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分类号：R284单位代码：10193密级：公开学号：20150603硕士学位论文吉林左家、河北昌黎两地乌苏里貉三种血液病原菌检测及致病性分析DetectionandPathogenicityAnalysisofThreeBloodPathogenicBacteriainWusuliRaccoonDoginJilinlefthometownandHebeiChangliCounty作者姓名：关东学位类别：农学硕士专业名称：野生动植物保护与利用研究方向：动物疾病方向指导教师：王全凯教授所在学院：中药材学院二零一八年五月 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其它个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其它形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日 摘要粘质沙雷氏菌、木糖氧化无色杆菌、草绿色链球菌均是条件致病菌，粘质沙雷氏菌和木糖氧化无色杆菌为革兰氏阴性菌，草绿色链球菌为革兰氏阳性菌。长期以来，由它们引起的疾病并不常见，还有一些人认为是有益菌，因此一直未被人们所重视。随着社会的发展，由多种病原菌引起疾病的相关报道也日益增加，许多病原菌引起疾病的发病情况、病情表现十分相近，且许多是混合感染，导致医生经验用药的情况持续发生且滥用抗生素的现象也十分普遍，造成医药费的严重浪费，由此许多病原菌在机体内发生变异，耐药性及致病性都有所增强，甚至有许多病原菌已出现多重耐药的情况。以上三种病原菌分别引起的疾病在临床医学上也越来越常见，近年相关文献报道逐渐增加，以上三种致病菌在健康人及动物体内存在，使人身安全受到潜在威胁。感染这几种菌有许多相似的病症，如宿主出现局部脓肿、发育不良、肺炎等，这给疾病诊断带来一定的干扰，也冲击养殖业的发展。作为人畜共患病的病原菌，在医学、兽医学领域意义重大。在对僵化乌苏里貉、病死乌苏里貉（以下称僵貉、病死貉）的研究中发现了以上三种菌。因此，急需开展对健康动物血液病原菌的检测调查，完善相关文献报道。鉴于以上原因，本研究第一部分对吉林左家养殖基地、河北昌黎两地共采集到的153份乌苏里貉进行血液进行病原菌检测调查（其中包括解剖收集6份僵貉、7份病死貉肝脏，其余均为健康乌苏里貉血液）。采用16SrRNA基因序列特异性扩增方法检测血液样品，对阳性样品克隆测序，通过构建系统发育树探寻每种病原菌的同源性差异；第二部分对检测到木糖氧化无色杆菌的僵化貉和病死貉肝脏进行细菌分离纯化培养，将分离到的木糖氧化杆菌菌株进行动物致病性试验及分析，为预防吉林、河北两地毛皮动物因木糖氧化无色杆菌引发疾病提供一些参考。1.吉林左家养殖基地、河北昌黎县散养户乌苏里貉血液病原菌的调查及系统发育分析在两地共选取153份血液样品通过细菌16SrRNA基因通用引物序列进行PCR扩增,阳性样品（1500bp左右）经克隆测序得出有草绿色链球菌4.58%（7/153）、节杆菌1.31%（2/153）、木糖氧化无色杆菌32.68%（50/153）、粘质沙雷氏菌5.23%（8/153）、微杆菌1.31%（2/153）、嗜麦芽窄食单胞菌1.31%（2/153），其中在河北昌黎散养户中检测到以上6种菌，吉林左家养殖基地只检测到木糖氧化无色杆菌，检测阳性率排前三的分别是木糖氧化无色杆菌、粘质沙雷氏菌和草绿色链球菌，将以上三种测序结果结合参考序列建立系统发育树，初步确定木糖氧化物色杆菌属于无色杆菌属；粘质沙雷氏菌属于沙雷氏属；草绿色链球菌属于链球菌属。2.动物致病性试验I 应用在僵貉、病死貉肝脏中分离出的木糖氧化无色杆菌，给小鼠腹腔注射进行动物致病性研究，试验结果表明：在48小时内吉林、河北两地共有8株组别致小鼠死亡，占总分离菌株61.54%。其中吉林地区致小鼠死亡情况较河北严重。关键词：草绿色链球菌；木糖氧化无色杆菌；粘质沙雷氏菌；病原菌检测；分离鉴定；致病性II AbstractStreptococcusviridans,Achromobacterxylosoxidans,andSerratiamarcescensareallconditionedpathogens.StreptococcusviridansisGram-positivebacteria,AchromobacterxylosoxidansandSerratiamarcescensareGram-negativebacteria.Foralongtime,thediseasescausedbythemhavenotbeencommon,andtheyhavebeenconsideredasbeneficialbacteriaandhavenotbeentakenseriouslybypeople.Withthedevelopmentofsociety,therearegrowingreportsofdiseasescausedbyavarietyofpathogens.Asmanypathogenicbacteriacausediseases,theconditionisverysimilar,andmanyofthemaremixedinfections,leadingtothedoctor'sexperienceindruguseandthepersistenceoftheabuseofantibiotics.Thephenomenonisalsoverycommon,resultinginaseriouswasteofmedicalexpenses,manypathogenicbacteriathusmutatedinthebody,resistanceandpathogenicityhavebeenenhanced,andeventherearemanycasesofpathogenshavebeenmultidrug-resistant.Diseasescausedbytheabovethreepathogensaremorecommoninclinicalmedicine.Therearereportsintheliteraturethattheabovethreepathogenicbacteriaexistinhealthypeopleandanimals,whichpossessapotentialthreattohumansafety.Therearemanysimilardiseasesthatinfectthesebacteria,suchaslocalabscess,dysplasia,pneumonia,etc.,whichbringscertaindisturbancetothediagnosisofthediseaseandalsoimpactsthedevelopmentoftheaquacultureindustry.Asapathogenofzoonosis,itisofgreatsignificanceinthefieldsofmedicineandveterinarymedicine.Theabovethreetypesofbacteriawerefoundinthestudyofrunt-likeWusuliRaccoondogscorpionanddiseasedWusuliRaccoondog(Thefollowingiscalledmortalsanddeadcirrhoticlivers).Therefore,Itisurgenttocarryoutinvestigationsonbloodpathogensinhealthyanimalsandimproverelevantliteraturereports.Fortheabovereasons,inthefirstpartofthestudy,153samplesofWusuliroccoondogpulmonaliscollectedinJilinandHebeiProvincewereinvestigatedforbloodpathogens(includinganatomicalcollectionof6mortalsand7deadcirrhoticlivers.Therestwereallhealthy.Wusuliroccoondogblood).16SrRNAgenesequence-specificamplificationmethodwasusedtodetectbloodsamples,andpositivesampleswereclonedandsequenced.Thephylogenetictreewasestablishedtoexplorethehomologydifferencesofeachpathogen;thesecondpartwastodetecttherigidityofAchromobacterxylosoxidans.Thesputumanddisease-killedliverswereisolatedandpurifiedbybacteria.Theisolatedxylose-oxidizingbacillusstrainswereusedforanimalspathogenicitytestsandanalysistoprovidesomereferenceforthepreventionofdiseasecausedbyAchromobacterxylosoxidansinfuranimalsinJilinandHebeiprovinces.1.InvestigationandphylogeneticanalysisofbloodpathogenicbacteriaintheleftfamilybreedingbaseinJilinandWusuliroccoondoginafree-familyhouseholdinChangliCounty,HebeiProvince.Atotalof153bloodsamplesweretakenfrombothsitesandamplifiedbybacterial16SrRNAuniversalprimers.Positivesamples(about1500bp)wereclonedandsequencedtofindStreptococcusviridans4.58%(7/153)andArthrobacter1.31%.