《检测血清4型禽腺病毒非结构蛋白22K、52K抗体的ELISA方法建立及应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号Ｍ１５０７０５学号ＵＤＣ密级蜷叫大奈ＹＡＮＧＺＨＯＵＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ硕士学位论文（全日制学术学位）检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用申秋平指导教师姓名：叶建强教授，扬州大学，江苏扬州，２２５００９申请学位级别：硕士学科专业名称：预防兽医学论文提交日期：２０１８年４月论文答辩日期：２０１８年５月３０日学位授予单位：杨州大学学位授予日期：２０１８年６月２１曰答辩委员会主席：陈鸿军研究员２０１８年６月 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５５Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＥＬＩＳＡｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｔｏｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｒｏｔｅｉｎ２２Ｋａｎｄ５２Ｋｏｆｙｐｓｅｒｏｔｙｐｅ４ｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ研究生：申秋平导师：叶建强教授扬州大学二〇一八年 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用１检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用摘要－ＦＡｄＶ４于禽腺病毒属＿４血清４型禽腺病毒（）属。近年来，国内鸡群由ＦＡｄＶ引起的包涵体肝炎－４不－７１－２０、心包积液病例逐渐增多。ＦＡｄＶ仅感染３周龄肉鸡，还感染０周龄的，给养鸡业造成了巨大的经济损失，蛋鸡。由于灭活疫苗的研制及应用今后如何来鉴别鸡－群是自然感染还是处于免疫状态，对ＦＡｄＶ４有效及时防控至关重要。本研究以ＦＡｄＶ４的非结构蛋白中的２２Ｋ和５２Ｋ为靶点，通过多肽合成，建立分别检测２２Ｋ和５２Ｋ蛋白抗体的基于多肽表位的ＥＬＩＳＡ方法，并评价其能否用于区分检测自然感染鸡群与灭活疫苗免疫鸡群。－１Ｖ４２２Ｋ５２Ｉ．检测ＦＡｄ非结构蛋白、Ｋ抗体的ＥＬＳＡ方法建立ＤＮＡ－为区分检测自然感染鸡群与灭活疫苗免疫鸡群，本研宄在利用Ｓｔａｒ对ＦＡｄＶ４非结构蛋白２２Ｋ及５２Ｋ进行抗原性分析的基础上，进行了多肽合成、筛选，并建立了检测－２２Ｋ及５２Ｋ蛋白抗体的ＥＬ２２Ｋ４Ｐ和５２Ｋ－４ＰＩＳＡ方法。多肽筛选结果发现，合成多肽与－－ＦＡｄＶ－４。阳性血清反应性最佳通过条件优化，分别建立了基于２２Ｋ４Ｐ和５２Ｋ４Ｐ多肽的－－－－－Ｖ４ＥＬ２２Ｋ４Ｐ－ＥＬＩＳＡ４Ｐ－检测ＦＡｄ抗体的ＩＳＡ方法，以及５２ＫＥＬＩＳＡ。２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ以－－４Ｐ－ＥＬＳＡＣＵＴＯＦＦ及５２ＫＩ的值分别为０．１６６８以及０．１８２。特异性试验证明所建立的两个ＥＬ－ＩＳＡ仅与ＦＡｄＶ４多抗血清反应，而不与所检测的抗其它禽类病毒包括鸡贫血病毒ＣＡＶ－（）、血清８型禽腺病毒ＦＡｄＶ８、禽网状内皮组织增生症病毒（ＲＥＶ）、传染性支气管炎（）病毒（ＩＢＶ）、马立克氏病病毒（ＭＤＶ）、新城疫病毒（ＮＤＶ）、禽流感病毒（ＡＩＶ）的多抗血清反应。ＥＬ－重复性试验表明所建立的两个ＩＳＡ的批内及批间的变异系数均小于１０％。检测ＦＡｄＶ４－２Ｋ－４Ｐ－ＳＡ５２Ｋ－４ＰＥＬＥＬＩＩＳＡ方抗体的２以及法的建立，为区分检测自然感染鸡群与灭活疫苗免疫鸡群提供了技术可能。－２．检测ＦＡｄＶ４非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法的初步应用－－２２４Ｐ－ＥＬ－Ａ为评价所建立的ＫＩＳＡ以及５２Ｋ４ＰＥＬＩＳ方法能否用于区分检测自然感染－－－－－，２Ｋ４ＰＥＬ鸡群与灭活疫苗免疫鸡群将２ＩＳＡ以及５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ对ＦＡｄＶ４人工感染鸡群，临床发病鸡群以及灭活疫苗免疫鸡群血清进行了检测：并与基于结构蛋白Ｆｉｂｅｒ２的检测ＦＡｄＶ４抗体的ＥＬＩＳＡ以ＩＦＡ。检测结果表明２４ＦＡｄＶ－４及方法进行了比较：在检测份人－－－－－，２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ，５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡＦ２ＥＬＩＡ工感染鸡群鸡血清样品时，Ｓ和ＩＦＡ的阳性率分别为８７．５％、９５．８％、１００％和〗００％；在检测１８９份临床发病鸡群鸡血清样品时，－－－２２Ｋ－４Ｐ－ＥＬ，５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ，Ｆ２ＥＬＩＳＡＩＦＡ．７％、．９６．３％ＩＳＡ和的阳性率分别为８５８８％、９－－－－和９３－．７％；在检测８１灭活疫苗免疫鸡群血清中，２２Ｋ４ＰＥＬ１ＳＡ，５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ，Ｆ２ＥＬＩＳＡ ２扬州大学硕士学位论文和ＩＦＡ的阳性率分别为２．５％，０％，１００％和１００％。以上结果表明，本研宄建立的－－４ＦＡｄＶ－４２２Ｋ－４ＰＥＬＩＳＡ和５２Ｋ－４Ｐ－ＥＬＩＳＡ方法可以鉴别鸡群是ＦＡｄＶ自然感染还是处于－灭活疫苗免疫状态，可为ＦＡｄＶ４的防控与净化提供技术支撑。－４２２Ｋ５２Ｋ关键词；：：灭活疫苗免疫：ＦＡｄＶ：；；合成肽间接ＥＬＩＳＡ自然感染 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用３ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＥＬＩＳＡｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｔｏｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｒｏｔｅｉｎ２２Ｋａｎｄ５２Ｋｏｆｓｅｒｏｔｅ４ｐｙｐｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓＡｂｓｔｒａｃｔ－Ｓｅｒｏｔｅ４ＦｏｗｌＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＦＡｄＶ４ｂｅｌｏｎｇｓｔｏｔｈｅｇｅｎｕｓＡｖｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓｙｐ（），ｔｈｅｃａｓｅｓｏｆｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｈｅｐａｔｉｔｉｓ（ＩＢＨ）ａｎｄｈｙｄｒｏｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＨＰＳｃａｕｓｅｄｂ）ｙｄ－４－ＦＡＶｉｉｆｌｉＴｔＡｄＶ４ｏｔｉｎｄｏｍｅｓｔｃｃｈｃｋｅｎｏｃｋｓａｒｅｎｃｒｅａｓｉｎｇｇｒａｄｕａｌｌｙ．ｈｅｏｕｂｒｅａｋｏｆＦｃｃｕｒｓｎｏ－－ｏｎｉｌｆｂｕ０ｌｄｌｉｎ３７ｗｅｅｋｓｏｌｄｂｒｏｅｒｌｏｃｋｓｔａｌｓｏｉｎ１２０ｗｅｅｋｓｏｌａｅｒｆｌｏｃｋｓｗｈｉｃｈｈａｓｃａｕｓｅｄｙ，ｙ，ｓｅｒｏｕｓｅｃｏｎｏｍｃｌｏｓｓｅｓｔｏｔｈｅｏｕｌｔｒｉｎｄｕｓｔｒｉｎＣｈｉｎａ．ｕｅｔｏｔｈｅｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔａｎｄａｌｉｃａｔｉｏｎｉｉｐｙｙＤｐｐｐｏｆｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｓｈｏｗｔｏｄｉｓｔｉｎｕｉｓｈｔｈｅｃｈｉｃｋｅｎｓｗｉｔｈｎａｔｕｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｆｒｏｍｔｈｅｓｅ，ｇｖａｃｃｉｎａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｉｓｃｒｕｃｉａｌｆｏｒｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｎｄｔｉｍｅｌｙｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｐｆｏｈｅｔ－ｒｔｈｅｄｉＡＶ４ＩｎｔｔｒｔｉｉｓｅａｓｅｃａｕｓｅｄｂｔｉｎｆｅｃｏｎｏｆＦｄ．ｔｈｉｓｓｕｄｔｗｏｎｏｎｓｕｃｔｕｒａｌｒｏｅｎｓ２２Ｋｙｙ，ｐｔｓ－ｅｆｏｒｅｔｉｄｅｓｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｔｈｅｅｔｄＥＬＩＳＡａｎｄ５２Ｋｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｔａｒｉｅｂａｓｅｄｓｗｅｒｅｇｐｐｙ，ｐｐｆｏｒｅｔｅｃｔｉｉｉｈｅｄｄｅｖｅｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｅｓａａｎｓｔ２２Ｋａｎｄ５２Ｋｒｅｓｅｃｔｖｅｌ．ＴｈｅｅｓｔａｂｌｉｓＥＬＩＳＡｓｌｏｐｅｄｄｇｐｙ－ｆｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｆｏｒｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｓｆｏｒｄｉｓｔｉｎｇｕｓｈｉｎｇｔｈｅＦＡｄＶ４ｎａｔｕｒａｌｌｙｉｎｆｅｃｔｅｄｆｌｏｃｋｓｒｏｍｆｌｏｃｋｓｖａｃｃｉｎａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅ．１ｂ－－ｌｉｈｍｅｎｄｉｌ．ＥｓｔａｓｔｏｆａｎＥＬＩＳＡｆｏｒｔｈｅｅｔｅｃｔｏｎｏｆＦＡｄＶ４ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｒｏｔｅｉｎｓ２２Ｋａｎｄ５２ＫｐＩｔｉｎｏｒｄｅｒｏｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｔｈｅｎａｔｕｒａｌｌｙｎｆｅｃｔｅｄｃｈｉｃｋｅｎｓｆｒｏｍｃｈｉｃｋｅｎｓｖａｃｃｉｎａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｔｅａｎｔｉｅｎｃｉｔｏｆｔｗｏｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕａｌｒｏｔｅｉｎ２２ＫａＫｏｆＦＡｄＶｓ，ｈｇｉｙｒｐｎｄ５２４ｗａｆｉｒｓｔｌａｎａｌｚｅｄｕｓｉｎＤＮＡＳｔａｒａｎｄｓｅｖｅｒａｅｔｅｓｄｅｒｖｅｄｆｒｏｍ２２Ｋａｎｄ５２Ｋｒｅｓｅｃｔｉｖｅｇｌｉｄｉｌｙｙ，ｐｐｐｙ－ｗｅｒｅｓｎｔｈｅｓｉｚｅｄａｎｄｓｃｒｅｅｎｅｄＴｔｄｅＩＳＡｆｏｒｈｅｄｅｔｅｃｔｉｉｙ．ｈｅｅｉｂａｓｅｄＥＬｔｉｏｎｏｆａｎｔｂｏｄｉｅｓａａｎｓｔｐｐｇ－Ｐ－２２Ｋａｎｄ５２Ｋｗｅｒｅｅｎｅｒａｔｅｄｉｔｇ．ｅｐｔｄｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔ２２Ｋ４Ｐａｎｄ５２Ｋ４Ｐｐｅｐｉｄｅｓ－－－ｓｔｉｗ４ｉｉｓｈｏｗｅｄｒｏｎｒｅａｃｔｉｖｔｉｔｈＦＡｄＶｏｓｔｖｅｓｅｒａ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡａｎｄｇｙｐ，－－５２Ｋ－４ＰＥＬＩＳＡｗｅｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＦＡｄＶ４ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｏｔｉｍｉｚｉｎｇｔｈｅｙｐ－－－－－ｃｏｎｄｉＴｈｅＣｖａ２２Ｋ４ＰＥＬＩＡ５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡｗ１１８２ｔｉｏｎｓ．ＵＴＯＦＦｌｕｅｏｆＳａｎｄａｓ０．６６８ａｎｄ０．－ｒｅｓｅｃｔｖｅｌｔｒｔｔｔｗｏＥＬＩＳｌｄｗＶ４ｌ．ＳｅｃｉｆｉｃｉｔａｎａｓｉｓｄｅｍｏｎｓａｅｄｔｈａＡｓｏｎｒｅａｃｔｅｉｔｈｔｈｅＦＡｄｐｉｙｐｙｙｙｓｅｒａｔｎｏｔｗｔｈｓｅｒａａａｉＣｈｉｉｂｕｉｎｓｔｔｈｅｏｔｈｅｒａｖａｎｖｉｒｕｓｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｃｋｅｎａｎｅｍｉａｖｒｕｓＣＡＶｉ，，ｇｇ（）－Ｓｅｒｏｔｅ８ｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓＦＡｄＶ８ＲｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓｖｉｒｕｓＲＥＶｎｆｅｃｔｉｏｕｓ（）？