气单胞菌B15，将细菌包被于微孔板，抗体标记后的荧光纳米粒子作为检测抗体进行检验。采用正交试验对细菌包被时间、细菌包被温度、纳米粒子-抗体浓度进行了优化，得出嗜水气单胞菌的最低检测限为51.0×10cfu/mL。（2）为提高检测灵敏度，将嗜水气单胞菌B15的抗体直接包被于微孔板，建立了双抗夹心纳米粒子TRFIA法。正交试验法对包被抗体浓度、抗体包被时间、免疫反应时间以及纳米粒子-IgG浓度进行了优化。根据优化结果进行实验，得出最低检测线为31.0×10cfu/mL。（3）引入生物素-链霉亲和素系统检测嗜水气单胞菌B15，进一步提高灵敏度。将生物素标记嗜水气单胞菌B15的抗体，使用链霉亲与荧光纳米粒子偶联，建立了生物素亲合素（Biotin-Avidin，BA）-纳米粒子TRFIA法。采用正交试验法优化生物素化抗体浓度、生物素化抗体与BA-荧光纳米粒子结合时间、BA-荧光纳米粒子浓度，最终得出嗜水气单2胞菌B15的最低检测线为8×10cfu/mL。关键词：纳米粒子；时间分辨荧光免疫分析；嗜水气单胞菌；水产致病菌I Time-resolvedfluoroimmunoassaybasedonnanoparticlesfordetectingpathogensofaquacultureAbstractTheaquacultureofchinahasbeendevelopingrapidly.However,thefrequentoccurrenceofdiseasefrombacterialeadstogreatfinanciallossinaquaculture.Thecommonlyusedimmunassys,suchasenzyme-linkedimmunosorbentassayandfluorescentantibodymethod,sufferfromlowsensitivityandhighbackgroundfluorescence.Time-resolvedfluorescenceimmunoassay(TRFIA)isasensitiveandefficientmeansofdetectionbecausethebackgroundfluorescenceofTRFIAcanbeeffectivelyreduced.TRFIAhasbeenwidelyusedintheimmunoassayforpathogens,toxiccompounds.Thefluorescentnanoparticlescombinewithavarietyofbiologicalmacromoleculessuchasantibodiesandtheirbiologicalactivitiesaren’taffected.Inthisstudy,TRFIAbasedonnanoparticlesfordetectingpathogensofaquaculturewasestablished.Thecontentsareasfollows:（1）AdirectnanoparticlesTRFIAforAeromonashydrophilaB15wasestablished.Thebacteriawerecoatedontheplate,andtheantibodylabeledbythefluorescentnanoparticleswasusedasdetectionantibody.Thecoatingtime,thetemperatureofcoatingandtheconcentrationofnanoparticles–antibodywereoptimizedbyorthogonalexperiment.Thedectitonlimitwas1.05×10cfu/mL.（2）Inordertoimprovethedetectionsensitivity,theantibodyforAeromonashydrophilaB15werecoatedontheplate,andadouble-antibodysandwichnanoparticlesTRFIAwasestablished.Theconcentrationofcoatedantibody,thecoatingtime,immunereactiontimeandtheconcentrationandconcentrationofnanoparticles–antibodywereoptimizedbyorthogonal3experiment.Thedectitonlimitwas1.0×10cfu/mL.（3）ThesensitivityofdetectionforAeromonashydrophilaB15canbefurtherimprovedinbiotin-streptavidinsystems.Theantibodywaslabeledbybiotin,andstreptavidinwascombinedwithfluorescentnanoparticles.Aavidin-biotin(Biotin-Avidin,BA)-nanoparticlesTRFIAforAeromonashydrophilaB15wasestablished.Theconcentrationofbiotinylatedantibody,thecombiningtimeofbiotinylatedantibodyandBA-fluorescentnanoparticlesandtheconcentrationofBA-fluorescentnanoparticleconcentrationwereoptimizedbyorthogonalexperiment.The2dectitonlimitwas8.0×10cfu/mL.Keywords：Nanoparticles；Time-resolvedfluorescenceimmunoassay；Aeromonashydrophila；AquaticpathogensII 目录第1章引言.....................................................................................................................................11.1时间分辨免疫荧光（TRFIA）检测研究进展....................................................................11.1.1时间分辨免疫荧光的检测原理....................................................................................11.1.2时间分辨免疫荧光检测技术的新进展........................................................................21.2纳米粒子研究进展................................................................................................................51.2.1纳米粒子的分类............................................................................................................61.2.2纳米粒子的合成............................................................................................................61.2.3纳米粒子的生物应用....................................................................................................71.3纳米粒子在TRFIA中的应用..............................................................................................71.4水产养殖致病菌检测方法的研究现状................................................................................91.4.1免疫分析检测方法......................................................................................................101.4.2分子生物学快速检测方法..........................................................................................101.4.3时间分辨荧光免疫检测水产致病菌..........................................................................101.5本研究的意义、内容和技术路线.....................................................................................111.5.1研究意义......................................................................................................................111.5.2技术路线......................................................................................................................121.5.3研究内容......................................................................................................................12第2章直接纳米粒子TRFIA检测嗜水气单胞菌B15............................................................132.1材料与方法.........................................................................................................................132.1.1试剂和材料..................................................................................................................132.1.2实验仪器......................................................................................................................132.1.3主要试剂配制..............................................................................................................132.2试验方法............................................................................................................................202.2.1抗体IgG纯化..............................................................................................................202.2.2纳米粒子标记抗体......................................................................................................212.2.3纳米粒子与抗体标记效率计算..................................................................................222.2.4直接纳米粒子TRFIA的建立....................................................................................222.2.5试验最佳条件的确定..................................................................................................222.2.8重复性实验..................................................................................................................242.2.9特异性测定..................................................................................................................24III 2.2.10灵敏度测定................................................................................................................242.2.11直接纳米粒子TRFIA的实际应用..........................................................................242.3试验结果.............................................................................................................................252.3.1IgG的纯化及分析鉴定结果........................................................................................252.3.2纳米粒子与抗体标记效率..........................................................................................252.3.3单因素优化..................................................................................................................252.3.4正交试验结果..............................................................................................................272.3.5重复性实验..................................................................................................................292.3.6特异性实验..................................................................................................................292.3.7敏感性测定..................................................................................................................302.3.8直接纳米粒子TRFIA检测法的实际应用...............................................................302.4讨论.....................................................................................................................................31第3章双抗夹心纳米粒子TRFIA检测嗜水气单胞菌B15....................................................333.1材料与方法.........................................................................................................................333.1.1试剂与材料..................................................................................................................333.1.2试验仪器......................................................................................................................333.1.3主要试剂配制..............................................................................................................333.2试验方法.............................................................................................................................333.2.1纳米粒子标记抗体......................................................................................................333.2.2双抗夹心纳米粒子TRFIA.........................................................................................333.2.3实验最佳条件确定......................................................................................................343.2.4重复性实验..................................................................................................................353.2.5特异性实验..................................................................................................................353.2.6灵敏度测定..................................................................................................................353.2.7双抗夹心纳米粒子TRFIA的实际应用....................................................................363.3结果与分析.........................................................................................................................363.3.1单因素优化..................................................................................................................363.3.2正交试验结果.............................................................................................................383.3.3微孔板的影响.............................................................................................................403.3.4重复性实验.................................................................................................................403.3.5特异性实验..................................................................................................................413.3.6敏感性实验.................................................................................................................41IV 