(2/153),32.68%(50/153)ofAchromobacterxylosoxidans,5.23%(8/153)ofSerratiamarcescens,1.31%(2/153)ofMicrobacterium,maltophilicnarrowcellThebacteriawas1.31%(2/153),ofwhich6strainswereIII detectedinafree-familyhouseholdinChangliCounty,HebeiProvince,andonlyAchromobacterxylosoxidanswasdetectedintheleftfamilybreedingbaseinJilin.ThetopthreeratesforthepositiveratewereStreptococcusviridans,xylose,andcolorlessoxidation.BacillusandSerratiamarcescens,establishphylogenetictreesbycombiningtheabovethreesequencingresultswithreferencesequences,initiallyconfirmedthattheAchromobacterxylosoxidansbelongstoAchromobacter;SerratiamarcescensbelongstoSerratia;AchromobacterviridansbelongstoStreptococcus.2.AnimalpathogenicitytestUsedintherunt-likeRaccoondogandisolatedliversofA.xylosoxidans,micewereinjectedintraperitoneallytostudythepathogenicityofanimals.Theresultsshowedthat:within48hoursJilin,Hebei,atotalof8groupsofchicsmallRatsdied,accountingfor61.54%ofthetotalisolates.Amongthem,thedeathofmiceinJilinareawasmoreseriousthanthatinHebei.Keywords:Streptococcusviridans;Achromobacterxylosoxidans;Serratiamarcescens;Pathogendetection;Isolationandidentification;PathogenicityIV 缩略词英文缩英文全称中文名称写Blastbasiclocalalignmentsearchtool基于局部对准的搜索ddH2Odobledistilledwater双蒸水hhour小时minminute分钟IPTGPropylthio-b-D-galactoside异丙基硫代半乳糖苷PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应mlmilliliter毫升rpmroundperminute转／分TAETris-aceticacid-EDTAelectror乙酸电泳缓冲液cmcentimeter厘米NCBINationalCenterforBiotechnologyInformation美国国立生物技术信息中心LBLuria-Bertani溶菌肉汤kgkilogram千克VSViridansStreptococci草绿色链球菌CFcysticfibrosis全球囊性纤维ICUIntersiveCareUnit重症监护室LAMPLoop-MediatedIsothermalAmplification环介导等温扩增CFUColony-FormingUnits菌落形成单位16SrRNA16SribosomalRNA16S核糖体核酸核糖AmpAmpicillin氨苄青霉素5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-X-Galgalactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷mgmilligram毫克Llitre升μlmicroliter微升ssecond秒TSBTrypticSoyBroth胰蛋白胨大豆肉汤V 目录摘要...................................................................IAbstract.................................................................III缩略词.....................................................................V前言...................................................................1第一篇文献综述............................................................2第一章貉简介..............................................................21.1貉概述及生物学特性...................................................21.2貉经济价值...........................................................21.3我国貉饲养发展现状...................................................3第二章貉血液几种病原菌的研究进展..........................................42.1貉血液中几种病原菌的简介.............................................42.2貉血液中几种病菌引发疾病及其危害.....................................62.3貉血液中几种病原菌流行病情况研究.....................................7第三章貉血液病原菌的鉴定方法.............................................103.1传统鉴定方法........................................................103.2分子生物学鉴定方法..................................................10第四章本研究目的及意义...................................................12第二篇研究内容...........................................................13第一章貉血液病原菌的检测调查.............................................131.1试验材料............................................................131.2试验方法............................................................141.3结果与分析..........................................................171.4讨论................................................................241.5小结................................................................25第二章木糖氧化无色杆菌分离鉴定及动物致病性试验...........................262.1试验材料............................................................262.2试验方法............................................................262.3结果................................................................292.4讨论................................................................332.5小结................................................................34结论...................................................................35参考文献..................................................................36 作者简介..................................................................41致谢..................................................................42 前言如今，优质的生活条件使人们的思想观念发生了转变，以往人们对穿衣打扮已从廉价耐用转变为奢华时髦，对裘皮大衣、毛呢外套、毛绒围脖等高档服饰用品的需求量大大增加，因此毛皮动物养殖业随之蓬勃发展。