（）Ｉｙｐ，’ｂｒｏｎｃｈｉｉＩＢＶＭｉＭＤＶＮｔｌＡｖｉｉｔｓｖｒｕｓａｒｅｋｓｄｉｓｅａｓｅｖｒｕｓｅｗｃａｓｅｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓＮＤＶａｎ（），（），（），－－．ｄｕｉｌｉｈｏｗｉｉｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓＡＩＶｔｅｓｔｅｄＲｅｐｒｏｃｉｂｔｙａｓｓａｙｓｅｄｔｈａｔｂｏｔｈｔｈｅｎｔｒａａｎｄｎｔｅｒａｓｓａｙ（）ｃｏｅｆｌｉｆｆｉｃｅｎｔｓｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆｔｗｏＥＬＩＳＡｓｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ１０％．Ｔｈｅｅｓｔａｂｓｈｍｅｎｔｏｉ ４扬州大学硕士学位论文－－－－－ｄｅｔｔ２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡａｎｄ５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡｆｏｒｔｈｅｅｃｉｏｎｏｆＦＡｄＶ４ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｒｏｖｉｄｅｄｔｅｃｈｎｉｃａｌｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓｆｏｒｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇｔｈｅｎａｔｕｒａｌｌｉｎｆｅｃｔｅｄｃｈｉｃｋｅｎｓｆｒｏｍｔｈｅｃｈｉｃｋｅｎｓｖａｃｃｉｎａｔｅｄｗｉｔｈｐｙｔｈｅｉｉｎａｃｔｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅ．－－２．ＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＥＬＩＳＡｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＦＡｄＶ４ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｒｏｔｅｉｎ２２Ｋａｎｄ５２Ｋａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｐ－Ｔｏｔｔ２２Ｋ－４ＰＥＬＩＳＡＫ－４Ｐ－ＥＬＩＳＡｅｖａｌｕａｅｗｈｅｈｅｒａｎｄ５２ｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｔｏｄｔｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｈｅｃｈｉｃｋｅｎｓｗｉｔｈｎａｔｕｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｆｒｏｍｔｈｅｓｅｖａｃｃｉｎａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅ，ｓｅｒａｆｒｏｍ－－ｃｈｉｃｋｅｎｓｅｘｅｒｉｌｆｅｃｔｅｄｉＦＡｄＶ４ｌｉＦＡｄＶｍｅｎｔａｌｉｎｗｔｈｃｎｉｃａｌｃｈｉｃｋｅｎｓｗｉｔｈｄｉｓｅａｓｅｃａｕｓｅｄｂ４ｐｙ，ｙ？ａｎｄｃｈｉｃｋｅｎｓｖａｃｃｉｉｎａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｂｔｈｅｔｗｏＥＬＩＳＡｙｅｎｅｒａｔｅｄｈｅｒｅａｎｄａ－ｌｓｏｂｔｈｅＦｉｂｅｒ２ｂａｓｅｄＥＬＩＳＡａｎｄＩＦＡｍｅｔｈｏｄＤａｔａｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｇ．，ｙ－ｏｓ－－－－ｔｖｅｒａｔｅｏｆ２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ５２Ｋ４ＰＥＬＩＡＦｅｒ２ＥＬＳＡａｎｄＩＦＡｗａｓ８７．５％ｐｉｉ，Ｓ，ｉｂＩ，９５．８％？１００％ａｎｄ１００％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｆｏｒ２４ｓｅｒａｆｒｏｍｃｈｉｃｋｅｎｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＦＡｄＶ－４ｔｔ－ｉｎｉｃａｌｃｈｔＦＡｄＶ４ｗａ８５ｈａｆｏｒｓｅｒａｆｒｏｍｃｌｉｃｋｅｎｓｗｉｈｄｉｓｅａｓｅｃａｕｓｅｄｂｓ．７％８８．９％？ｙ，，９６．３％ａｎｄ９３．７％ａｎｄｔｈａｔｆｏｒｓｅｒａｆｒｏｍｃｈｉｃｋｅｎｓｖａｃｃｉｎａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｗａｓ－０％ａｎｄ００％－－－２．Ｏｕｄｅｍｏｎ２２４Ｐ．５％０％１０１ｒｄａｔａｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔＫＥＬＩＡａｎｄ５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ，，Ｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｈｅｒｅｃｏｕｌｄｂｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙａｐｐｌｉｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇｔｈｅｃｈｉｃｋｅｎｆｌｏｃｋｓｗｉｔｈｔｈｅｎａｔｕｒａｌｆｉｅｃｔｉｏｎｆｏｍｈｅｃｈｉｃｋｅｎｌｏｃｓｖａｃｃｉｎｔｅｄｗｉｔｈｔｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｗｈｎｎｏｖｅｎｆｒｔｋａｈｅｉｎｅｉｃｈｒｏｖｉｌ，ｐｇｔｏｏｓｏｒｔｔｅｒｃｏｎｔｒｏ－ｌｆｂｅｌｉｎｔｅｓｅａｓｅｃａｕｓｅｄｂＦＡｄＶ４ｌｇｈｄｉｙ．Ｋ－４２２Ｋ５２Ｋｔｈｅｔｅｏｒｄｓ：ＦＡｄＶＳｎｉｃｅｔｉｄｅＩｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡＮａｔｕｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｙｗ；；；ｙｐｐ；；；Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅ 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用５目录擬１Ａｂｓｔｒａｃ３ｔｍｍ７文献综述８１８禽腺病毒概况１．１禽腺病毒的形态结构与理化特性８１２．禽腺病毒的流行病学与致病性８１．３９禽腺病毒的基因组结构１４１０．禽腺病毒的非结构蛋白及其功能１．５禽腺病毒的诊断技术ＩＩ２研宄的目的与意义１２１３概ＦＡｄ－４２２Ｋ５２ＫＥＬＩＳＡ方法建立检测Ｖ非结构蛋白、抗体的１３１材料与方法１３１．１试验材料１３２方法１３２．１计算机软件分析１３２．２最佳多肽的确定１３２．３间接ＥＬＩＳＡ条件优化１４２．４特异性试验１５２．５批间及批１５内重复性试验３结果与分析１５３．１多肽序列筛选结果１６３．２最佳反应多肽的确定１７３．３间接ＥＬＩＳＡ方法的建立及优化１８３３．４交叉反应性的试验０３．５重复性试验３０４顿财ｉｆｅ３２３４啦＿＝ＦＡｄＶ４２２Ｋ、５２Ｋ检测非结构蛋白抗体ＥＬＩＳＡ的初步应用３４１材料与方法３４ ６扬州大学硕士学位论文１．１细胞与试剂３４３４１．２主要仪器－－－ＥＬＩＳＡ１３２２ＰＥＬＩＳＡ以及２Ｋ４Ｐ３４．Ｋ４５１．４基于纤突蛋白Ｆ２的ＥＬＩＳＡ３５１５５．间接免疫荧光检测３１．６血清样品３６２结果３６２．１检测ＦＡｄＶ４人工感染鸡群血清样品３６２．２检测临床发病鸡群血清样品４０２．３４５检测灭活疫苗免疫鸡群血清样品３小结及讨论４７全文小结４９参考文献５０攻读学位期间发表的学术论文及申请专利５４ａｍ５５扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书５６ 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用７符号说明英文缩写英文全称中文名称ＡｉＩＶＡｖａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ禽流感病毒ＣＡＶＣｈｉｃｋｅｎａｎｅｍｉａｖｉｒｕｓ鸡贫血病毒ＥＬＩＳＡＥｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ酶联免疫吸附试验ＦＡｄＦｏｗｌｅｎｏｖＶａｄｉｒｕｓ禽腺病毒ＦＩＴＣＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ异硫氰酸焚光素ＨＲＰＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ辣根过氧化物酶ｉｉＩＢＶＩｎｆｅｃｔｏｕｓｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓｖｒｕｓ传染性支气管炎病毒ＩＢＤＶＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ传染性法氏囊病病毒ＩＧＩｍｍｕｎｏｌｏｂｕｌｉｎＧ免Ｇｇｇ疫球蛋白ＭＤＶＭ’ａｒｅｋｓａｉｓｄｉｓｅｓｅｖｍ马立克氏病病毒ｅｗｃａｓｌｄｉＮＤＶＮｔｅｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ新城疫病毒ＯＤＯｔｉｐｉｃａｌｄｅｎｓｔｙ光密度ＰＢＳＰｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ爾酸盐缓冲液ＲＥＶＲｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓｖｒｉｕｓ禽网状内皮组织増生症病毒ＲＳＲａｂｂｉｔｓｅｒｕｍ兔血清ＳＰＦＳｐｅｃｉｆｉｃｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｅｅ无特定病原体ＴＭＢＴｅｔｒａｍｅｔｈｅｎｚｉｄｉｎｅｙｌｂ四甲基联苯胺ｒ／ｍｉｉｎＲｏａｏｎｅｒｍｉｎｕｅ转／分ｔｔｐｔｉＭｉｃｒｏｒａｍ微克（ｇｇＬＬｉｔｅｒ升ｍＬＭｉｌｌｉｌｉｔｅｒ毫升ａＬＭｉｃｒｏｌｉｔｅｒ（微升ＧＧｒａｍ克ＭｉｎＭｉｎｕｔｅ分钟ＨＨｏｕｒ小时 ８扬州大学硕士学位论文文献综述１禽腺病毒概况禽腺病毒（Ｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＦＡｄＶ）属于腺病毒科禽腺病毒属，最早被发现于１９４９年，１４［］其对上皮细胞表现为易感性。根据限制性酶切图谱及血清交叉中和反应性，ＦＡｄＶ可分４－［々５Ｅ１２１－７８－Ａ，８１１。ＦＡ为个种（以及个血清型（，ａｂ，９ｄＶ是禽类常见传染性病原之））一，其感染往往引起包涵体肝炎、轻度呼吸道疾病、心包积液综合症、肌胃糜烂及产蛋下８＿２７８＂［１］［，，，降等。近年来ＦＡｄＶ在许多国家爆发流行，给当地养禽业造成了巨大的经济损失１３］〇１．１禽腺病毒的形态结构与理化特性禽腺病毒是二十面体无包膜ＤＮＡ病毒，直径９０ｎｍ。病毒由衣壳、纤突、核酸芯髓及２３４６１４１５［，，，，，］相关蛋白组成，衣壳由有２５２个壳粒组成。血清１型禽腺病毒的每个五邻体上２２ｎｍ－－１３７０Ａｌｌ有个纤突，直径约，长度约为００Ａ。六邻体类似于棱柱状，直径约为７ｎｍ。病毒毒粒有１４条多肽，其中ＩＩ为六邻体；ＩＩＩ为五邻体；ＩＶ为纤维蛋白；Ｖ为核心蛋白；ＴＰ为ＤＮＡ的末端蛋白禽腺病毒无囊膜包裹，因而易于被甲醛灭活，但对有机溶剂（如乙醚、氯仿、胰蛋白酶、°－酚类等）的敏感性较低。病毒在２０Ｃ的条件下可较长时间保持活力，室温条件下可存活６°Ｃ°个月，２５的干燥环境中可存活７天，加热至５６Ｃ可被灭活。病毒稳定的最适ＰＨ值为５￣．０６．０，在ＰＨ值低于２．０或者高于１０．０的环境中该病毒均不能稳定存在。禽腺病毒一定的耐受性对恶劣的外界环境具有，经过动物消化系统排出的病毒仍具有活力。因此从１１９］动物的排泄物中可以分离得到该病毒。１．２禽腺病毒的流行病学与致病性６２°２１［，，］禽腺病毒的易感动物主要有鸡、鸭和鹅。相关研宄表明，在鸽子、鹦鹉、猎鹰２３［２２，］等动物体内可以分离得到有别于已发现的血清型的禽腺病毒。禽腺病毒的主要传播方［２４］式有垂直传播和水平传播。病毒可通过种蛋污染鸡胚，使雏鸡的生长受到抑制。早期死－，感染鸡的排毒高峰为４６亡率大幅增高，严重影响了养殖场的经济效益。在肉鸡中周龄；产蛋鸡的排毒高峰为５－９周龄，感染鸡群在１４周龄时依然存在排毒现象最近有研宄４，２５］［发现，感染禽腺病毒后，肉鸡的死亡率明显高于蛋鸡。，由于宿主基因遗传的影响一－禽腺病毒感染般以亚临床症状为主，而急性感染的主要症状有包涵体肝炎、肝炎一些临床数据表明心包积液综合症和肌胃糜烂等。，不同种或血清型的禽腺病毒具有不同。－包涵体肝炎主要与血清２，３５，ａ，９的致病性，，６８８ｂ以及禽腺病毒感染有关。肝炎４型禽腺病毒ＦＡｄＶ－４急性感染致死家禽的主要病因心包积液综合症是血清）。