3.3.7鳗鲡样品检测.............................................................................................................423.4讨论...................................................................................................................................43第四章BA-纳米粒子TRFIA检测嗜水气单胞菌B15...........................................................454.1材料与方法........................................................................................................................454.1.1试剂和材料.................................................................................................................454.1.2实验仪器.....................................................................................................................454.1.3主要试剂配制.............................................................................................................454.2实验方法............................................................................................................................454.2.1IgG的亲和纯化...........................................................................................................454.2.2IgG的效价分析...........................................................................................................454.2.3IgG的生物素标记.......................................................................................................454.2.4BA-纳米粒子TRFIA的建立.....................................................................................464.2.5实验最佳条件确定......................................................................................................464.2.6重复性实验..................................................................................................................474.2.7特异性测定..................................................................................................................484.2.8灵敏度测定..................................................................................................................484.2.9BA-纳米粒子TRFIA的实际应用..............................................................................484.3结果与分析........................................................................................................................484.3.1生物素化IgG标记比计算.........................................................................................484.3.2单因素优化..................................................................................................................484.3.3正交试验结果..............................................................................................................504.3.4重复性实验.................................................................................................................524.3.5特异性实验..................................................................................................................524.3.6敏感性实验.................................................................................................................534.3.7BA-纳米粒子TRFIA的实际应用.............................................................................534.4讨论...................................................................................................................................54第5章结论与展望....................................................................................................................56致谢.....................................................................................................................................57参考文献.....................................................................................................................................58在学期间发表的学术论文...........................................................................................................65V 主要符号表英文缩写英文全称中文名称BSABovineserumalbumin牛血清蛋白TRFIATime-resolvedfluoroimmunoassay时间分辨免疫分析法TOPOTrioctyl-phosphineoxide三辛基氧膦β-NTAβ-naphthoyltrifluoroacetoneβ-萘酰三氟丙酮2-(N-吗啉)乙磺酸一水合MES2-(N-Morpholino)ethanesulfonicacid物Sulfo-NHSN-HydroxysulfosuccinimidesodiumsaltN-羟基硫代琥珀酰亚胺IgGImmunoglobulinG免疫球蛋白CFUColony-formingunit菌落数TrisTris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷VI 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌第1章引言1.1时间分辨免疫荧光（TRFIA）检测研究进展时间分辨免疫荧光检测是一种非同位素免疫分析技术，它利用镧系元素标记抗原或者抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，并且通过检测波长和时间两大参数进行信号分辨，能够有效排除背景荧光的干扰，极大地提高分析的灵敏度。早在1987年，该技术就被用来检测艾滋病病毒(HIV)，并且和传统ELISA方法相比，阳性检测率高达100%且具有更高的灵敏度。后时间分辨免疫技术得到了国内外学者的高度关注，近年来其应用更加的广泛，其检测领域涉及临床病原菌检测、食品安全快速检测、大分子蛋白检测等。1.1.1时间分辨免疫荧光的检测原理[1]稀土离子螯合物的荧光寿命较长(100-1000μs)，其发出的荧光称为时间分辨荧光，如果延迟一定时间（如200μs）后再行测量，可有效消除本底荧光（1-10ns）的干扰，原理如图1-1所示。此外，时间分辨荧光Stokes位移宽，螯合物的荧光发射峰狭窄，可通过波长分辨的方式进一步区别于背景荧光。而以稀土离子螯合物作为抗原或抗体的标记物，将时间分辨荧光与免疫分析技术相结合的方法称为时间分辨荧光免疫分析法（Time-resolvedfluoroimmunoassy,TRFIA），与通常的荧光免疫分析法相比，TRFIA可有效避免本底荧光的[2]干扰，大大提高TRFIA的灵敏度和准确性。Joob等曾用TRFIA实现了对B型肝炎病毒[3][4,5][6,7]抗原的免疫检测，Lv等检测了亚硝酸细菌。TRFIA已广泛应用于医学、食品检测、[8]兽药残留检测等领域经典的TRFIA为解离增强镧系元素荧光免疫分析（Dissociation-enhancedlanthanidefluorometricimmunoassay,DELFIA）和CyberFluorFIAgen时间分辨荧光免疫分析。DELFIA[9]法由芬兰Wallac生化实验室（现Perkin-ElmerLifeSciences公司）研究并开发，该方法的原理是免疫反应后加入含有β—奈酰三氟丙酮（β—NTA），三辛基氧化膦（TOPO）以及3+TritonX—100的弱酸性Wallac荧光增强液（Fluorescenceenhancementsolution,FES）使Eu3+3+从荧光复合体中解离出来，从而在增强液中形成β-NTA—Eu—TOPO复合物，将Eu荧[4,10-12]光千万倍放大。此方法现已得到广泛应用。但增强液易受到重金属离子的干扰，因此对测定环境的要求很严格，不恰当的操作易对测量造成污染。另一种是使用荧光性镧系元素配合物4,7-bis(chlorosulfophenyl)-1,10-phenanthroline-2,9-dicarboxylicacid（BCPDA）作为标记物与抗原、抗体等物质进行标记。CyberFluorFIAgen系统也是TRFIA的常用分析方法，当抗原与抗体发生免疫反应后生成固相免疫复合物。由于鳌合剂BCPDA分子本身3+3+就可以和Eu形成强荧光螯合物Eu-BCPDA，因此无需增强液可直接测量固相荧光，该[13,14][15]系统解决了液相测量带来的易污染和操作复杂问题。Johnsen等人采用FIAgen系统1 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌测定了血清中胃泌素的含量，与传统RIA相比，避免了放射性同位素保存时间不长以及辐射等缺陷，且易实现自动化。但其分析灵敏度不如DELFIA。图1-1时间分辨荧光测定的原理1.1.2时间分辨免疫荧光检测技术的新进展1.1.2.1酶放大(Enzyme-amplified)TRFIA酶放大时间分辨免疫分析法，是把酶放大与TRFIA相结合的一种超灵敏生物分析法，[17]是由Diamandis等在Bobrow等的工作基础上提出的。酶放大TRFIA的基本原理如图1-2所示，将捕捉蛋白包被于微孔板后依次加入分析物和生物素标记的检测抗体，形成了捕捉抗体-分析物-检测抗体三元复合物，再向体系中加入链霉亲和素标记的酶如碱性磷酸酶（ALP），通过碱性磷酸酶的作用将水杨酸磷酸盐转变为相应的水杨酸衍生物。常用的ALP底物为5-氟水杨酸磷酸脂（5-FSAP），ALP可将其分解为5-氟水杨酸（5-FSA），5-氟水杨3+酸与镧系元素（Tb）在碱性条件下和乙二胺四乙酸（EDTA）形成强荧光络合物直接测定[18]荧光，通过测量荧光强度可计算出待测物质的含量。由于酶放大TRFIA集中了酶放大作用、生物素-链霉亲和素的高亲和力放大作用，镧系元素stokes位移长，荧光寿命长等优[19]点，是一种超灵敏、无放射性污染、无需外加增强液的分析方法。Jiang等人基于镧系元素荧光酶放大反应，研究出一项检测强毒素的新方法，与传统流动注射及高效液相色谱方−6−8−8法相比，此方法将检测限分别从2.0×10mol/L、1.56×10mol/L提升优化至1.28×10mol/L，[20]且增加了高效液相色谱的回收率。Veiopoulou等人通过实验发现，当ALP底物为二氟尼[21]柳时，其灵敏度会高于5-FSAP。Petrovas等人将二氟尼柳作为ALP的底物，用EALL检测肿瘤坏死因子α（TNF-α），检测限达到1ng/L。除碱性磷酸酶外，葡萄糖氧化酶、黄2 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌[22]嘌呤氧化酶和β-半乳糖苷酶均已用于酶放大TRFIA，其对应的底物及检测限见表1-1，由表可知碱性磷酸酶的灵敏度最高，所以较为常用。图1-2酶放大镧系荧光体系基本原理图中1为捕捉抗体，2为样品分析物，3为检测抗体，4为水解和氧化还原酶表1-1不同酶对应的底物及检测限对比酶底物检测限碱性磷酸酶不同取代基的水杨酸磷酸盐0.2amol葡萄糖氧化酶1,10-邻二苯杂菲-2,9-二羧酸肼2fmol-6黄嘌呤氧化酶水杨醛10Uβ-半乳糖苷酶水杨-β-D-半乳糖苷90amol1.1.2.2基于荧光共振能量转移的TRFIAFRET是一种非辐射能量转移过程，是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体Donor,D）的发射光谱与另一个基团（受体Acceptor,A）的吸收光谱有效重叠，当这两个基团间的距离满足一定条件时（一般小于10nm），能量由处于激发态的供体通过[23,24]偶极-偶极相互作用以非辐射的方式传递到处于基态的受体。基于FRET的TRFIA是以长寿命的镧系元素螯合物作为供体，有机荧光团或者荧光蛋白作为受体，供体标记在抗体(antibody,Ab)，受体标记在抗原（antige,Ag），反之亦可，抗原与抗体的特异性结合使得供体和受体间的距离缩短，发生能量转移，能量供体荧光减弱，能量受体荧光增强。通过检测受体的时间分辨荧光强度可进行蛋白质和半抗原的测定。这种方法不仅可有效除背景荧光（包括散射光和生物分子的自身荧光等），而且能避免由于微粒的光漫射或内滤效应[25]带来的光学干扰以及猝灭带来的局限性。另外由于FRET，使得荧光的stokes位移比单一的镧系元素螯合物的stokes位移还要大，大大降低了激发光谱的干扰，灵敏度更高且适3 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌[26]用于复杂体系。FRET的这些特性使之被运用于核酸降解、寡核苷酸从核糖体上的开释[27]等方面，通过在核酸的不同部位标记能量供体和受体，一旦核酸结构发生变化，能量转移的效率会随之改变。在FRET体系中，荧光材料的选择至关重要。能够用于FRET体系的荧光物质可分为[28-31][32,33]3+有机染料、生物材料和无机材料等。Mathis等人以磷酸三丁酯（TBP）-Eu和别藻蓝蛋白(APC)为标记物建立的荧光共振能量转移TRFIA是目前成功的均相分析体系之一。别藻蓝蛋白，它是一个分子量为105KDa的藻胆蛋白三聚物，可以吸收600-660nm范围内的光，并释放出665nm波长的光，量子产率为68%，可有效的得到Eu螯合物荧光共振能[34]量转移产生的能量。随后，有一种新型受体被运用，这是一种与改良过的别藻蓝蛋白有相同光物理性质的有机染料，但体积比别藻蓝蛋白小100倍，可以避免由于分子间的空间[35]阻碍，使得分子反应活性受到影响，实验还表明更小的第二代受体可显著增加FRET的稳定性，从而提高灵敏度。而量子点等新型荧光探针的引入解决了有机染料荧光信号较弱、[36]荧光寿命短、稳定性差等问题，Wang等人将发绿色荧光和红色荧光的两种量子点用于免疫分析法，将发红色荧光的量子点与牛血清蛋白标记，发绿色荧光的量子点与牛血清蛋白的抗体标记，当牛血清蛋白抗原抗体的免疫复合物形成时，两个量子点之间就发生了FRET，使用竞争法可对BSA的浓度进行定量分析。利用镧系元素螯合物荧光寿命长、Stokes位移大等优点，可避免FRET供受体荧光相互干扰的问题，。共振能量转移时间分辨荧光技术首次用于催乳素两种IgG的分离，其分[37]别用镧系元素螯合物和别藻蓝蛋白标记，结果显示催乳素的最低检测限可达到0.3μg/L。[38]Enomoto等人运用此方法检测白介素-13，其检测限小于600ng/L，且与ELISA相关性达[39][40]到95.35%。Kokko等人建立了基于FRET的均相TRFIA，对甲状腺素、生物素等小分子化合物进行了定量分析。时间分辨荧光猝灭技术也是在FRET的基础上建立的，只是受体基团是荧光猝灭基团。在时间分辨荧光猝灭技术中，分析缓冲液中使用了可溶的猝灭剂分子，这种猝灭剂分子与荧光体的荧光光谱部分重叠，在反应过程中荧光体的能量转移到猝灭剂分子上，使得荧光体的荧光发生猝灭，而猝灭剂分子得到了激发，发生能量转移。这种猝灭剂分子可首先猝[41]灭未标记配体的荧光，已经结合的配体就可在猝灭机制中被保护起来。Harma等人将荧光偏振和能量转移荧光猝灭时间分辨两种方法用于雌二醇的免疫检测。荧光偏振方法中用荧光素标记雌二醇，荧光猝灭法中标记物则选用镧系元素螯合物，将时间分辨荧光与荧光猝灭法相结合。实验证明，能量转移荧光猝灭TRFIA的检测限可达到10pM，是荧光偏振的10倍，，且由于能量转移荧光猝灭TRFIA在实验中抗体和标记配体的使用量较少，故与荧光偏振法相比具有较大优势。1.1.2.3与其他技术联用1.1.2.3.1与流动注射分析技术（Flowinjectionanalysis,FIA）联用4 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌[42]流动注射分析技术是20世纪70年代由丹麦学者Ruzicka与Hansen提出的一种新型的连续流动分析技术。这种技术是把一定体积的试样溶液注入到一个流动着的，非空气间隔的试剂溶液（或水）载流中，被注入的试样溶液流入反应盘管，形成一个区域，并与载流中的试剂混合、反应，再进入到流通检测器进行测定分析及记录。由于其操作简便、高[43,44]样品处理量、灵敏度高、重现性好、易实现自动化等优点，现已广泛应用于营养学、[45-47][48,49]制药学、环境和临床分析等领域。流动注射分析技术与其他技术联用，具有很广泛的适用性，既可以实现自动化操作，又可实现在线分离检测。[50]钱昌顺将流动注射与TRFIA相结合，建立了癌胚抗原（CEA）的免疫分析方法。该法将CEA单克隆抗体稀释，置于装有琼脂糖的免疫反应柱内，经过包被封闭等过程，将抗体结合在柱中，然后将免疫反应柱放于流动注射体系中，在电脑上编辑程序后，让其自动完成时间分辨的整个过程。该方法使常规的CEA检测时间从几个小时缩减至几分钟。综合了流动注射技术和时间分辨荧光技术的优点，具有灵敏、快速、准确的特点。且使得[51]免疫试剂的加入更加灵活,便于实现自动化操作。Yan等人也将FIA与解离增强TRFIA结合用于测定癌胚抗原（CEA），取得了较为满意的结果。1.1.2.3.2与实时荧光定量PCR（real-timePCR）联用[52]1995年美国PE公司推出了实时荧光定量PCR技术，Heid等首先报道了其原理及方法。