貉作为毛皮动物产业重要的经济动物之一，其身上如毛、皮张、胆等均可加工成商品销向市场。因此，养殖户把能养出健壮、毛色光泽、低绒丰厚的貉作为养殖金标准。实际在养殖过程中，全国每年有成千上万的养殖户因貉患疾病、养殖技术落后等原因导致饲养成本上升、貉皮质量达不到市场回收标准，使养殖户蒙受巨大的经济损失，甚至还有部分养殖户及工作人员因为饲养管理不当患人兽共患病，同时也给人们身心健康带来威胁。目前通过对养殖场及散养户的走访调查发现，貉患疾病后很多是基于基础剖检，没有科学性诊断与针对性的治疗，靠经验下结论的现象较多，随着抗生素类药物滥用，导致许多病原菌耐药性、致病性增强，给动物医学界带来较大的挑战。本试验通过检测貉血液内病原菌，测试阳性率较高菌株的致病性，为减少因潜在病原菌患病所引发疾病而带来的损失贡献自己绵薄之力，也为动物疾病研究做出基础性研究。1 第一篇文献综述第一章貉简介1.1貉概述及生物学特性貉（Raccoondog）属动物界，脊索动物门，哺乳纲，食肉目，犬科的一种具有经济价值的毛皮动物[1]。貉在20世纪初分布在中国、朝鲜、俄罗斯和日本等许多国家，是东亚地区特有的毛皮动物，由于貉具有悠久的生存史，曾被认作是相似于犬科动物的祖先[2]。20世纪中叶，貉引入欧洲东部、北部后开始大量繁殖。之前自然状态下的貉为野生型乌苏里貉，由于貉皮经济价值日益凸显，单纯的人工捕猎已无法满足人们的消费需求，各国开始驯化、繁育，养貉业因此蓬勃发展。经过多年发展，貉养殖基地在我国各地分布较为广泛，因此有学者以长江为界，将长江南北的貉命名为南貉、北貉[3]。经过多年的人工养殖、人工培育，出现了如红色突变貉、吉林白貉、黑色突变貉，目前共有这4种貉。其中吉林白貉于1974年首次被发现，经过6年的发展在黑龙江再次被发现，中国农业科学院特产研究所成员花费近20年的研究[4]，终于将此色型貉稳定培育并受到消费者的热捧。在这四种貉中，乌苏里貉存在最普遍，以乌苏里貉为例，喜卧，群居性动物，养殖时一般一貉一笼，只有在繁殖期才一公一母同笼饲养。貉体重约6～12kg，体长约50～80cm，尾长约15～30cm。貉每年繁殖一次，1月末至4月初为貉配种的最佳时期，妊娠期约为两个月，平均胎数8头，分窝在50～60日（以出生日计算）。1.2貉经济价值貉有很高的经济价值，貉皮是裘皮产业中的重要原料之一，属大毛细皮，有抗寒保暖、结实抗磨、皮质柔软等优点，是制作高档裘皮大衣、皮领、皮帽等衣物备选材料之一[5-6]。貉针毛和尾毛可作为美妆工具的原材料。貉胆汁经干燥后入药，也有类似熊胆入药的功效[7]。据了解，2018年貉皮价格较年前略有上升，每张皮较年前涨了40元左右／张，各地因皮张质量、大小等因素价格略有不同。通过了解山东吉林、辽宁、黑龙江等貉养殖大省貉皮价格，综合统计见表1-1。表1-12018年东北三省、山东省貉皮价格统计表Tab.1-1StatisticsonMinkPriceofNortheastProvinceandShandongProvincein20182 东北三省皮价格（元／山东省皮价格（元／品种规格尺寸（cm）张）张）（Type）Size生皮熟皮生皮熟皮≥110350-380380-410330-360360-390100-109320-350350-380300-330330-360乌苏里貉95-99290-320320-350280-300300-33090-94270-290300-320250-280280-30085-89250-270280-300220-240250-270≥100400-450450-500390-440420-46095-99350-380380-400330-360350-380白貉皮90-94270-310310-340250-280280-31085-89240-270270-300210-240240-270注：以上信息仅代表个人观点，仅供参考！1.3我国貉饲养发展现状经过几十年，全球养貉业都迅猛发展，我国养貉业发展也是跌宕起伏，回顾我国养殖业旺势发展原因有以下几点：1、入行门槛低，养殖人员工作时间短、工作强度低；2、副产品价格较为合理，消费客户更加广泛；3、利润客观，回报率高；4、人民生活消费水平不断提高，对裘皮制品需求增多；5、可加工研制副产品种类较多；6、貉皮、貉毛等制品出口贸易增多；7、副产品奢华时尚，流行不易过时。制约其发展的原因有：1、养殖人员职业水平不过关，缺乏理论支撑及职业素养；2、养殖条件较差、饲养规模较小、缺乏科学的养殖技术指导；3、没有统一行业标准及管理办法，市场较为混乱；4、养殖场设施陈旧、营养配料不均衡；5、育种方式不合理，乱配现象严重；6、疾病预防意识不够强，导致许多地区传染病等各类疾病流行；7、盲目生产导致供过于求，产品价格下滑，成本增加。目前，中国毛皮动物养殖量居全球首位，各项工作也逐渐形成规模，规范化养殖也是我国毛皮动物产业发展的必经之路。自2013年起，中国皮革协会正式对外发布貂、狐、貉取皮数量，为毛皮动物养殖产业可持续发展提供了有力的数据支撑。2013～2017年我国貉取皮数量见图1-1。自2013年开始，取皮量连续三年持续增长[8-10]，到2016年开始滑落，这显示貉皮市场供大于求，库存量较多，根据中国皮革协会数据及当年的市场实际情况显示[10]，2016年貉取皮数量近五年来首次下降，2015年是取皮量顶峰的一年，说明库存量较大，接下来将会去库存，这会使取皮量减少，市场价格持续低迷。自数据被官方公布后，黑龙江省、吉林省、辽宁省、山东省和河北省五省貉养殖量就超过全国貉养殖总量的90%，这与温度、地理位置、市场需求等因素密不可分，其中养殖量最多的是河北省，其次是山东[11]。2017中国皮革协会最新统计报告显示，2017年全国貉3 取皮量同比降幅15.59%，是近五年来最大一次降幅，在2015年达到取皮量峰值后，近两年取皮数量有明显的下降趋势，说明去库存持续进行，为降低养殖成本，提高收益，养殖户在貉繁殖期不仅要控制繁殖数量，更应注重优质种貉的繁育。2013年-2017年我国貉取皮量对比图18001610单位：万张16001469140014001240119912001000800600400200020132014201520162017图1-12013～2017我国貉取皮量对比图Fig.1-12013-2017Comparisonoftheamountofraccoondoginourcountry第二章貉血液几种病原菌的研究进展2.1貉血液中几种病原菌的简介2.1.1草绿色链球菌（ViridansStreptococci，VS）4 草绿色链球菌又称为甲型（α）溶血性链球菌，属链球菌属，兼性厌氧G+细菌，显微镜下可发现溶血环内有红细胞，通常是人体重要的菌群之一，主要分布于上呼吸道、胃肠道等。近些年研究表明，当该菌进入血液后，尤其是在患有易感症状或免疫力低下的人群中时，会够造成严重感染，进而引起多种疾病，其中较为常见的有细菌性心内膜炎、中耳炎、鼻窦炎、脑膜炎、腹腔感染、免疫缺陷性肺炎和脑脓肿等[12-18]。该菌由于同一物种菌株之间的表型差异，这些生物体的分类和物种分化一直是一个挑战，至今并未被界内统一，目前该菌致病性菌株主要有唾液链球菌组（S.salivariusgroup）、变异链球菌组（S.mutansgroup）、缓症链球菌组（S.mitisgroup）和咽峡炎链球菌组（S.anginosusgroup），后者包括咽峡炎链球菌（S.anginosusgroup）、星座链球菌（S.constellatusgroup）和中间链球菌（S.intermediusgroup）[19]。如今，通过生理生化及细菌形态已经无法准确将其进行准确分型，需要通过16SrRNA基因序列结合管家基因验证来对该菌的种属进行准确系统的划分。2.1.2粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）粘质沙雷氏菌粘质属肠杆菌科，沙雷氏属，它是兼性厌氧G-菌，显微镜下呈短杆状，多分布于自然环境中。沙雷氏菌于1819年首次被报道，经历一个世纪后被统一命名为Serratiamarcescens。该菌是沙雷氏菌属中第一个被分离并命名的种，是该菌属中最常见的菌株，也是被研究人员研究的热点，到目前为止共有18个种归入沙雷氏菌属。早先，仅有几篇文献报道该菌可能会引起机体感染，多数认为是非致病菌，由于许多粘质沙雷氏菌菌株有红色素，因此它常被用作医学实验中的指试剂。如今，这种微生物病原菌是一种公认的临床病原体，易引起人类，动物和昆虫感染，临床上因该菌患病或是混合致病的病例越来越多，尤其在高危环境中更易引起发病。同时，也有报道该菌在动物体内被检测到具有致病性，因此该菌也属于人兽共患病病原菌之一。温度对该菌的影响很大，在25℃-31℃间会产生一种具抗癌作用的灵菌红素。同时温度升高也会提高该菌活力，增强其感染力及致病力[20]。2.1.3木糖氧化无色杆菌（Achromobacterxylosoxidans）木糖氧化无色杆菌多存在于水生环境中，属于无色杆菌属，是种需氧型G-菌，过氧化氢酶及氧化酶试验均呈阳性。该菌最初由Yabuuchi和Ohyama两人在患有化脓性中耳炎患者耳部分泌物中分离出来的，经过一系列生理生化鉴定及耐药性分析，发现分离物与之前已有物种不同，因此被正式命名[21]。该菌广泛分布于潮湿的土壤、木材等水含量丰富的环境中[22]，Amoureux等人对土壤、水、泥土、植物、医院及家庭中潮湿角落进行木糖氧化无色杆菌易感测试，最终发现在每处均有该菌存在，且在医院所检测到的菌株与患该菌的患者分离出的菌株相同[23]。由于它是机会性病原体，被认为是全球囊性纤维（cystic5 fibrosis，CF）患者和免疫功能低下患者中重要的新发病原体，通常感染免疫力较差（如新生儿）、体质较弱，机体自身患病（如肿瘤患者）及使用大量抗生素的患者。