病毒感染鸡（胚后，，鸡胚蜷曲通过观察肝组织切片，在肝细胞中可见可见胚胎充血或出血，肝肿大； 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用９２６２７￣［］嗜碱性或嗜酸性核内包涵体。近年来，在世界各地由禽腺病毒感染引发的包涵体肝炎、心包积液综合症和肌胃糜烂３３｜［，】【２６］２７２００９［］的病例不断增加。，、自年感染禽腺病毒的病例呈上升的趋势在日本加拿大、［３２］間ＭＭＷ美国、韩国、匈牙利、印度及波兰等国家均报道了禽腺病毒的爆发。虽然鸡感染禽腺病毒后体内可产生高水平的抗体，但是病毒仍然可以再次感染此鸡群。在感染动物３７［］体内进行复制，母源抗体也无法提供足够的保护。近几年有报道称纤突Ｆ２蛋白对禽腺一病毒毒力存在重要的影响ＰｅｄｒｏＦ等对株高致病性ＦＡｄＶ－４病毒毒株ＳＨＰ９５的纤突Ｆ２基因进行了序列分析，发现高致病性ＳＨＰ９５毒株的Ｆ２基因与经典的ＫＲ５和ＯＮ１毒株３９［１纤突Ｆ２基因相比，ＳＨＰ９５的Ｆ２基因出现缺失，部分氨基酸改变。纤突Ｆ２蛋白的变异一ｄＶ－４病毒毒力增强有关－可能与ＦＡ。ＨｏｎｇＳｕＰａｒｋ等分离了株ＦＡｄＶ４，通过序列分析，该毒株与ＳＨＰ９５和０Ｎ－１相比，在六邻体中的１９５位氨基酸出现缺失，纤突Ｆ２蛋白的１１１５４Ｑ［］位氨基酸也发生缺失－，这些也可能与病毒的致病性有关。与国内２０１３年ＦＡｄＶ４分离株－相比，叶建强等对２０１５年分离于国内鸡群的８株ＦＡｄＶ４分离８０株序列分析发现株２１５－ｄＶ４２９－４年ＦＡ分离株在基因ＯＲＦ均存在不同长度的缺失。与国外ＦＡｄＶ相比较，国内４＊一１４３ＦＡｄＶ－４丨］１９６１分离株还存在个ｎｔ的缺失。国内正流行的这些新型ＦＡｄＶ４病毒基因组中的缺失或突变可能是导致国内鸡群ＦＡｄＶ－４流行、爆发的原因。１．３禽腺病毒的基因组结构禽腺病毒为单分子一、线性双链ＤＮＡ病毒，不同腺病毒的基因组大小有定的差异，通常在２６－４５ｋｂ之间。基因组可分为编码区和非编码区。根据病毒ＤＮＡ复制的起始时间可将编码区分为早期转录区和晚期转录区。早期转录区包括Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ３和Ｅ４四个区，禽腺病毒没有Ｅ３区结构。晚期转录区包括ＬＩ、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４和Ｌ５共五个区，起始于晚期启ＭＬＰ的转录表达，主要功能为负责编码病毒的结构蛋白动子（）．．Ｘ１３１Ｅ［２ＡＥ２Ｂ和Ｅ４Ｅ早区中位于反链编码区的有Ｅ、，其他位于正链编码区。１Ａ、Ｅ１Ｂ通过表达蛋白从而参与相关基因及细胞基因的转录：Ｅ２Ａ，Ｅ２Ｂ主要负责编码ＤＢＰ、ＴＰ、ｐｏｌ、ｐＩＶａｌｌ等蛋白，主要功能为调节和参与病毒ＤＮＡ的复制；Ｅ３编码的基因产物对于病毒逃避宿主免疫系统的攻击有重要作用。Ｅ４编码的基因产物参与病毒ＤＮＡ的复制、晚期区基４｜１５ｉｍ，】因的表达、终止细胞的生物合成等。１．３．２Ｌ［Ｘ－晚期转录区由Ｌ１Ｌ５组成，该区蛋白的表达起始于晚期启动子，其基因产物为病毒的一ＴＡＴＡＡＡＡ结构蛋白。晚期启动子含有段保守序列，（）其主要的作用是促进先导序列的启动。转录产物的长度约为２０ｋｂ，经过剪切加工可产生多种ｍＲＮＡ，再翻译成不同病毒的蛋 １０扬州大学硕士学位论文４４［］白。晚期转录产物由ＬｌＩＩＩａ、５２／５５ｋ、Ｌ２Ｗ、五邻体、ｐＸ、Ｌ３六邻体、ＥＰ、ＶＩ、（）（ｐ）（ｐ）Ｌ４（ｐＶｌ、１００ｋ）和Ｌ５（纤突蛋白）五个病毒的主要结构蛋白构成，可为病毒自身的组装提供相应的材料。１．３．３ＩＴＲ一４０－２００ｂ重复序列ＩＴＲ在基因组的两端，，分别有段长约ｐ的反向（）序列重复的次数。和长度可随病毒类型和不同毒株而有所差异，并与病毒的传代次数有关基因组的左端１９４－３８５存在着病毒的包装信号，腺病毒基因组复制和病毒包装需要的顺式作用元件为（）ＩＴＲ和包装信号。１．４禽腺病毒的非结构蛋白及其功能该部分蛋白主要包括Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、ＡＤＰ（Ｅ３）、Ｅ４、ＥＰ、１００ｋ、３３ｋ、２２ｋ、５２／５５ｋ１Ａ，等。病毒以Ｅ１Ａ的转录表达为周期的起始，Ｅ蛋白不仅能激活其他早期基因的启动而且还能通过颉抗干扰素增强诱导细胞对肿瘤坏死因子的杀伤作用。Ｅ１Ｂ、Ｅ４蛋白可以阻断宿主细胞ｍＲＮＡ的转录和翻译。Ｅ１Ａ蛋白的抗干扰素作用和Ｅ３编码的多个蛋白可帮助病毒逃避宿主免疫系统的攻击。Ｅ３区编码的腺病毒死亡蛋白，可以加速宿主被感染细胞的死亡。在腺病毒感染后期，１００Ｋ蛋白含量极为丰富，它与六邻体多肽结合，使之发生卷曲并折叠成同源三聚体；还可以把六邻体多肽从细胞内质网转运到细胞核内进行装配；同时还４ＲＮＡ结合［４＜１４，５ｌ３３Ｋ蛋白的主能与腺病毒晚期ｍ，促进病毒蛋白的含成要功能为参与衣壳蛋白的形成，它是病毒衣壳的主要成分。当病毒ＤＮＡ进入衣壳时，３３Ｋ蛋白立刻被＿ｔ４６，１４，４６１蛋白酶水解。一２２ＫＤＮＡ包装中ＨＡｄＶ－Ｃ５中２２Ｋ是另种在起重要作用的非结构蛋白在，和３３Ｋ２６１９５ｎｔ位，２２Ｋ２６７８５ｌｔ。蛋白的阅读框于点开始翻译蛋白的阅读框直到ｉ位点结束２６５一而３３Ｋ蛋白的阅读框在１０ｎｔ和２６７１３ｎｔ核苷酸之间包含个内含子２２Ｋ。与阅读框ｔ２２Ｋ－１０不同的是，３３Ｋ的阅读框直到２７０８６ｎ结束。因此３３Ｋ５，和蛋白共用Ｎ末端的个氨基酸残基，这意味着它们可能具有共同的功能２２Ｋ。不表达蛋白的突变体腺病毒在基ｔ＃因组包装上是有功能缺陷的。２２Ｋ的基因组包装功能很可能是由Ｃ端保守的半胱氨酸和剛组氨酸介导的。５２Ｋ蛋白在腺病毒形态中起重要作用。根据氨基酸序列情况预测其分子量约为［５１］４８）１＜１３。５２１＜＿蛋白位于病毒细胞核，集中在与病毒ＤＮＡ复制中心不同的位点处的核周边。不能表达５２Ｋ或携带两个氨基酸突变ＥＬ３３４－３３５ＧＰ的ＨＡｄＶ－Ｃ５突变体不能将ＤＮＡ包装（）５１，５２［］。５２ＫＤＮＡ到空壳体由这些突变体装配的衣壳不含任何病毒ＤＮＡ，表明蛋白在病毒注入空衣壳的识别过程中起着十分重要的作用。５２Ｋ蛋白与病毒感染细胞中的病毒包装序 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用Ｕａ２－７３列相关联。５２Ｋ蛋白与ＩＶ的相互作用由Ｎ末端的１个氨基酸介导，而执行基因组包－３３装功能地序列位于Ｎ末端的１个氨基酸，这意味着５２Ｋ与包装序列的相互作用对于其５３［］在基因组包装中的功能至关重要。１．５禽腺病毒的诊断技术１．５．１病毒中和试验一中和试验是种为检测抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验。中和试验可用于病毒感染的血清学诊断、疫苗的免疫原性效果评价等。该试验可在、分离毒株的鉴定１４５４［￣］动物体内进行，也可在组织培养的细胞中进行。１．５．２琼脂扩散试验琼脂扩散试验可检测抗原（或抗体。试验结果判定的标准为是否有肉眼可见的抗原抗）体沉淀线％。智海东等用不同代次的病毒鸡胚尿囊液进行了三批次的琼脂扩散试验。用原液、２倍稀释的抗原与３２倍稀释的阳性血清反应，均出现清晰地沉淀线，而且抗原不与其一它病原体的阳性血清反应。结果表明该方法具有定的灵敏度和特异性，可用于禽腺病毒感染的血清学检测。名１．５．３酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验可测定抗原，也可测定抗体。ＥＬＩＳＡ是在不影响酶活性和免疫球蛋。白分子的条件下，使酶分子和免疫球蛋白分子共价结合成酶标记抗体由于标记酶酶促反应的放大作用，其灵敏度比常规血清学试验高，更适于临床大批量的血清学检测。目前酶联免疫吸附试验在免疫学检测领域已得到快速的发展和广泛的应用。４１５［－】六邻体ｈｅｘｏｎ和五邻体ｅｎｔｏｎ是Ｉ群禽腺病毒的主要结构蛋白（ｐ）。罗思思、谢泉等）（一用原核表达并纯化后ｈｅｘｏｎ和ｐｅｎｔｏｎ蛋白作为包被抗原，建立了种检测Ｉ群禽腺病毒抗体的间接ＥＬ１ＳＡ方法，结果显示两种ＥＬＩＳＡ方法即可检出灭活苗产生的抗体，也可检出野毒感染抗体。Ｉ１００Ｋ３３Ｋ在群禽腺病毒中，非结构蛋白、具有抗原性，。在病毒复制过程中它们能持续刺激机体产生相应的抗体。当病毒自然感染鸡群时，体内既产生结构蛋白抗体，也产生。非结构蛋白抗体，但当以灭活苗免疫鸡群时，体内只产生结构蛋白的抗体因此在血清学方一１００Ｋ．３３Ｋ，面，免疫鸡群般不会产生针对．蛋白的抗体而只产生于野毒感染鸡群中。因一１５５６［，］３Ｋ此，邓显文等运用重组的３和１００Ｋ非结构蛋白作为检测抗原建立了种能区分ＦＡｄＶ－１自然感染和灭活疫苗接种鸡群的ＥＬＩＳＡ方法。 １２扬州大学硕士学位论文２．研究的目的与意义－－近年来，国内鸡群由ＦＡｄＶ４引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。ＦＡｄＶ４不－－３７，２０周龄的蛋鸡。仅感染周龄肉鸡还感染１０，给养鸡业造成了巨大的经济损失由于灭活疫苗的研制及应用，ＦＡｄＶ４，今后如何来鉴别鸡群是自然感染还是处于免疫状态对一有效及时防控至关重要。病毒的非结构蛋白般只在病毒感染的细胞中表达，而在全整的一成熟病毒颗粒中是不存在的。因此，在活病毒感染机体后，由于可产生非结构蛋白，般能诱导机体产生针对非结构蛋白的特异性抗体；而病毒灭活疫苗中由于不存在非结构蛋一白，免疫机体后般也不产生针对非结构蛋白的抗体。所以针对某些非结构蛋白抗体的检测能够鉴别鸡群是自然感染还是处于灭活疫苗免疫状态。虽然国内外有学者利用血清１型－－禽腺病毒ＦＡｄＶ１的非结构蛋白３３Ｋ和１００Ｋ，建立了可区分ＦＡｄＶ１自然感染和灭活疫苗（）ＥＬＩＳＡＦＡｄＶ－４的类似ＥＬ接种鸡群的方法；但目前尚无基于非结构蛋白检测ＩＳＡ。本研宄－４的非结构蛋白中的２２Ｋ和５２Ｋ为靶点拟以ＦＡｄＶ，通过多肽合成立分别检测２２Ｋ和，建５２Ｋ蛋白抗体的基于多肽表位的ＥＬＩＳＡ方法，并评价其能否用于区分检测自然感染鸡群与￣灭活疫苗免疫鸡群，为ＦＡｄＶ４有效防控提供技术支撑。 ４２２Ｋ５２ＩＳＡ１３检测血清型禽腺病毒非结构蛋白、Ｋ抗体的ＥＬ方法建立及应用研究内容一检测ＦＡｄＶ－４非结构蛋白２２Ｋ５２Ｋ、抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立－近年来４－，国内鸡群由ＦＡｄＶ引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。ＦＡｄＶ４不－－＾仅感染３７周龄肉鸡，而且还感染１０２０周龄的蛋鸡，给养鸡业造成了严重的经济损失ｍｍＤＮＡ－。为区分检测自然感染鸡群与灭活疫苗免疫鸡群，本研究在利用Ｓｔａｒ对ＦＡｄＶ４非结构蛋白２２Ｋ及５２Ｋ进行抗原性分析基础上，进行了多肽合成、筛选，并建立了检测－ＥＬＩＳＡＬ－２２Ｋ５２Ｋ方法ＩＳＡ，２２Ｋ４Ｐ和５２Ｋ４Ｐ及蛋白抗体的。通过间接Ｅ方法结果筛选发现￣４阳性血清反应性最佳－合成多肽与ＦＡｄＶ。通过条件优化，分别建立了基于２２Ｋ４Ｐ和－－５２Ｋ４Ｐ多肽的检测ＦＡｄＶ－４ＥＬ－－－抗体的ＩＳＡ方法，２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ以及５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ。２２Ｋ－４Ｐ－ＥＬ－－－ＩＳＡ以及５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡＣｕｔｏｆ０．１６６８，０１。的值分别为．８２特异性试验证明所ＥＬ－建立的两个ＩＳＡ仅与ＦＡｄＶ４多抗血清反应，而不与所检测的抗其它禽类病毒的多抗血清反应。重复性试验表明所建立的两个ＥＬＩＳＡ的批内及批间的变异系数均小于１０％。检测ＦＡｄＶ－４抗体的２２Ｋ－４Ｐ－ＥＬＩＳＡ以及５２Ｋ－４Ｐ－ＥＬＩＳＡ方法的建立，为区分检测自然感染鸡群与灭活疫苗免疫鸡群提供了技术可能。１材料与方法１．１试验材料多肽由上海杰肽生物技术有限公司合成。抗禽贫血病病毒ＣＡＶ）、血清８型禽腺病毒（ＦＡｄＶ－８ＲＥＶＢＶ（）、禽网状内皮增生性病毒（）、传染性支气管炎病毒（Ｉ、马立克氏病病毒）ＭＤＶＮＤＶ－）、新城疫病毒、禽流感病毒（ＡＩＶ）以及血清４禽腺病毒ＦＡｄＶ４的阳性血清及（（）（）ＳＰＦ血清均为本实验室保存。牛血清白蛋白ＢＳＡ、ＨＲＰ标记的兔抗鸡ＩＧ（）辣根过氧化物酶（）ｇ购买自Ｓｉｇｍａ公司；９６？ＬＥＬＩＳＡ酶标板贝勾买自Ｃｏｒｎｉｎｇ公司；四甲基耳关苯胺（ＴＭＢ）购买自索莱宝生物科技有限公司。２方法２．１计算机软件分析利用分子生物学软件ＤＮＡＳｔａｒ中的ＰＲＯＴＥＡＮ对ＦＡｄＶ－４病毒的非结构蛋白２２Ｋ和５２Ｋ序列进行分析，选取抗原性良好的序列进行多肽合成。２．２最佳多肽的确定通过间接ＥＬＩＳＡ方法对多肽免疫反应性进行了检测。简要步骤如下：用°Ｎ＊ａ２Ｃ０３ＮａＨＣ０３缓冲液稀释合成好的多肽至５．（Ｈｉｇ／ｍｌ，１０〇ｎＬ／孔包被，置于４Ｃ过夜；，ＰＢＳＴ，用５％脱脂乳每孔加入３６〇ｈ酶标板弃掉包被液用ｌＰＢＳＴ洗两遍拍千ｎＬ封闭； １４扬州大学硕士学位论文°－洗三遍后拍干每孔加入１０〇ＨＬ（ｌ：４００稀释的ＦＡｄＶ４阳性血清，同时设立阴性对照，３７Ｃ）ｌｈＰＢＳＴ，００１：１００００孵育；洗六遍后拍干每孔加入１＾）稀释的ＨＲＰ标记的兔抗鸡ＩｇＧ，（°Ｍ°３７Ｃ孵育ｌｈ；ＰＢＳＴ洗六遍拍干，每孔加入ｌＯＯ＾ＬＴＢ显色液，在３７Ｃ恒温水浴锅内避光孵育ｌＯｍｉｎ；每孔５０ｐＪＬ２ＭＨ２Ｓ〇４终止反应，４５０ｎｍ波长下测定ＯＤ值。