RT-PCR是将荧光能量传递技术应用于常规多聚酶链式反应仪中。通过受体发色团之间的相互作用，能量由供体转移到受体，受体荧光染料发射出荧光讯号，且此荧光讯号强度与DNA产量成正比，通过检测PCR过程的荧光讯号便可得到靶序列初始浓度。与常规PCR相比，它具有灵敏度高、重复性好、特异性强、自动化程度高等优点成为分子生物学研究中的重要工具。[53]Gueimonde等人使用镧系元素探针RT-PCR技术，进行排泄物中双歧杆菌的定量测定。荧光原位杂交技术（FISH）常用于微生物的定量分析，但此方法费时，且肉眼技术很困难，限制了其应用范围。在该实验中，将RT-PCR技术与时间分辨技术联用，建立了一种快速、精确、简便的双歧杆菌定量方法。在常规PCR体系中加入一定量的Eu-标记探针，95℃变性10min后循环40次，并在每次循环后测定体系荧光值。得出结果与FISH相关性[54]良好。Gueimonde等人还进行了人排泄物中双歧杆菌的测定实验，该结合方法与FISH相比，具有很多优势，FISH在双歧杆菌含量较低时，会出现测量结果偏高的现象。1.2纳米粒子研究进展纳米粒子是指尺寸在1-1000nm之间的超微粒子，它与块状材料相比，具有特殊的纳[55]米效应：表面效应、体积效应、量子尺寸效应等，因此它的理化特性都有显著的提高。近年来，纳米粒子的研究得到国内外学者的高度关注，其在光电、化学、生命科学等领域都具有广阔的应用前景，尤其是生物医药领域。5 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌1.2.1纳米粒子的分类1.2.1.1有机纳米粒子从纳米粒子的结构和组成来看，可以把纳米粒子分为有机纳米粒子、无机纳米粒子和[56]有机/无机杂化纳米粒子。其中有机纳米粒子中又可以分为：碳纳米粒子、聚合物纳米粒子以及有机复合纳米粒子。碳纳米粒子是有机纳米粒子中组成最简单的纳米粒子，其制备原料是最常见的炭黑，目前对碳纳米粒子的研究更专注于其功能化的研究，提高生物应用[57]能力。聚合物纳米粒子一般是聚合物交联形成的一种可以包裹活性物质的纳米粒子，它[58]能与周围介质隔离，因此它具有很好的贮藏性和相容性。而有机复合纳米粒子结合了碳纳米粒子和聚合物纳米粒子各自的优点，因而受到了越来越多科研工作者的关注，根据其[59,60]组成结构的不同可以分为两类：多元聚合物纳米粒子和碳/聚合物复合纳米粒子。1.2.1.2无机纳米粒子根据无机纳米粒子的组成元素不同可以分为两大类别：单质金属纳米粒子和无机复合纳米粒子。单质金属纳米粒子常见的使用元素有金、银、镍等贵金属，它具有良好的导电[61,62]性和生物相容性，因此受到了广大学者的关注。无机复合纳米粒子相比与单质金属纳米粒子，组成更加的复杂，种类也更多包括金属合金纳米粒子、无机金属化合物纳米粒子（如金属硫化物纳米粒子、金属氧化物纳米粒子等）等，它的特性包括无毒性、良好的生物相容性及稳定性，但其在使用中存在一些不足，如温度变化系数小等。因此，近年来无[55]机复合纳米粒子的研究向多元化的方向发展。1.2.1.3有机/无机杂化纳米粒子有机/无机杂化纳米粒子是指将其组成成分中的有机组分和无机组分在合成时复合，其中有机组分作为粒子载体，保证纳米粒子在理化性质上的稳定性。无机组分则赋予纳米粒子多元化的优势，因此可以开发出具有特殊功能、多元化的复合材料。常见的有机/无机杂[63]化纳米粒子一般都是具有核壳结构，因此其在合成时要分步进行。1.2.2纳米粒子的合成纳米粒子应用广泛，对人类生活的各个领域都有影响，纳米粒子的合成方法也是多种多样，一般可以分为三大类：一是化学合成法，如液相化学还原法、化学、光化学反应反向胶束法等；二是物理合成法，如热分解法、辐射辅助法、电化学法、微波辅助法；三是[64]绿色化学或生物合成路线法，如利用植物、细菌真菌合成。化学合成法是目前比较常用的纳米粒子合成法。超顺磁性氧化铁纳米粒子由于具有良[65]好的生物相容性、超顺磁性、低毒性等特点，是目前最具有应用前景的纳米粒子。其合成方法包括物理方法、化学方法和生物方法。化学方法较其它两种方法在一定程度上能有效控制粒子尺寸、形状、结晶度和磁学特性等特性，所以常被用来合成超顺磁性氧化铁纳6 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌米粒子。特别是其中的沉淀法、水热法、微乳液法、高温分解法和溶胶-凝胶法应用最为广[66]泛。物理合成法也是较为常用的纳米粒子合成法。金纳米粒子是一种单质金属无机纳米粒子，是黄金的纳米级颗粒，呈黑色。其常用的合成方法包括微波合成法、电化学法和光化学合成法等。微波合成法是指通过热效应制备纳米粒子的方法，该方法反应快速，纯度高，[67]粒径分布窄，但是粒子不够均匀，会出现三角形、棒形的纳米粒子。覃爱苗等人利用微波高压合成法，以聚丙乙烯作为还原剂，制备了不同粒径的金纳米粒子，在该方法中，表面活性剂的浓度对粒子形态的影响较为明显。生物合成法是指利用有生命的生物体，如细菌、放线菌、真菌和高等植物等，在适宜的条件下合成无机纳米粒子的方法。和物理、化学合成方法相比，生物合成法是一种清洁无污染的绿色合成法，且合成的粒子具有稳定性高、生物相容性好、产率高，成本低等优[68]点。1.2.3纳米粒子的生物应用近年来，纳米粒子的生物应用受到了越来越多国内外学者的关注。由于纳米粒子具有特殊的纳米效应：比表面积大、表面活性高等特点，其在生物医药领域、生物标记、免疫[69,70]检测、生物传感器等方面都有广泛的应用。首先，纳米粒子可以作为刺激响应感应器：当纳米粒子中结合具有环境刺激响应性的基团或者化合物时（如pH敏感或者温度敏感型感应器），该粒子可用作刺激响应型感应器。[71]Chah等制备了表面结合了细胞色素的金纳米粒子，该粒子在低pH环境时，细胞色素会展开，高pH环境时，细胞色素会折叠起来。通过分子构象的改变导致纳米粒子颜色的变化。其次，纳米粒子可以用于生物细胞的定位和分离。近年来，多功能化磁性纳米粒子应用于生物细胞分离的报道有很多。粒子可以借助功能基团与特定生物细胞相互作用以达到对靶细胞的特异吸附，然后通过外加磁场实现对纳米粒子的选择性分离，这一技术常用于[72]对癌细胞的靶向治疗。纳米粒子还常用于生物特异性标记。纳米粒子与生物体内的DNA、酶等生物大分子结[73]合后将产生特异性的响应，从而实现对该生物大分子的标记、识别与定位。Wang等制备了一种新型的核壳结构的有机纳米粒子：蒽/聚丙烯酰胺有机纳米粒子。该粒子能够对水体中的铬元素进行定量的分析，并且不需要对水样品进行铬的分离。此外，纳米粒子还可被用于药物或者基因的载体，实现对人体局部的定向治疗，如前[74,75]列腺癌细胞的靶向治疗。1.3纳米粒子在TRFIA中的应用纳米技术一般是指在纳米尺度范围内按照自己的意志直接操纵原子核分子或原子团7 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌和分子团，进行材料加工以及创制具有特定功能的产品。生物界有许多分子是纳米级的，如DNA链的直径为1.8nm，蛋白质为1-20nm等。由于纳米粒子比大多数器官小，这就为生物学提供了新的研究领域。将纳米粒子和生物技术[76]相结合的纳米生物技术不仅对探索生命本质具有重大科学意义，而且具有重要应用价值。[77-79]现已广泛应用于生物标记、检测或生物传感器等方面。[80][81]目前纳米生物技术研究的热点有药物纳米载体、分子马达和纳米生物机器人以及[82]纳米荧光标记物等，传统的荧光探针是有机染料，由于激发光谱和荧光特征谱的限制，使得不同探针分子荧光的区分较困难。将纳米粒子作为荧光标记物能较好解决这些问题。将纳米颗粒与TRFIA相结合，建立了一种高灵敏的检测方法，其基本原理（如图1-2）是将镧系元素螯合物包埋入纳米颗粒，并在其表面包裹上生物分子，再与捕捉蛋白和分析物形成三元复合体，最后加入增强液来检测荧光强度。这种方法结合了纳米粒子、镧系元素的优点，可使更多的发光分子连接在生物上起到信号放大作用，还可克服外界环境对镧系元素的影响，增加了反应的灵敏度。包裹了镧系元素的聚苯乙烯纳米粒子已在特异性抗原实验中得到应用，该法与传统的[83][83-89]Eu标记的链霉亲和素相比灵敏度提高了100倍。Harma等人用这种纳米粒子通过不同方式来测定前列腺特异性抗原（PSA）的浓度，实验在包被了抗-PSA的微孔板上进行，再向体系中加入生物素化的PSA，孵育洗板后再加入包裹了链霉亲和素的纳米粒子，随后该实验方法还用于检测血清中的PSA含量，均取得了较满意的结果。标记了纳米微粒的lgG[90][91]也被用于检测疱疹病毒，B型肝炎病毒（HBsAg）和乙型肝炎病毒表面抗原。近来，掺杂了Eu和Sm的二氧化硅纳米粒子被用于人和鼠的双镧系元素免疫分析，为纳米时间分[92]辨免疫提供了新的发展方向。这种二氧化硅粒子与基于乳胶的纳米粒子相比有很多优势，[93]包括提高水的溶解度和化学耦合程度。[94]Tang等人将铕纳米技术用于炭疽病毒保护性抗原（PA）的检测。该实验将单克隆抗-PA抗体包被于微孔板，用于捕捉样品中的炭疽PA。PA蛋白与兔抗PA抗体和生物素化+的羊抗兔抗体形成三明治结构。被链霉亲和素（SA）修饰的Eu金纳米颗粒识别并结合到+这个生物素化的抗原-抗体复合物上。加入生物素化的抗SA-抗体和Eu标记的链霉亲和素分子可以提高结合物的信号强度。这一方法与ELISA相比，灵敏度提高了100倍。在对样品的检测中，此方法与ELISA的检测灵敏度分别为100%（11/11样品）以及36.4%（4/11[95]样品）。Du等人也将金纳米颗粒用于双酚A的检测，结果显示，该方法的检测限比已报道的方法降低了4个数量级，说明在双酚A的检测方面具有高灵敏度的特点。[96]Jaakohuhta等人使用时间分辨荧光技术，乳胶颗粒作为示踪剂，建立了李斯特菌属的免疫检测方法。该实验将被生物素化的抗李斯特菌鞭毛特异性单克隆抗体包被于联合亲霉素处理过的微孔板中，其后加入完整细菌细胞样品盒纳米微粒，纳米粒子与鞭毛接触形成链状。再经过热休克处理使细胞破裂，鞭毛断裂为各个小片段，在微孔板中形成抗体-鞭毛-纳米微粒的三明治结构。实验将灵敏度提升至20CFU/mL。这项技术可缩短检测李斯8 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌特菌属的时间，还可用于其他细菌的检测。图1-3基于纳米粒子的时间分辨荧光图中1为包含Eu离子的纳米粒子，2为检测抗体，3为样品分析物，4为捕捉抗体将纳米粒子引入均相体系，形成了均相纳米检测体系。包含了大量Eu螯合物的纳米粒子与传统镧系元素标记物相比有很高的比活度，如果将这种纳米粒子用于均相体系作为[97]能量供体，大量Eu螯合物结合到纳米粒子上，将轮流激发能量受体。Kokko等人将均相纳米技术用于雌二醇的免疫分析，该实验将17β-雌二醇特异重组抗体Fab包被在92nmEu螯合物染色纳米粒子上，作为能量供体，雌二醇与近红外的染料AlexaFluor680结合作为能量受体，实验证明该方法特异性和灵敏度都很好，且易实现自动化，也可用于其他小分[98]子的快速检测。随后，Kokko等人还通过实验验证了在聚苯乙烯的疏水性保护下，纳米Eu螯合物与单独的Eu螯合物相比，在对抗混合物干扰方面是否有更好的耐受性，除此之外，还检测了在生物亲和性反应实验中，金属离子的存在对荧光能量转移是否会产生影响，实验证明纳米Eu螯合物的耐受性更好，金属离子和不同的pH对标记荧光均无影响。之后，该实验团队还分别把可溶性Eu螯合物和包含Eu螯合物的聚苯乙烯纳米颗粒作为能量供体[99]进行实验，结果表明引入纳米颗粒的方法其检测限是普通可溶性Eu螯合物的20倍左右。1.4水产养殖致病菌检测方法的研究现状近年来，我国水产养殖业迅速发展，规模、产量均列于世界前列。然而，由于不当的管理方式以及高密度养殖的模式，使得水产养殖常遭受细菌、病毒以及寄生虫等多种感染，细菌影响尤其严重。因此，建立快速、灵敏准确的致病菌检测方法，成为国内外学者关注并探究的热点。目前，对于水产致病菌检测的方法主要包括两大类：一类是传统的诊断方法：首先观察分析患病鱼的症状、组织病理等，然后对致病菌进行分离和鉴定，传统的细9 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌菌鉴定方法即生理生化试验耗时长，工作量很大，对于水产养殖的疾病防控带来很大的困难。另一类是新型的分析方法：包括基于免疫分析的检测方法和分子生物学等检测方法。1.4.1免疫分析检测方法最常见的免疫分析检测法有酶联免疫分析法，免疫印迹技术，荧光抗体技术等。酶联免疫分析法是一种以酶作为标记物的免疫分析技术，通过抗原-抗体的特异性反应形成反应复合物，最后通过免疫复合物上酶的催化作用使催化底物发生显色反应，从而进[100]行定性、定量的技术。王斌等人利用间接ELISA法检测出血性败血症大菱鲆中的迟钝5爱德华氏菌，经优化得最低检测限为2×10个/mL，并对19尾人工感染了败血症的大菱鲆[101]进行检测，阳性检出率为89.5%，且与其他标准菌株的交叉反应均为阴性。池信才等人采用双抗夹心ELISA技术，对大黄鱼的病原菌副溶血弧菌进行了检测，最终得出此方法最4低检测限为5×10个/mL，且14尾患病大黄鱼中有11尾检测出副溶血弧菌，在10尾健康大黄鱼中未检测出致病菌，说明该实验特异性良好。ELISA技术检测成本低、分析容量大[102,103][104]等优点，使之广泛应用于环境检测和医学等领域。免疫印迹技术是在酶联免疫分析技术的基础上发展起来的免疫检测技术，原理是利用硝酸纤维素膜作为病原菌的抗体的固相载体，然后将待测样品滴在膜上孵育，最后加入酶标二抗进行显色反应，如膜上有黑色印迹出现，则表明为阳性。荧光抗体免疫分析法将荧光素与抗体结合形成的荧光抗体作为检测抗体，通过抗原抗体的特异性反应形成反应复合物，反应复合物在一定的波长下会产生荧光，最后通过荧光[105]值达到对被检测物质定性定量分析的目的。白雪梅等人以感染病原菌的林蛙的组织脏器[106]作为抗原,用自备的抗体建立了间接荧光抗体试验方法并对试验条件进行了优化。樊景凤等人也建立了凡纳滨对虾红体病病原-副溶血弧菌的间接免疫荧光抗体检测方法，确定了荧光抗体最适工作浓度，该方法具有高特异性，能够适用于现场应用。1.4.2分子生物学快速检测方法水产致病菌的检测方法也可以利用分子生物学的手段。如利用PCR技术扩增病原菌的16SrRNA，由于该分子具有保守性，在进化过程中改变很少，因此常用于生物体的分类指[107]标。沈锦玉等对中华鳖白底板病病原进行分析，通过传统的鉴定与分子生物学鉴定方法，得出中华鳖白底板病是由病毒和嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌混合感染引起。另外，也可以利用核酸杂交技术用于细菌的检测，该方法不仅能够鉴定病原菌，还能够直接检出患病鱼中病原菌。1.4.3时间分辨荧光免疫检测水产致病菌水产致病菌的传统检测方法耗时耗力，工作量大。而新型的免疫检测技术如酶联免疫分析技术等均存在背景荧光较高，灵敏度较低的特点，时间分辨免疫荧光检测技术是一种[109]高效、高灵敏度的检测方法。本实验室顾宏杰已成功建立了应用于鳗鲡致病菌的时间分10 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌辨荧光免疫检测技术，目前该技术在水产致病菌检测的应用很少，但是其具有高特异性、高灵敏性的特点，将来在水产致病菌的检测领域将有良好的发展前景。1.5本研究的意义、内容和技术路线1.5.1研究意义我国为世界水产大国，也是世界上唯一水产养殖产量高于捕捞产量的国家，然而随着集约化、高密度养殖模式的发展，水产养殖业遭受着各种疾病暴发的困扰，严重影响了水产养殖业的发展。其中水生生物病原菌是各种疾病暴发的主要原因,每年给水产养殖业造成重大的经济损失。因此建立灵敏、特异、快速的病原菌检测技术，对水产养殖病害防治能起到积极的指导作用。时间分辨荧光免疫检测法（Time-resolvedFluoroimmunoassay，TRFIA）是在免疫荧光分析的基础上发展起来的一种新型免疫分析技术。TRFIA技术是以镧系元素螯合物为标记物，同时利用波长分辨和时间分辨两个测量技术测量荧光，有效排除非特异荧光，对待测物质进行定量分析。它除具有标记物制备简便、对被标记物的生物活性和结构无影响、储存时间长、无放射性污染和检测重复性好等优点外，还具有可实现多种标记及多元测试、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点。纳米粒子由于比表面积大，对周围环境敏感、表面活性高等特点，在生物标记、检测[77-79]或生物传感器等方面已有广泛应用。荧光纳米粒子是指荧光分子通过其它材料的包裹或连接形成几百个甚至上千个发光粒子构成的纳米粒子。这种包裹作用一方面能使更多的荧光分子连接在生物分子上起到信号放大作用，另一方面可克服外界环境对荧光试剂的影响（如猝灭作用等），增加荧光试剂的稳定性。相对于传统的单个荧光分子标记物，用多个发光分子组成的纳米颗粒作标记物是一种―集成‖的先进方法，这种方法与现有标记有关的方法相结合可能会使所有的分析方法的灵敏度得到提升，已成为目前标记物的主要发展方向之一。结合TRFIA的优点，我们若将其用于水生动物病原菌全菌体检测，则这种基于纳米粒子的TRFIA新技术不仅具有一般免疫法简便、特异的优点，而且克服了酶标记物的不稳定、化学发光易受环境干扰、电化学发光的非直接标记等缺点。这种高灵敏的检测方法不仅对于水产养殖病害的早期防治，维护水生生物生态平衡意义重大，更为重要的是为病原菌检测提供了新的思路，有望成为继荧光抗体法、酶联免疫吸附法之后的适用于水生生物病原菌检测的常规方法。11 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌1.5.2技术路线图1-4技术路线1.5.3研究内容1）建立直接纳米粒子TRFIA检测嗜水气单胞菌B15，将菌体抗原直接包被在聚苯乙烯微孔板上，纳米粒子标记嗜水气单胞菌抗体作为反应用抗体，通过单因素分析与正交试验相结合的方法对菌体包被时间、菌体包被温度以及纳米粒子抗体浓度进行优化。用优化后的方法对嗜水气单胞菌进行检测，并绘制标准曲线。通过同一微孔板与不同微孔板间的反应、与其他细菌交叉反应、人工感染鳗鲡组织样品，对实验的重复性、特异性以及使用性进行深入研究。2）为进一步提高包被效率，提高检测灵敏度，采用嗜水气单胞菌抗体包被微孔板的方法，建立了双抗夹心纳米粒子TRFIA检测嗜水气单胞菌B15。通过单因素分析与正交试验相结合的方法对抗体包被浓度、抗体包被时间、细菌与纳米粒子抗体免疫时间以及纳米粒子抗体浓度进行优化。通过建立的最优实验条件，得出反应灵敏度，并绘制标准曲线，并且对其进行特异性、重复性以及实用性的研究。3）为增强抗体与纳米粒子之间的结合力，特引入生物素-链霉亲和素系统，建立BA-纳米粒子TRFIA。该方法使用包裹了链霉亲和素的荧光纳米粒子，并将生物素与嗜水气单胞菌抗体相标记，利用生物素-链霉亲和素之间的高亲和力，使抗体与纳米粒子相结合。该实验通过单因素分析与正交试验相结合的方法对生物素标记抗体、标记抗体与BA-纳米粒子免疫时间以及BA-纳米粒子抗体浓度进行优化，利用最优的实验条件，得出反应灵敏度，并绘制标准曲线，并且对其进行特异性、重复性以及实用性的研究。12 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌第2章直接纳米粒子TRFIA检测嗜水气单胞菌B15由于TRFIA具有灵敏度高、特异性好等特点，已广泛应用于医学、食品检测等方面。本实验室已成功建立双抗夹心TRFIA检测产酸克雷伯氏菌B12以及直接双标记TRFIA直接法检测产酸克雷伯氏菌B12等检测体系，不仅为水产疾病的早期诊断起到积极作用，还扩大了TRFIA的应用范围。为进一步对TRFIA做更深入的研究，特引入纳米生物技术。纳米粒子具有特殊的纳米效应：比表面积大、表面活性高等特点，其在生物医药领域、生物标记、免疫检测、生物传感器等方面都有广泛的应用，将纳米粒子与TRFIA相结合，既具有镧系元素的特点，又可使更多的发光分子连接在生物上起到信号放大作用，包裹了镧系元素的聚苯乙烯纳米粒子已在特异性抗原实验中得到应用，该法与传统的Eu标记的链霉亲和素相比灵敏度提高了100倍。而TRFIA与纳米粒子相结合技术，在水产致病菌的检测方面鲜有报道。本研究开展了直接纳米粒子TRFIA检测嗜水气单胞菌B15，不仅证明了纳米粒子TRFIA在致病菌检测方面的可行性，还能扩大纳米粒子TRFIA的应用领域。2.1材料与方法2.1.1试剂和材料Fluoro-Max包裹镧系元素聚苯乙烯荧光微粒、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基丁二酰亚胺（sulfo-NHS）、2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES），购自ThermoscientificPierce公司；96孔微孔板：购自厦门怡佳美公司；牛血清蛋白（BSA）、β-萘甲酰三氟丙酮（β-NTA）、TOPO：购自Sigma公司；SephadexG-50，购自GEHealthcare公司；其他相关试剂均为国产分析纯。菌株B15获得于病变的日本鳗鲡；实验用鳗鲡购自福建莆田养殖场；嗜水气单胞菌B15抗体（IgG）由实验室制备，效价为1:25600，可用于免疫实验2.1.2实验仪器PerkinElmerVICTORX4多标记分析仪购自Perkins-Elmer公司产品；AKTAPurifier100蛋白纯化系统购自GEHealthcare公司；匀浆机购自德国IKA公司；Millipore超纯水系统购自MILLIPORE公司；BS124S型和TE2101L型电子分析天平购自Sartorius公司；电热恒温培养箱购自上海精宏实验设备有限公司；移液器全套购自RAININ公司；超声波破碎仪购自SONICS公司；低温超速离心机购自Thermo公司；-80℃超低温冰箱购自Thermo公司；pH计购自OHAUS公司；微型振荡器MH-1型购自其林贝尔公司。