2.2貉血液中几种病菌引发疾病及其危害2.2.1草绿色链球菌引发的疾病草绿色链球菌是人类的一种条件致病菌[24]。常见的草绿色链球菌及致病类型多样见表2.1，感染草绿色链球菌的人大多引发胸腔感染、脑脓肿、脑膜炎、心内膜炎等疾病，主要表现以长期发热、心力衰竭等症状。草绿色链球菌原本是人体正常菌群之一，后发现其具有致病性，在人们口腔内就可引发感染，如牙龈出血，甚至在刷牙过程中未注意有该菌进入血液中，易引发菌血症，严重者会患上心内膜炎。有学者调查发现，由该菌引发的感染性心内膜炎病例数量在近些年呈明显的上升趋势[25]。同时也有研究报道，草绿色链球菌在经济动物水貂体内被发现，病貂前胸及大腿内侧出现脓包，出现大规模死亡，共造成118只仔貂病死，给养殖场带来巨大经济损失，这也是我国首次在病死貂中分离出该菌[26]，给毛皮动物养殖业带来一定的警示作用。表2-1草绿色链球菌主要致病菌种类、疾病Tab.2-1MainPathogensandDiseasesofStreptococcusviridans致病菌疾病名称草绿色链球菌属唾液链球菌脑膜炎、脑脓肿、肺炎等变异链球菌心内膜炎缓症链球菌血流感染、中耳炎、心内膜炎中间链球菌牙龈脓肿、败血症、心内膜炎咽峡炎链球菌组咽峡炎链球菌腹腔感染、心内膜炎星座链球菌菌血症、皮肤感染、心内膜炎2.2.2粘质沙雷氏菌引发的疾病粘质沙雷氏菌在以前被认为是农作物病虫防害的天然菌种，对害虫具有很强的致病性，有效降低植物受侵害的可能性[27-29]，被认作是有益菌。经过多年的发展，由于环境、寄主等条件的变化，该菌为一种条件致病菌，越来越多的研究集中在人和动物感染该菌患病，感染该病的人许多会出现肺炎[30]、眼部疾病[31]、尿路感染、败血症和脑膜炎等[32-33]同时有研究表明，该菌在河流中被分离[34]，可能感染鱼类、虾类等水生动物，若人们在日常生活中，食用该菌感染的鱼类、虾类等水产食品，或接触该菌污染的海水，都极有可能产生疾病，由于该菌分布之广，不仅会使水产养殖业受威胁，增加水产食品受污染的可能性，还会给食品安全、公共卫生安全带来严峻挑战。6 2.2.3木糖氧化无色杆菌引发的疾病木糖氧化无色杆菌为条件治病菌，通过查阅前些年相关报道其致病力不强。近些年，由该菌引发的疾病案例不断增多，严重程度逐渐加深，人类及动物均有因该菌患病报道。感染木糖氧化无色杆菌的患者会引发肺炎[35]、菌血症[36]、脑膜炎[37]、腹泻[38]、心内膜炎[39]、心包炎[40]、败血症[41]、伤口及组织感染[42]等疾病。除人外，在猪动物体上也发现由该菌引起猪肺炎病[43]的病例，病猪呼吸困难，精神抑郁、时常咳嗽、剖检发现胸部积液；新生儿感染该菌患败血症表现为出生体重不高于1.5kg，个别甚至低于1kg，同时血小板含量及中性粒细胞有明显减少。该菌致病力虽然不强，但存在潜在致病性，也常与其他病菌混合致病，根据近些年文献记载，人与动物均因该菌有过病发史并且致病力逐年上升，该菌对人类身心健康及畜牧业稳定发展造成一定的困扰。因此，我们需引起重视。2.3貉血液中几种病原菌流行病情况研究2.3.1草绿色链球菌流行病情况研究在人类方面，有关草绿色链球菌引发的疾病案例在国内外已经被广泛报道，典型疾病为感染性心内膜炎，严重可使人致死。感染心内膜炎多以心脏机能较弱、免疫缺陷及有心脏手术史的患者为主。研究人员收集213名感染草绿色链球菌患者样本，经分离统计发现咽峡炎链球菌组中的这两种菌占比近63%，其中咽峡炎链球菌占比高于星座链球菌，可见咽峡炎链球菌在致病性方面相较于其他几种菌存在明显的优势，需要加以重视[19]。另有研究人员对98例感染心内膜炎患者进行血培养，最终有39株为致病菌，其中有23株为草绿色链球菌，但其并未对这23株进行种属分类[44]。吴雅冬等对子宫切除术后病人观察第5天发现患者盆腔积有脓液，后经细菌培养鉴定为草绿色链球菌所致[45]。曹云松等在某儿童医院眼科收集分泌物715份，分离得到革兰氏阳性菌551份，其中有366份为草绿色链球菌，在对草绿色链球菌药敏试验中发现，该菌对红霉素的敏感率最低，所以在眼部抗菌药的研制过程中应将这一因素考虑其中[46]。除人类外，王昭文等发现仔貂感染草绿色链球菌，导致死亡118只仔貂，给养殖场带来巨大损失，患病原因经调查怀疑是喂饲病死猪肉进而感染草绿色链球菌[26]。与此同时，国外也有相关报道，VallejoM等在哥伦比亚的四家医院调查有关社区获得性腹腔感染的原因，共将192位患者纳入调查，经分离得到致病菌136株，其中有88株为G-菌（大肠埃希菌81株），23株为G+菌（其中草绿色链球菌6株、肺炎克雷伯菌3株）。因此，作者建议在预防及治疗急腹症过程中应将这三种主要致病菌综合考虑，科学用药[47]。JomaaW等人在突尼斯三所医院纳入73例年龄≤18岁的未成年患感染性心内膜炎的儿童，其中有17例分离出草绿色链球菌[48]。综上可见，感染草绿色链球菌由心脏扩至全身大多部位，在动物体内也有发现，因此我们应加以重视，这对科学预防疾病发生、公共卫生安全及养殖业健康发展具有重要意义[49]。7 2.3.2粘质沙雷氏菌流行病情况研究在人类方面，由粘质沙雷氏菌引发的疾病在国内外已经被广泛报道，研究人员在浙江大学医学院重症监护室（IntersiveCareUnit,ICU）共分离出57株粘质沙雷氏菌，不考虑重复菌株共有17株，其中有16株来自血液样品，1株来自医务人员手中，这种病菌在许多医院内都被分离过，是医院获得性感染病原菌之一，大约占全部数量的8%。同时还发现患者大部分有长期的基础疾病史，这也与免疫力的低下有一定关系[50-51]。另有文献报道在许多地区该菌在眼部被发现，其中有自发感染、也有术后感染，这可能是通过镜框、隐形眼镜片、手术器械等外部因素感染该菌[52]。杨芳[53]等人在湖南省某医院收集到该菌共427株，并对该菌的分离标本、分离科室进行详细统计，结果显示痰液中占比64.87%，在ICU内分离占比19.44%，再一次证明该菌在ICU内分布之广泛。在动物体内，以往由该菌感染的病例鲜有报道，近些年报道病例逐渐上升。张志强[54]等人于2018年于河北省昌黎县某养殖场发现一株该菌致水貂败血症的病例，这是国内首例报道。潘跃[55]等人在黑龙江某养殖场取病死水貂脏器，经分离培养得到三株该菌株，经测试确定其具有一定的致病性，这两例报道为毛皮动物养殖业带来一定警示作用。在其他动物如猪[56]、兔[57]、鸡[58]等动物也有感染该菌致病的相关报道。与此同时，在国外许多国家也有相关报道。自20世纪50年代以来，已有大量报道粘质沙雷氏菌大暴发与医院相关，所以通常认为由粘质沙雷氏菌引起的感染主要是医源性的。然而，最近Laupland[59]等人对加拿大的沙雷菌感染进行了广泛的调查，发现沙雷氏菌引起的所有感染中有65%是以社区为基础的，粘质沙雷氏菌是最常见的分离物种，占所有分离的沙雷氏菌（233株）物种总数的92％。2003年11月至2004年1月在波兰进行的一项全国范围的大型调查显示，粘质沙雷氏菌是肠杆菌科中第五个最常被回收的生物体，占所有肠杆菌科临床分离物的4％。2008年1月至2008年6月在日本的一项全国性调查显示，粘质沙雷氏菌会引起6.4％的尿路感染，该研究于国外证实粘质沙雷氏菌是导致尿路感染的五大常见原因之一[60]。还有调查数据显示，从所有住院患有肺炎的患者中分离出来的病原菌统计有3.5％为粘质沙雷氏菌。在这次调查中，美国肺炎患者中粘质沙雷氏菌的发病率为4.1％，欧洲发病率为3.2％，拉丁美洲为2.4％。总体而言，沙雷菌属物种是医院住院患者肺炎的常见七大原因之一[61]。2.3.3木糖氧化无色杆菌流行病情况研究在人类方面，由木糖氧化无色杆菌引发的疾病在国内外已经被广泛报道，临床上多数以肺炎症状为主，严重可使人或动物致死，由于该菌为机会治病菌，免疫力低下或者患有疾病的人群更易被感染。刘超[62]等人在某解放军医院发现28例由感染该菌引发的获得性肺炎，其中男性23例，女性5例，年龄均在60岁以上，其中有25例年龄超过80岁。也有学者对广西某医院86份感染该菌患者信息得出，患者平均年龄≥68岁，多有基础病史[63]。由此看出，年龄较大、免疫力较低的人更易被感染。王伟宝[41]等人发现新生儿感染该8 菌引发败血症，多数新生儿体重少于1kg，有1例死亡，曾有报道因感染该菌死亡率在15%～47.5%，在一定程度上威胁着新生儿的生命安全。近些年在临床上动物体感染该菌患病的报道较少，近期一例因猪感染该菌患肺炎致死[43]，为加强畜牧业日常预防工作敲响警钟。同时国外有学者对22例患病新生儿研究发现，有12例因感染该菌患菌血症，这12名患者均为早产儿，另有三例患败血症死亡，经调查发现所有分离出的菌株与医院菌株相同，怀疑可能由于院内感染所致[36]。相继在土耳其也有类似报道[64-65]，这些案例在一定程度上证实了新生儿感染该菌易患菌血症，因此在患病婴儿中应注意早产儿、体重较轻儿童的身体状况，从而有效降低疾病发生机率。Roy[49]等人在印度发现一例在癌症患者中有该菌引发的肺部感染，迄今为止，仅有极少数地区记录过这一病情，这是印度环境下首例患有潜在恶性肿瘤的患者中由该菌引起的肺部感染。9 第三章貉血液病原菌的鉴定方法3.1传统鉴定方法传统的病原菌鉴定方法是先将低浓度的病原菌进行培养，通过提供待测样品中的病原菌相应的条件，再展开一系列生理生化鉴定。以木糖氧化无色杆菌为例，该菌在麦康凯培养基上的形态呈圆形、半透明、灰白色、光滑凹凸的菌落。在37℃孵育24小时后，观察可疑菌落从中挑选进行生化鉴定。木糖氧化无色杆菌指标见表3-1。表3-1木糖氧化无色杆菌的生化特征Tab.3-1BiochemicalcharacteristicsofAchromobacterxylosoxidans特征氧化酶触酶V-PM-RO-F硝酸盐还吲哚原木糖氧化无色++--O-+杆菌H2S蔗糖麦芽糖甘露醇尿素酶DNA酶乙酰氨酶------+·注：“+”阳性,“—”阴性,“O”非发酵型。Note:"+"positive,"-"negative,"O"non-fermented随着技术的不断发展，传统的鉴定方法有时会因个别菌生化指标十分相似、技术方法不规范等因素导致结果偏差，目前更多试验研究倾向菌株分离培养、生理生化鉴定、分子生物学鉴定、管家基因鉴定等方法相结合，更能准备检测，目前传统的生理生化鉴定在多数情况下作为一种有效的辅助鉴定方法。