２．３间接ＥＬＩＳＡ条件优化利用２．２中筛选出的最佳多肽构建间接ＥＬＩＳＡ的基础上，对不同封闭液与稀释液进行了筛选，，对不同多肽包被浓度、二抗浓度及反应时间等参数进行了滴定及优化并确定了ＥＬ－ＩＳＡ阳性判定标准Ｃｕｔｏｆ值。２．３．１最佳封闭及稀释液的选择°Ｃ０＊用Ｎａ２３ＮａＨＣ０３包被缓冲液稀释最佳多肽至５．〇ｎｇ／ｍｌ，］００叫／孔包被，４Ｃ过夜；酶标板弃掉包被液用ＰＢＳＴ洗两遍拍干，用不同封闭液每孔加入３６０ｇＬ封闭ｌｈ；封闭液及待检血清稀释液分别为２％ＢＳＡ／２％ＢＳＡ、８％ＲＳ／８％ＲＳ、５％脱脂乳＋１％小牛血清／Ｉ％脱脂乳稀释和５％脱脂乳＋１％小牛血清／ＰＢＳＴ稀释时，按２．２操作程序进行ＥＬＩＳＡ试验，测定各孔的ＯＤ４５０ｎｍ读值。选用阳性读值较高，阴性读值较低的封闭及稀释液作为最佳封闭及稀释液。２．３．２最佳封闭时间的确定用２％ＢＳＡ封闭液进行封闭，封闭时间设立为以下几个时间３０ｍｉｎ、ｌｈ、２ｈ、３ｈ。按（）间接ＥＬＩＳＡ程序进行试验，同时设立阴、阳性对照，每孔做２个重复，确定最佳封闭时间。２．３．３多肽抗原最佳包被浓度的确定ＣＯ＊参考间接ＥＬＩＳＡ的要求，用ＰＨ９．６的ＮａｚｓＮａＨＣ０３包被缓冲液稀释多肽抗原至８０５０．０ｌ个浓度．、．、４．０、３、２．０、１．０、０．５０．２５／ｍｌＯＯｉＬ２．２，分别为６和ｐｇ，每孔加入ｊ，按操作程序进行ＥＬＩＳＡ试验，当阳性血清的ＯＤ４５０ｎｍ值接近１．０、Ｐ／Ｎ值最大时，对应的抗原浓度确定为最佳抗原包被浓度。２．３．４血清最佳稀释度的确定用２％ＢＳＡ将ＦＡｄＶ４阳性血清和阴性血清分别以１：５０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１５００、１００、１８００Ｏ２２操作ＥＬＩＳＡ：：６：倍稀释ｌＯｐＬ／孔，按．程序进行试验，当阳性血清的ＯＤ４５０ｎｍ值接近１．０、Ｐ／Ｎ值最大时，对应的血清稀释倍数确定为血清最佳稀释度。２．３．５血清最佳作用时间的确定以抗原最佳包被浓度、包被条件包被，选用血清最佳稀释度，血清孵育时间分别为（３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ，按间接ＥＬＩＳＡ程序进行试验，选取ＯＤ４５０ｎｍ值在１．０）左右一，Ｐ／Ｎ比值最大的组即为血清的最适作用时间。２．３．６酶标二抗最佳浓度的确定 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用１５按已优化的方法进行ＥＬ，ＨＲＰ，００００、１１５０、ＩＳＡ试验标记的兔抗鸡ＩｇＧ做１：１：００１２００００、１２５０００、１３００００、１３５０００、１４００００、１４５０００、１５００００，：：：：：：：稀释确定酶标二抗的最佳工作浓度。２．．３７酶标二抗最佳作用时间按己优化的方法进行ＥＬＩＳＡ试验，酶标二抗作用时间分别为３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、６０ｍｉｎＥＬ一和９０ｍｉｎ，按间接ＩＳＡ，选取ＯＤ４５０ｎｍ值在１．０左右Ｐ／Ｎ比值最大的程序进行试验，组即为酶标二抗的最适作用时间。２．３．８底物最佳显色时间的确定按已优化的方法进行ＥＬＩＳＡ试验，底物作用时间分别为５ｍｉｎ、ｌＯｍｉｎ、１５ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、２５ｍ３０ｍ，ＥＬＩＳＡ，ＯＤ４５１０，ＰＮ比ｉｎ和ｉｎ按间接程序进行试验选取０ｎｍ值在．左右／值最大即为底物最佳的显色时间。２．３．９ＥＬＩＳＡ阳性、阴性临界值的确定－－ＥＬ－－按照优化好的反应条件，用建立好的间接２２Ｋ４ＰＩＳＡ和５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ检测方法检测１８２份阴性血清，７份其他病毒的阳性血清，１０份灭活细胞苗免疫的血清，１１份灭辑组织苗免疫的血清，读取〇Ｄ４５０ｎｍ值计算其ＯＤ４５０ｎｍ的平均值Ｘ和标准差Ｄ。根据（）（Ｓ）统计学原则，若待检样品的ＯＤ４５０ｎｍ值＞２又，判为阳性，若待检样品的ＯＤ４５０ｎｍ值含２Ｘ，判为阴性。２．４特异性试验－－－２２Ｋ４Ｐ－ＥＬ－用建立好的间接ＩＳＡ和５５Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ检测方法对ＣＡＶ、ＦＡｄＶ８、ＲＥＶ、－ＩＢＶ、ＭＤＶ、ＮＤＶ、ＡＩＶ和ＦＡｄＶ４多抗血清进行特异性效果检测，ＳＰＦ鸡血清作为阴性对照，验证是否有交叉反应。２．５批间及批内重复性试验２．５．１批内重复性试验一００按照已确定的包被浓度包被批酶标板，ｉＬ５０％，次日封闭后洗净每孔加入１甘油｜室温孵育ｌＯｍｉｍ弃去甘油，置于通风处内吹３ｈ，真空抽干气后置于４度保存。在第１天、第３天、第５天分别检测４份阳性样本及４份阴性样本，每个样本重复４个孔，通过ＯＤ４５０ｎｍ又和＝＝值分析，计算平均值标准差ＳＤ，通过公式：变异系数ＣＶ（ＳＤＸ）Ｍ〇〇％，进行批内重复性分析。２．５．２批内重复性试验－３－－制作不同个批次的酶标板，批次分别命名为１１、１２、１３，制作步骤见２５丨。．．分别检测分别检测４份阳性样本及４份阴性样本，每个样本重复４个孔，通过ＯＤ４５０ｎｎ！值＝，又和标准差ＳＤ，通过公式ＣＶＳＤ＋又１〇〇，分析计算平均值：变异系数％进行批间（户 １６扬州大学硕士学位论文重复性分析。３结果与分析３．１多狀序列师选结果根据ＤＮＡＳｔａｒ对氨基酸序列的亲水性、抗原性及二级结构进行了综合分析，具体见图－－－１１以及图１２。根据分析结果，对ＦＡｄＶ４非结构蛋白２２Ｋ以及５２Ｋ分别选取了６个多肽，２２Ｋ－－－－－－－－ｌＰｌ２０ａａ２２Ｋ２Ｐ２４３ａａ分别命名为）、１、２２Ｋ３Ｐ４４６５ａａ、２２Ｋ４Ｐ６６８８ａａ、（（）（）（）－－－－－２２Ｋ８９０４２－－－５Ｐ１ａａ、２Ｋ６Ｐ１０５１３５ａａ以及５２ＫｌＰ１５４４ａａ、５２Ｋ２Ｐ４５７１ａａ、（）（）（）（）－－－－－－５２Ｋ３Ｐ４－－１０１２０ａａ、５２Ｋ４Ｐ１２６１４８ａａ、５２Ｋ５Ｐ］５１１７４ａａ、５２Ｋ６Ｐ３７４４０１ａａ。（）（）（）（）ｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉ｜ｉｉ｜１０２０３０４０５０６０７０８０９０１００１１０１２０１３０１４０１５０１６０１７０１８０１９０＿Ｈ－ＫＳ細Ａ啊ｇ綱１３Ｆ＾ｒｅ？Ｒｔｅｎ物ｏＡ翻總齡＊期５８４；？＜ＩｆｍＢ－－－－＇－■■Ｓ－ｒ－ｏｉ１ｔ８ｌｔｆ□ｅｅａｆｔｔｏｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍ＊ｂ—■＿－—Ｂ墨Ｍｌａ雄ａ１－■．□ＴＢＥ３ＢｔｉａｉＯ：Ｔ－Ｇ６ｏ－ＲｂｃｎＥ３Ｅ３ｕｎｍ—Ｃ１－—－—－－－￣Ｈ□Ｃｌｆｔｃｒｓ－Ｏｍｏ－ｆｔｍ１□１１ＤＤ１—Ｉ□０１ＨｆｌＰ０ＩＤＳｇｈ４５．］＾…＾－〇＿ｉｖ？ａ＊ｆｅ？４．５Ｊ’￣￣ｔｉａＷｓｓｆ＾Ｓ＾３＾￣０ｒＡｒｉａｌｔＦｆｅｒｅ．？ＢａｒｔｅｒＢ＾ａ＾ｐｌ＾ｅｇ？—■－￣———－Ｒ－ＢＪＳＳＥｎｆｅｒｔｓＥＳＳＥＳ３ｆｉｆｌＥＳｍｇｓｇ＇ｎ１＂１，Ｆ—Ｊ．Ｖｉ—ＴＴｉ■．Ａ—ｆ；７，．；．．Ｋｎ－—Ｑ－－ｒ＾ｌＦｔｅｔｉＦｒｔＫａｉｆｒａｉｔ＾ｆｋ０．，ｚ２２．１ｍＭｒｆＫｔｏ－Ｊａｒｏｃｎ－＊ｚ＿＾ｇ＼Ａ＾；ｊ１ｎｎＲＩｅ，１ＶｕＡ＇ｎ厂Ｊ＼ｊ］ｎ－＂－￣￣＂．．．＇－Ｊ＇？Ｕｗ－ｕｒ二．－气一严ＵＳｖＪｉａｃｅＲｏｔｅｔｉＦＷｔｎｙｊＵｒｊ一ｙｎ＾｜，Ｉ１图Ｍ２２Ｋ抗原性分析Ｆ－ｉｕｒｅ１１ＡｎｔｉｅｎｉｃｉｔａｎａｌｓｉｓｏｆＫｇｇｙｙ２２ｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉ２０４６０８０１００１０１４０１６Ｄ８０２００２０２４０２ＯＴ８０３００２１２２０３２０３４０３６０３８０￣－—－￣￣ｆｔＡ１賺ｆｌ處Ｊ？Ｅ３－－ｒｅｒ－ｓｍ１ｈＣＺＳＳＢＢＥ］０物ｇｉＢａｒｉＲｉａｍｍｍｍｍｍ缴戰ｗｍｍｍｍｍｍｍ％ｍｍｍｍｍｍ，ｗ．々ＥＬｉｉ通■－ｆｌ－—￣—－画４＾￣－－ＢＲｆ－ｔ－ｔＳＢＢＱＢ＾Ｈ＾＾８ｆｌ１｜Ｅ３ＢＥＳ３ｉ０ｆａＣ＾ｔｂｆｔｔｓｃｎｂ＞？磬一？■—ｍｍｍ…ｍ一一一￣－ｒｍｍｍｍｍ—－■汹兩饥．鉍撕Ｔ■－￣Ｈ－￣—一—１４ｔｆｌＤｒｔＵ８１Ｂ卜Ｉ１ＱＩＷＩ□Ｔｕｎｆ＾ｎ－－ｂｓＱｍｓｆｔｃｎＤＰ■———■￣￣—－－—Ｃ！００□ｔｆｌＩ００ＤｌＩ□０ｃＦｔｔ－（－ｉｎＤＩ□ＨＨｆＤａｇｒｅｉｍｓＲｓｅ４５］＊Ｓ’＇，Ｗａ一．ＶＷＡ，／ＷＡｙ０￣＝ｎ〇＇？１〇ａｉｗｔＬｒｎｄＡ＊ｉ＊＞Ｔ３－ｉｌ：ａｊｉｖｆｃ…ｖ＾ｙｔｏ＾ａｃｆｃｖ＾ａＶ］ＴＰ－４５＿？￣￣￣￣￣—翻ＢＳ＾ＢＡｆＦｔｅ－ｉｔｏ１ｒ＾ｒｐＢｆｅｇ？－－－￣—￣Ｊ？４ＨｍＳＢ￣Ｂ■一ＳＢｔｏＡｒｉｆｅ－ｒｔ翻题ｅｒｍｈ：ｇｒｅＥａｕｇｉ—￣￣——－－－￣￣ＦＱＣＩＺＺ３ＭＳＳＺＤＤｍＺ３£ａＤＥ３０Ｅ－４Ｓ￣—－－ＤＣＺ２￣－０ｔｅｔｆｃ－ＳＳ３３ＩＯ００ＢＧＢ＼１＝：＾Ｆｆ＾ｍｋｆｅ．接气，——＊—６ＪｉＰ丨－图１２５２Ｋ抗原性分析Ｆ－ｉｕｒｅ１２Ａｎｉｉｉｌｇｔｇｅｎｃｔｙａｎａｓｉｓｏｆ５２Ｋｙ 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用１７３２．最佳反应多肽的确定按照上述间接ＥＬＩＳＡ试验过程进行操作，确定非结构蛋白２２Ｋ分段后的６个短肽与－－－Ｖ－４２２Ｋ４Ｐ１３ＦＡｄ人工感染鸡阳性血清均有反应，但短肽反应性最好（结果见表１１，图）；－Ｋ６ＦＡｄＶ－４非结构蛋白５２分段后的个短肽与人工感染鸡阳性血清也均有反应，但５２Ｋ４Ｐ卜２－短肽反应性最好，图１４。（结果见表）－表１１２２Ｋ非结构蛋白分段后的多肽与血清的反应－Ｔａｂｌｆｈｅｉｂｔｅｔｉｄｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍ２２Ｋａｎｄｓｅｒｕｍｌｅ１１Ｒｅｓｕｔｓｏｔｒｅａｃｔｏｎｅｗｅｅｎｐｐ－－－２２Ｋ－２２Ｋ－２Ｐ２２Ｋ－３Ｐ２２Ｋ４Ｐ２２Ｋ５Ｐ２２Ｋ６Ｐ血清来源１Ｐ０．０７６０．０８４６０．０９１８０．０７２２０．０７３８０．０９４３ＳＰＦ＆０９９７０１５４８０．１６８８０．１０３８０．１１３３０．１５１８组织灭活苗免疫鸡０．１２２５０．１２６１０．０９４３０．０９４３０．１３１７细胞灭活苗免疫鸡０２０８１０．．人工感染鸡－３６８６０．３９６１１．４７３５０２４３０３３１２－２．０１画ＳＰＦ鸡？组织灭活苗免疫鸡１１繼ｉ灭活苗免疫鸡．１ｉ５『圓人工感染鸡￡ｃ－２１．０Ｑ〇－０．５．？！ｉｌｌ§Ｌ〇〇ｍｐｍｍｆ￥＾ｓ／／／／／／２２Ｋ多肽编号－图ｌ３２２Ｋ■非结构蛋白分段后的多肽与血清的反应－Ｆｉｉｒｅ１３Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｒｅａｃｏｎｂｅｔｗｅｅｎｅｔｉｄｅｓｄｅｒｖｅｄｆｒｏｍ２２Ｋａｎｄｓｅｒｕｍｇｕｔｉｐｐ １８扬州大学硕士学位论文－表１２５２Ｋ非结构蛋白分段后的多肽与血清的反应＊Ｔａｂ－ｌｅ１２Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｂｅｔｅｉｄｄｉｗｅｅｎｔｅｓｅｒｖｅｄｆｉｏｍ５２Ｋａｎｄｓｅｒｕｍｐｐ－－－５２Ｋ－－－血清来源１Ｐ５２Ｋ２Ｐ５２Ｋ３Ｐ５２Ｋ４Ｐ５２Ｋ５Ｐ５２Ｋ６Ｐ０．０７９１０．０７７６０．０７８８０．０８２４０．０７７６０．０９２３ＳＰＦ鸡〇．１１４７〇－组织灭活苗免疫鸡１１〇９０．１０１１０．１１４０．１０８８０．１６５９０．１００５００９５８０．０９细胞灭活苗免疫鸡１５０．０９３６０．０９１１０．１３人〇．３２６３０－２３３７０．１９１６０．８１２６０．１７４６０．２９６６工感染鸡－１．２■ＳＰＦ鸡－０．９圓组织灭活苗免疫鸡■细（！ｉ灭活苗免疫鸡￡＿人工感染鸡Ｃｓ＿０．６Ｑ｜〇１“丄ｉ＿＿＿＿；冬令冬多冬冬５２Ｋ多肽编号－图１４５２Ｋ非结构蛋白分段后的多肽与血清的反应Ｆ－ｗｅｅｎｉｇｕｒｅ１４Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｂｅｔｅｔｉｄｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍ５２Ｋａｎｄｓｅｒｕｍｐｐ３３．间接ＥＬＩＳＡ方法的建立及优化３３１．．最佳封闭及稀释液的选择封闭液及待检血清稀释液分别为２％ＢＳＡ／２％ＢＳＡ、８％ＲＳ／８％ＲＳ、５％脱脂乳＋１％小牛血清／－Ｉ％脱脂乳稀释和５％脱脂乳＋１％小牛血清／ＰＢＳＴ稀释时，２２Ｋ４Ｐ多肽最佳封闭及稀－－－１３－，１５５２Ｋ４Ｐ释液的选择结果见表图；多肽最佳封闭及稀释液的选择结果见表１４，图－１６。－－从表格以及图中数据可见，２２Ｋ４Ｐ多肽和５２Ｋ４Ｐ２％ＢＳＡ多肽用作为封闭、稀释液时非特异性较低，封闭效果最佳，因此后期实验采用２％ＢＳＡ作为封闭液以及待检血清稀释液。 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ■抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用１９－－表１３２２Ｋ４Ｐ多肽最佳封闭液及稀释液的选择－Ｔａｂｌｅ－１３Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｏｔｉｍａｌｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆｌｏｃｋｉｄｉｌｉｆｐｂｎｇａｎｄｕｔｏｎｏｒ２２Ｋ４Ｐ血清来源２％ＢＳＡ／２％ＢＳＡ８％ＲＳ／８％ＲＳ５％脱脂乳＋１％小牛血清５％脱脂乳＋１％小牛血清／Ｉ％／脱脂乳ＰＢＳＴ组织灭活苗０．