2.1.3主要试剂配制2.1.3.1纳米粒子标记1）EDAC溶液（0.1mol/L）：13 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌用量EDAC0.192gMilli-QH2O10ml2）Sulfo-NHS溶液（0.05mg/ml）用量Sulfo-NHS0.15gMilli-QH2O3ml3）MES缓冲液（PH6.0，0.5mol/ml）用量MES5.3gNaCl7.3125gNaOH调PH值至6.0Milli-QH2O定容至50ml4）粒子封闭液用量甘氨酸0.4gBSA0.2gMES10ml(注意：上述试剂均需恢复至室温才可进行称量，MES缓冲液需经0.22μm的微孔滤膜的抽滤。)2.1.3.2抗体纯化1）PBS缓冲液（pH7.4，0.02mol/L）：用量NaH2PO4·2H2O0.2964gNa2HPO4·12H2O2.9009gNaCl4.25gddH2O定容至500mL2）柠檬酸缓冲液（pH3.0，0.1mol/L）：用量柠檬酸·H2O9.7715g柠檬酸三钠·2H2O1.0294gddH2O定容至500mL14 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌3）Tris-HCL缓冲液（pH9.0，1mol/L）：用量Tris-base6.05gddH2O40mL浓盐酸调pH至9.0ddH2O50mL4）20%乙醇：用量无水乙醇20mLddH2O80mL注意：以上所配制的溶液都要经过0.45μm的微孔滤膜的过滤。5）透析液：用量EDTA·2Na0.1866gNaHCO310gNaOH调PH至8.0ddH2O500ml6)EDTA溶液（PH8.0，0.0001mol/L）用量EDTA0.146gNaOH调PH至8.0ddH2O500ml2.1.3.3ELISA1）PBS缓冲液（pH7.4，0.02mol/L）：用量NaH2PO4·2H2O0.2964gNa2HPO4·12H2O2.9009gNaCl4.25gddH2O定容至500mL2）碳酸盐包被液（pH9.6，0.05mol/L）：用量Na2CO30.745gNaHCO31.465g15 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌NaN30.1gddH2O定容至500mL3）封闭液（1%BSA）：用量BSA1g磷酸盐缓冲液定容至100mL4）洗涤液：用量Tween-200.5mL磷酸盐缓冲液定容至100mL5）底物溶液：A液（0.1mol/L柠檬酸溶液）：用量柠檬酸906gddH2O定容至500mLB液（0.2mol/LNa2HPO4溶液）：用量Na2HPO435.85gddH2O定容至500mL临用前用量A液4.86mLB液5.14mLOPD4mg30%H2O25μL6）终止液（2mol/LH2SO4）：用量H2SO410mLddH2O定容至90mL2.1.3.4TRFIA1）碳酸盐包被液（pH9.6，0.05mol/L）：用量Na2CO30.745gNaHCO31.465g16 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌NaN30.1gMilli-QH2O定容至500mL2）磷酸盐缓冲液（pH7.4，0.05mol/L）：用量NaH2PO4·2H2O0.2964gNa2HPO4·12H2O2.9009gNaCl4.25gNaN30.1gMilli-QH2O定容至500mL3）封闭液（1%BSA）：用量BSA1g磷酸盐缓冲液定容至100mL4）洗涤缓冲液：用量Tris-base6.057gTween-202mLNaN30.5gNaCl9gMilli-QH2O800mL浓盐酸调pH值到7.8Milli-QH2O定容至1L5）增强液：用量TritonX-1001mLTOPO19.33mgβ-NTA3.99mg邻苯二甲酸氢钾1.3g冰醋酸6mLMilli-QH2O定容至1L6）分析缓冲液：用量Tween-201mLTris-base6.057gNaCl9g17 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌BSA2gDTPA0.0196gNaN30.5gMilli-QH2O800mL浓盐酸调pH值到7.8Milli-QH2O定容至1L2.1.3.5SDS-PAGE1）4×分离胶缓冲液：用量Tris-base90.85gddH2O400mLSDS(10%)20mLHCl调至pH8.8ddH2O定容至500mL用0.45μm滤膜过滤溶液，4℃储存。2）4×压缩胶缓冲液：用量SDS(10%)4mLTris-base6.06gddH2O400mLHCl调至pH8.8ddH2O定容至500mL3）2×上样缓冲液：用量SDS(10%)4mLTris-base6.06gddH2O400mLHCl调至pH8.8ddH2O定容至500mL4）单体储存液：用量丙烯酰胺150gN,N’-甲叉双丙烯酰胺4g18 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌ddH2O定容500mL用0.45μm滤膜过滤溶液，4℃避光储存。5）10%（w/v）SDS溶液：用量SDS5gddH2O50mL6）10×SDS凝胶电泳缓冲液：用量Tris-base60.6g甘氨酸288.2gSDS20gddH2O定容至2L7）1×SDS凝胶电泳缓冲液：用量10×SDS凝胶电泳缓冲液50mLddH2O450mL8）10%（w/v）APS溶液：用量APS0.2gddH2O2.0mL震荡混匀溶解，避光放置，使用前配制。9）固定液用量95%乙醇21mL100%乙酸5mLddH2O定容至50mL10）G250染色液配制（500mL）：1）50mLddH2O加入58.8mLH3PO4(85%)；2）加入50g粉末状（NH4)2SO4，充分溶解；3）加入0.6gCBBG-250长时间搅拌尽量溶解；4）加水到400mL，搅拌；5）加入100mL甲醇；6）无需过滤，室温保存在棕色瓶中。19 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌2.2试验方法2.2.1抗体IgG纯化2.2.1.1蛋白亲和层析法1）将1mLpH7.4，0.02mol/LPBS缓冲液与1mL血清混匀后，经0.45μm过滤膜过滤后置于冰上待用；2）分别在10个离心管中加入200μL的Tris-HCl缓冲液；3）用10mL注射器吸取10mL超纯水清洗层析柱；4）柱平衡：加入10mLpH7.4，0.02mol/LPBS缓冲液平衡2min；5）用注射器将样品加入层析柱中，静置5min；6）取pH7.4，0.02mol/LPBS缓冲液10mL，洗脱层析柱中在杂蛋白，并收集于50mL离心管中；7）取pH3.0，0.1mol/L柠檬酸缓冲液10mL，缓慢洗脱IgG，将洗脱物每管1mL分别收集于10个离心管中；8）用10mL超纯水冲洗柱子后，再用20%乙醇溶液封存柱子；2.2.1.2透析袋的预处理1）将透析袋剪成适当长度（10-20cm）小段；2）将透析袋置于500mL透析液中煮沸10min；3）用超纯水彻底清洗透析袋；4）将透析袋置于500mL的EDTA溶液中煮沸10min；5）将透析袋置于超纯水中清洗干净。2.2.1.3蛋白透析1）用微量蛋白测定仪测定蛋白亲和层析中洗脱液的OD595值，将OD595值较大的洗脱液合并；2）用夹子将透析袋一端夹紧；3）检漏：从透析袋另一端装超纯水，手指稍加压，检查是否漏水；4）把水倒出，将所得洗脱液溶液加入透析袋中；5）两端夹紧后，置于1L透析液中透析24h，12h时换透析液一次。2.2.1.4纯度鉴定1）将制胶仪器安装好，检测是否漏水，按照表2.1先制备12.5%的分离胶，待分离胶凝固后制备3%的压缩胶；20 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌表2.1SDS-PAGE分离胶和压缩胶制备12.5%分离胶体积3%压缩胶体积单体储存液2.44mL单体储存液0.3mL4×分离胶缓冲液1.50mL4×压缩胶缓冲液0.5mLTEMED7μLTEMED5μL双蒸水2.06mL双蒸水1.2mL10%APS32μL10%APS18μL2）蛋白样品与2×上样缓冲液等体积混合，Marker与混合液均95℃变性5min，每孔上样蛋白量10μg，上样体积10L；3）电泳程序：8mA，30min；18mA，1h，直至溴酚蓝指示剂到凝胶底部时即停止电泳；4）电泳结束后，拆除装置，每块胶加入50mL固定液，固定2h；6）用双蒸水漂洗4次，每次15min；7）每块胶加入50mLG250染色液，染色30min-2h；8）用双蒸水脱色直至凝胶背景清楚。2.2.1.4效价测定71）用碳酸盐包被液将菌液稀释至1×10cfu/mL，每孔100μL加入透明的96微孔板中，60℃包被12h；2）用PBST洗涤液洗涤三次，每次3min；3）每孔加入200μL1%BSA封闭液，37℃孵育2h；4）洗涤液洗涤三次，每次3min；5）将血清按1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600的稀释度稀释，每孔100μL加入微孔板中，37℃震荡孵育1h；6）洗涤液洗涤3次，每次3min；7）将辣根过氧化物酶标记的二抗用PBS按1:2000的稀释度稀释，每孔加入100μL，37℃震荡孵育1h；8）洗涤液洗涤3次，每次3min；9）将配置好的A液、B液按1:1混匀后，100μL每孔加入板中，37℃避光反应15min；10）每孔加入50μL2mol/L硫酸终止液终止显色，于450nm波长处检测OD450值。2.2.2纳米粒子标记抗体1）向离心管中加入20μL纳米粒子和180μL0.05mol/LMES缓冲液，并混合均匀；2）加入4μLEDAC溶液后，迅速加入10μLSulfo-NHS溶液，混匀室温反应15min；3）加入0.28μL巯基乙醇，室温反应10min；21 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌4）将离心管置于冷冻离心机中，4℃，15000rpm离心35min；5）弃上清液，加入200μL0.05mol/LMES缓冲液；6）加入200μL0.1MpH7.5的PBS缓冲液溶解的IgG抗体；7）室温反应2h，离心后，收集上清液并测其OD595；8）加入粒子封闭液200μL，反应过夜。9）离心去上清，加入200μL碱性-SDS室温温和孵育30min；10）15000rpm离心30min，移去上清；11）用200μL碱性-SDS超声波清洗粒子，离心后去上清，重复三次；12）加入200μL0.05mol/LMES缓冲液，制成纳米粒子-IgG溶液，保存于4℃冰箱。2.2.3纳米粒子与抗体标记效率计算纳米粒子与抗体标记效率体现了纳米粒子与抗体的结合程度。首先在595nm处测定原始蛋白浓度的吸光度值OD前，然后测定2.2.2步骤7中的上清液吸光度值OD后，通过下列出的公式（2-1）求出纳米粒子与抗体标记效率。OD前−OD后标记比=OD前×100%公式（2-1）2.2.4直接纳米粒子TRFIA的建立1）用碳酸盐包被液（pH9.6，0.05mol/L）梯度稀释嗜水气单胞菌B15，每孔100μL加入到96孔微孔板中，工作温度下包被一段时间；2）洗涤液洗涤3次，每次3min；3）每孔加入200μL的1%BSA，37℃封闭2h；4）洗涤液洗涤3次，每次3min；5）加入工作浓度的纳米粒子-IgG溶液100μL，37℃振动孵育1h；6）洗涤液洗涤6次，每次3min；7）每孔加入200μL增强液，室温振荡后，多标记分析仪上测量TRF。测量参数设置：激发波长为340nm，发射波长为615nm，延迟时间0.4ms，测量时间0.4ms。2.2.5试验最佳条件的确定2.2.5.1单因素优化实验条件1）嗜水气单胞菌B15包被时间的确定固定细菌包被温度和纳米粒子-IgG浓度，包被时间分别设为6h、12h、18h、24h、48h，每个时间段3孔平行，对照组细菌用分析缓冲液代替。用建立的直接纳米粒子TRFIA对嗜水气单胞菌B15进行测定。22 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌2）嗜水气单胞菌B15包被温度的确定7固定细菌抗原浓度为1×10cfu/mL，包被时间固定为12h，纳米粒子-IgG浓度固定，包被温度分别设为28℃、37℃、45℃、55℃、65℃，每个温度3孔平行，细菌抗原和纳米粒子-IgG每孔均为100μL，对照组用碳酸盐缓冲液代替，用建立的直接纳米粒子TRFIA对嗜水气单胞菌B15进行测定。3）纳米粒子-IgG浓度的测定固定细菌抗原的包被浓度和包被时间，纳米粒子-IgG浓度分别稀释为1:1000、1:2000、1:4000、1：6000、1:8000、1:10000。对照组用碳酸盐包被液代替细菌抗原进行包被。用建立的直接纳米粒子TRFIA对嗜水气单胞菌B15进行测定。2.2.7.2正交试验设计根据单因素优化的结果，选定嗜水气单胞菌B15的包被温度、包被时间和纳米粒子-IgG浓度的实验范围，设计三因素四水平的正交试验表，由于试验次数的限制，在实验中选择五因素四水平正交表进行试验，如表2.2和表2.3。5表2.2L16(4)正交试验因素表水平纳米粒子浓度（A）包被温度（B）包被时间（C）11:200040821:3000451231:4000501641:500055185表2.3L16(4)正交实验组合表组合纳米粒子浓度（A）包被温度（B）包被时间（C）111121223133414452126221723482439313103241133123 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌5续表2.3L16(4)正交实验组合表组合纳米粒子浓度（A）包被温度（B）包被时间（C）1234213414144231543216441以实验组TRF值与对照组TRF值（即P/N值）作为因变量，各因素水平作为自变量进行方差分析与极差分析。2.2.8重复性实验[106]根据文献，将板间变异系数和板内变异系数作为实验可重复性的参考指标。按照直接纳米粒子TRFIA免疫反应体系对嗜水气单胞菌进行免疫检测，随机选定同一96微孔板上的六个微孔进行平行实验，测定并记录各组荧光值，算出平均值和标准偏差，根据板内变异系数=板内标准差/平均值×100%，算出板内变异系数。又随机选定六块96微孔板，进行免疫反应，根据结果计算出平均值与标准偏差，得出板间变异系数。2.2.9特异性测定利用建立的直接纳米粒子TRFIA对10株不同的水产致病菌进行免疫测定，实验菌株7浓度均为1×10cfu/mL，细菌包被时间和包被温度采用最适条件，纳米粒子-IgG采用最适工作浓度，微孔板中每孔加入100μL菌液进行包被，同时设立重复组，阴性对照孔用100μL碳酸盐包被液代替。反应结束之后，记录各组荧光值。2.2.10灵敏度测定采用细菌包被时间、细菌包被温度和纳米粒子-IgG的最适条件，按照已经建立的免疫7反应体系进行免疫测定，嗜水气单胞菌B15用碳酸盐包被液稀释，使菌液浓度呈现1×10、65441×10、1×10、8×10、1×10cfu/mL的浓度梯度。每个浓度梯度分别设有三组平行对照，对照组的菌液用碳酸盐包被液代替，测定TRF荧光值后，将菌浓度、TRF值取对数后分别作为横坐标、纵坐标绘制标准曲线。2.2.11直接纳米粒子TRFIA的实际应用将生长发育相近的日本鳗鲡，饲养于条件适宜的条件下，待鳗鲡适应环境，生理状态8稳定时，以每尾0.2mL的量注射用0.85%生理盐水稀释至1×10cfu/mL的嗜水气单胞菌B15，对照组注射相同量的生理盐水。饲养一段时间后，将表现正常及有初期发病症状的鳗鲡作为取样对象，将其肾、鳃、肠、肝、肌肉等部位组织取出，置于-80℃冰箱备用。检测时，取各部位组织0.05g，与生理盐水混匀后，匀浆、离心取上清液；根据已建立的直接纳米24 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌粒子TRFIA进行测定，实验组设置三组平行，测定并记录TRF值。2.3试验结果2.3.1IgG的纯化及分析鉴定结果通过SephadexG-50亲和层析柱的纯化，得到经柠檬酸盐缓冲液洗脱下来的兔抗IgG以及用磷酸盐缓冲液冲洗下来的杂蛋白。图2.1为纯化IgG溶液SDS-PAGE检测结果。由图可知，在凝胶上出现了两条蛋白条带，与Marker对比可知，一条迁移较快的为25kDa的轻链；另一条迁移较慢的为55kDa的重链。这与IgG实验中会由于变性作用降解为55kDa的重链和25kDa的轻链的反应相符。并且通过与杂蛋白的对比可知，得到的蛋白纯化效果较好。图2-1兔抗血清纯化产物SDS-PAGE电泳结果M：Marker1：杂蛋白2：兔抗IgG2.3.2纳米粒子与抗体标记效率分别测出标记前和标记后溶液的OD值，并根据公式（2-2），得出纳米粒子与抗体的标记效率：0.424-0.056标记比=×100%=86.79%公式（2-2）0.4242.3.3单因素优化2.3.3.1细菌包被时间优化结果实验选取6h、12h、18h、24h、48h进行单因素实验分析，以包被时间为横坐标，P/N值即实验组TRF值与对照组TRF值的比值为纵坐标作图，从图2-2可知P/N值随着包被时间的增加先上升后下降，在12h左右出现峰值。为保证实验的精确性，在后续进行的正交试验中，水平范围定为8h-18h25 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌图2-2不同细菌包被时间下P/N值2.3.3.2细菌包被温度优化结果实验选取28℃、37℃、45℃、55℃、65℃进行单因素分析，以包被温度为横坐标，TRF值为纵坐标作图。结果如图2-3所示，由图可知，在37℃以前TRF值变化不大，但之后随着温度的升高，TRF值逐渐增加，并且在50℃左右出现最高值。固选取40-55℃作为正交试验水平选择范围。图2-3不同细菌包被时间下P/N值26 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌2.3.3.3纳米粒子-IgG浓度优化结果实验将纳米粒子-IgG浓度分别稀释为1:1000、1:2000、1:4000、1：6000、1:8000、1:10000进行单因素分析，以纳米粒子浓度为横坐标，由于纳米粒子-IgG浓度与TRF值的大小呈正相关，固以纳米粒子-IgG浓度为横坐标，P/N值为纵坐标作图。结果如图2-4所示，P/N值在1:2000-1:6000范围内较高，因此选择1:2000-1:6000作为正交试验的水平选择范围。图2-4不同纳米粒子-IgG浓度条件下P/N值2.3.4正交试验结果2.3.4.1正交试验极差分析结果如表2-4各因素组合正交试验结果所示：将P/N值作为因变量，细菌包被时间、细菌包被温度、纳米粒子-IgG浓度作为自变量进行极差分析和方差分析。结果如表2-4所示，K1、K2、K3表示各因素各个水平下所对应P/N值的和，如K1表示―1‖水平所对应的试验指标的数值之和，依此类推。k1、k2、k3则表示K1、K2、K3的平均值，值越大，表明该水平下试验结果越好，由此可以得出最优组合为A2B1C2，即在纳米粒子-IgG浓度为1:3000，包被温度为40℃，包被时间为12h时试验结果最好。自变量因素的R值为k1-k4中极大值与极小值之差，R值越大对因变量的影响就越大，由表2-4极差分析结果可得出，对P/N值影响程度依次为C>B>A，即包被时间>包被温度>纳米粒子-IgG浓度。27 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌表2-4各因素组合正交试验结果实验组纳米粒子浓度（A）包被温度（B）包被时间（C）P/N111116.18212214.7131336.47414410.43521228.81622113.9172346.61824312.71931311.03103249.12113319.281234214.251341410.52144239.071543218.38164417.38K147.7966.5446.75K262.0446.8176.15K343.60840.7439.28K445.3544.7736.68k111.94716.63511.690k215.5111.70319.038k310.92010.1859.820k411.33811.1939.170R4.596.459.868注：P/N值为三个平行组的平均值2.3.4.2正交试验方差分析结果正交试验方差分析结果如表2-5所示，表中Sig（P值）越小，表示该因素与应变量之间的关联性越大，细菌包被时间的P值=0.021<0.05，表示对P/N值有显著影响，细菌包被温度P值=0.133>0.05，纳米粒子-IgG浓度P值=0.292>0.05，对P/N值无显著影响。通过比较F值可知对于结果影响程度依次为包被时间>包被温度>纳米粒子浓度，与极差分析结果一致。28 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌表2-5正交试验方差分析结果表变异来源自由度F比P值细菌包被时间27.079.021细菌包被温度22.774.133纳米粒子-IgG浓度21.570.2922.3.5重复性实验为考量实验的重复性，采用最优条件下实验体系，考察实验的板间及板内变异系数。在同一96微孔板上随机挑选六孔进行板内标准偏差计算的结果为：1010660、1115608、1111495、1035620、1135835、1204556，平均数为1102296，标准偏差为64144；再随机挑选的六块96微孔板进行实验得到板间变异系数结果为：968994、1011545、1249880、1135479、1039867、984786，平均数为1065093，标准偏差为98563。分析数据后，得出嗜水气单胞菌的板内变异系数为5.82%，板间变异系数为9.25%。板内变异系数和板间变异系数均符[110]合小于15%的要求，说明96微孔板的吸附力稳定性好，也说明该方法能够多次反复检测。2.3.6特异性实验利用建立的直接纳米粒子TRFIA，采用菌株B15的抗体与其他日本鳗鲡病原菌菌株进行TRFIA测定，并同时进行菌株B15的测定，以实验组TRF值与对照组TRF值比值大于2，即P/N>2时判断为阳性。由表2-6可知，嗜水气单胞菌抗体与菌株B15有较强的阳性反应，与其他水产致病菌菌株无交叉反应，说明抗体特异性良好，该法可用于嗜水气单胞菌的初步检测。