3.2分子生物学鉴定方法近些年，学者对细菌的鉴定不局限于传统的鉴定方法，而是通过分子生物学技术来检测微生物病原菌，结果较传统鉴定方法更准确，辨别度更高。其中主要有聚合酶链反应同源性分析（PCR）、荧光定量PCR、介导等温扩增反应（LAMP）、酶联免疫PCR（ELISA-PCR）等方法。目前最常用的分子检测方法是利用16SrRNA基因序列设计引物诊断，利用其保守区高度稳定，分类不同种属核苷酸片段，通常是将菌种进行分离纯化，结合生理生化反应进行鉴定，接着通过对16SrRNA基因序列设计通用引物进行分子上的鉴定，结合测序结果进行数据比对，构建进化树进行遗传信息分析，这种方法不仅敏感性高，鉴定准确度、简10 易程度优于传统的鉴定方法，目前生理生化鉴定实验结合16SrRNA基因序列进化分析是当前实验室鉴定病原菌的热点方法。除此之外，也有人通过利用LAMP法检测病原菌，LAMP法整个扩增反应只需在等温条件下进行，反应条件也相对简便，用肉眼就能观测检测结果。何晓伟[66]等人运用LAMP法检测李斯特菌，灵敏度能够检测到1.08×101cfu/mL，但其弊端会因灵敏度更高而易造成假阳性。以上两种方法是利用分子生物技术鉴定病原菌的常用方法，但任何技术都有其缺陷[67]，如利用16SrRNA基因序列鉴定对序列间差异较大的有较好的效果，而对差异较小的（如同种间菌株的分型），该方法就存在一定局限性；LAMP法存在引物设计较为复杂、敏感度过高、不易扩增长链DNA等。11 第四章本研究目的及意义貉作为主要毛皮动物之一，有着较高的经济价值。因此貉患病不仅影响着自身皮张质量、毛缺乏光泽、繁殖等各项生理机能下降，还关乎养殖者自身安全及利益。草绿色链球菌（ViridansStreptococci，VS）、粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）、木糖氧化无色杆菌（Achromobacterxylosoxidans）均在貉体内检测到，经了解，这三种病原菌均为人兽共患病的病原菌，而这几种病原菌并未引起人们的重视，由于许多疾病的患病因素是极其复杂的，人们也并未对此进行更深层的诊断，导致抗生素类药物广泛使用。长此以往，可能会致使菌株耐药性增强，毒力增强，导致动物体或人类患病，严重甚至死亡。经国内外查阅文献发现，本试验检测到的这几种病原菌首次在貉体内发现。本试验通过对正常貉血液病原菌进行16SrRNA基因序列分析及构建发育树，对僵貉、病貉进行病原菌分离培养及动物致病性实验，力求填补这几种病原菌可引发貉患疾病的空白，为减少在毛皮动物养殖业中因这几种病原菌引发疾病产生的经济损失以及为疾病预防及针对性治疗做些基础性研究。12 第二篇研究内容第一章貉血液病原菌的检测调查1.1试验材料1.1.1动物样品来源样品来自河北昌黎县散养户、吉林左家镇中国农业科学院特产研究所养殖基地的乌苏里貉。1.1.2主要试剂及配制方法试剂名称公司国家血液DNA提取试剂盒北京全式金生物技术有限公司中国北京EXTaq酶TAKARA公司日本DL2000Marker、DL3000Marker、DL15000MarkerTAKARA公司日本50×TAE上海将来实业股份有限公司中国PCR产物回收纯化试剂盒康为世纪生物科技有限公司中国溴化乙锭金博益生物技术有限公司中国DH5α感受态细胞TAKARA公司日本琼脂糖上海生工生物公司上海pUCm-T载体TAKARA公司日本培养皿扬州市创新医疗器械有限公司中国质粒DNA小量纯化试剂盒TAKARA公司日本（1）氨苄青霉素（Amp）贮存液（0.1g/mL）：用电子天平称取氨苄粉末0.5g，置于10mL离心管中，加入5mL双蒸水，震荡混匀，70℃水浴充分溶解，1.5mL离心管分装并用锡纸包裹放于-20℃保存。（2）X-Gal（20mg/mL）：用电子天平称1g固体X-Gal，置于50mL离心管中，加入40mLDMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解后，定容至50mL，分装于离心管（1mL/份）后，用锡纸包裹好贮存于-20℃保存备用。（3）IPTG：用电子天平秤称2gIPTG置于离心管中，加入8ml蒸馏水，定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装于离心管（1mL/份），贮存于-20℃。（4）LB液体培养基：用电子天平秤取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，置于1000mL烧杯中，在其中加入800mL蒸馏水将其充分搅拌溶解；滴加1mol/L的NaOH13 溶液将PH调至7.2左右后倒入容量瓶（1L）中定容至1L，121℃高压灭菌30min。放置超净工作台中冷却约60℃时，加入1mL氨苄溶液（100mg/mL），牛皮纸密封瓶口后置于4℃保存备用。（5）含Amp的LB固体培养基：用电子天平秤取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，置于1000mL烧杯中，在其中加入800ml蒸馏水使其充分搅拌溶解；滴加1mol/L的NaOH溶液将PH调至7.2左右后倒入容量瓶（1L）中定容至1L，加入琼脂粉12g，121℃高压灭菌30min。放置超净工作台中冷却约60℃时，加入1mL氨苄溶液（100mg/mL），摇匀后进行倒板，每个平板中倒入10mL左右的固体培养基，混匀，待培养基凝固晾干好后用封口膜包好平板倒置于4℃环境保存备用。（以上配制过程需要在无菌环境下操作）1.1.3主要仪器恒温培养振荡器（ZWY-240，上海世平实验设备有限公司）、高压灭菌锅（NC581UI07237，上海申安医疗器械厂）、电子天平（200730139667，沈阳拓宇宙衡器有限公司）、超低温-80℃冰箱（739274VD83G，海尔公司）、PCR扩增仪（Eppendorf公司，德国）、干式恒温金属浴（MK-200，无锡沃信仪器制造有限公司）、切胶仪（374BR-4343，美国）、超净工作台（TY201400020，苏州净化设备有限公司）、分析天平（上海岛韩实业有限公司）、高速低温离心机（Sigma离心机1-14，Sigma离心机1-14）、8联排离心机（MK-20AS-MK20-1897，杭州奥盛仪器有限公司）、电泳仪（EPS-3006014G，上海书俊仪器设备有限公司）、凝胶成像仪（721BR05599，美国）、电热恒温培养箱（21.003150111，苏州威尔实验用品有限公司）、制冰机（SHS400617104，厦门国仪科学仪器有限公司）等。1.2试验方法1.2.1样品采集共两次采集样品，第一次于2016年5月于河北省昌黎县5家散养户中7选取共70只外表健康的乌苏里貉、6只僵化貉的血液；第二次于同年6月于吉林市左家镇中国农业科学院特产研究所养殖场选取70只外表健康的乌苏里貉血液、7只病死貉；心脏采集血液并编号，-20℃冻存。其中僵貉和病死貉经剖检讲肝脏取出带回实验室-80℃冻存。1.2.2貉血液DNA提取根据北京全式金生物技术有限公司EasyPureBloodGenomicDNAKit提取试剂盒（目录号：EE121，全式金，北京）说明书，操作步骤如下：1、在样品中加20μlProteinaseK，500μlBB3，漩涡15秒充分混匀样品，室温放置10分钟。2、短暂离心，将上述样品全部倒入装有吸附柱的管内，12000rpm离心1分钟，弃流出液。14 3、加入500μl溶液CB3（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30秒，弃流出液。4、加入500μl溶液WB3（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30秒，弃流出液。5、重复步骤4一次。6、12000rpm离心2分钟，彻底去除残留的WB3。7、将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入50-200μl预热EB（60℃-70℃），或去离子水（PH>7.0）室温静置1分钟，12000rpm离心1分钟，洗脱DNA。8、可选步骤：为得到更多的DNA，可进行第二次洗脱，在柱的中央加入50-200μl预热EB（60℃-70℃）或去离子水（PH>7.0）室温静置1分钟，12000rpm离心1分钟，洗脱DNA；洗脱出的DNA于-20℃保存。DNA质量检测：将所提取的DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测（5uL，130V，25min），Marker为DL15000，标号分装于离心管中，-20℃保存备用。1.2.3引物设计与合成引物参考GenBank上细菌通用引物[43、68]16SrRNA基因序列设计引物并由上海生工生物技术有限公司合成。表1-1实验所用引物Tab.1-1Experimentalprimersused引物名目的片段长目的基因称引物序列度16FACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT16SrRNA1500±200bp16RGGTTACCTTGTTACGACTT1.2.4PCR反应及产物纯化回收1.2.4.1PCR扩增表1-2PCR扩增体系Tab.1-2StepsOneoftheNestedPCR试剂反应体系（μL）DNA模板215 16F116R1EXTaq酶12.5ddH2O8.5体积25根据TaKaRaExTaq酶说明书PCR扩增反应要求，条件如下：98℃10sec，56℃30sec，72℃1.5min，整体进行30个循环，4℃保存。1.2.4.2扩增产物电泳将PCR扩增产物（5μl）置于1%琼脂糖电泳仪胶孔中，130V，25分钟，Marker为DL2000，结束置于凝胶成像仪观察结果并做好图片保存。1.2.4.3产物切胶回收、纯化将电泳胶块置于紫外灯切胶仪中，佩戴防护眼镜，将阳性样本目的片段切下回收，做好标记。