１０９９０．０７１５０．１０４１０．１５３７免疫鸡细胞灭活苗０．０８９２０．０６２００．０８０５０．１３０９免疫鸡人工感染鸡１．２００５０．４４５６０．４６０４１．０１７２ｍ２％ＢＳＡ／２％ＢＳＡｍ８％ＲＳ／８％ＲＳ１４■＋Ｉ５％脱脂乳１％小牛血淸／１％脱脂乳Ｍ５％脱脂乳，小牛血細，２－－１〇Ｉ－０．８Ｉ！０－§．６ｆＩ薩ｉｉＢｉＩｓｌｉＭｍｍｉ１１１１ｏＪ％ｙｙ／／／血清来源－－图１５２２Ｋ４Ｐ多肽最佳封闭及稀释液的选择Ｆ－ｉｕｒｅｌｉ－１５Ｓｅｅｃｔｏｎｏｆｏｔｉｍａｌｓｏｌｕｉｏｎｏｆｂｌｏｃｋｉｎｄｉｌｕｉｆｇｐｔｇａｎｄｔｏｎｏｒ２２Ｋ４Ｐ ２０扬州大学硕士学位论文表－４５２－１Ｋ４Ｐ多肽最佳封闭及稀释液的选择Ｔ－－ａｂｌｅｌ４Ｓｅｌｅｃｉｉｍａｌｔｏｎｏｆｏｔｓｏｌｕｉｏｎｏｆｌｏｃｋｉｎａｎｄｄｉｌｕｔｉｏｎｆｏｒ５２Ｋ４Ｐｐｔｂｇ血清来源２％ＢＳＡ／２％ＢＳＡ８％ＲＳ／８％ＲＳ５％脱脂乳＋１％小牛血清５％脱脂乳＋１％小牛血／Ｉ％脱脂乳清／ＰＢＳＴＳＰＦ鸡０．０７８６０．０６２５０．０７０２０．０９８７组织灭活苗０．１０４６０．０６９０．０９２０．１３３８免疫鸡细胞灭活苗０．０８１２０．０６３４０．０８０５０．１１１８免疫鸡人工感染鸡０．７０８６０．４６１３０．４８５５０．５８７６１．２ｔ＿２％ＢＳＡ／２％ＢＳＡ＿８％ＲＳ／８％ＲＳ－１．０Ｍ５％脱脂乳＋１％小牛血清／１％脱脂乳＋血清＿５％脱脂乳１％小牛／ＰＢＳＴ－０．８ｓｉｉｎｉ＿ｚ／／／ｖ／／血清来源－－图１６５２Ｋ４Ｐ多肽最侦封闭及稀释液的选择－Ｆ－ｉｒｅ１６Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｉｍａｌｌｉｆｇｕｏｐｔｓｏｕｔｏｎｏｂｌｏｃｋｉｎｇａｎｄｄｉｌｕｔｉｏｎｆｏｒ５２Ｋ４Ｐ３３２．．最佳封闭时间的确定／ｌ按照５卜ｉｍ的抗原浓度进行包被酶标板，用２％ＢＳＡ封闭液进行封闭ｇ，封闭时间设立以下几个时间（３０ｍｉｎ、ｌｈ、２ｈ、３ｈ）。按间接ＥＵＳＡ程序进行试验，测定其〇Ｄ４５０ｎｍ值，并计算ＯＤ４５０ｎｍ的平均值，结果显示封闭时间ｌｈ时，Ｐ／Ｎ值最大，封闭效果最好。因此，－－最佳封闭时间为］ｈ。具体结果见表５图１７。１， 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用２１－表１５封闭时间的优化Ｔａｂ－ｌｅ１５Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｂｌｏｃｋｉｎｇｔｉｍｅｉｎ封闭３０ｍ封闭ｌｈ封闭２ｈ封闭３ｈ血，清来棘－－－－－－２２Ｋ４Ｐ５２Ｋ４Ｐ２２Ｋ４Ｐ５２Ｋ４Ｐ２２Ｋ４Ｐ５２Ｋ４Ｐ２２Ｋ－４Ｐ５２Ｋ－４ＰＳＰＦ鸡０．１２６２０．１１４８０．１１４８０．１０２５０．０８７３０．０７８５０．１９０１０．１５９８组织灭活苗免０．０９６１０．０９０８０．０８３０．０９０７０．０６８５０．０７３１０．０８６９０．１８１１疫鸡组织灭活苗免０．０８６４０．３６０．０８０５１３０．０８４１０．０６８８０．０６６５０．３３７０．１１５４３疫鸡人工感染鸡０．７６４５０．６３５０．７６１１０．５８９５０．５２３３０．４２３３０．９００２０．７３３５Ｐ／Ｎ值人工感（６．０５７８５．５３１４６．６２９８５．７５１２５．９９４３５．３９２４４．７３５４４．５９０１染鸡／ＳＰＦ鸡）７－．０｜－６．８－６．６＿６，４＾？２２Ｋ－４Ｐｅ．ｏ４－．４４－．２４．０ＩＩＩＩ１３０６０９０１２０１５０１８０封闭时间ｍｉｎ）（－图１７封闭时间的优化Ｆ－ｉｒｅｌ７Ｏｉｉｉｆｈｅｂｌｏｉｇｕｔｍｚａｔｏｎｏｔｃｋｎｔｉｍｅｐｇ３．３．３最佳抗原包被浓度的确定－－２２Ｋ４Ｐ和５２Ｋ４ＰＡｄＶ－将ＩＳＡ两种多肽以不同浓度包被ＥＬ酶标板，以Ｆ４人工感染鸡阳性血清为一抗，测定各孔的ＯＤ４５０ｎｍ值，并计算Ｐ／Ｎ值。检测结果发现抗原包被浓度为５￣ｇ／ｍｌ，阳性血清的ＯＤ４５０ｎｍ值较高，阴性样品的ＯＤ４５０ｎｍ值较低，阳性样品的ＯＤ４５０ｎｍ与阴性样品的ＯＤ４５０ｎｍ的比值－６（Ｐ／Ｎ）为最高。具体结果见表１，图卜８。因此，两种多肽的最佳包被浓度均确定为５．０ｉ／ｍＩ。（ｇ ２２扬州大学硕士学位论文－表１６抗原最佳包被浓度的确定－Ｔａｂｌｅ１６Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｔｈｅｃｏａｔｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｅｎｇｇ包被浓度２２Ｋ－４ＰＰＮ５２Ｋ－４ＰＰ／Ｎ＾６ｉ／ｍｌ０．１２１８１．００９６８．２８９００．１３２０．５３４４．０４５５ｊｇ５ｉｇ／ｍｌ０．１０７０．９４３７８．８１９６０．１２６９０．５６２６４．４３３４｜４ｉｇ／ｍｌ０．１０２４０．８００３７．８１５４０．１１７０．４８２５４．１２３９｜３ｉ／ｍｌ０．１００６０．７０３４６．９９２０．１１３８０．４６９３４．１２３９（ｇ２ｉ／ｍｌ０．１０７３０．６４０５５．９６９２０．１１２４０．４５３４３．７０４２｜ｇｌｉ／ｍｌ０．１０３８０．６０１５５．７９４８０．１２５３０．４５５３３．６３３７ｊｇ０．．５ｉ／ｍｌ０．１３４５０．５０５６３．７５９１０．１２４０．４０８７３２９６｜ｇ０．２５ｉ／ｍｌ０．１２８１０．４６６３３．６４０１０．１２２９０．３２４４２．６３９５［ｇ－１０｜９－ｅ－＾２２Ｋ－４Ｐ７＿？５２Ｋ－４Ｐ孽６－１５／２－１ｊｊｊｊｊｊ０．５１．０１．５２．０２．５３．０３．５４．０４．５５．０５．５６．０包被浓度（Ｍｇ／ｍｌ）－图ｌ８抗原最佳包被浓度的优化Ｆ－ｉｕｒｅ１８Ｏｔｉｍｉｎｔｈｅｃｏａｔｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｅｎｉｚｇｇｐｇｇ３．３．４血清最佳稀释度的确定－，我们将ＦＡｄＶ４人工为确定待检血清的最佳稀释度１份感染鸡阳性血清、２份灭活苗－－免疫鸡血清和１份阴性血清进行试验。检测结果发现，２２Ｋ４Ｐ和５２Ｋ４Ｐ多肽包被浓度为５．〇／ｍ００ＯＤ４５０，ｎｇｌ，血清稀释倍数为１：４时，阴性对照ｎｍ值均较低且Ｐ／Ｎ值较高（结果－００见表１７。因此，血清最佳稀释确定为１：４。） 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用２３－表１７血清最佳稀释度的确定Ｔ－ａｂｌｅ１７Ｄｅｉｉｏｎｏｄｉｕｏｎｔｅｒｍｎａｔｆｏｐｔｉｍａｌｌｔｉｏｆｓｅｒｕｍ２２Ｋ－４Ｐ５２Ｋ－４Ｐ稀释组织细胞人工Ｐ／Ｎ值组织灭细胞人工Ｐ／Ｎ值度ＳＰＦ鸡灭活灭活感染（人工感ＳＰＦ鸡活苗免灭活感染（人工感苗免苗免鸡染鸡疫鸡苗免鸡染鸡＇疫鸡疫鸡／ＳＰＦ鸡ｊＳＭ／ＳＰＦ鸡））１：５００．２２４１０．１７９０．７４３９３．６３３５１６．２１３７０７０．１４２９０８５４２．８２９１．２１５３０．３．０９１：１０００．１３９６０．１１８７０．４２６３３．２０６８２２．９７１３０．１７１７０．０９８３０．６０６１．８７２２１０．９０４０８９４２．４０７３２４．０９７１．．１：２０００．０９９９０．０．２５６２０１１３８００８９４０．３３３８１．０８５５９．５３８７１：３０００．０８９９０．０７８９０．１９４１１．９７２７２１．９４３２０．０９９９０．０７８３０．１９２４０８１０９．１１７１．８１：４０００．０８４５０．０７２２０．１５２２１．８５０７２１．９０１７０．０８２１０．０６６０．２２６５０．５７２６６．９７４４１：５０００．０７６５０．０７５５０．１４７３１．２２６６１６．０３４０．０８１２０．０６５６０．１６０３０．４８６９５．９９６３１．．４１０．９５６３．８７６６３４０．０６９６８．：６０００．０６８９００６４４０１１１１０．０７０．１２３０３７６３５．１２６７．１：８０００．０６２５０．０６０８０．０９７０７５０３１２．００４８０．０７０５０．０６４２０．１０８７０．２６６５３．７８０１３．３．５血清最佳作用时间的确定按照上述确定的最佳条件操作，将血清分别作用时间３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ确定最佳反应时间。结果发现血清作用时间６０ｍｉｎ时Ｐ／Ｎ值较高，随着时间的延长，阴性。－－，６０ｍ１８，１９对照读值增加因此将ｉｎ作为血清最佳作用时间（结果见表图。）－表１８血清作用时间的优化Ｔａ－ｉｂｌｅ１８Ｏｉｍｚａｉｏｎｏｆｈｅｎｃｕｂａｔｉｏｎｉｍｅｆｏｒｓｅｒｕｍｐｔｉｔｔｔ３０ｍｉｎ４５ｍ孵育孵育ｉｎ孵育６０ｍｉｎ孵育９０ｍｉｎ血清来源－－－２２Ｋ－４Ｐ５２Ｋ４Ｐ２２Ｋ４Ｐ５２Ｋ－４Ｐ２２Ｋ４Ｐ５２Ｋ－４Ｐ２２Ｋ－４Ｐ５２Ｋ－４ＰＳＰＦ鸡０．１０１．０９９．１０７５０．０９８２０．１．７．．１１００１７４０１０９０１２４６０２７组织灭活苗免０．０７４９０．０８５８０．０８１３０．０８１８０．０８８３０．０９０２０．０９４８０．０９７７疫鸡细胞灭活苗免０．０８３０．０７３２０．０７８９０．０８１３０．０８３７０．０８３０．０９２８０．０８９５疫鸡０．５７９３０．４１６３０．６３２１０．５３０７０．８４１３０．６９６０．８６．６３２人工感染鸡１１７０Ｐ／Ｎ值人工感（５．７３５６４２０５１５．８８５．４０４３７．１６６１５７４２４６．９１５７５．６０７８．．染鸡／ＳＰＦ鸡） ２４扬州大学硕士学位论文８－．０１７＂＇６２２Ｋ－４Ｐ７＂＇２５２Ｋ－４Ｐ▼６－．４Ｚｆ６－．０＾５１＾５一＾．６５－．２４－．８４－．４￣．—－４ＩＩ，０｜｜３０４５６０７５９０孵育时间ｍｉｎ（）－图１９血清最佳作用时间确定ｕｒｅ－Ｆ１９ｔｍｚａｏｎｏｆｔｈｅｎｃｕｂａｏｎｍｒｅｒｕｍｉｇＯｐｉｉｔｉｉｔｉｔｉｅｆｏｓ３．３．６酶标二抗最佳稀释度的确定ＥＬ－ＩＳＡ１ＦＡｄＶ４人工、２按照建立的方法，选取份感染鸡阳性血清份灭活苗免疫鸡一．１１００００、１血清和１份阴性血清作为二：、２００００、抗酶标抗稀释度分别为：１５０００１：１：１２５０００１００００１：３５０１：４００、１５００００ＥＬＩＳＡ，。：、：３、００、００：进检测确定最佳二抗工作浓度，二１１５检测发现当酶标抗稀释度为：０００，结果最佳，阳性血清读值较高，阴性血清读值－－，Ｐ／Ｎ１９，图１１０。较低值较大（结果见表）表－９二１抗最佳稀释度的确定Ｔａ－ｍｂ１９Ｄｅｅｒｍｉｎａｏｆｏｌｉｌｕｏｎｏｆｓｅｃｏｎｒｎｉｌｅｔｔｉｏｎｐｔｉａｄｔｉｄａｙａｔｂｏｄｙ２２Ｋ－４Ｐ５２Ｋ－４Ｐ组织灭细胞灭Ｐ／Ｎ值（人组织灭细胞灭Ｐ／Ｎ值（人人工感￣人工感￣二抗稀释度ＳＰＦ鸡活苗免活苗免工感染鸡ＳＰＦ鸡活苗免活苗免工感染鸡染鸡染鸡疫鸡疫鸡／ＳＰＦ鸡）疫鸡疫鸡／ＳＰＦ鸡）．４３７２０．１：１０００００．１０１３０１３０３０．０９２６３．３３．９３１１２１５０．２０４７０．１４７３１．５５３６１２７８６８．１：１５００００．０７９１０．１０１８０．０７７７３３．８４１３１．０５３４０．０７０９０．１３７０．１１２５１．０７８８１５．２１５８１０００．０．００．０７２８２６．６９３０．０５４３０．０６８０．１２３２０．００．８６１２２９：２０００７１８８７５７９７８７２．７５１：２５００００．０６４６０．０７２５０．０６３２６．８１１２２５．９６７０．０６３１０．０９６３０．０８３９０．６１８６９．８０３５１３００００．０４０．０６３１２．４４８２５．０８３７．１．１０．１９：００６３８．０７７３１００６２０．０８０８０６０４．７２７９１：３５０００００６１０．０６９９０．０６３９２２．３５２１２１．９９７５０．０５９９０．０８９１０．０７４４０４９６１８２８２１．．．１４００００００６３９．０７２１０．０６１．６８３９２０．７９５４０５７６０．０８９４０．０７７８０４９９４８６７０１：．０３９２．０．．１０３２７４７０１１：５０００００．０５９７０．０６６７００５９７．１３１７．．０５５７００７９０．０６５４０３５３８４．９２１．．． 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用２５３６－．５１３４０＾．ｋ．３１－．５＾２２Ｋ－４Ｐ２９－．０＊５２Ｋ＇４Ｐ２６５－．２４０－．－５３２１．５１９０－￡．１６－．５１１５－．、ｉ９－．０６５－．－４０—．Ｉ１１１？１００００２００００３００００４００００５００００二抗＿度－图１１０二抗最佳稀释度的确定－ｉｉｉｍａｉｉｉＦｇｕｒｅ１１０Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｎｏｆｏｐｔｌｄｌｕｔｏｎｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｔｂｏｄｙ３．３．７二抗最佳作用时间的确定？Ｖ在确定好的ＥＬＩＳＡ条件下，将酶标二抗分别作用３０ｍ４５ｍｉｎ、６０ｍｉｎ９０ｍｉｎｉｎ、以及，ｉｎ时，阳性血清读值较高进行测定最佳二抗反应时间。检测结果发现二抗反应６〇ｍ，阴性血清读值较低，Ｐ／Ｎ值较大；６０ｍｉｎ之后读值增长变缓，本着节约实验时间的原则，故６０ｍｎ作为酶标二抗的最佳作用时间－－将ｉ（结果见表１１０，图１１１。）