表2-6直接纳米粒子TRFIA特异性测定菌名称菌号P/N值结果嗜水气单胞菌A.hydrophilaB1522.95+嗜水气单胞菌A.hydrophilaB42211.88-爱德华氏菌EdwardsiellaB811.57-中间气单胞菌AeromonasmediaB42341.01-副溶血弧菌VibrioParahaemolyticusB10021.65-产酸克雷伯氏菌KlebsiellaoxytocaB121.36-杀鲑气单胞菌A.salmonicidaB57521.29-溶藻弧菌VibrioalginolyticusB10011.28-一种气单胞菌A.bivalviumB71121.21-一种气单胞菌A.aquriorumB72891.20-注：+代表阳性结果，-代表阴性结果。29 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌2.3.7敏感性测定采用建立的直接纳米粒子TRFIA，得出嗜水气单胞菌实验组（三组平行）测量结果如下：1010660、1115608、1111495，395477、385019、382812，128376、155314、138373，69389、61838、65450，阴性对照为：55274、54983、55105，空白值为：4695、4826、4733。各组数据取平均值，并减去空白值之后，以所测TRF值的对数即IgTRF为纵坐标，细菌浓度的对数值IgCFU为横坐标，绘制标准曲线，结果见图2-5，方法灵敏度依据ELISA法[111]确定，以样品孔的TRF值（P）与对照孔的TRF值（N）之比大于2（即P/N>2）时所5对应的最小浓度为最低检测限，其灵敏度为1.0×10cfu/mL。6.36.15.95.75.5IgTRF5.35.14.94.74.544.555.566.577.5IgCFU图2-5直接纳米粒子TRFIA标准曲线2.3.8直接纳米粒子TRFIA检测法的实际应用以腹腔注射嗜水气单胞菌的鳗鲡组织样品作为实验组，腹腔注射生理盐水的鳗鲡组织样品作为对照组，利用建立的直接纳米粒子TRFIA对其进行免疫测定，以实验组的TRF值与对照组的TRF值比值大于2（即P/N>2）时判断为阳性。随机选取不同鳗鲡的20个组织样品进行测定。结果见表2-6，从表中可以看出，所有20份样品均呈现阳性，阳性检出率达100%。这说明直接纳米粒子TRFIA可用于被嗜水气单胞菌感染的样品，有利于嗜水气单胞菌的早期诊断。30 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌表2-5直接纳米粒子TRFIA测定鳗鲡组织样品样品编号检测组织结果样品编号检测组织结果1肝+11肝+2鳃+12鳃+3肾+13肾+4肠+14肠+5肌+15肌+6肝+16肝+7鳃+17鳃+8肾+18肾+9肠+19肠+10肌+20肌+注：+代表阳性结果。2.4讨论嗜水气单胞菌属革兰氏阴性菌，为人畜共患病的致病菌，也是多种水产动物的致病菌[112][113]。嗜水气单胞菌可引起鱼类、蛇类等动物出血性败血症，还会导致人类的急性胃肠炎。[114][115][116]目前，该菌检测方法主要有间接ELISA、PCR技术、Dot-ELISA等，这些方法虽均有各自优势，但也存在其局限性，如ELISA法，存在酶易失活，不稳定，检测限不高等缺点；PCR虽灵敏度高，特异性强，但费用较高，且样品前处理复杂。细菌包被时间结果显示，随着包被时间的增加，P/N值先上升后下降，在12h左右出现峰值，可知包被时间过短，会影响包被的速率，而时间过长则导致溶液蒸发对包被结果造成影响，因此在包被过程中要严格控制病原菌包被时间。细菌包被温度结果显示，随着包被温度的增高，P/N值先上升后下降，在40-50℃范围内出现最大值，表明若包被温度太低，会影响反应速度，进而影响实验结果；若温度太高，则易导致包被物脱落，使得最终结果达不到理想值。不同纳米粒子-IgG浓度结果显示，随着纳米粒子-IgG浓度的升高，P/N值先上升后下降，在浓度为1:4000左右出现最大值，表明若浓度太高会导致非特异性吸附，导致阴性荧光值增大，若浓度太低，则会导致抗原与抗体结合不完全，影响最终结果。通过一系列优化实验，本实验建立的直接纳米粒子TRFIA检测嗜水气单胞菌，检测限5为1.0×10cfu/mL，高于常规ELISA，且纳米粒子的引入，可有效增加荧光效率，防止荧光物质的泄露。在确定最佳实验条件过程中，采用了正交试验法，可排除各影响因素之间的交互作用，较控制变量法更准确、有效。在抗体与纳米粒子的标记实验中，采用EDAC与sulfo-NHS相结合的两步标记法，较只是用EDAC的一步标记法来说，sulfo-NHS的加入可31 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌使中间产物更稳定，利于抗体与聚苯乙烯纳米粒子表面活化的羧基进行反应。直接纳米粒子TRFIA体系的优化结果表明，纳米粒子-IgG浓度为1:3000，细菌包被温度为40℃，细菌包被时间为12h时实验结果最好。且用该方法对20份鳗鲡样品进行检测，检出率达100%。直接纳米粒子TRFIA检测嗜水气单胞菌的阳性检出率较好，能达到初步检测的要求，但检测限未达到理想值，需进一步提高。32 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌第3章双抗夹心纳米粒子TRFIA检测嗜水气单胞菌B155在直接纳米粒子TRFIA检测嗜水气单胞菌B15中，检测灵敏度为1.0×10cfu/mL，并未达到理想值。原因可能为用细菌直接包被微孔板，会出现包被量不稳定、灵敏度不高等[117]问题，而据相关文献记载，聚苯乙烯微孔板与免疫球蛋白有较好的亲和性，若采用抗体包被，则能大大提高包被效率，减少由于包被量不稳定等问题对结果的影响。故为进一步提高检测的灵敏度，本实验使用抗体直接包被的模式，并采用正交试验的方法，对包被抗体最适工作浓度、免疫反应时间及纳米粒子-IgG的最适浓度进行了优化，建立了双抗夹心纳米粒子-TRFIA检测嗜水气单胞菌B15。3.1材料与方法3.1.1试剂与材料试剂与材料同2.1.1。3.1.2试验仪器主要试验仪器同2.1.2。3.1.3主要试剂配制主要试剂配制同2.1.3。3.2试验方法3.2.1纳米粒子标记抗体同2.2.4。3.2.2双抗夹心纳米粒子TRFIA1）用碳酸盐包被液将嗜水气单胞菌B15抗体稀释至一定浓度，每孔100μL加入96微孔板，4℃包被一段时间。2）弃去液体，洗涤液洗涤3次，每次3min，扣干。3)每孔加入200μL的1%BSA，37℃封闭2h。4）洗涤液洗涤三次，每次3min。5）用分析缓冲液将嗜水气单胞菌B15稀释到一定浓度，对照孔用分析缓冲液代替，37℃振荡1h。6）弃去液体，洗涤液洗涤3次，每次3min，扣干。7）每孔加入100μL工作浓度的纳米粒子-IgG,震荡孵育一段时间。8）弃去液体，洗涤液洗涤6次，每次3min，扣干。33 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌9）每孔加入200μL增强液，室温震荡15min。10)用多标记分析仪测量时间分辨荧光，测量的参数设置为：激发波长340nm，发射波长615nm；延迟时间定为0.4ms，测量时间为0.4ms。3.2.3实验最佳条件确定3.2.3.1单因素优化实验条件1）抗体包被浓度优化采用控制变量法，固定致病菌浓度、抗体包被时间、抗体与细菌孵育时间和纳米粒子-IgG浓度，分别用碳酸盐包被液将包被IgG稀释为1μg/mL，0.8μg/mL，0.6μg/mL，0.4μg/mL，0.2μg/mL，0.1μg/mL，每孔分别加入不同浓度的包被抗体100μL，对照孔加入碳酸盐包被液，实验组设置三组平行，记录不同浓度包被抗体免疫反应后的TRF值。2）抗体包被时间优化固定致病菌浓度、包被抗体浓度、抗体与细菌孵育时间和纳米粒子-IgG浓度，将抗体包被时间分别定为6h，8h，12h，18h，24h，用已建立的免疫反应体系进行测定，设置平行三组，测定并记录时间分辨荧光值。3）细菌与纳米粒子-IgG孵育时间优化采用控制变量法，保持致病菌浓度、包被抗体浓度、包被抗体时间和纳米粒子-IgG浓度不变，将抗体与嗜水气单胞菌病原体的孵育时间分别定为1h，2h，3h，4h，5h。用已建立的免疫反应体系进行测定，设置三组平行，测定并记录时间分辨荧光值。4）纳米粒子-IgG浓度优化除纳米粒子-IgG浓度外的其他条件均保持一致，将纳米粒子-IgG分别稀释成1:2000，1:4000，1:5000，1:8000，1:10000，用建立的免疫反应体系进行测定，绘制不同纳米粒子-IgG浓度下，P/N值得曲线图。3.2.3.2正交试验设计根据单因素优化的结果，选定嗜水气单胞菌B15抗体的包被浓度、包被时间、抗体与细菌孵育时间和纳米粒子-IgG浓度的实验范围，设计正交试验表。4表3-1L9(3)正交试验因素表水平抗体包被时间（A）抗体包被浓度（B）免疫时间（C）纳米粒子-IgG浓度(D)1100.52.51:20002120.631:40003160.73.51:600034 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌4表3-2L9(3)正交实验组合表组合抗体包被时间（A）抗体包被浓度（B）免疫时间（C）纳米粒子-IgG浓度(D)111112122231333421235223162312731328321393321表3.3为不同的九组实验组合方式，以实验组TRF值与对照组TRF值（即P/N值）作为因变量，各因素水平作为自变量进行方差分析与极差分析，并对各因素的边际值进行估计。3.2.4重复性实验板间变异系数和板内变异系数是实验精密度的重要参考指标。按照已经建立的双抗夹心纳米粒子TRFIA免疫反应体系对嗜水气单胞菌进行免疫检测，用控制变量法，固定细菌浓度、包被时间、包被温度，纳米粒子浓度，随机在同一96微孔板上的六个不同微孔间进行实验，根据最终荧光值算出平均值和标准偏差，根据板内变异系数=板内标准差/平均值×100%，算出板内变异系数，再随机在六块微孔板间进行免疫反应，测定并记录各组荧光值，计算出板间变异系数。3.2.5特异性实验利用建立的双抗夹心纳米粒子TRFIA对15株不同的水产致病菌进行免疫测定，实验7菌株浓度均为1×10cfu/mL，抗体包被浓度和包被时间采用最适条件，纳米粒子采用最适工作浓度，微孔板中每孔加入100μL抗体血清进行包被，同时设立重复组。反应结束之后，记录各组荧光值。3.2.6灵敏度测定用碳酸盐包被液将嗜水气单胞菌B15抗体血清做一系列梯度稀释，使菌液浓度呈现87654321×10、1×10、1×10、1×10、1×10、1×10、1×10cfu/mL的浓度梯度。按照已经建立的免疫反应体系进行免疫测定，每个浓度梯度分别设有三组平行对照，对照组用分析缓冲液代替，测定TRF荧光值后，将菌浓度、TRF值取对数后分别作为横坐标、纵坐标绘制标准曲线。35 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌3.2.7双抗夹心纳米粒子TRFIA的实际应用将生长发育相近的日本鳗鲡，饲养于条件适宜的条件下，待鳗鲡适应环境，生理状态8稳定时，以每尾0.2mL的量注射用0.85%生理盐水稀释至1×10cfu/mL的嗜水气单胞菌B15，对照组注射相同量的生理盐水。饲养一段时间后，将表现正常及有初期发病症状的鳗鲡作为取样对象，将其肾、鳃、肠、肝、肌肉等部位组织取出，置于-80℃冰箱备用。检测时，取各部位组织0.05g，与生理盐水混匀后，匀浆、离心取上清液；根据已建立的双抗夹心纳米粒子TRFIA进行测定，实验组设置三组平行，测定并记录TRF值。3.3结果与分析3.3.1单因素优化3.3.1.1包被抗体浓度优化由图3-1所示，随着包被抗体浓度的逐渐升高，P/N值呈现先上升后下降的趋势，并在包被抗体浓度为0.6时，P/N值达到最大值，为确定最佳的包被抗体浓度在后续的正交试验中，选取浓度0.4-0.8作为包被抗体浓度的范围。图3-1不同包被抗体浓度下的P/N值3.3.1.2抗体包被时间优化实验选取6h、8h、12h、18h、24h进行单因素实验分析，以包被时间为横坐标，P/N值为纵坐标作图，结果如图3-2所示，随着包被时间的延长，P/N值先迅速上升后逐渐下降，并且当抗体包被时间在12h左右基本保持平稳。为确定最佳的包被时间，在后续进行的正交试验中，选取8h-16h作为正交试验水平值。36 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌图3-2不同包被时间下的P/N值3.3.1.3抗体与细菌免疫时间优化实验选取1h、2h、3h、4h、5h进行单因素分析，以免疫时间为横坐标，P/N值为纵坐标作图，结果如图所示，4h内随着免疫时间的增加，P/N值先迅速升高后降低，并且在免疫时间为3h左右达到最大值。4h后P/N值趋于平缓，因此在正交试验中选取2.5-3.5h为试验水平范围。图3-3不同免疫时间的P/N值37 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌3.3.1.4纳米粒子-IgG浓度优化结果采用控制变量法，选取1:2000，1:4000，1:5000，1:8000,1:10000进行单因素实验分析，以纳米粒子-IgG浓度为横坐标，P/N值为纵坐标作图，结果如图所示，随着纳米粒子浓度-IgG浓度的升高，P/N值急剧上升。在1：6000至1:2000浓度范围内，P/N值趋于平稳。当浓度超过1：2000后P/N值反而下降，是由于纳米粒子浓度太高使得阴性对照荧光值升高，误差增大。因此，为确定最佳的工作浓度，在后续的正交试验中，选取1:2000-1:6000为正交试验水平。图3-4不同纳米粒子-lgG浓度下的P/N值3.3.2正交试验结果3.3.2.1正交试验极差分析结果正交试验极差分析结果如表3-4所示。将P/N值作为因变量，抗体包被时间、抗体包被浓度、免疫时间、纳米粒子-IgG浓度作为自变量进行极差分析和方差分析。K1-K3为不同水平下对应P/N值的和，k1-k3分别为K1-K3的平均值，自变量因素的R值为该因素均值的极大值与极小值之差，即个水平k1-k3中极大值与极小值之差，k1-k3中的最大值表示该水平条件下的P/N值最大，水平最优，R值越大表示该因素对因变量的影响越大。由表3-4极差分析结果，可以得出最优组合为A2B1C2D2，即抗体包被时间为12h，抗体包被浓度为0.5μg/mL，免疫时间为3h，纳米粒子-IgG为1:4000时为最优。根据R值大小也可得出，对P/N值影响程度依次为A>D>C>B，即抗体包被时间>纳米粒子-IgG浓度>免疫时间>抗体包被浓度。38 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌表3-3各因素组合正交试验结果实验组抗体包被时间（A）抗体包被浓度（B）免疫时间（C）纳米粒子-IgG浓度(D)P/N1111135.572122235.323133331.754212338.315223139.926231240.427313236.478321333.109332136.45K1103.020110.529109.269112.119K2118.650108.540110.280112.410K3106.02008.621108.141103.161k134.34036.84336.42337.373k239.55036.18036.76037.470k335.34036.20736.04734.387R5.2100.6630.7133.083注：P/N值为三个平行组的平均值3.3.2.2正交试验方差分析结果极差分析的结果，可以看出，抗体包被浓度和免疫时间两个因素对实验结果的影响较小，因此在进行方差分析时，将抗体包被浓度和免疫时间当做误差项进行分析。由表3-6中P值可以看出，抗体包被时间P值=0.001<0.01，表明抗体包被浓度对P/N值有极显著的影响，纳米粒子IgG浓度P值=0.006<0.01，所以该因素对P/N值也有极显著的影响。并且方差分析的分析结果与极差分析的结果一致。表3-4方差分析结果变异来源自由度F比P值抗体包被时间259.124.001纳米粒子IgG浓度222.813.006a.R方=.976（调整R方=.952）3.3.2.3验证实验结果根据极差分析可以得出，实验最优组合为A2B1C2D2，但是该组合并未出现在所做9次39 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌实验的组合中，为了增加实验结果的准确性，将验证组加入原先的正交试验设计组中，重新利用建立的双抗夹心纳米粒子TRFIA方法测定实验的P/N值，结果如图3-5所示。由图可知，在所有10组实验中，第10组的P/N值最大，即正交试验对实验结果的优化具有一定的指导意义。因此可以确定双抗夹心纳米粒子TRFIA检测法中，最优实验条件为：抗体包被时间12h，抗体包被浓度0.5μg/mL，免疫时间3h，纳米粒子-IgG1:4000。图3-5正交试验及验证实验结果3.3.3微孔板的影响本实验考察了黑色微孔板与白色不透光微孔板对荧光测量的影响，发现在完全相同的条件下，白色不透光微孔板的读数明显高于黑色微孔板，黑色微孔板的荧光值趋近于空白。分析原因是因为黑色不透明板采用的是聚丙烯材质，白色不透光板采用的是聚苯乙烯材质，聚丙烯对蛋白质吸附力差，基本不吸附蛋白，而聚苯乙烯对蛋白质有强吸附作用，因此双抗夹心纳米粒子TRFIA体系能很好的在白色不透光微孔板上进行。因此我们采用专用的白色不透明微孔板。3.3.4重复性实验利用双抗夹心纳米粒子TRFIA检测嗜水气单胞菌板内变异系数结果如下：721850、698625、735841、688569、701540、739680，平均数为714351，标准偏差为19304；板间变异系数结果为：586565、583898、711920、656120、550148、695707，平均数为630726，标准偏差为60685。分析数据后，得出嗜水气单胞菌的板内变异系数为2.70%，板间变异系数为9.62%。板内变异系数和板间变异系数均符合小于15%的要求，说明96微孔板的吸附力稳定性好，也说明该方法能够多次反复检测。40 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌3.3.5特异性实验利用建立的双抗夹心纳米粒子TRFIA，采用菌株B15的抗体与其他病原菌菌株进行TRFIA测定，并同时进行菌株B15的测定，以实验组TRF值与对照组TRF值比值大于2，即P/N>2时判断为阳性。由表3-5可知，嗜水气单胞菌抗体与菌株B15有较强的阳性反应，与其他水产致病菌菌株无交叉反应，说明抗体特异性良好，该法可用于快速检测嗜水气单胞菌。表3-5双抗夹心纳米粒子TRFIA特异性测定菌名称菌号P/N值结果嗜水气单胞菌AeromonashydrophilaB1522.95+嗜水气单胞菌AeromonashydrophilaB551.24-嗜水气单胞菌AeromonashydrophilaB561.35-嗜水气单胞菌AeromonashydrophilaB571.65-嗜水气单胞菌AeromonashydrophilaB651.42-嗜水气单胞菌AeromonashydrophilaB661.52-鲁氏耶尔森氏菌YensiniaruckeriB041.21-维隆气单胞菌AeromonasveroniiB57611.13-兽生气单胞菌AeromonasbestiarumB42271.18-鳗鱼气单胞菌AeromonasencheleiaB43301.27-溶藻弧菌VibrioalginolyticusB10011.33-异嗜糖气单胞菌AeromonasallosaccharophilaB42201.31-中间气单胞菌AeromonasmediaB42321.25-大肠杆菌EscherichiacoliB10031.18-嗜泉气单胞菌AeromonasencrenophilaB42241.20-注：+代表阳性结果，-代表阴性结果。3.3.6敏感性实验利用建立的双抗夹心纳米粒子TRFIA，与不同浓度的致病菌进行免疫反应，不同浓度的致病菌对应不同的TRF值，TRF值随致病菌浓度的增高而增大。嗜水气单胞菌实验组（三组平行）测量结果如下：1505738、1490152、1467387,711920、695707、731951，217549、205386、199612,108972、108405、99730，51834、52255、51532，34131、33053、34215，20692、17096、20367，阴性对照为：20692、17096、20367，空白值为：4591、5565、5001。各组数据取平均值，并减去空白值之后，以所测TRF值得对数即IgTRF为纵坐标，细菌浓度的对数值IgCFU为横坐标，绘制标准曲线，结果见图3-5，以样品孔的TRF值（P）与对照孔的TRF值（N）之比大于2（即P/N>2）时所对应的最小浓度为最低检测限，其41 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌32灵敏度为1.0×10cfu/mL，线性方程为IgTRF=0.3532IgCFU+3.3142，R=0.9905。6.565.5IgTRF54.543456789IgCFU图3-6双抗夹心纳米粒子TRFIA标准曲线3.3.7鳗鲡样品检测以腹腔注射嗜水气单胞菌的鳗鲡组织样品作为实验组，腹腔注射生理盐水的鳗鲡组织样品作为对照组，利用建立的双抗夹心纳米粒子TRFIA对其进行免疫测定，以实验组的TRF值与对照组的TRF值比值大于2（即P/N>2）时判断为阳性。随机取出30个包括肝、鳃、肾、肠、肌五个组织在内的样品进行了测定，结果见图3-6（横坐标为样本数，纵坐标为P/N值），样品均呈阳性，检出率达100%。并与ELISA法进行对比（见图3-7），发现ELISA的阳性检出率较低，且最终P/N值也远小于双抗夹心纳米粒子TRFIA的结果。图3-7双抗夹心纳米粒子TRFIA检测嗜水气单胞菌42 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌图3-8ELISA检测嗜水气单胞菌3.4讨论采用正交试验法建立的直接纳米粒子TRFIA体系，是一种可靠、准确、成本低的检测方法，但其灵敏度未达到理想值，在其基础上，本实验建立了双抗夹心纳米粒子TRFIA体系，以期提高实验灵敏度。