根据TaKaRaMiniBESTDNAFragmentPurificationKitVer.4.0试剂盒进行试验操作，4℃保存。1.2.5产物连接转化a.连接反应：试剂反应体系10×LigationBuffer1μl50%PEG1μlpUCm−T载体1μl纯化后的PCR产物2μl无菌水4μlT4DNALigase1μlFinalVolume10μl于16℃恒温水浴锅反应1小时。注意：一般最后加入T4DNALigase。b.转化：1.将100μlE.coliDH5α感受态细胞，置于冰上30分钟，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。16 2.加入5μl连接液，轻轻混匀。冰上放置30分钟。3.42℃水浴加热90秒，插入冰中15-20分钟。4.加400μlSOC培养基，37℃，于恒温培养振荡器200-250rpm振荡培养1小时。5.常温下4000rpm离心5分钟，抽取上清液400μl，用剩余的培养基将细胞悬浮。6.将上述培养液每10μl涂布在预先用20μl100mMIPTG及100μl20mg/mlX-gal涂布的氨苄青霉素平板上。此步骤注意要先将提前备好的LB培养皿取出，在无菌工作台中紫外照射20分钟，涂板前应做好标记，涂板时每涂一个应及时封闭、灭菌，平板在37℃下正向放置1小时待培养液浸入平板，然后放入恒温培养箱过夜培养即可看到菌落情况，若有平板未长菌落或菌落较少，可适当增加培养时间。1.2.6质粒DNA提取质粒DNA根据Takara公司质粒DNA小量纯化试剂盒说明书提取（CodeNo.9760）。凝胶电泳观察结果。1.2.73种病原菌16SrRNA基因序列进化树的建立除草绿色链球菌、黏质沙雷氏菌、木糖氧化无色杆菌外，其余菌株样本量较少，所以本试验只将以上三种菌株双向测通后的基因序列全长在NCBI数据库进行Blast比对，分别下载同源性最近的序列，用Mega5.0软件绘制进化树。1.3结果与分析1.3.1电泳结果1.3.1.1血液DNA提取结果从血液DNA提取结果图中（图1-1）可看出，貉血液DNA呈单一明亮、清晰密集条带，满足后续试验的标准。图1-1貉部分血液DNA提取结果Fig.1-1RaccoondogPartialBloodDNAExtractionResults1.3.1.2PCR结果17 将PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳仪中130V，工作20分钟，Marker为DL2000，在凝胶成像仪下约1500bp（部分结果见图1-2）左右有明亮条带出现，符合预期片段长度要求，可用于后期试验。M1234567891011121314151617181920图1-2貉血液病原菌PCR检测M:DNA分子质量标准（DL2000）1-20:部分血液样品（约1500bp），5、7、8、10、11为阴性样品,其余为阳性样品Fig.1-2RaccoondogBloodPathogenDetectionbyPCRM:DL2000DNAMarker1-20:Partofthebloodsample(about1500bp)，5、7、8、10、11arenegativesamples,therestarepositivesamples1.3.2转化子蓝白斑筛选转化成功重组克隆子在X-Gal／IPTG平板上呈现白色，非重组克隆呈现蓝色，如图1-3，选择白色菌落，进行后续试验。18 图1-3X-Gal／IPTG平板蓝白斑生长情况Fig.1-3X-Gal/IPTGplateblueandwhitespotgrowth1.3.3吉林左家养殖基地、河北昌黎两地乌苏里貉血液病原菌感染情况分析在吉林、河北两地收集到的153份血液样品中，采用16SrRNA基因序列细菌通用引物进行PCR扩增，经克隆、质粒回收测序，共检测到71株阳性样品，总阳性率为46.41%，其中吉林地区采集血液77份，检测到33株阳性样品，阳性率为42.86%，在河北地区采集血液76份，检测到38株阳性样品，阳性率为50%，两地检测到的阳性菌株种类及阳性率见表1-3。经统计发现，吉林、河北两地均检测出木糖氧化无色杆菌，其中6只僵化貉与7只病死貉检测结果也全部为木糖氧化无色杆菌。表1-3吉林、河北两地貉血液病原菌感染情况Tab.1-3BloodPathogenicBacteriaInfectioninRoccoondoginJilinandHebei省份种类检测数阳性样品数阳性率（%）草绿色链球菌74.58微杆菌21.31木糖氧化无色杆菌1722.37河北76嗜麦芽窄食单胞菌21.31粘质沙雷氏菌85.23节杆菌21.31吉林木糖氧化无色杆菌773342.86合计（Total）1537146.411.3.3.1不同地区乌苏里貉感染情况19 本研究对吉林左家养殖基地、河北昌黎散养户中采集153份血液样品，通过采用16SrRNA基因序列扩增，除木糖氧化无色杆菌在两省菌检测到外，其余病原菌不做对比。在两省共检测到50份为木糖氧化无色杆菌，该菌在两地阳性率分别见下图，吉林左家检出率（42.86%）高于河北昌黎检出率（22.37%），如图1-4。木糖氧化无色杆菌阳性率0.50.40.30.20.10吉林河北1-4吉林、河北两地木糖氧化无色杆菌阳性率对比图Fig.1-4Comparisonofthepositiveratesofxylo-oxidizingachromobacterinJilinandHebei1.3.3.2两地不同性别乌苏里貉感染木糖氧化无色杆菌情况在检测的153分血液样品中，其中公、母乌苏里貉血液分别为77份和76份，本研究从不同性别间检测到木糖氧化无色杆菌，在吉林左家检测到公乌苏里貉21份，母乌苏里貉12份，阳性率分别为27.27%和9.12%；在河北昌黎县散养户中共检测到公乌苏里貉10份，母乌苏里貉7份，阳性率分别为12.99%和9.21%，见图1-5。阳性率%403020100公母20吉林河北 图1-5吉林、河北两地不同性别乌苏里貉感染木糖氧化无色杆菌情况Fig.1-5InfectionwithAchromobacterxylosoxidansindifferentsexesinJilinandHebei1.3.4种病原菌发育树的构建1.3.4.1草绿色链球菌16SrRNA基因序列同源性比较及进化树分析通过系统发育树可以看出，测序所得到的7份样品与草绿色链球菌都有同源性，属于草绿色链球菌属，虽然有个别基因缺失等因素的干扰，但依然可以作为鉴定扩增序列为草绿色链球菌的一种有效的方法，其中16HB-43与参考序列NR025197、16HB-58与参考序列KU179373.1、16HB-15与16HB-19同源性较高，其中参考序列NR025197是从香肠中分离得到，可能与制作香肠的动物原料有关。图1-6河北貉草绿色链球菌与相近病原菌16SrRNA基因序列比较的同源性系统发育树Fig.1-6Homologyphylogenyofthe16SrRNAgenesequencesofStreptococcusviridansandsimilarpathogensinRaccoondog,HebeiProvince21 1.3.4.2木糖氧化无色杆菌16SrRNA基因序列同源性比较及进化树分析经克隆测序在吉林地区共有33株木糖氧化无色杆菌样品，在GenBank上Blast比对，选取11个参考序列进行进化树的构建及同源性关系分析，进化树表明，33株木糖氧化无色杆菌与所报道的木糖氧化无色杆菌同在一个分支上，其中16JL-05(S)与HQ676601.1同一进化支上，该参考序列菌株从肺结节癌症患者中分离到；16JL-07(S)与MF144475.1在同一分支上，该参考序列菌株从囊性纤维化患者分离到；还有一部分菌株形成新的分支，如图1-7。将河北地区所检测到的木糖氧化无色杆菌样品在GenBank上Blast比对，选取7株参考序列进行进化树的构建及同源性分析，进化树表明，所有序列与已报道的木糖氧化无色杆菌有同源性，其中16HB-03(J)与KY697918.1在同一分支上，相似率达到97%，16HB-05(J)和16HB-06(J)与16HB-03(J)遗传距离也较近，但不在同一分支上，表明不同动物体的木糖氧化无色杆菌存在一定的差异；16HB-04(J)与MF144475.1在同一分支，与16HB-02(J)相距较与16HB-03(J)更近，如图1-8。22 图1-7吉林貉木糖氧化无色杆菌与相近病原菌16SrRNA基因序列比较的同源性系统发育树Fig.1-7.Homologyphylogenyofthe16SrRNAgenesequencesofAchromobacterxylosoxidansandsimilarpathogensinRaccoondog,JilinProvince图1-8河北貉木糖氧化无色杆菌与相近病原菌16SrRNA基因序列比较的同源性系统发育树Fig.1-8.Homologyphylogenyofthe16SrRNAgenesequencesofAchromobacterxylosoxidansandsimilarpathogensinRaccoondog,HebeiProvince1.3.4.3粘质沙雷氏菌菌16SrRNA基因序列同源性比较及进化树分析通过系统发育树可以看出，测序所得到的8份样品与粘质沙雷氏菌都有同源性，属于沙雷氏菌属，同样有个别基因缺失等因素的干扰，但依然可以作为鉴定扩增序列种属关系23 的一种有效的方法，其中16HB-27与参考序列JASM1同源性为98%，与16HB-42同源性高达99%，说明他们属于同一种。图1-9河北貉粘质沙雷氏菌与相近病原菌16SrRNA基因序列比较的同源性系统发育树Fig.1-9.Homologyphylogenyofthe16SrRNAgenesequencesofSerratiamarcescensandsimilarpathogensinRaccoondog,HebeiProvince1.4讨论人们通常习惯性的认为非常见致病菌不会感染动物体或对其不能造成致病性伤害，一直未能引起人们的重视，但近些年由于环境的破坏、药物的滥用等众多因素，一些游离于人们视线之外的非常见病原菌致病案例报道快速增长，作为人畜共患病的病原菌，它们不仅会使动物患病，还会使人类感染疾病，传播性强且范围广。