－表１１０二抗最佳作用时间的优化Ｔａｂｌｅ１－１０Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｔｉｂｏｄｙ醉育３０ｍｉｎ辉育４５ｍｉｎ辉育６０ｍｉｎ辉育９０ｍｉｎ血清来源－－－－－－２２Ｋ４Ｐ５２Ｋ４Ｐ２２Ｋ４Ｐ５２Ｋ４Ｐ２２Ｋ４Ｐ５２Ｋ４Ｐ２２Ｋ－４Ｐ５２Ｋ－４ＰＳＰＦ鸡０．１１４１０．０９８４０．１２９０．１１７８０．１２５６０１１４４０．１５１９．１４１３．０组织灭活苗免疫鸡０．０７４１０．０７５８０．０８４０．０８７５０．０８３８０．０８２９０．１０１７０．１０５４０．０７９５００７１４０．０８６３０．０８４７０．０８６４０．０８３．细胞灭活苗免疫鸡．１０．１０２６０１０２５人工感染鸡０．５０６１０．３９５３０．６２６７０．４９８４０．７８１５０．６５４７０．９７７２０．８８６２Ｐ／Ｎ值（人工感染鸡４４．０３４．８５８１４．２３６．２２２．３．４３５６１７１１５７２６．４３３２６．２７２／ＳＰＦ鸡） ２６扬州大学硕士学位论文７－２２２Ｋ－４Ｐ６］＇＇９？５２Ｋ－４Ｐ６－．６赢－－－６．３＾３ｒｊ３．９３－．６３－．３－３＊．〇ｉｉｉｉ３０４５６０７５９０辭育时间ｍｉｎ（＞－图ｉｉｉ二抗最佳作用时间的优化－ｍｅＦｉｇｕｒｅ１１１Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｔｉｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｔｉｂｏｄｙ３．３．８底物最佳作用时间的确定在上述优化好的条件下确定底物的最佳作用时间，选取Ｐ／Ｎ值最大的１０分钟作为底－－物最佳作用时间１１，图１１２。（结果见表１）－表１１１底物显色液最佳作用时间的优化－ｍｍｅｎＴａｂｌｅｚａｉｏｎｏｉｌｅ１１１Ｏｔｉｉｔｆｔｈｅｎｃｕｂａｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆｃｏｏｒｄｅｖｌｏｔｐｐ血清来源ＳＰＦ鸡组织灭活苗免细胞灭活苗免人工感染鸡Ｐ／Ｎ值人工感（染鸡／ＳＰＦ鸡）＾輕０．０６９８．１０．０．５１１８３８７显色－００９４６７６０６．０５ｍｉｎ２２Ｋ４Ｐ〇．〇．０８６４０．０．４２２．５１５２Ｋ－４Ｐ６４２０７０７０７６８４０．０８２５０．１０３１．０８１０４１１．３９４０ｍ－０．９显色１ｉｎ２２Ｋ４Ｐ〇〇７１１５９０．０．８６１７１１５３１５２Ｋ－４Ｐ．５９０．８７３０．３．１０．０．０显色ｎ２２Ｋ－４Ｐ００９４９０６０３９６５１６６１１１．２３４１５ｍｉ〇．０５７７．〇９２６０１３７２０．１１３７．９８６９１０．６５２Ｋ－４Ｐ－Ｈ３４０１７３９０．１００５１．２１１．２５３２０ｍ－４０．８４３３显色ｉｎ２２ＫＰ．．１５６８．１５１１１．２２５２Ｋ－４Ｐ〇１〇８４０００７．１８９０３－６０．１８０５０．１．３１１．１２４２２５ｍ２２Ｋ－４Ｐ０１２１１１１１５２７显色ｉｎ１３３３－０－１１５７０１６７４０１５２７．２１８７１０．５５２Ｋ４Ｐ．．０．１３３２０１８７３０．１２８７１．４１２６１０．１显色３０ｍ２２Ｋ－４Ｐ．６０５ｉｎ０－１２８７０１７４４０．１６８９１３０４２１０．１３４．．５２Ｋ－４Ｐ 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用２７１３－．－１２－１１＾．２２Ｋ－４Ｐ＇■＊＊——■＊５２Ｋ－－／／４Ｐ１０ｒＪ６－５－４￣￣ＩＩＩＩ＊５１０１５２０２５３０显色时间（ｍｉｎ＞图Ｍ２底物显色液最佳作用时间的优化－ｍｅｎＦｅ１１２Ｏｔｉｚａｏｎｆｔｈｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｃｏｌｏｔｉｇｕｒｐｉｍｔｉｏｔｉｍｅｏｆｒｄｅｖｅｌｏｐ３．３．９阴阳性判断标准的确定－２Ｋ４Ｐ－ＥＬ２用建立好的２ＩＳＡ检测方法，检测１８份阴性血清，７份其它病毒的阳性血－清，１０份１１，１。细胞灭活苗免疫鸡血清样品，份组织灭活苗免疫鸡血清样品（结果见表ｌ２ｊＯＤ４５０ｎｍ值的平均值Ｘ为００８３４ＳＤ为００１５１。所有血清样品．和标准差．综合考虑临床阴－－性血清平均值以及阴性血清最高读值，将２倍的阴性血清平均值作为２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ方法＝的阴阳性判断标准。即当ＯＤ４５０ｎｍ值大于等于０．０８３４ｘ２０．１６６８为阳性，ＯＤ４５０ｎｍ值小０６６８于．１为阴性。 ２８扬州大学硕士学位论文－－－表１１２２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ检测阴性血清样本的结果－－－Ｔｂｌｌｂａｌｅ１１２Ｒｅｓｕｓｏｆｎｅｉｖｅｓｅｒｕｍａｍｅｓｄｅｅｃｔｅｄ２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡｔｇａｔｓｐｔｙ２１８份阴性血清０．．．．１．１１４．．０．０６６３０７８９００７８６０．０７９２００６８８００９８０２００９４５０，０７３３００９２６０．．．０７０６０．０７７０．０７３００６８６０．０９９４００７５７０．０６７５０．０７７１０．０８０．０７５２０．１０１１０．０９５８０．０７０４０．０６６５０．０７１０．０７２５０．０９６１０．０７２９０．０７０８０．０６６６００７８５０．０５５１０．０８７９７８６０．０６９６０．０８１１０．２８７０．０７５５０．０８８３０．０６９４．０．０１０．０６０２０．０６４６０．１０３３０．１０３８０．０７２７０．０９２７０．１２０１０．１０８８０．０７４５０．０９０６０．０８１．１０３４０．０９２．００．０．００．０．１０６００６２７０．３０８４２９０７０８０６０．０８３８６４５０，０７８１０．０８３９０．０７０４０．１０１７０．０７０３０．０７６２０．０６９０．１０２０．０６７６０．０７８３．０．．．５２．．１００６６９０７８１．．．０１００８００８３４０１０００７７００８５０．００７０２００９３０７７５０．０８８４００７０６０．０７１４．０８５８００６８８０４０．０６２３０．０８６７００９１４０．０７６７．０．０．１．０．０７１０．０７８６０．１１３５０．０７２９０．０８５５０．０９７５０．０９４５０．０８７６０．０９２１０．０６９７０．０７５５０．１１４５０．０８５１０．０８３１０．１０６５０．０８８５０．０８５４０．０６７４０．０８０４０．０７７２０．０７９８０．０９５６０．０８１８０．０８４２０．０９１０．０８４８０．０６９６０．０８５１０．０９５５０．０９２４０．０９１３０．０８８０．０７４５０．１０５５０．１１６８０．０８２３０．０６８６０．０７８０．０７７３０．０９４１０，０６８６０．０７６８０．０７４９０．０８１３０．０７０８０．０７８１０．０８８９０．０９１１０．０９３７０．０７２２０４２０．０９０．０．０８１６．８０．０８７３０．０７０４．０８４６０．．０８１００７１３００６７００９３２．００７９７０．０８０４００７５６０．０９１０．０７７０７４７０．０７２７０．０５７８０．０９９９５４０．０６７２．０．０．００．０５６９０．０８４８０．０７５９０．０７３３０．１２７０．０７９１０．１０４０．１２０．０７２８０．０５６５０．０．．０７５７０．０９５０．０７２７０７７６０．０７２３００８６３０．０７８３０．０８０．０５４５０．０６３１０．０６９８００８６５．７份其它病毒的阳性血清００９６３０６１１０１０８５７６８５０．０８２８０．０９１２．０．．０５７０．０．０１０份灭活细胞苗免疫的血清０．１２０２０．０７５４０．１２２５０．０９０６０．０８２０．０９２１０．１３６９０．０８６２０．０８３１０．１４２６１１份灭活组织苗免疫的血清０．０７９９０．０９２５０．０７４５０．０９０７０．０８５４０．０９０４０．０９３４０．０９６７０．０７９９０．０７９４０．０８０５阳性对照１．０５６７１．１０４６２Ｋ－４Ｐ－ＥＬ用建立好的５ＩＳＡ检测方法，检测１８２份阴性血清，７份其它病毒的阳性血 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用２９－，１０１１１１３。清份细胞灭活苗免疫鸡血清样品，份组织灭活苗免疫鸡血清样品（结果见表）所有血清样品ＯＤ４５０ｎｍ值的平均值Ｘ为０．０９１和标准差ＳＤ为０．０１６５。综合考虑临床阴－２－性血清平均值以及阴性血清最高读值，将倍的阴性血清平均值作为５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ方法ｘ＝的阴阳性判断标准。即当ＯＤ４５０ｎｍ值大于等于０．０９１２０．１８２为阳性，ＯＤ４５０ｎｍ值小于０．１８２为阴性。－－－表１１３５２Ｋ４ＰＥＬ１ＳＡ检测阴性血清样本的结果Ｔ－－ａｂｌｅ１－３ＲｅｔｉｒｕｍｓａｍｌｂＫ１ｓｕｌｔｓｏｆｎｅｇａｖｅｓｅｐｅｓｄｅｔｅｃｔｅｄｙ５２４ＰＥＬＩＳＡ１８２份阴性血清０．０８０４０．０７４４０．１１１１０．０５９７０．０７４４０．０８３８０．０７１５０．１２４５０．０８８６０．０７４９０．１３０３０．１２７２０．０９８７０．０６８６０．０６２４０．０９２９０．０９０９０．０８８９０．０９８８０．１２６７０．１０．０９４２０．０９８９０．０６９８０．０６０８０．０７４１０．０６９７０．１０５１０．０９１１０．０６９５０．１０６８０．０８３４０．１１２１０．０６８２０．０８７９０．０８２６０．１２１１０．１０４１０．０７０９０．０９４８０．０８４９０．０７５８０．１０６７０．１５３８０．０９８８０．０７９０．１０３３０．０８６１０．０８６７０．０８８６０．１３０．０８２４０．１０１４０．１００７０．１０２．０８０９０．０．０９５．００．０９８５１０８０８９８０４０８５３０．０９４８０．０７７１０．１３１１０．０９８１０．１１９２０．０８５５０．０９１６０．０９０３０．０９８６０．０８５６０．１２２６０．０８３４０．０８５４０．０９５４０．１１０９０．０８５３０．０９５９０．０７９６０．０８９２０．０８８３０．１１７９０．０７０２０．０９８５０．１０６３０．１１０６０．１０９６０．０７３０．０８３７０．０８６９０．０８７８０．０７９０．１０７．０９８５０．１２７５０．０９３９０．０７７１０．０８９０．０７８１００９９５００９６５１８０．．０．０７７５０．０８５４０．０８１５０．０９０８０．０９２３０．０７８２０．０９８４０．０８３４０．０７３１０．０９８９０．０７１６０．１０７９０．０７５２０．１０８４０．０７９９０．０７５１０．０８２０．０７６７０．０８５７０．０８０．０８６６０．１．．０９．１０．．．．．１１２８００８８６０８９００９０８０２００９３１００７２３００７５００９３０．０７１０．０７５０．０９０７０．０６７８０．０７４０．０５４５０．１０９６０．０７８．０７１２０．１８００８２５０．０６７３０．０９０１０．０８０２０．０９３９０．１０６０．０７８８０．０８６７０．０８４３０．０９５０．１０２８０．０８６１０．０８１１０．０７３５０．０６７４０．０６２９０．０７１２０．１２２４０．０７３１０．０８５２０．１２６６０．０８７３０．１１５８０．１００９０．１０２７０．０８９３０．１０２５０．１０３４．０９５４０．０８０９０１２２２０．０．．．１１．４０．１４．．．，０７９６００７２１０．０７５００７５５０４５０１１０１６００９４６００７２００８０３０．０７１４０．０７９２７份其它病毒的阳性血清０．０９１６０．０７６１０．１００８０．０５５４０．０９７６０．０７０３〇ｉ〇４４１０份灭活细胞茁免疫的血淸００．１０．０８６０．０１７．０９〇．〇８２３．１１１６０．０７６８２０４８００８０．１１６５０．０９７５０．０７７７１１份灭活组织苗免疫的血清 ３０扬州大学硕士学位论文００７５９０．０８８３０．１２９４０．０７０８０．１０２１０．０９０８０．０９１４０．１０６３０．０９７９０．０８５８０．０８２５阳性对照０．７７９１０．８３９３３４．交叉反应性的试验ＳＣＡＶ－ＤＶ、ＮＤＶ、ＡＩＶ按照上述建立的ＥＬＩＡ方法，用、ＦＡｄＶ８、ＲＥＶ、ＩＢＶ、Ｍ和－ＳＰＦ。３，ＦＡｄＶ４．３阳多抗血清进行特异性效果检测，鸡血清作为阴性对照参照性临界值－－ＥＬ１ＳＡＦＡｄＶ４，而不图１１３证明本研究建立的多肽间接方法仅与多抗血清反应与抗其它禽类病毒的多抗血清反应，说明特异性良好。ｍ２２Ｋ－４Ｐ１５２＿５２Ｋ－４Ｐ１：４４］－１．３６－１．２８－１．２０１－．１２１－－０４１０－．９６■－Ｉ０．８８＿＿ｓ１＇〇°－６４－議０．５６０－．４８０－．４０－０，３２Ｌ〇ＤＭ６－１ｇ圏Ｉ画Ｍ羅疆＿ｉｉＭＩｇ：＿血清类型－ＥＬ图ＩＳＡ方法的１１３特异性－Ｆｉｇｕｒｅ１１３ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎａｌｓｉｓｏｆＥＬＩＳＡｙ３５．重复性试验３５１．．批内重复性检测结果一３５４４份用同批制作的酶标板分别在第１天、第天、第天分别检测份阳性血清和－－４，４５０ｎｍ，。２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ批阴性血清，每份血清做个重复通过ＯＤ读值进行结果分析－－－４１４５２Ｋ４ＰＥＬ１ＳＡ内重复试验变异系数最大值为．１９％，表明批内重复性较好。结果如表１；－９９％，。１１５。批内重复试验变异系数最大值为．