通过实验可知，与酶标板对结果会产生影响，因此本实验将不透明的黑色酶标板与白色酶标板进行比较，实验发现聚丙烯材质的黑板对免疫球蛋白的吸收效率很差，不利于固[118]相实验的进行，因此本实验选用白色不透明酶标板作为反应容器。又据文献可知，聚苯乙烯的微孔板在使用紫外照射一段时间后，吸附蛋白的能力会增强，因此，在实验进行前，用紫外照射微孔板30min。此外，本实验存在较长时间的温育过程，为了消除溶液蒸发对实验结果的影响，温育反应均在装有纱布和无菌棉的湿盒中进行。在双抗夹心纳米粒子TRFIA中，若包被IgG浓度过大，则会因蛋白分子之间的相互作用而影响载体对蛋白质的吸附，洗涤时，就会有一部分蛋白质分子被洗脱，高浓度的IgG，也会导致不必要的非特异性吸附；若浓度太低，会降低检测敏感性。在单因素实验中，发现抗体与细菌免疫时间和包被抗体浓度对P/N值有显著的影响，然而在正交试验中得出这个两个因素对P/N值影响不大，这可能是由于抗体与细菌免疫时间范围选择为2.5-3.5h，范围过窄，也说明2.5-3.5h为较优免疫时间。而包被抗体浓度也与抗体与细菌免疫时间一样，所选范围0.4-0.8mg/mL均为较优的试验条件。本实验针对大分子颗粒性的全菌体抗原，引入了具有信号放大作用的荧光纳米粒子，并对嗜水气单胞菌B15抗体的包被时间、包被温度、细菌与纳米粒子-IgG免疫时间以及纳米粒子-IgG浓度进行了优化，建立了双抗夹心纳米粒子TRFIA检测法。结果显示，检测嗜水气单胞菌B1543 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌的板内变异系数为2.7%，板间变异系数为9.62%，说明此方法可重复性好；在与其他细菌进行的交叉实验中，也未出现阳性反应，说明抗体具有较高的特异性；该法检测嗜水气单32胞菌B15的灵敏度为1×10cfu/mL，线性方程为IgTRF=0.3386IgCFU+3.4064，R=0.9905，[119]与其他常规TRFIA检测手段相比，灵敏度得到了提升。且此方法在对致病菌样品的检测中，阳性检出率也高于ELISA。44 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌第4章BA-纳米粒子TRFIA检测嗜水气单胞菌B15在前面的研究中，均需将抗体与纳米粒子进行标记，而标记方法不一，用量与反应时间很难掌握，考虑到操作简单性与试剂的通用性，此方法不适于商品化。因此，本实验在双抗夹心的基础上，引入生物素-链霉亲和素系统（Biotin-streptavidinsystem）。用生物素标记抗体，并使用链霉亲和素包裹的荧光纳米粒子。生物素标记抗体的方法简单且成熟，生物素-链霉亲和素系统间的亲和力强，存在信号放大作用。固该方法无论在理论还是在实际中都具有极大的发展前景。4.1材料与方法4.1.1试剂和材料Fluoro-Max链霉亲和素包裹荧光微粒、生物素标记试剂盒（24135），购自ThermoscientificPierce公司；96孔微孔板购自厦门怡佳美公司；ALP-链霉亲和素、牛血清蛋白（BSA）、β-NTA、TOPO，购自Sigma公司；SephadexG-50购自GEHealthcare公司；其他相关试剂均为国产分析纯。通过免疫新西兰大白兔制得兔抗嗜水气单胞菌B15血清；交叉实验所用的菌均来自西班牙普通微生物保藏中心（CECT）；菌株B15分离于患病鳗鲡，人工感染后确定病原菌，经鉴定为嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）。4.1.2实验仪器同2.1.2。4.1.3主要试剂配制同2.1.3。4.2实验方法4.2.1IgG的亲和纯化同2.2.4。4.2.2IgG的效价分析4.2.3IgG的生物素标记1）从-20℃冰箱内取出装有生物素的小瓶，将其平衡至室温后称取0.7mg，溶于127μL的超纯水中；2）将纯化冻干后的样品溶于磷酸盐缓冲液；3）取14.3μL生物素溶液和1mL抗体溶液，混匀后4℃反应2h；4）从4℃冰箱内取出生物素标记试剂盒中的脱盐柱，平衡至室温后，去掉柱子底塞；45 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌5）将脱盐柱放入15mL的离心管中，1000r/min离心2min，待保护液全部流出后倒掉，再将脱盐柱放回到离心管中；6）取2.5mL0.15M的磷酸盐缓冲液，加入脱盐柱中，离心机1000r/min离心2min；7）步骤6重复3次后，将离心管中的磷酸盐缓冲液倒掉；8）将步骤3中反应完的混合液加入脱盐柱，并将其放入新的15mL离心管中；9）离心机1000r/min离心2min，此时收集到的液体即为生物素标记的抗体。10）通过HABA反应计算标记比。4.2.4BA-纳米粒子TRFIA的建立1）将嗜水气单胞菌B15的抗体用碳酸盐缓冲液稀释，每孔100μL加入到96孔微孔板中，，4℃包被12h；2）洗涤液洗涤3次，每次3min；3）每孔加入200μL1%的BSA，37℃封闭2h；4）洗涤液洗涤3次，每次3min；5）用分析缓冲液稀释嗜水气单胞菌，每孔100μL加入96微孔板，对照孔以分析缓冲液代替，37℃振荡孵育1h；6）洗涤液洗涤3次，每次3min；7）每孔加入工作浓度的生物素化IgG溶液100μL，37℃振荡孵育1h；8）洗涤液洗涤3次，每次3min；9）加入工作浓度的Fluoro-Max链霉亲和素包裹荧光微粒100μL，37℃振荡孵育一段时间；10）洗涤液洗涤6次，每次3min；11）每孔加入200μL增强液，室温振荡15min；12）用多标记分析仪测量时间分辨荧光(Time-resolvedfluorometry,TRF)，测量参数设置如下：激发波长340nm，发射波长615nm，延迟时间0.4ms，测量时间0.4ms。4.2.5实验最佳条件确定4.2.5.1单因素优化实验条件1）生物素化IgG浓度优化将生物素化IgG浓度分别按1：500、1:1000、1:1500、1:2000、1:3000的稀释度稀释，对照孔用分析缓冲液代替，在保证其他实验条件不变的情况下测定实验的TRF值，每个稀释度重复三次。2）生物素化IgG与纳米粒子结合时间优化将生物素化的IgG与包裹了亲和素的荧光纳米粒子之间的反应时间分别设置为30min、1h、1.5h、2h、3h。固定包被抗体浓度、生物素化IgG的浓度以及包裹了亲和素的纳米粒子的浓度。每个实验孔三个重复，测定并记录TRF值。46 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌3）纳米粒子浓度将纳米粒子按1:2万、1:4万、1:6万、1:8万、1:10万的比例稀释。其他条件均保持不变，对照孔用分析缓冲液代替，每个稀释度重复3孔，测定并记录TRF值。4.2.5.2正交试验设计根据单因素优化的结果，选定免疫结合时间、生物素化IgG浓度、亲和素包裹荧光纳米粒子浓度的实验范围，设计三因素三水平的实验，该实验选定三因素四水平正交试验表进行实验。3表4.1L9(4)正交试验因素表水平生物素化IgG浓度（A）免疫时间（B）亲和素纳米粒子浓度（C）11:12001.21:5万21:15001.51:6万31:18001.81:7万5表4.2L16(4)正交实验组合表组合生物素化IgG浓度（A）免疫时间（B）亲和素纳米粒子浓度（C）111121223133421252236231731383219332以实验组TRF值与对照组TRF值（即P/N值）作为因变量，各因素水平作为自变量进行方差分析与极差分析，并对各因素的边际值进行估计。4.2.6重复性实验按照BA-纳米粒子TRFIA免疫反应体系对嗜水气单胞菌进行免疫检测，随机在同一96微孔板上的六个不同微孔间进行实验，测定并记录各组荧光值，算出平均值和标准偏差，根据板内变异系数=板内标准差/平均值×100%，算出板内变异系数。同理，随机在六块微孔板间进行免疫反应，测定并记录各组荧光值，计算出板间变异系数。47 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌4.2.7特异性测定利用建立的BA-纳米粒子TRFIA对10株不同的水产致病菌进行免疫测定，实验菌株7浓度均为1×10cfu/mL，免疫时间、生物素化IgG和BA-纳米粒子采用最适条件，微孔板中每孔加入100μL菌液进行包被，同时设立重复组，阴性对照孔用100μL碳酸盐包被液代替。反应结束之后，记录各组荧光值。4.2.8灵敏度测定76用碳酸盐包被液将嗜水气单胞菌B15做一系列梯度稀释，使菌液浓度呈现1×10、1×10、543221×10、1×10、1×10、8×10、2×10的浓度梯度。按照已经建立的免疫反应体系进行免疫测定，每个浓度梯度分别设有三组平行对照，对照组的菌液用碳酸盐包被液代替，测定TRF荧光值后，将菌浓度、TRF值取对数后分别作为横坐标、纵坐标绘制标准曲线。4.2.9BA-纳米粒子TRFIA的实际应用利用建立的BA-纳米粒子TRFIA法检测了人工感染后7条鳗鲡组织样品，腹腔注射嗜水气单胞菌B15的鳗鲡组织样品作为实验组，同样处理注射生理盐水的鳗鲡作为对照组，各设置三组平行，测定并记录TRF值。4.3结果与分析4.3.1生物素化IgG标记比计算生物素化IgG标记比可检测标记实验的标记效果，代表每个IgG分子上标记的生物素分子数，根据生物素标记试剂盒（24135）说明书的要求及计算过程，求出生物素化IgG中生物素分子浓度和IgG的摩尔浓度即可得到。通过计算得出生物素化IgG中生物素分子-6-6浓度为14.3×10mmol/L，IgG的摩尔浓度为6.67×10mmol/L，相除得标记比为2.14。4.3.2单因素优化4.3.2.1生物素化IgG浓度优化结果将生物素化IgG浓度分别按1：500、1:1000、1:1500、1:2000、1:3000的稀释度稀释，对照孔用分析缓冲液代替，在保证其他实验条件不变的情况下测定实验的TRF值，每个稀释度重复三次。以生物素化IgG浓度为横坐标，P/N值为纵坐标做图，结果如图4-1所示。由图可知抗体浓度在1：3000到1：1500，P/N值急剧上升，后1:1000-1:1500之间趋于平稳，且在1：1500时P/N值达到最大值17.03，后随着浓度升高P/N值逐渐下降。因此为确定最佳的生物素化IgG浓度，在正交试验中，稍扩大取值范围，选择1:1000-1:1800为生物素化IgG的取值范围。48 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌图4-1不同生物素-IgG浓度下P/N值4.3.2.2生物素化IgG与BA-荧光纳米粒子结合时间优化将生物素化的IgG与包裹了亲和素的荧光纳米粒子之间的反应时间分别设置为30min、1h、1.5h、2h、3h。以结合时间为横坐标，P/N值为纵坐标做图，结果如图4-2所示：随着结合时间的延长，P/N值先逐渐上升后逐渐下降，并且在结合时间为1.5h时达到最大值。图4-2不同生物素化IgG与BA-荧光纳米粒子结合时间下P/N的关系4.3.2.3BA-荧光纳米粒子浓度优化将纳米粒子按1:2万、1:4万、1:6万、1:8万、1:10万的比例稀释。其他条件均保持不变，对照孔用分析缓冲液代替，每个稀释度重复3孔，测定并记录TRF值。以稀释度为横坐标，P/N值为纵坐标做图，结果如图4-3所示：P/N值随着纳米粒子浓度的升高先急剧上升，并在1：8万-1：6万之间趋于平缓，后逐渐下降。49 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌图4-3不同BA-荧光纳米粒子下P/N值4.3.3正交试验结果4.3.3.1正交试验极差分析结果表4.3正交试验极差分析结果实验组抗体生物素浓度（A）抗体粒子结合时间（B）粒子浓度（C）P/N111118212211.68313312.54421218.98522313.32623113.13731318.37832115.31933214.64K142.21955.3546.44K245.42940.31145.30K348.32140.31144.202k114.07318.45015.480k215.14313.43715.100k316.10713.43714.734R2.0345.0130.737将P/N值作为因变量，生物素化IgG浓度、生物素化IgG与BA-荧光纳米粒子结合时间、BA-荧光纳米粒子浓度作为自变量进行极差分析和方差分析。自变量因素的R值为该50 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌因素均值的极大值与极小值之差，R值越大对因变量的影响就越大，由表4-3极差分析结果，可以得出最优组合为A3B1C1，根据R值大小也可得出，对P/N值影响程度依次为B>A>C。4.3.3.2正交试验方差分析结果表4.4方差分析表变异来源自由度F比P值生物素IgG浓度22.562.281免疫结合时间220.745.046链霉亲和素粒子浓度2.336.748a.R方=.959（调整R方=.838）由表4-4可以看出，免疫结合时间的P值=0.046<0.05，对实验结果的P/N值影响显著，生物素IgG浓度（P=0.281>0.05）和链霉亲和素粒子浓度（P=0.748>0.05）由于选取范围已经经过单因素优化，各水平之间差别不大，固对最终P/N值没有显著影响。但通过比较F值，可得出对P/N值影响程度依次为免疫结合时间>生物素IgG浓度>链霉亲和素粒子浓度，与极差分析的结果一致。4.3.3.3验证实验结果根据极差分析可以得出，实验最优组合为A3B1C1，但是该组合并未出现在所做9次实验的组合中，为了增加实验结果的准确性，将验证组加入原先的正交试验设计组中，重新利用建立的BA-纳米粒子TRFIA方法测定实验的P/N值，结果如图4-4所示。由图可知，在所有10组实验中，第10组的P/N值最大，即正交试验对实验结果的优化具有一定的指导意义。因此可以确定BA-纳米粒子TRFIA检测法中生物素化IgG最适浓度为1:1800，生物素化IgG与BA-荧光纳米粒子最优结合时间为1.2h，BA-荧光纳米粒子最适浓度为1:5万。图4-4正交试验及验证实验结果51 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌4.3.4重复性实验利用BA-荧光纳米粒子TRFIA检测嗜水气单胞菌板内变异系数结果如下：5946709、5290494、5090748、5768210、5524420、5798665，平均数为5569874，标准偏差为300934；板间变异系数结果为：5115709、4653101、5619881、5173089、5587592、5968410，平均数为5352964，标准偏差为424955。分析数据后，得出嗜水气单胞菌的板内变异系数为5.40%，板间变异系数为7.94%。板内变异系数和板间变异系数均符合小于15%的要求，说明96微孔板的吸附力稳定性好，也说明该方法能够多次反复检测。4.3.5特异性实验利用建立的BA-荧光纳米粒子TRFIA，采用菌株B15的抗体与其他病原菌菌株进行TRFIA测定，并同时进行菌株B15的测定，以实验组TRF值与对照组TRF值比值大于2，即P/N>2时判断为阳性。由表4-5可知，嗜水气单胞菌抗体与菌株B15有较强的阳性反应，与其他水产致病菌菌株无交叉反应，说明抗体特异性良好，该法可用于快速检测嗜水气单胞菌。表4-5特异性试验菌名称菌号P/N值结果嗜水气单胞菌AeromonashydrophilaB1528.75+嗜水气单胞菌AeromonashydrophilaB551.35-嗜水气单胞菌AeromonashydrophilaB701.46-嗜水气单胞菌AeromonashydrophilaB641.62-嗜水气单胞菌AeromonashydrophilaB651.28-嗜水气单胞菌AeromonashydrophilaB661.47-嗜水气单胞菌AeromonashydrophilaB111.66-嗜水气单胞菌AeromonashydrophilaB271.58-嗜水气单胞菌AeromonashydrophilaB56-11.33-肠棕色气单胞菌AeromonasenteropelogenesB42551.11-波波夫气单胞菌AeromonaspopoffiiB49551.23-兽生气单胞菌AeromonasbestiarumB42271.09-简达气单胞菌AeromonasjandaeiB42281.32-豚鼠气单胞菌AeromonascaviaeB8381.14-中间气单胞菌AeromonasmediaB42321.25-大肠杆菌EscherichiacoliB10031.20-维隆气单胞菌AeromonasveroniiB57611.41-注：+代表阳性结果，-代表阴性结果。52 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌4.3.6敏感性实验利用建立的BA-荧光纳米粒子TRFIA，与不同浓度的致病菌进行免疫反应，不同浓度的致病菌对应不同的TRF值，TRF值随致病菌浓度的增高而增大。嗜水气单胞菌实验组（三组平行）测量结果如下：5946709、5290494、5090748,3266922、3066896、3228520，1182474、1333350、1268764,681161、682743、679673，424872、418071、409211，370608、370495、379759，301107、296013、230577阴性对照为：192792、173299、199497，空白值为：6038、6036、5264。各组数据取平均值，并减去空白值之后，以所测TRF值得对数即IgTRF为纵坐标，细菌浓度的对数值IgCFU为横坐标，绘制标准曲线，结果见图4-5，线性范围在278.0×10-1.0×10范围内良好。以样品孔的TRF值（P）与对照孔的TRF值（N）之比大于22（即P/N>2）时所对应的最小浓度为最低检测限，其灵敏度为8.0×10cfu/mL，线性方程2为IgTRF=0.29IgCFU+4.7096，R=0.9904。76.86.66.46.26IgTRF5.85.65.45.2533.544.555.566.577.5IgCFU图4-5BA-纳米粒子TRFIA标准曲线4.3.7BA-纳米粒子TRFIA的实际应用利用建立的BA-纳米粒子TRFIA对40个鳗鲡样品进行检测，以腹腔注射嗜水气单孢菌B15的鳗鲡组织样品为实验组，以同样处理的注射生理盐水的鳗鲡组织样品为对照组，测定并记录相应TRF值。结果如图4-6，4-7所示，40个鳗鲡样品的检测结果均呈阳性，阳性检测率达到100%，并与ELISA进行对比，在ELISA检测中，阳性检出率为92.5%。说明BA-纳米粒子TRFIA检测效果高于ELISA法，且能够很好的应用于嗜水气单孢菌的检测。53 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌图4-6鳗鲡样品BA-纳米粒子TRFIA检测结果图4-7鳗鲡样品ELISA检测结果4.4讨论生物素-链霉亲和素系统，是一种应用于免疫学的新型生物反应放大系统。生物素（biotin）是一种广泛分布于动、植物体内的小分子生长因子，经化学修饰后，可成为带有[120]多种活性基因的衍生物-活化生物素（BNHS），其可与包括抗体在内的各种蛋白质结合。链霉亲和素（streptavidin）是一种由链霉菌分泌的蛋白质，其与生物素之间的亲和常数极高。生物素-亲和素之间的高亲和力及多级放大效应，使得BAS比其他示踪分析更灵敏，54 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌已广泛应用于抗体、抗原定性及定位观察研究。在实验过程中，发现在洗板过程中易导致各孔之间的污染，因此在清洗时，要将每孔注满且至不溢出为止，在倒出洗涤液时，也注意要垂直倒出，避免各孔之间的污染。最后一次洗板时，一定要注意扣干。加样时，应垂直将样品加入孔内，避免触碰孔壁等非包被区，造成样品不必要的损失。本实验在TRFIA的基础上，结合生物素-链霉亲和素系统，建立了双抗夹心纳米粒子2[119]TRFIA检测嗜水气单胞菌的新方法，最低检测限为8.0×10cfu/mL，优于卢杰等人建立3的TRFIA检测产酸克雷伯氏菌的检测限（5.0×10cfu/mL）。在特异性方面，与嗜水气单胞菌的其他亚种以及常见的水产致病菌均无交叉反应，说明虽然使用同一种抗体作为包被抗体和标记抗体，依然不会影响实验的特异性。原因是大分子的致病菌抗原在与检测抗体结合后，仍留有标记抗体可结合的位点，且包被抗体与标记抗体的加入时间不同，因此实验中使用同一种多克隆抗体不会存在问题，而且可以降低实验的成本。本实验灵敏度虽有提高，但结果仍不够理想，可能是抗体与生物素标记效率不够高，影响了最终荧光值。实验证明了BA-纳米粒子TRFIA的结合在水产致病菌检测方面的可行性，在灵敏度上还有很大的上升空间。本实验虽大大提高了检测灵敏度，但由于实验是一种抗体针对一种致病菌，使得检测范围比较狭窄，且需在前期制备专门的特异性抗体，周期较长。在实际应用当中，由于很多情况下，无法得知致病菌的种类，因此增加制作抗体的识别范围是可作为时间分辨体系的研究方向。55 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌第5章结论与展望本研究在TRFIA的基础上，引入具有高荧光效率和信号放大作用的纳米荧光粒子，镧系元素包裹在纳米粒子中，防止了荧光元素的泄露。本研究的主要研究内容如下：1）本研究首次将直接纳米粒子TRFIA技术用于水产致病菌嗜水气单胞菌B15的检测。该实验直接将抗原包被于微孔板，，再加入纳米粒子标记的抗体，形成了致病菌的直接检5测体系。通过该方法得到嗜水气单胞菌B15的检测限为1.0×10cfu/mL。2）将抗原直接包被在微孔板上的方法，有包被效率低，灵敏度达不到实验要求等缺点。