本研究主要对吉林左家养殖基地、河北昌黎散养户中外表健康的乌苏里貉及几例僵化、病死貉血液病原菌进行检测分类，虽然检测到6种菌，但检测阳性率最高的前三种菌为草绿色链球菌、木糖氧化无色杆24 菌、粘质沙雷氏菌，所以本次研究主要对以上三种菌进行数据分析及系统进化分析。这三种菌均为条件致病菌，具有很低的致病力，经过近些年的发展，可能由于缺乏科学的确诊导致抗生素的滥用及抗菌药物的普及应用，这几种病原菌的致病力逐渐增强，也有出现多重耐药的情况。免疫力低下或患有疾病的人群更易感染这几种菌，在医院内，木糖氧化无色杆菌和粘质沙雷氏菌更易爆发，引起肺炎、败血症等疾病[69-70]除感染人类外，近些年在毛皮动物中感染现象越来越普遍。本章试验对吉林、河北两地乌苏里貉血液检测发现，这三种菌在河北昌黎散养户中都被检测到，其中检测到草绿色链球菌7份，木糖氧化无色杆菌17份，粘质沙雷氏菌8份；在吉林左家养殖场只检测到木糖氧化无色杆菌，共33份，这在一定程度说明散养可能较规模化养殖病原菌更具多样性，这可能也与当地的养殖环境、温度、饲料等因素有关。在检测样品中，僵貉与病死貉更为特殊，在它们的血液中均检测到木糖氧化无色杆菌，这是首次在僵化貉、病死貉体内发现该菌的存在，导致貉僵化或致死可能有多种原因，这可能是其中的一种病原菌，具体需要全面、长远的研究。本试验通过16SrRNA基因序列对153份血液病原菌进行初步检测，为后续针对性试验样品选择进行筛选，同时又通过系统发育树的构建，了解每种病原菌的同源性，更进一步确定种属关系。目前在兽医学界，由于许多致病因素十分复杂，很多情况下无法及时、准确的确诊治疗，一方面导致许多动物患病，严重威胁动物界持续性稳定发展；另一方面，未经了解其致病机理，更多的是尝试性治疗，致使许多病原菌发生多重耐药性。因此，通过本次的检测，已有许多健康貉存在潜在病原菌，在实际养殖过程中，养殖者更应坚持预防大于治疗的原则，定期观察、检测，不能忽视每一个细节。1.5小结从吉林左家养殖基地、河北昌黎散养户中随机选取的153份貉血液样品中通过16SrRNA基因序列扩增检测到71份阳性样品，经克隆质粒回收测序，共有6种菌，其中草绿色链球菌、木糖氧化无色杆菌、粘质沙雷氏菌阳性率排前三。25 第二章木糖氧化无色杆菌分离鉴定及动物致病性试验根据之前结果得出，这是目前首次在吉林病死貉、河北僵貉（均为乌苏里貉）血液中均检测到木糖氧化无色杆菌，近些年有关木糖氧化无色杆菌引起人类及动物发病的相关报道也日益增多，病情严重甚至会危及生命安全。乌苏里貉感染该菌不仅会严重抑制貉的生长发育、皮张质量，给养殖者造成巨大的经济损失，还可能会作为传染源传染其他人或动物。在本章试验中，分离培养木糖氧化无色杆菌，通过生理生化鉴定、16SrRNA基因序列扩增、酶切鉴定确定该菌，进而对该菌致病性强弱研究试验，针对试验结果统计及分析。以其为未来的疾病预防提供一点参考，为公共卫生安全作出小小的贡献。2.1试验材料2.1.1主要试剂及配制方法试剂名称公司细菌DNA提取试剂盒北京全式金生物技术有限公司6×loadingbufferTAKARA公司细菌微量生化反应管河北明发生物科技有限公司麦康凯培养基北京华越洋生物科技有限公司PstI限制性内切酶TAKARA公司其余试剂同本文1.1.2。胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基：用电子天平秤取胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，置于1000mL烧杯中，在烧杯中加入800mL蒸馏水使其充分溶解，滴加1mol/L的NaOH溶液将PH调至7.2左右后倒入容量瓶（1L）中定容至1L，121℃高压灭菌30min，牛皮纸密封瓶口后置于4℃保存备用。2.1.2主要仪器同本文1.1.3。2.2试验方法2.2.1样品采集同本文1.2.1保存的僵貉、病貉肝脏，实验动物为6周龄左右的昆明鼠70只，体重15-18g，购自吉林大学实验动物中心。2.2.2细菌分离培养26 将本文1.2.1保存的河北、吉林两地僵貉及病貉肝脏样品（共13只）在无菌操作下分别接种新鲜的麦康凯琼脂平板，将平板分为大小不等的四个区域ABCD每个区域之间夹角为120度。首先选取圆滑的接种环，按照无菌操作蘸取少量培养的菌液，左手持平板倾斜四十五度靠近酒精灯，右手持带有菌液的接菌环在A区域画平行的五条线，随即将接菌环置于酒精灯外焰灼烧，目的是将多余的菌液清除，避免多余菌液影响分离单菌落效果。灼烧的接菌环在平板边缘未使用的区域轻点几下，待接菌环温度恢复正常后在B区域画五条平行线，与A区域划线夹角保持在120度。随后重复B区域划线步骤完成C、D区域的划线操作。将培养基置于厌氧罐中37℃培养24小时，观察菌落生长形态，挑取清晰闪亮、光滑的菌落至LB液体培养基中，37℃恒温纯培养24小时后观察菌落，革兰氏染色，镜检。2.2.3细菌保存将菌液置于高速低温离心机中8000rpm离心5min，挑取菌体置于标好记号的管中，加入200µL80％甘油和200µLTSB液体培养基，振荡混匀，密封后在液氮中冻结转至-80℃冰箱保存备用。2.2.4生化反应鉴定挑取少许麦康凯培养基中生长良好的单个菌落，置于细菌微量生化反应管中，根据说明书中规定的反应时间进行生化反应鉴定。2.2.5细菌分子生物学鉴定2.2.5.1细菌DNA提取1、Gram-negativeBacteria裂解（a）取出过夜培养的木糖氧化无色杆菌1ml，12000rpm离心1分钟，将上清液尽可能的吸取弃掉。（b）加入100μlLB11和20μlProteinaseK，振荡至菌体彻底悬浮。（c）55℃孵育15分钟。（此时溶液应呈清亮状，若无此现象出现，可延长孵育时间呈30分钟，每隔5分钟摇匀一次。）2、加入20μlRNaseA混匀后放置2分钟。3、加入400μlBB11（使用前请先检查是否加入无水乙醇）漩涡30秒。（此步可能会产生白色絮状沉淀或者透明胶状物，但不影响基因组DNA的提取。）4、将上一步反应物加入离心柱中，12000rpm离心30秒，丢弃滤液。5、加入500μlCB11,12000rpm离心30秒，丢弃滤液。6、重复步骤5一次。27 7、加入500μlWB11（使用前请先检查是否加入无水乙醇），12000rpm离心30秒，丢弃滤液。8、重复步骤7一次。9、12000rpm离心2分钟，彻底去除残余的WB11。10、将离心柱置于一干净的离心管中，在柱中央加入50-200μl预热EB（60-70℃）或去离子水（pH>7.0）,室温静置2分钟，12000rpm离心1分钟，洗脱DNA。11、重复步骤10一次。洗脱的DNA于-20℃保存，作为PCR扩增反应中DNA模板。DNA质量检测：将所提取的DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测（5uL，130V，25min），Marker为DL15000，标号分装于离心管中，-20℃保存备用。2.2.5.2木糖氧化无色杆菌PCR鉴定木糖氧化无色杆菌引物参照文献[71-72]并附加酶切位点，由上海生工合成。表2-1实验所用引物（加酶切）Tab.2-1Experimentalprimersused(enzymedigestion)引物名目的基因称引物序列目的片段长度16FCTGCAG-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG16SrRNA1500±200bp16RCTGCAG-GGTTACCTTGTTACGACTTPCR反应体系及条件同1.2.4。2.2.5.2产物电泳同本文1.2.4.2。将产物送至上海生工进行测序。2.2.5.3产物切胶回收、纯化同本文1.2.4.3步骤操作。2.2.5.4产物连接转化同本文1.2.5步骤操作。2.2.5.5质粒DNA提取同本文1.2.6步骤操作，将所提质粒送至上海生工测序部进行测序。28 2.2.5.6琼脂糖凝胶电泳同本文1.2.6.1步骤操作。2.2.5.7酶切鉴定将上一步提取的质粒进行酶切鉴定，反应体系：PstⅠ1μl10×MBuffer2μl质粒DNA2μl无菌水15μl反应条件：温度37℃，酶切水浴1小时。琼脂糖凝胶电泳检测：制备1％琼脂糖凝胶电泳，观察酶切结果，结果标记为pMD18(J、S)。2.2.6动物致病性试验取70只小鼠，随机分为14组，每组5只，1-13组为试验组，14组为对照组，参照蔺旭光[40]等人研究的接种剂量，取上述试验分离纯化的13株分离株菌液，用无菌磷酸缓冲盐溶液（PBS）将13株分离株菌液浓度分别调至1×109CFU/ml，每株对应一组，腹腔注射0.5ml稀释菌液，对照组注射等量的生理盐水，接种后每隔12小时观察，观察3天并做好记录。2.3结果2.3.1细菌的分离从吉林病死貉及河北僵化貉肝脏中共分离出12株菌株，该分离菌在麦康凯琼脂平板上呈光滑、闪光、透明、边缘整齐的菌落，见图2-1.图2-1菌落形态29 Fig.2-1Colonymorphology2.3.2生化鉴定结果将河北、吉林两地分出的13例疑似木糖氧化无色杆菌通过细菌生化试验进行鉴定，13株生化试验结果统计见表2-2。表2-2分离株生化结果Table2-2Biochemicalresultsofisolates检测类别（Detection阳性率（Positiverate）阴性率（Negativerate）category）氧化酶（Oxidase）100%(13/13)0（0/13）触酶（catalase）100%(13/13)0（0/13）蔗糖（sucrose）0（0/13）100%（13/13）麦芽糖（maltose)0（0/13）100%（13/13）硝酸盐还原(Nitratereduction)0（0/13）100%（13/13）甘露醇（Mannitol）0（0/13）100%（13/13）尿素酶（Urease）0（0/13）100%（13/13）乙酰氨酶（Acetylase）100%(13/13)0（0/13）DNA酶（Dnase）0（0/13）100%（13/13）H2S0（0/13）100%（13/13）枸橼酸盐（Citrate）0（0/13）100%（13/13）吲哚试验（Indoletest)100%(13/13)0（0/13）V-P(Voges-Prokauerreaction)0（0/13）100%（13/13）M-R（Methylred）0（0/13）100%（13/13）葡萄糖氧化发酵F0（0/0）O100%（13/13）注：“O”为非发酵型，“F”为发酵型Note:"O"isnon-fermented,"F"isfermented2.3.3细菌分子生物学及酶切鉴定2.3.3.1DNA质量检测结果将所提的细菌DNA与6×loadingbuffer混合后，加样至1%琼脂糖凝胶电泳仪中，130V，工作20分钟，结果如图2-2。