表明批内重复性较好结果如表所示 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用３１－－－表１１４２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ酶标板的批内重复性试验Ｔ－－－－ａｂｌｅ１１４Ｉｎｒａｒｅｒｏｄｕｃｂｉｌｉａｓｆｏｒ２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡｔｂａｔｃｈｐｉｔｙｓａｙ检测时间ＳＰＦ鸡人工感染鸡１２３４５６７８０．０９２２０．０８４４０．１００７０．０８５２０３７００．７９３８．９０３４０．Ｄａ．８０５８６５ｙｌ．．０９１．１０６０．０８６９０８２４８０．８２６６０．８２５５０．６４４４Ｄａｙ２００９０８０８０１．Ｄ３０．０８７３０．０８８４０．１０７９０．０９１９０．８４５３０．８３２３０．８２９９０．６１６７ａｙ平均值Ｘ０．０９０１０．０８８２０．１０６４０．０８８０．８３５７０．８１７６０．８５２９０．６１５９（）０－００２１０．００３１０．００４２０．００２８０．００８４０．０１６７０．０３５７０．０２３６ＳＤ标准方差（）变异系数（ＣＶ％）２．３３％３．５１％３．９５％３．１８％１．０１％２．０４％４．１９％３．８３％－－表－１１５５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ的批内重复性试验结果Ｔａ－－－－ｂｌｅ１１５Ｉｎｔｒａｂａｔｃｈｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙａｓｓａｆｏｒ５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡｙ检测时间ＳＰＦ鸡人工感染鸡１２３４５６７８０．０８８２．０８５８．０９８５０．０８７４０５７９５０．６７９６０．４９８１０．５５４２Ｄａ００．ｙｌ０１０．．．．Ｄａｙ２．１０１９０．５８０．１０１５０．１０３８０７２５７０７５４４０５７９２０６１３７Ｄａ３０．０９３３０．０９８６０．１０４２０．１０１５０．７１５８０．７３９７０．５７７１０．６１６６ｙ０．０９４５０．０９６７０．１０１４０．０９７６０．６７３７０．７２４６０５５１５０．５９４８．平均值；Ｘ（）０－００５７０．００３６０．００２３０．００７３０．０６６７０．０３２４０．０３７７０．０２８８标准方羌（ＳＤ）变异系数（ＣＶ％６．０３％３．７２％２．２７％７．４８％９．９％４．４７％６．８４％４．８４％）３．５．２批间重复性检测结果３ＥＬ－－－制作个不同批次的ＩＳＡ酶标板，批次自命名为１１、１２、１３，分别检测４份阳４４２２Ｋ－－ＥＬＩＳＡ性血清和份阴性血清，每份血清做个重复孔４Ｐ。酶标板的批间重复性试验中８份血清的变异系数最大值为５６９％－６３．结果如表１１所示），说明个批次的酶标板重（－－复性较好。５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ酶标板的批间重复性试验中８份血清的变异系数最大值为％－９１７３．２４结果如表１所示），说明个批次的酶标板重复性较好。（ ３２扬州大学硕士学位论文－－－表１１６２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ酶标板的批间重复性试验－－－Ｔａｂ－ｌｅ１１６Ｉｎｔｅｒｂａｔｃｈｒｅｒｏｄｕｃｉｌｉａｓｓａｆｏｒ２２Ｋ４ＰＥＬＩＡｐｉｂｔｙＳｙ批次ＳＰＦ鸡人工感染鸡１２３４５６７８１８００８６８０．１０２７００．７．９．１，０．０９．．０８５１８１２０．８３８０６３５０６０１１１０８３８０．０８９２．１０８００．８７５２０．８８２７０．８５７１０．６４９６．００７．０８８３０．０９０２．０１０．１１０７０．０８８１０．８７８９０．９０１５０．８５４７０．６３１７＿０９０１３０８８６０．０８８７０．１０７４．０８７２０．８４５１０．８７４０．８９１８０．６２７５平均值Ｘ．００１（）Ｄ〇．〇〇３５０．００１４０．００３４０．００１５０．０４５２０．０２６６０．０５０７０．０２０１标准方差（Ｓ）变异系数（ＣＶ％）３．９５％１．５８％３．１７％１．７２％５．３５％３．０４％５．６９％３．２１％－－－表１１７５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ酶标板的批间重复性试验Ｔａｂ－－－－ｌｅ１１７Ｉｎｔｅｒｂａｔｃｈｒｅｒｏｄｕｃｆｏｒ５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡｐｉｂｉｌｉｔｙａｓｓａｙ批次ＳＰＦ鸡人工感染鸡１２３４５６７８０．０８５２０．０８８４０，０９８９０．０８８０．６０７１０．６８３１０．５２３９０．５７４８１，！０．２．１１０．１０４５．．．１２６０．５１０８００５３０，００５０７６２０７８５０６８０９＿０．０９７７０．１０１６０．１０１１０．１０３６０．７０２７０．７７１５０．６０９１０．５９５８！３０９５２０．０９８４．１０．０９．６９．７５．５８１７０５８３８平均值．００００２８７００６０４６０．（Ｘ）Ｄ〇．〇〇７４０．００７３０．０００９０．００７６０．０６３８０．０４５２０．０４１０．００８８标准方差（Ｓ）７７％７．４．９７．７．．‘．变异系数（ＣＶ％）．７２％０％％９２４％６０５％７０５％１５１％４小结及讨论－近年来，ＦＡｄＶ４引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多国内鸡群由，给养鸡业造成了巨大的经济损失。由于灭活疫苗的研制及应用，今后如何来鉴别鸡群是自然感染还一－是处于免疫状态，对ＦＡｄＶ４有效及时防控至关重要。由于活病毒感染机体后，般能诱导机体产生针对非结构蛋白的特异性抗体，免；而病毒灭活疫苗中由于不存在非结构蛋白一般不产生针对非结构蛋白的抗体，通过检测机体内针对病原的某些非结疫机体后。因此构蛋白抗体的检测，能够鉴别鸡群是处于自然感染状态、还是处于灭活疫苗免疫状态。为－建立鉴别鸡群是ＦＡｄＶ４自然感染还是处于灭活疫苗免疫状态ＦＡｄＶ－４的非结构，本研宄以蛋白中的２２Ｋ和５２Ｋ为靶点，利用多肽合成技术，建立了基于多肽表位的检测２２Ｋ和５２ＫＥＬ一非结构蛋白抗体的ＩＳＡ方法。值得提的是，与传统的间接ＥＬＩＳＡ检测抗体方法不同，本研宄是以合成的多肽作为抗原包被ＥＬＩＳＡ板子，进而来检测抗体。近年来，随着合成肽ＥＬ［５７＃ＩＳＡ技术的不断成熟，多肽作为包被抗原。传统，在疾病诊断中得到了很好的应用 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用３３的间接ＥＬＩＳＡ中往往以基因工程表达的融合蛋白或全病毒作为包被抗原来检测相应的抗。，体在理论上，以合成多肽为包被抗原将具有更强的特异性可降低全蛋白或全、重复性病毒作为抗原可能引起的交叉反应背景。但由于合成多肽较短，包含的Ｂ细胞表位数有限，多肽ＥＬＩＳＡ的灵敏度可能不及全蛋白包被的ＥＬＩＳＡ。为获得最佳的反应多肽，我们通过ＤＮＡＳｔａｒ中的Ｐｒｏｔｅａｎ对２２Ｋ和５２Ｋ非结构蛋白抗原性等进行了分析，各合成了６个多肽。一ＦＡｄＶ－４病毒鸡的血清ＥＬ利用人工感染进行的ＩＳＡ筛选，最终各确定了个反应性最佳的－－多肽，２２Ｋ４ＰＡＧＥＤＫＥＮＳＰＰＴＩＰＰＫＲＳＲＮＡＳＳＶ以及５２Ｋ４ＰＫＡＩＣＰＤＴＶＰＤＹＤＲＤＭ（）（ＱＧ－－Ｋ－４ＰＡｄＶ４ＭＹＲＳＧＱＶ）。与其它合成的多肽比较，多肽２２４Ｐ以及５２Ｋ与Ｆ阳性血清的良５２好反应性表明，这两个多肽中分别包含了２２Ｋ以及Ｋ蛋白的Ｂ细胞优势表位。为了提高多肽ＥＬＩＳＡ的灵敏度，将两个多肽混合包被，结果显示灵敏度会下降。特异性以及重复－－性试验证明，本研究构建的检测２２Ｋ和５２Ｋ非结构蛋白抗体的２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ以及－５２Ｋ－４ＰＥＬＩＳＡ具有良好的应用前景，为区分检测自然感染鸡群与灭活疫苗免疫鸡群提供了技术可能。 ３４扬州大学硕士学位论文研究内容二ＦＡｄＶ－４非结构蛋白２２Ｋ５２ＫＥＬＩＳＡ的检测、抗体初步应用－２２Ｋ－４Ｐ－ＥＬＩＳＡ以５２Ｋ４Ｐ－ＥＬ－为评价所建立的及ＩＳＡ方法能否用于区分检测ＦＡｄＶ４自－－－－－然感染鸡群与灭活疫苗免疫鸡群，将２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ以及５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ对ＦＡｄＶ４人工感染鸡群，临床发病鸡群以及灭活疫苗免疫鸡群血清进行了检测，并与基于结构蛋白Ｆｉｂｅｒ２ＦＡｄＶ－４ＥＬＩＳＡＩＦＡ方法进行了比较４ＦＡｄＶ－４的检测抗体的以及。检测结果表明：在检测２份－－２２Ｋ－４Ｐ－ＥＬ－人工感染鸡群鸡血清样品时，ＩＳＡ，５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ，Ｆ２ＥＬＩＳＡ和ＩＦＡ的阳性率分别为８７．５％、９５．８％、１００％和１００％；在检测１８９份临床发病鸡群鸡血清样品时，－－２２Ｋ４Ｐ－ＥＬ－－ＩＳＡ，５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡＦ２ＥＬＩＳＡＩＦＡ８５．７％、８８．９％、９６３，和的阳性率分别为．％－４Ｐ－ＥＬＩＳＡ－－－和９３．７％在检测８１灭活疫苗免疫鸡群血清中，２２Ｋ，５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ，Ｆ２ＥＬＩＳＡ；和ＩＦＡ的阳性率分别为２．５％，０％，１００％和１００％。以上结果表明，本研宄建立的－－－－２２Ｋ４ＰＥＬＫ４Ｐ－ＩＳＩＳＡ和５２ＥＬＡ方法可以鉴别鸡群是ＦＡｄＶ４自然感染还是处于ＦＡｄＶ４ＦＡｄＶ－４灭活疫苗免疫状态，可为的防控与净化提供技术支撑。１材料与方法１．１细胞与试剂鸡肝细胞ＬＭＨ为本实验室保存。辣根过氧化物酶（ＨＲＰ标记的兔抗鸡ＩｇＧ、异硫氰荧）光素ＦＩＴＣ标记的羊抗鸡ＩｇＧ、胰蛋白酶购自Ｓｉｇｍａ公司；３０％过氧化氢购买自国药集团化学试剂有限公司；四甲基联苯胺（ＴＭＢ）购买自索莱宝生物科技有限公司；９６孔酶标板为Ｃｏｍｉｎｇ公司产品。１．２主要仪器通用酶标仪购于Ｔｅｃａｎ贸易有限公司；荧光显微镜购买自Ｏｌｙｍｐｕｓ公司；超低温冰箱°购买自Ｔｈｅｒｍｏ公司；３７Ｃ恒温水浴锅购自上海跃进医疗器械厂。２２Ｋ－４Ｐ－Ｋ－－１．３ＥＬＩＳＡ以及５２４ＰＥＬＩＳＡ４２２Ｋ一检测血清中的血清型禽腺病毒非结构蛋白、５２Ｋ抗体参照研宄内容所建立的方法，简述如下：°ａ２２Ｋ－４Ｐ和５２Ｋ－４Ｐ多２％ＢＳＡ５，１００／，４？包被肽用稀释至ｎｇ／ｍｌ成孔Ｃ包被过夜２－１４１ｈ；（）°ｂ．封闭第二天将酶标板放置３７Ｃ恒温水浴锅回温４５ｒｎｉｎ，ＰＢＳＴ洗两遍拍干，每孔加入３６〇ｎＬ２％ＢＳＡ封闭ｌｈ；°ｃ．ＰＢＳＴ三遍拍干，阴阳性血清及待检血清１４００１（Ｌ，３７Ｃ洗：稀释后，每孔加％孵 ４２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬ３５检测血清型禽腺病毒非结构蛋白ＩＳＡ方法建立及应用育ｌｈ；°ｄ．ＰＢＳＴ洗六遍拍干，ＨＲＰ标记的兔抗鸡ＩｇＧ１：１５０００稀释后，每孔加ｌＯＯ＾ｉＬ，３７Ｃ孵育ｌｈ；Ｔ°ｅ．ＰＢＳ洗六遍拍干，每孔加ｌＯＯ＾ＬＴＭＢ显色液，３７Ｃ孵育ｌＯｍｉｎ；ｆ．每孔加５０ｉｉＬ２ＭＨ２Ｓ〇４终止反应；｜４５０ｎｍｇ．酶标仪测定各孔在波长的吸光值；ｈ．计算结果。１．４基于纤突蛋白Ｆ２的ＥＬＩＳＡ２ＥＬＩＳＡ血清中纤突蛋白Ｆ抗体的检测采用方法，检测步骤简述如下：ａ．检测Ｆ２抗体的酶标板回温；一ＰＢＳＴ：Ｈ）：ｌ进行：４００，ｂ．阴阳性血清及待检血清用抗稀释液（菌体裂解液（））１稀释涡°ｌＯＯＬ３７旋仪上振荡混匀后，每孔，Ｃ水浴锅内孵育ｌｈ＾；°ｃ．ＰＢＳＴ洗涤３次后加入ＨＲＰ标记的兔抗鸡ＩｇＧ，每孔１００吣，３７Ｃ水浴锅内孵育ｌｈ；°ｄ，ＴＭＢ底物显色液，３７Ｃ水浴锅内孵育ｌＯｔｎｉｎ．ＰＢＳＴ洗涤３次每孔加入ｌＯＯ＾Ｌ；ｅ？每孔加入５（ＨｔＬＨ２Ｓ〇４终止反应；ｆ４５０ｎｍ．酶标仪测定各孔在波长的吸光值；Ｆ２－ｔＥＬＩＳＡ的Ｃｕｏｆ值，０１７７２０１７７２ｇ．根据大于．的为阳性，小于．的为阴性，判定结果。１５．间接免疫荧光检测ａ，，９６．鸡肝细胞用生长液培养铺满整个细胞瓶后用胰酶消化将细胞悬液加入到孔细胞培养板中，大约铺满８０％，每孔加入ｌＯＯ＾Ｌ新鲜培养基，置于培养箱培养；ＦＡｄＶ－４ｂ，９６００．次日从超低温冰箱取出病毒进行稀释，在孔板中，每孔细胞感染１个ＴＣＩＤ５０最后每孔补加１００ｇＬ１％维持液；°ｃ５３７Ｃ培养箱内培养３－４．９６孔板放在％Ｃ０２、山９６ＰＢＳ一ｄ，．将孔细胞板中的液体弃掉，洗遍在吸水纸张轻拍弃去多余残液；°－２０３２－，３５ｍｅ．每孔加入５０ｉＬＣ预冷的丙酮：乙醇（：在通风橱内固定ｉｎ后弃去固定液，（）吹干；ｆ．用ＰＢＳ润洗细胞，弃去液体；°ｇ．每孔加入ｌＯＯ＾Ｌ１：５００稀释的待检血清，将细胞板置于３７Ｃ水洛锅内孵育４５ｍｉｎ；°ｈ１１５ＦＩＴＣＧ３７４５ｍｉｎ．ＰＢＳ洗３次后，加入：０稀释的羊抗鸡，Ｃ水浴锅内孵育；Ｉｇｉ．ＰＢＳ洗３次后，每孔加入６０吣ＰＢＳ；，。．荧光显微镜下观察计数细胞有荧光的孔数ｊ ３６扬州大学硕士学位论文１６血清样．