在直接纳米粒子TRFIA的基础上，展开了对双抗夹心纳米粒子TRFIA的探讨，聚苯乙烯微孔板对IgG的吸附效率高，可有效提高实验的灵敏度，实验首先通过单因素分析，确定各实验条件的优化范围，使用正交试验的方法，对包被抗体浓度、抗体包被时间、细菌与纳米粒子-IgG免疫时间以及纳米粒子-IgG浓度进行了优化，排除了各个因素之间的交互反应，增加了实验精确度，并用不同微孔板进行实验，检测实验效果；实验还从灵敏度、特异性、重复性以及实际应用等方面进行了深入研究，得出白色不透明微孔板的效率高于383黑色不透明微孔板，嗜水气单胞菌的检测限为1×10cfu/mL，标准曲线在1×10-1×10cfu/mL线性范围良好；重复性好；特异性强；在实际检测中阳性检出率达100%，高于常用ELISA法及常规TRFIA。3）采用链霉亲和素包裹的纳米粒子，引入生物素-链霉亲和素系统，建立BA-纳米粒子TRFIA，以进一步提高检测灵敏度。实验将抗体IgG与链霉亲和素进行标记，由于生物素-链霉亲和素的高亲和力，使得IgG与荧光纳米粒子之间的结合更加紧密。利用建立的27BA-纳米粒子TRFIA对嗜水气单胞菌进行检测，检测限为8×10cfu/mL，标准曲线在1×102cfu/mL-8×10cfu/mL范围内线性良好，通过与ELISA的对比检测实验，得出该方法的检测效果明显好于ELISA，为水产致病菌的早期检测提供了新方法。为进一步完善体系，简化操作步骤，提高检测灵敏度。本实验后续研究方向为：1）为简便方法、提高灵敏度，可进行高荧光产率新型稀土螯合物的合成。2）可制备高效价的单克隆抗体，提高抗原与抗体间的特异性。3）为缩短检测时间，可引入荧光共振能量转移体系，进行均相的TRFIA检测，可省去繁琐的洗板过程；还可采用高自动化的仪器缩短操作时间。56 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌致谢时光飞逝，三年研究生生涯即将结束，在此毕业论文完成之际，衷心的感谢我的导师林鹏教授对我的悉心指导和关怀。林老师渊博的学识，对工作一丝不苟的态度，严谨的工作作风深深影响着我，是我学习的榜样，努力的方向。我科研上取得的成绩以及良好实验规范的养成都离不开林老师的谆谆教诲，再次向林老师表示崇高的敬意以及感谢！特别感谢王艺磊教授、冯建军副教授、陈锦民博士、王淑红副教授、王国栋副教授、郭松林副教授、陈芸博士在三年研究生期间给予的支持与帮助。感谢翁璐梅老师在我刚来到学校时，对我的帮助和安慰，感谢林伟强老师在工作和学习中对我的帮助。感谢顾宏杰师兄、卢杰师兄、陈仕海师兄、张鑫师兄在我生活及研究生生涯中对我的关心和帮助，在我实验技能未完全掌握，经常犯错的情况下，耐心细致指导。感谢我的同学黄媛、师妹谢东琴和谭世玉，以及实验组其他同学在生活中给予的关心，在实验过程中给予的帮助。衷心的感谢2013级全体研究生对我研究生三年的帮助和关怀。特别感谢我的家人多年来对我的包容与关心，让我伤心难过时有了依靠，让我变得更加坚强。感谢曾万斌对我生活和学习的关心，在我遇到困难时对我的鼓励和帮助。最后感谢每一位支持我、帮助过我的老师、同学和家人，没有你们的关心和支持，我无法取得现在的成绩。本研究得到了国家自然科学基金（NO.30972281,31001136）、福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划（闽教科[2007]20号）和集美大学创新团队基金项目（NO.2010A001）的资助，在此表示特别感谢！57 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌参考文献[1]SinhaA.FluorescenceandLaserActioninRareEarthChelates[J].SpectroscInorgChem,1971,2255-288.[2]JoobB,WiwanitkitV.Time-ResolvedFluoroimmunoassayforHepatitisBVirusPreS1AntigenDetection[J].JournalofImmunoassay&Immunochemistry,2012,33(3):337-337.[3]LvX,LiZ,NiuC,etal.DeterminationofAmmonia-OxidizingBacteriaBasedonTime-ResolvedFluorescenceandTandemProbe[J].WaterScience&Technology,2012,66(6).[4]YuT,GaoS,YinA,etal.ASensitiveTime-ResolvedFluoroimmunoassayforDeterminationofMedianLevelsofPregnancy-AssociatedPlasmaProteinainPregnantWomeninChina[J].JournalofImmunoassayandImmunochemistry,2013,34(4):365-375.[5]谭玉华,于婷,董梅,等.人巨细胞病毒IgM抗体生物素-亲和素单克隆抗体捕获时间分辨荧光免疫法检测试剂盒的研制与评价[J].中国生物制品学杂志,2014,(02):221-225.[6]WangK,HuangB,ZhangJ,etal.ANovelandSensitiveMethodfortheDetectionofDeoxynivalenolinFoodbyTime-ResolvedFluoroimmunoassay[J].ToxicologyMechanismsandMethods,2009,19(9):559-564.[7]YuLSL,ReedSA,GoldenMH.Time-ResolvedFluorescenceImmunoassay(TRFIA)fortheDetectionofEscherichiacoliO157:H7inapplecider[J].JournalofMicrobiologicalMethods,2002,49(1):63-68.[8]WeiS,LeT,ChenY,etal.Time-ResolvedFluoroimmunoassayforQuantitativeDeterminationofTylosinandTilmicosininEdibleAnimalTissues[J].ChineseScienceBulletin,2013,58(15):1838-1842.[9]PetterssonK,SiitariH,HemmiläI,etal.Time-ResolvedFluoroimmunoassayofHumanChoriogonadotropin[J].ClinicalChemistry,1983,29(1):60-64.[10]ShenJ,ZhangZ,YaoY,etal.AMonoclonalAntibody-basedTime-resolvedFluoroimmunoassayforChloramphenicolinShrimpandChickenMuscle[J].AnalyticaChimicaActa,2006,575(2):262-266.[11]VanGenderenFT,GorusFK,VermeulenI,etal.DevelopmentofaMultipurposeTime-ResolvedFluorescenceImmunoassayforRatInsulin[J].AnalyticalBiochemistry,2010,404(1):8-13.[12]BinZ,KaiZ,JueZ,etal.ANovelandSensitiveMethodfortheDetectionofEnrofloxacininFoodUsingTime-resolvedFluoroimmunoassay[J].ToxicologyMechanismsandMethods,2013,23(5):323-328.[13]ChanM,BellemA,DiamandisE.Time-ResolvedImmunofluorometricAssayofAlpha-fetoproteininSserumandAmnioticFluid,WithaNovelDetectionSystem[J].ClinicalChemistry,1987,33(11):2000-2003.[14]DiamandisEP,ChristopoulosTK.EuropiumChelateLabelsinTime-resolvedFluorescenceImmunoassaysandDNAHybridizationAssays[J].AnalyticalChemistry,1990,62(22):1149A-1157A.[15]JohnsenAH,AssaadFN,RehfeldJF.CompetitiveSolid-PhaseImmunoassayofGastrininSerumUsingTime-resolvedFluorometry[J].ScandinavianJournalofClinical&LaboratoryInvestigation,2011,71(3):216-220.[16]金晶,赖卫华,涂祖新,等.时间分辨荧光免疫分析技术的研究进展及在食品安全领域中的应用[J].食品科学,2006,27(12):886-889.[17]ChristopoulosTK,DiamandisEP.EnzymicallyAmplifiedTime-resolvedFluorescenceImmunoassaywithTerbiumChelates[J].AnalyticalChemistry,1992,64(4):342-346.[18]SteinkampT,KarstU.DetectionStrategiesforBioassaysBasedonLuminescentLanthanideComplexesandSignalAmplification[J].AnalyticalandBioanalyticalChemistry,2004,380(1):24-30.[19]JiangCQ,ZhangN.Enzyme-amplifiedLanthanideLuminescenceBasedonComplexationReaction—a58 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌NewTechniquefortheDeterminationofDoxycycline[J].JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis,2004,35(5):1301-1306.[20]VeiopoulouCJ,LianidouES,IoannouPC,etal.ComparativeStudyofFluorescentTernaryTerbiumComplexes.ApplicationinEnzymeAmplifiedFluorimetricImmunoassayforα-Fetoprotein[J].AnalyticaChimicaActa,1996,335(1):177-184.[21]PetrovasC,DaskasSM,LianidouES.DeterminationofTumorNecrosisFactor-α(TNF-α)inSerumbyaHighlySensitiveEnzymeAmplifiedLanthanideLuminescenceImmunoassay[J].ClinicalBiochemistry,1999,32(4):241-247.[22]DicksonEFG,PollakA,DiamandisEP.Time-ResolvedDetectionofLanthanideLuminescenceforUltrasensitiveBioanalyticalAssays[J].JournalofPhotochemistryandPhotobiologyB:Biology,1995,27(1):3-19.[23]LakowiczJR.PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy[J].Springer,JournaloftheAmericanChemicalSociety,2006,126(3):321-333.[24]ClappAR,MedintzIL,MauroJM,etal.FluorescenceResonanceEnergyTransferBetweenQuantumDotDonorsandDye-labeledProteinAcceptors[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2004,126(1):301-310.[25]TrinquetE,MathisG.FluorescenceTechnologiesfortheInvestigationofChemicalLibraries[J].MolecularBiosystems,2006,2(8):380-387.[26]UchiyamaH,HiranoKi,Kashiwasake-JibuM,etal.DetectionofUundegradedOligonucleotidesinVivobyFluorescenceResonanceEnergyTransferNucleaseActivitiesinLivingSeaUrchinEggs[J].JournalofBiologicalChemistry,1996,271(1):380-384.[27]ZelphatiO,SzokaFC.MechanismofOligonucleotideReleasefromCationicLiposomes[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1996,93(21):11493-11498.[28]WuP,BrandL.ResonanceEnergyTransfer:MethodsandApplications[J].AnalyticalBiochemistry,1994,218(1):1-13.[29]DennisAM,BaoG.QuantumDot−FluorescentProteinPairsasNovelFluorescenceResonanceEnergyTransferProbes[J].NanoLetters,2008,8(5):1439-1445.[30]JensenKK,MartiniL,SchwartzTW.EnhancedFluorescenceResonanceEnergyTransferBetweenSpectralVariantsofGreenFluorescentProteinThroughZinc-SiteEngineering[J].Biochemistry,2001,40(4):938-945.[31]MitraRD,SilvaCM,YouvanDC.FluorescenceResonanceEnergyTransferBetweenBlue-EmittingandRed-shiftedExcitationDerivativesoftheGreenFluorescentProtein[J].Gene,1996,173(1):13-17.[32]MathisG,SocquetF,ViguierM,etal.HomogeneousImmunoassaysUsingRareEarthCryptatesandTimeResolvedFluorescence:PrinciplesandSpecificAdvantagesForTumorMarkers[J].AnticancerResearch,1996,17(4B):3011-3014.[33]MathiesRA,PeckK,StryerL.OptimizationofHigh-SensitivityFluorescenceDetection[J].AnalyticalChemistry,1990,62(17):1786-1791.[34]EliseevaSV,BünzliJCG.LanthanideLuminescenceforFunctionalMaterialsandBio-sciences[J].ChemicalSocietyReviews,2010,39(1):189-227.[35]DegorceF.HTRF®:PioneeringTechnologyforHigh-throughputScreening[J].2006,1(7):753-764.[36]WangS,MamedovaN,KotovNA,etal.Antigen/AntibodyImmunocomplexfromCdTeNanoparticle59 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌Bioconjugates[J].NanoLetters,2002,2(8):817-822.[37]MathisG.RareEarthCryptatesandHomogeneousFluoroimmunoassayswithHumanSera[J].ClinicalChemistry,1993,39(9):1953-1959.[38]EnomotoK,ArakiA,NakajimaT,etal.High-throughputMiniaturizedImmunoassayforHumanInterleukin-13SecretedfromNK3.3CellsUsingHomogenousTime-ResolvedFluorescence[J].JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis,2002,28(1):73-79.[39]KokkoT,KokkoL,SoukkaT,etal.HomogeneousNon-CompetitiveBioaffinityAssayBasedonFluorescenceResonanceEnergyTransfer[J].AnalyticaChimicaActa,2007,585(1):120-125.[40]KokkoL,ReinvallI,SoukkaT.HomogeneousImmunoassayforThyroid-stimulatingHormoneBasedonFluorescenceResonanceEnergyTransfer[J].ElsevierScience,2005,355S224-S224.[41]HärmäH,SarrailG,KirjavainenJ,etal.ComparisonofHomogeneousSingle-labelFluorometricBindingAssays:FluorescencePolarizationandDual-parametricQuenchingResonanceEnergyTransferTechnique[J].AnalyticalChemistry,2010,82(3):892-897.[42]Ṙuz̆ic̆kaJ,HansenE.FlowInjectionAnalyses:PartI.ANewConceptofFastContinuousFlowAnalysis[J].AnalyticaChimicaActa,1975,78(1):145-157.[43]Locascio-BrownL,PlantAL,HorvathV,etal.LiposomeFlowInjectionImmunoassay:ImplicationsforSensitivity,DynamicRange,andAntibodyRegeneration[J].AnalyticalChemistry,1990,62(23):2587-2593.[44]LiuH,YuJC,BindraDS,etal.FlowInjectionSolid-PhaseChemiluminescentImmunoassayUsingaMembrane-BasedReactor[J].AnalyticalChemistry,1991,63(7):666-669.[45]BjarnasonB,BousiosN,EreminS,etal.FlowInjectionEnzymeImmunoassayofAtrazineHerbicideinWater[J].AnalyticaChimicaActa,1997,347(1):111-120.[46]BereczkiA,HorváthV.NovelTypeofFlowInjectionImmunoassayfortheDeterminationofPhenytoininSerum[J].AnalyticaChimicaActa,1999,391(1):9-17.[47]BurestedtE,KjellströmS,EmnéusJ,etal.DevelopmentofAnOfflineNoncompetitiveFlowImmunoassayfortheDeterminationofInterleukin-8inCellSamples[J].AnalyticalBiochemistry,2000,279(1):46-54.[48]NandakumarR,NandakumarM,MattiassonB.QuantificationofNisininFlow-injectionImmunoassaySystems[J].BiosensorsandBioelectronics,2000,15(5):241-247.[49]LuoJ-X,YangX-C.FlowInjectionChemiluminescentImmunoassaywithPara-phenylphenolandSodiumTetraphenylborateasSynergisticEnhancers[J].AnalyticaChimicaActa,2003,485(1):57-62.[50]钱昌顺.流动注射—时间分辨荧光联用检测CEA[J].现代检验医学杂志,2005,(02):38-39.[51]YanF,ZhouJ,LinJ,etal.FlowInjectionImmunoassayforCarcinoembryonicAntigenCombinedwithTime-resolvedFluorometricDetection[J].JournalofImmunologicalMethods,2005,305(2):120-127.