30 图2-2细菌提取DNA结果Fig。2-2DNAExtractionResultsofBacteria2.3.3.2PCR电泳结果13株分离株经琼脂糖凝胶电泳试验结果显示清晰条带约1500bp，这与预期目的片段大小相符；如图2-2。将1-6菌株命名为16HB-01(J)、16HB-02(J)、16HB-03(J)、16HB-04(J)、16HB-05(J)、16HB-06(J)；7-13命名为16JL-01(S)、16JL-02(S)、16JL-03(S)、16JL-04(S)、16JL-05(S)、16JL-06(S)、16JL-07(S)。图2-2僵貉、病死貉分离株质粒PCR检测M:DNA分子质量标准（DL2000）1-6：僵貉分离株质粒，7-13：病死貉分离株质粒（约1500bp）Fig.2-2Runt-likeanddead-killerRaccoondogisolatesPCRdetectionM:DL2000DNAMarker1-6:Runt-likeRaccoondogIsolateplasmid，7-13dead-killerRaccoondogIsolateplasmid(about1500bp)2.3.3.3酶切鉴定结果31 所提质粒用PstI限制性内切酶单酶切，由于目的片段两端分别有一个酶切位点，中间有一个酶切位点，共得到2773bp、1000bp和500bp三条带，如图2-3.图2-3PstⅠ酶切鉴定电泳图pMD18(J、S)M:DNA分子质量标准（DL3000）Fig.2-3PstIdigestionanalysiselectrophoresisM:DL3000DNAMarker2.3.4动物致病性试验结果对13株木糖氧化无色杆菌分离株进行动物致病性试验，试验结果表明：吉林地区分离株48小时内试验组共有5组分离株致小鼠致死，占吉林分离株总组数71.4%（5/7），其中全部死亡的占28.57%（2/7），四只死亡无，致三只及三只以下小鼠死亡组数的分别占14.29%（1/7），有两组未出现小鼠死亡情况；河北地区分离株48小时内实验组共有3组分离株致小鼠，占河北分离株总组数50%，其中全部死亡及死亡四只为零，致三只及三只以下小鼠死亡组数的分别占33.33%（1/7）。吉林河北共有8组出现致小鼠死亡的情况，占两地分离株总组数的61.54%（8/13），此次试验对照组小鼠未出现死亡情况。小鼠死亡具体情况见表2-3、表2-4。表2-3吉林木糖氧化无色杆菌分离株菌株动物致病性结果一览表Table2-3AnimalpathogenicityofstrainsisolatedfromJilinAchromobacterxylosoxidans16JL-16JL-16JL-16JL-16JL-16JL-16JL-01(S)02(S)03(S)04(S)05(S)06(S)07(S)12h1只死亡1只死亡1只死亡03只死亡04只死亡24h2只死亡03只死亡0005只死亡36h00005只死亡0032 48h0000000死亡数2/51/53/505/505/5死亡率40%20%60%0100%0100%表2-4河北木糖氧化无色杆菌分离株菌株动物致病性结果一览表Table2-4AnimalpathogenicityofstrainsisolatedfromHebeiAchromobacterxylosoxidans16HB-01(J)16HB-02(J)16HB-03(J)16HB-04(J)16HB-05(J)16HB-06(J)12h001只死亡1只死亡0024h1只死亡02只死亡3只死亡0036h00000048h000000死亡数1/502/53/500死亡率20%0%40%60%0%02.4讨论本试验从吉林左家镇养殖基地6只病死貉、河北昌黎县7只僵化貉肝脏中分离得到貉体内病原菌，经细菌分离培养、生化特性试验、细菌16SrRNA基因序列克隆扩增、酶切等相关鉴定方法，证明在这13只貉体内所分离的病原菌为木糖氧化无色杆菌。木糖氧化无色杆菌为条件性致病菌，由于该菌致病力相对较弱，没有对人类及动物健康构成威胁，人们忽视了对该菌的研究，但近些年由该菌引发的疾病报道明显增加。目前，在新发传染病的种类中，人兽共患病占四分之三[73]，随着人畜共患病病原菌种类不断增多且致病机理复杂多样，人类健康人面临严峻挑战，该菌作为人畜共患病的病原菌，已在许多动物体内被发现并报道，多引起动物厌食、呼吸困难、绒毛粗糙等表现，本次试验从僵化貉中分离到该菌，说明该菌可能影响动物消化过程，貉一旦出现僵化，不仅严重影响皮张质量，免疫力低的貉还易引起继发感染，失去饲养价值，给养殖户造成经济损失。除在貉外，在鸡、牛、狼等动物中也发现该菌。随着老龄化情况不断加剧，宠物犬成为人们生活中的精神伴侣，因貉为犬科动物，因此更应重视犬科动物中犬新发传染病的预防。即通过本试验将分离的木糖氧化无色杆菌进行动物致病性试验，以此了解其毒力，该菌的毒立经历从无到有、从弱到逐渐变强可能是基于人们长期的忽视，抗生素类药物的频繁使用，导致该菌产生耐药性突变。由于目前很少有木糖氧化无色杆菌引发毛皮动物发病的报道，未出现爆发性感染，但也有相关病例逐渐被报道。因此，我们需要规范使用抗生素类药物，发病要准确准段、及时治疗，未发病也要定期排查，提前预防。33 本试验有许多欠缺之处，如未对分离菌进行耐药性测试、毒力基因检测，在鉴定上缺少管家基因鉴定方法，再今后的学习中应在这几点上下功夫，以求多方位的了解该菌，为研究者提供更多有价值的信息。2.5小结通过分离培养吉林病死貉、河北僵化貉菌株，经生化特性鉴定、16SrRNAPCR扩增鉴定、酶切鉴定，测序比对得出所有菌株与血液病原菌检测相同，均为木糖氧化无色杆菌，后经小鼠致病性试验发现，病死貉所分离的菌株毒性高于僵化貉所分离的菌株。34 结论1.通过对吉林、河北地区养殖场及散养户抽检的貉进行病原菌种类检测调查，统计发现木糖氧化无色杆菌阳性率最高，总阳性率为32.68%（50/153），吉林作家养殖基地检测阳性率为42.86%（33/77），河北昌黎散部分养户检测阳性率为22.37%。另外，在河北散养户中共检出6种病原菌，吉林养殖场只检测出1种病原菌，说明散养病原菌种类多于规模化养殖，再此建议散养户应规范性养殖。2.对吉林病死貉、河北僵化貉肝脏分离培养木糖氧化无色杆菌，13株所分离的木糖氧化无色杆菌进行动物致病性试验，结果表明吉林作家养殖基地病死貉有5株具有致病性，河北昌黎散养户中僵化貉有3株具有致病性。35 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作者简介姓名关东性别男民族汉吉林省籍贯政治面貌中共党员入学时间2015.9长春市申请学位类论文答辩授予学位年农学硕士2018.52018.7别日期月就业信息就业单位联系方式（个人/办就业单位就业单位地址性质公）学习（工作）经历2011.9-2015.6吉林农业大学中药材学院野生动物与自然保护区管理专业2015.9-2018.6吉林农业大学研究生学院野生动植物保护与利用专业攻读学位期间发表与学位论文的科研成果信息胰岛素样生长因子11.吉林农业大学；基因多态性与生产性动物医学进12.中国农业科学院能关系研究进展展特产研究1.中国农业科学院附红细胞体病及流行动物医学进1特产研究；状况概述展2.吉林农业大学；41 致谢在这十九年的求学历程中，读研这三年让我感触颇多，三年一千零九十五个日日夜夜，让我满怀珍惜这一切的人和往事。在此衷心感谢我的导师王全凯教授，一日为师，终身为父，感谢您三年来对我的关心与呵护，让我时刻感受父爱般的温暖；感谢您在我迷茫时为我指引方向，使我有不断的动力前行；也要感谢恩师支持我所做的一切，让我懂得无论前方有多少艰难险阻，都有老师为我加油鼓劲，他的鼓励和信任使我不惧风浪、勇敢前行。王老师工作任劳任怨，科研规划严谨，对生活乐观态度都是我学习的动力，师恩永难忘，再次衷心的感谢王全凯老师。由衷的感谢中国农业科学院特产研究所徐超老师，也是在三年科研生活中帮助最多的人，毫不保留的给我传授知识、经验，使我在科研上不断完善方法设计，在生活的帮助及未来事业上少走弯路。由衷的感谢吉林农业大学李新殿老师、王超老师、赵全民老师、苏凤艳老师，帮助我树立了正确的人生观、价值观，在我人格养成的重要阶段给予许多帮助及指导性建议。由衷的感谢团队里的宋兴超老师、张浩、陈明帅、杜占宇等几位师兄对我试验上的帮助与指导，感谢郭跃跃、刘乃榕、李婷、韩志强、栾明明、李炎桂、潘虹军等师弟师妹们对我试验的帮助及平时带给我的快乐。由衷的感谢刁乃超、费亦东、李启军、李大帅、李泽西、王泽、侯云亮、陈宝、张正义、闫伟等几位好哥们多年的帮助与鼓励，使我在忙碌的科研生活中收获到这份宝贵的兄弟情。由衷的感谢本篇论文的评阅专家及答辩委员会的专家，感谢你们所提出的专业性修改意见，使我的论文更加饱满、完善。最后由衷的感谢我的父母，感谢多年的养育之恩，正是因为他们这么多年无微不至的照顾与关爱，我才可以健康的成长；也正是因为为我提供了优越的成长环境、教育资源，我才可以全身心投入学业，收获知识。同时，我也要感谢我的爱人，杜佳珊女士，一直以来在背后默默的支持着我！三年的时光匆匆流过，不舍的是师生之间浓浓的情谊，同学间互帮互助的情怀，正是你们的陪伴和支持，为我的研途生活留下许多美好回忆。在未来的工作中，我将秉持艰苦奋斗，自强不息的决心，为社会贡献绵薄之力。再次真挚感谢以上所有人，谢谢！42