[52]HeidCA,StevensJ,LivakKJ,etal.RealTimeQuantitativePCR[J].GenomeResearch,1996,6(10):986-994.[53]GueimondeM,DeborL,TölkköS,etal.QuantitativeAssessmentofFaecalBifidobacterialPopulationsbyReal‐TimePCRUsingLanthanideProbes[J].JournalofAppliedMicrobiology,2007,102(4):1116-1122.[54]GueimondeM,TölkköS,KorpimäkiT,etal.NewReal-timeQuantitativePCRProcedureforQuantificationofBifidobacteriainHumanFecalSamples[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2004,70(7):4165-4169.[55]陈梦君,杨万泰,尹梅贞.纳米粒子的分类合成及其在生物领域的应用[J].化学进展,2012,(12):60 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌2403-2414.[56]SaetchnikovAVA,TcherniavskaiaEA,SchweigerG,etal.ClassificationoftheMicroandNanoparticlesandBiologicalAgentsbyNeuralNetworkAnalysisoftheParametersofOpticalResonanceofWhisperingGalleryModeinDielectricMicrospheres[J].ProcSpie,2011,8090(1):298-306.[57]ChenR,RatnikovaTA,StoneMB,etal.DifferentialUptakeofCarbonNanoparticlesbyPlantandMammalianCells[J].Small,2010,6(5):612-617.[58]ThickettSC,GilbertRG.Emulsionpolymerization:StateoftheArtinKineticsandMechanisms[J].Polymer,2007,48(24):6965-6991.[59]LuM,HeB,WangL,etal.PreparationofPolystyrene–polyisopreneCore–ShellNanoparticlesforReinforcementofElastomers[J].CompositesPartBEngineering,2012,43(1):50-56.[60]ZhangC,ZhuB,LeeLJ.ExtrusionFoamingofPolystyrene/CarbonParticlesUsingCarbonDioxideandWaterasCo-BlowingAgents[J].Polymer,2011,52(8):1847-1855.[61]KorotcenkovG,BrinzariV,ChoBK.ConductometricGasSensorsBasedonMetalOxidesModifiedwithGoldNanoparticles:AReview[J].MicrochimicaActa,2016,183(3):1033-1054.[62]LiuJ,ChangMJ,GouXC,etal.One-StepSynthesisofAntibody-StabilizedAqueousColloidsofNobleMetalNanoparticles[J].Colloids&SurfacesAPhysicochemical&EngineeringAspects,2012,404(404):112-118.[63]LandfesterK.MiniemulsionPolymerizationandtheStructureofPolymerandHybridNanoparticles[J].AngewandteChemieInternationalEdition,2009,48(25):4488-4507.[64]TikarihaS,SinghS,BanerjeeS,etal.BiosynthesisofGoldNanoparticles,ScopeandApplication:AReview[J].InternationalJournalofPharmaceuticalSciences&Research,2012,3(4).215-224.[65]MaM,ZhanY,ShenY,etal.SynthesisofAmino-GroupFunctionalizedSuperparamagneticIronOxideNanoparticlesandApplicationsasBiomedicalLabelingprobes[J].JournalofNanoparticleResearch,2011,13(8):3249-3257.[66]宋新峰,孙汉文,吴静,等.超顺磁性Fe3O4纳米粒子化学合成及生物医学应用进展[J].应用化工,2015,(4):711-715.[67]覃爱苗,蒋治良,邹节明,等.用聚丙烯酰胺微波高压合成金纳米粒子[J].应用化学,2002,19(12):1150-1153.[68]LiX,XuH,ChenZS,etal.BiosynthesisofNanoparticlesbyMicroorganismsandTheirApplications[J].JournalofNanomaterials,2011,2011(2011):332-342.[69]ArigaK,JiQ,McshaneMJ,etal.ChemInformAbstract:InorganicNanoarchitectonicsforBiologicalApplications[J].Cheminform,2012,24(23):728-737.[70]XiaY,ZhouY,TangZ.ChiralInorganicNanoparticles:Origin,OpticalPropertiesandBioapplications[J].Nanoscale,2011,3(4):1374-1382.[71]ChahS,HammondMR,ZareRN.GoldNanoparticlesasaColorimetricSensorforProteinConformationalChanges[J].Chemistry&Biology,2005,12(3):323-328.[72]AndNS,LyonLA.AuNanoparticleTemplatedSynthesisofpNIPAmNanogels[J].ChemistryofMaterials,2007,19(19):719-726.[73]WangL,XiaT,LiuJ,etal.PreparationandApplicationofaNovelCore/ShellOrganicNanoparticleasaFluorescenceProbeintheSelectiveDeterminationofCr(VI)[J].SpectrochimicaActaPartAMolecular&BiomolecularSpectroscopy,2005,62(1-3):565-569.61 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌[74]PatelT,ZhouJ,PiepmeierJM,etal.PolymericNanoparticlesforDrugDeliverytotheCentralNervousSystem[J].AdvancedDrugDeliveryReviews,2012,64(7):701-705.[75]ShenJM,GuanXM,LiuXY,etal.Luminescent/MagneticHybridNanoparticleswithFolate-conjugatedPeptideCompositesforTumor-targetedDrugDelivery[J].BioconjugateChemistry,2012,23(5):1010-1021.[76]FreedL,MarquisICNA.Emmanual,MikosAG,YomeiMedV01.41,N0.6,200078772HyunW00KimandChangDongHanLangerR.NeocartilageFormationinVitroandinVivoUsingCellsCulturedonSyntheticBiodegradablePolymers[J].JBiomedMaterRes,1993,271l-25.[77]ArigaK,JiQ,McShaneMJ,etal.InorganicNanoarchitectonicsforBiologicalApplications[J].ChemistryofMaterials,2011,24(5):728-737.[78]XiaY,ZhouY,TangZ.ChiralInorganicNanoparticles:Origin,OpticalPropertiesandBioapplications[J].Nanoscale,2011,3(4):1374-1382.[79]ParveenS,MisraR,SahooSK.Nanoparticles:aBoontoDrugDelivery,Therapeutics,DiagnosticsandImaging[J].Nanomedicine:Nanotechnology,BiologyandMedicine,2012,8(2):147-166.[80]刘宁,曲毅,马腾.抗癌药递药有机纳米载体[J].广东化工,2016,(03):72-75.[81]KaranS,BanerjeeB,TripathiA,etal.NanoroboticsControlSystemsDesign–ANewParadigmforHealthcareSystem[J]..Springer,2015,83-91.[82]郑学刚.荧光碳纳米颗粒制备及其白光转换应用研究[D].曲阜:曲阜师范大学，2015.[83]HärmäH,SoukkaT,LönnbergS,etal.ZeptomoleDetectionSensitivityofProstate‐specificAntigeninaRapidMicrotitrePlateAssayUsingTime‐ResolvedFluorescence[J].Luminescence,2000,15(6):351-355.[84]VäisänenV,HärmäH,LiljaH,etal.Time‐ResolvedFluorescenceImagingforQuantitativeHistochemistryUsingLanthanideChelatesinNanoparticlesandConjugatedtoMonoclonalAntibodies[J].Luminescence,2000,15(6):389-397.[85]HärmäH,SoukkaT,LövgrenT.EuropiumNanoparticlesandTime-resolvedFluorescenceforUltrasensitiveDetectionofProstate-SpecificAntigen[J].ClinicalChemistry,2001,47(3):561-568.[86]SoukkaT,HärmäH,PaukkunenJ,etal.UtilizationofKineticallyEnhancedMonovalentBindingAffinitybyImmunoassaysBasedonMultivalentNanoparticle-AntibodyBioconjugates[J].AnalyticalChemistry,2001,73(10):2254-2260.[87]SoukkaT,PaukkunenJ,HärmäH,etal.SupersensitiveTime-ResolvedImmunofluorometricAssayofFreeProstate-SpecificAntigenwithNanoparticleLabelTechnology[J].ClinicalChemistry,2001,47(7):1269-1278.[88]SoukkaT,AntonenK,HärmäH,etal.HighlySensitiveImmunoassayofFreeProstate-SpecificAntigeninSerumUsingEuropium(III)NanoparticleLabelTechnology[J].ClinicaChimicaActa,2003,328(1):45-58.[89]HärmäH,PelkkikangasA-M,SoukkaT,etal.SensitiveMiniatureSingle-ParticleImmunoassayofProstate-SpecificAntigenUsingTime-ResolvedFluorescence[J].AnalyticaChimicaActa,2003,482(2):157-164.[90]LiangQN,ChenPQ,LiuTC,etal.DevelopmentofaTime-ResolvedFluoroimmunoassayforEpstein–BarrVirusViralCapsidAntigenIgAAntibodyinHumanSerum[J].JournalofVirologicalMethods,2015,22216-21.[91]ValanneA,HuopalahtiS,VainionpääR,etal.RapidandSensitiveHBsAgImmunoassayBasedonFluorescentNanoparticleLabelsandTime-ResolvedDetection[J].JournalofVirologicalMethods,2005,129(1):83-90.62 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌[92]MurrayK,CaoYC,AliS,etal.LanthanideDopedSilicaNanoparticlesAppliedtoMultiplexedImmunoassays[J].Analyst,2010,135(8):2132-2138.[93]WangF,TanWB,ZhangY,etal.LuminescentNanomaterialsforBiologicalLabelling[J].Nanotechnology,2006,17(1):111-125.[94]TangS,MoayeriM,ChenZ,etal.DetectionofAnthraxToxinbyanUltrasensitiveImmunoassayUsingEuropiumNanoparticles[J].ClinicalandVaccineImmunology,2009,16(3):408-413.[95]DuL,ZhangC,WangL,etal.UltrasensitiveTime-ResolvedMicroplateFluorescenceImmunoassayforBisphenolAUsingaSystemComposedonGoldNanoparticlesandaEuropium(III)-LabeledStreptavidinTracer[J].MicrochimicaActa,2015,182(3-4):539-545.[96]JaakohuhtaS,HärmäH,TuomolaM,etal.SensitiveListeriaImmunoassayBasedonEuropium(III)NanoparticulateLabelsUsingTime-ResolvedFluorescence[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2007,114(3):288-294.[97]KokkoL,SandbergK,LövgrenT,etal.Europium(III)Chelate-DyedNanoparticlesasDonorsinaHomogeneousProximity-BasedImmunoassayforEstradiol[J].AnalyticaChimicaActa,2004,503(2):155-162.[98]KokkoL,LövgrenT,SoukkaT.Europium(III)-ChelatesEmbeddedinNanoparticlesareProtectedfromInterferingCompoundsPresentinAssayMedia[J].AnalyticaChimicaActa,2007,585(1):17-23.[99]KokkoL,KokkoT,LövgrenT,etal.ParticulateandSolubleEu(III)-ChelatesasDonorLabelsinHomogeneousFluorescenceResonanceEnergyTransferBasedImmunoassay[J].AnalyticaChimicaActa,2008,606(1):72-79.[100]王斌,范薇,李艳,等.用两种ELISA方法快速检测大菱鲆细菌性出血性败血症的病原菌[J].大连水产学院学报,2008,(04):252-257.[101]池信才,王军,鄢庆枇,等.大黄鱼病原副溶血弧菌单克隆抗体制备及其应用[J].海洋科学,2007,(08):1-5.[102]高玉秋,万延建,陈田,等.基于ELISA的受体竞争结合法检测环境雌激素[J].生态毒理学报,2010,(04):599-605.[103]刘娜,孟庆雷,钟立华.酶联免疫吸附法在环境监测领域中的应用[J].安徽农业科学,2008,(24):10673-10674.[104]陈皓,方维焕,田春庄.虫媒病毒性脑炎的ELISA诊断方法研究[J].中国畜牧兽医文摘,2012,(07):51-52.[105]白雪梅,李太元,杨兴,等.应用间接荧光抗体技术检测林蛙嗜水气单胞菌[J].水产科学,2010,(10):613-615.[106]樊景凤,李光,王斌，等.间接免疫荧光抗体技术检测凡纳滨对虾红体病病原——副溶血弧菌[J].海洋环境科学,2007,(06):501-503.[107]沈锦玉,潘晓艺,余旭平,等.中华鳖白底板病病原的分析[J].中國水產科學,2007,14(5):815-822.[108]兰建新.养殖大菱鲆病原菌迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及快速检测技术的建立[D].青岛:中国海洋大学，2008.[109]顾宏杰.新型时间分辨荧光免疫分析法检测水产致病菌[D].厦门:集美大学，2015.[110]ZhiHM,HuangB,ZhangJ,etal.Time-ResolvedFluoroimmunoassayofZearalenoneinCerealswithaEuropiumChelateasLabel[J].JournalofRareEarths,2009,27(6):1088-1091.63 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌[111]张晓华,徐怀恕.检测海洋弧菌的酶联免疫吸附试验研究[J].青岛海洋大学学报,1997,(03):60-66.[112]朱大玲,李爱华,钱冬,等.嗜水气单胞菌毒力基因的研究进展[J].水生生物学报,2004,(01):80-84.[113]SubashkumarR,ThayumanavanT,VivekanandhanG,etal.OccurrenceofAeromonasHydrophilainAcuteGasteroenteritisamongChildren[J].IndianJournalofMedicalResearch,2006,123(1):61-66.[114]陈怀青,陆承平,陈琼,等.用点酶法检测鱼类致病性嗜水气单胞菌HEC毒素[J].动物检疫,1993,(04):9-11.[115]饶静静,李寿崧,黄克和,等.致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立[J].中国水产科学,2007,(05):749-755.[116]任燕,潘子豪,陆承平,等.Dot-ELISA法检测致病性嗜水气单胞菌[J].畜牧兽医学报,2011,(10):1409-1415.[117]HuangB,TaoW,ShiJ,etal.DeterminationofOchratoxinAbyPolyclonalAntibodiesBasedSensitiveTime-ResolvedFluoroimmunoassay[J].ArchivesofToxicology,2006,80(8):481-485.[118]焦奎.酶联免疫分析技术及应用[M].北京:化学工业出版社，2004.[119]卢洁,郭松林,冯建军,等.时间分辨荧光免疫法检测日本鳗鲡的产酸克雷伯氏菌[J].分析化学,2012,(11):1709-1714.[120]高翔,张燕,樊明涛.利用生物素链霉亲和素放大酶联免疫方法检测猪肉中莱克多巴胺残留[J].食品研究与开发,2009,(03):108-111.64 集美大学硕士学位论文基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌在学期间发表的学术论文[1]辛甜甜，郭松林，王艺磊，等.时间分辨荧光免疫分析技术的新进展[J].理化检验（化学分册）.65