品－－－２Ｋ－４Ｐ－ＥＬＩＳＡ和５２Ｋ４ＰＥＬ为评价所建立的２ＩＳＡ能否用于检测区别ＦＡｄＶ４自然感染鸡群还是灭活疫苗免疫鸡群，对１８９份来自自然感染鸡血清，８１份来自灭活疫苗免疫鸡血清一，２４份来自人工攻毒鸡血清；６份ＳＰＦ鸡血清进行了检测。为进步验证检测结果的可靠性，利用基于纤突蛋白Ｆ２的ＥＬＩＳＡ以及间接免疫方法对血清进行了验证检测。２结果－２．１检测ＦＡｄＶ４人工感染鸡群血清样品－２－４Ｐ－ＥＬＩＳＡ以及５２Ｋ４Ｐ－ＥＬＩＳＡＦＡｄＶ－４将２Ｋ对人工感染鸡群血清进行了检测，并与Ｆ２ＦＡｄＶ－４Ｆ２－ＥＬＩＳＡ以及ＩＦＡ。基于结构蛋白ｉｂｅｒ的检测抗体的方法进行了比较检测结－－－－２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ和５２Ｋ－４ＰＥＬＩＳＡ８７５％，９５８％２１果显示，的阳性率分别为．．（结果如表，－－－－表２－２２２Ｋ－４ＰＥＬＩＳＡＦ２ＥＬＩＳＡ１００％２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡＩＦＡ），与的阳性符合率为；与的阳性－－－４－符合率为１〇〇％，（结果如表２）。５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ与Ｆ２ＥＬＩＳＡ的阳性符合率为１００％；５２Ｋ－４Ｐ－ＥＬ－ＩＳＡ与ＩＦＡ的阳性符合率为１００％（结果如表２５）。２１１．．非结构蛋白抗体检测结果２２Ｋ－４Ｐ－ＥＬ－用建立的ＩＳＡ方法检测２４份ＦＡｄＶ４人工感染鸡群鸡血清样品，６份ＳＰＦ，３份为阴性鸡血清。检测结果显示２１份为阳性；６份ＳＰＦ鸡血清均为阴性；结果见表（－２－１ｄＶ４病毒后为了解感染ＦＡ，血清中２２Ｋ蛋白抗体变化的规律。因此，绘制２２Ｋ蛋）；ＦＡｄＶ￣４２２白抗体水平变化的柱状图。实验结果显示，感染后７天开始产生Ｋ蛋白抗体，２－１且抗体水平较高，１４ｄ时２２Ｋ蛋白抗体达到高峰ｄ之，２１后开始下降。结果如图）；（－表２１人工感染鸡中２２Ｋ非结构蛋白抗体变化水平－ｎｃｈｍｅｎＴａｂｉｔｈｅｅｖｅｏｆａｎｏｄｅｓａａｎｓ２２ＫｃｋｅｎｓｅｘｅｒａｎｆｅｃｅｄｗＦＡｄｌｅ２１ＣｈａｎｇｅｓｎｌｌｔｉｂｉｇｉｔｉｉｐｉｔｌｌｙｉｔｉｔｈＶ４样品编号１２３４５６阴性血清０，０９１２００９２６０．０８７８０．０７１６０．０９７７０．０８９４０１４９２０－４３０８０．１９７１０．２８８６０．４６８９０．３１８６攻毒７ｄ血清０．３２０．７２５８０．２４６３０３０８２１２３１６０３６６１５．．．攻毒１４ｄ血清０．８５１０．３６８２０．２２２７０．２１１９０．４７４８０．２９５７２１攻毒１ｄ血清攻毒２８ｄ０．１３７７０．３５６０．１９６１０．２０５１０．３９０６０．２０４６血清 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用３７－０．８－。．６Ｔ｜４＇°＇１－０．２■■■■■＾＾＾Ｔ＞令ｄａｏｓｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎｙｐ２－图１人工感染鸡中２２Ｋ非结构蛋白抗体变化水平Ｆｕ－－ｒｅ２１Ｃｈａｎｅｓｉｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａａｉｎｓｔ２２ＫｉｎｃｈｉｃｋｅｎｓｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｉｆｅｃｔｅｄｉｈＦＡｄｉｇｇｇｐｙｎｗｔＶ４－－５２Ｋ４ＰＥＬ－用建立的ＩＳＡ２４ＦＡｄＶ４人工感染鸡群鸡血清样品６方法检测份，份ＳＰＦ２３－，１份为阴性６ＳＰＦ２鸡血清。检测结果显示份为阳性；份鸡血清均为阴性（结果见表２。）为了解感染ＦＡｄＶ－４病毒后，血清中５２Ｋ蛋白抗体变化的规律。因此，绘制５２Ｋ蛋白抗体水平变化的柱状图－。实验结果显示，感染ＦＡｄＶ４后７天开始产生５２Ｋ蛋白抗体，且抗体ｄ时－水平较高１４５２Ｋ蛋白抗体达到，２１ｄ２２，高峰之后开始下降。（结果如图）；表２－２人工感染鸡中５２Ｋ非结构蛋白抗体变化水平－Ｔａｂ－ｌｅ２２Ｃｈａｎｅｓｉｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｉｉｉｇｓａｇａｎｓｔ５２ＫｎｃｈｃｋｅｎｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＦＡｄＶ４样品编号１２３４５６阴性血清０．０９７４０．０９５８０．０９５９０．０８１０．０９４８０．０８１７７０１８５８０－３８３７０．４５０１０．３４６８０．５５８８０．２４０２攻毒ｄ血清０２３０２０－５５０７０．５４３９０．３９３３０．５６０７０．３７５８攻毒１４ｄ血清〇．２４４６０２－５２３３０．２５２９０．２７４７０．９２６４０．３１４１攻毒１ｄ血清〇．－攻毒２８ｄ丨４９９０３０３３０．２０８９０．２２４１０．４３２４０．１８４血清 ３８扬州大学硕士学位论文－０．６１ｒ：＾４Ｔ＞＃ｄａｏｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｙｐｔ图２－２人工感染鸡中５２Ｋ非结构蛋白抗体变化水平Ｆ－ｆｅｃ－ｉｕｒｅ２２Ｃｈａｎｅｓｉｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａａｉｎｓｔ５２ＫｉｎｃｈｉｃｋｅｎｓｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｉｎｔｅｄｗｉｔｈＦＡｄＶ４ｇｇｇｐｙ２１２Ｆ２．．纤突蛋白抗体检测结果一－４为进步确认检测结果的准确性，用基于结构蛋白Ｆｉｂｅｒ２的检测ＦＡｄＶ抗体的ＥＬ－ＩＳＡ检测２４份ＦＡｄＶ４人工感染鸡群鸡血清样品，６份ＳＰＦ鸡血清。检测结果显示２４－－份均为阳性，６份ＳＰＦ鸡血清均为阴性（结果见表２３。为了解感染ＦＡｄＶ４病毒后，血清）中纤突蛋白Ｆ２抗体变化的规律。因此，绘制纤突蛋白Ｆ２抗体水平变化的柱状图。实验结－果显示，感染ＦＡｄＶ４后７天开始产生纤突蛋白Ｆ２抗体，且抗体水平较高，１４ｄ时纤突蛋Ｆ２－白抗体达到闻峰，２１ｄ之后开始下降结果如图２３。（）表２－３人工感染鸡中Ｆ２结构蛋白抗体变化水平Ｔａｂ－－ｌｅ２３ＣｈａｎｅｓｉｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａａｉｎｓｔＦ２ｉｎｃｈｉｃｋｅｎｓｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｉｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＦＡｄＶ４ｇｇｐｙｎ样品编号１２３４５６０．１３３８０１２２２〇．１〇９１０．１１１６０．１２３９０．１１５２阴性血清Ｌ９７１６１－６１８７１．３２５２２．３６２５２．５３９６０．９２４３攻毒７ｄ血清２．３３６８１－４５４３１．９７４５２．２７０５１．２３３２．攻毒４ｄ１７５６３１血清攻毒ｄ丨．３０丨０．Ｂ１０７１．０９４８１．３２７７０．７５８９０．７７７１２１血清〇．３７１８０－７８２１１．０６１７０．７８９９０．７４７９０．３８２８攻毒２８ｄ血清 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用３９２－．５．＂＊－－２－ＴＴ．０５＿１．１－１Ｉ－０ｖ：＾：＿議■。ｔ———一＾一＂ｓ——．１．１＾＾＾ｄａｏｓｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎｙｐ图２－３人工感染鸡中纤突蛋白Ｆ２抗体变化水平－－Ｆｉｕｒｅ２３ＣｈａｎｅｓｉｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅａａｉｎｉｎｉｋｅｎｉｌｌｉｇｇｓｇｓｔＦ２ｃｈｃｓｅｘｐｅｒｍｅｎｔａｙｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＦＡｄＶ４２１．．３间接免疫荧光检测一－为进步确认检测结果的准确性，用ＩＦＡ方法检测２４份ＦＡｄＶ４人工感染鸡群鸡血清样品，６份ＳＰＦ鸡血清。检测结果显示２４份均为阳性，６份ＳＰＦ鸡血清均为阴性（结果见２－４图。）－ＳＰＦＦＡｄＶ４阳性对照ＦＡｄＶ－４人工感染鸡■■■２－４－图ＩＦＡ检测ＦＡｄＶ４人工感染鸡群血清样品和ＳＰＦ鸡血清样品结果－Ｆ－ｉｒｅ２４ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＩＦＡｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｅｒｕｍｆｒｏｍｃｈｉｃｋｅｎｓｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｉｗｉｔｈＦｄ４ｇｕｐｙｎｆｅｃｔｅｄＡＶａｎｄＳＰＦｃｈｉｃｋｅｎｓ ４０扬州大学硕士学位论文－－－表－４ＰＳＡ２４２２ＫＥＬＩＳＡ、Ｆ２ＥＵ、ＩＦＡ结果的比较检测－－－Ａ－ＴａｂｌｅＣｉｄ２２Ｋ４ＰＥＬＩＦ２ＥＬＩＩＦＡ２４ｏｍｐａｒｓｏｎｏｆｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆＳ，ＳＡａｎｄ－ＩＦＡＦ２ＥＬＩＳＡｐｏｓｉｔｉｖｅｎｅｇａｔｉｖｅｐｏｓｉｔｉｖｅｎｅｇａｔｉｖｅ－２２Ｋ－４ＰＥＬＩＳＡｐｏｓｉｔｉｖｅ２１０２１０ｎｅａｉｖｅ３６３ｇｔ６ＩＦＡｐｏｓｉｔｉｖｅ／／２４０ｎｅｇａｔｉｖｅ／／０６２－５５２Ｋ－４Ｐ－ＥＬ－表ＩＳＡ、Ｆ２ＥＵＳＡ、ＩＦＡ检测结果的比较Ｔａ－５ｆ－－－ｂｌｅ２ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏ５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ，Ｆ２ＥＬＩＳＡａｎｄＩＦＡＩＦＡＦ２－ＥＬＩＳＡｏｓｉｔｉｖｅｎｅｇａｔｉｖｅｏｓｉｔｉｖｅｎｅａｔｉｖｅｐｐｇ－－５２４ＰＥＬＩＳＡｏｓｉｉｖｅ２３０２３０ｐｔｎｅａｔｉｖｅｇ１６１６ＩＦＡｏｓｉｔｉｖｅ／／２４０ｐｎｅａｔｉｖｅ／／０６ｇ２．２检测临床发病鸡群血清样品－－－２２Ｋ４Ｐ－ＥＬＩ４ＰＥＬＩＡ将ＳＡ以及５２ＫＳ对临床发病鸡群血清样品进行了检测，并与基－：Ｆｉｂｅｒ２的检测ＦＡｄＶ４ＥＬＩＳＡＩＦＡ抗体的以及方法进行了比较，于结构蛋白。检测结果显示－２２Ｋ－４Ｐ－ＥＬＩＳＡ５２Ｋ－４ＰＥＬ－－和ＩＳＡ的阳性率分别为８５．７％，８８．９％（结果如表２６，表２７，）２２Ｋ－４Ｐ－ＥＬ－－ＩＳＡ与Ｆ２的阳性符合率为９９．４％２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ与ＩＦＡ的阳性符合率为；９７５２－９。５２Ｋ－４Ｐ－ＥＬＩＳＡＦ２阳性符合率为９９５２Ｋ－４Ｐ－ＥＬＩＳＡＩＦＡ．％（结果如表）与的．４％；与９７６％２－１０的阳性符合率为．结果如表。（）２．２．１非结构蛋白抗体检测结果２２－４Ｐ－ＥＬ－－用建立的ＫＩＳＡ以及５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ方法检测１８９份临床发病鸡群血清样－２２Ｋ４Ｐ－ＥＬＩ－Ａ１６，２７２品。检测结果显示，Ｓ方法检出２份为阳性６份为阴性（结果见表）；－－ＥＬＩＳＡ１６８－５２Ｋ４Ｐ方法检出份为阳性，２１份为阴性２７（结果见表）； 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用４１２－Ｋ－４Ｐ－ＥＬ表６２２ＩＳＡ检测临床发病鸡群血清样品－－ｂ－Ｔａｌｅ２６２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡｆｏｒｃｉｉｆｅｃｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｅｒａｆｒｏｍｌｎｃａｌｌｙｉｎｔｃｈｉｃｋｅｎｓ１８９份临床发病鸡群血清样品０．５４３８０．７２５８０．３８７５０．７６４１０．７７９６０．７６３５０．８５４４０．６１６５０．８５０２０．４４１８０．９０１９０．５９０８０．７４２０．３７９７１．４２０５０．８３９７０．９０４６０．８９６５１．２１６６１．３３８３０．８１３７０．６８３６０．９７１２０．９４３３０．７６４６０．７７２１０．５５５７０．６９２１１．２８０５１．００６５１．１３７３１．０１３４１．３４７９１．１３３５０．５７６２０．６９９９０．６７４３０．５７３２０．８６１４１．０６１７１．１７４．１．２３５０．６８３４０．６２４２０８０４６０．５５７９０．８３４９５７２３０．９０５３６２１１．０．４８７０．．．．．８５１５０．７６３１１６０２０５１２６０．６２０５０．６６５６０５７５８１６０１３０．８８５９０．７６０１０．３５５２０．３５６８０．３８３９０．２２１０．７９０２０．５８５７０．３１６８０．４２２５０．３０４０，２７９７０５８２１０．５８２９０．２４２０．１９７３０．２４４０２８２１．１４６１０．１０９１０，２７０３１５８．．００．６０．１６７４０．１４１９０．１６３０．１６７７０．０８３４０．１４３９０．１０３０．１５９９０．２６３９０．３３３４０．４６２５０．２９５９０．４１６１０．４８１６０．９８２７２．２８７８０．３２９３１．４４１２０．３４４４２．００８．０．６９．０．．．２８９４７９０．３６９３０．６８４８０５１３４４５０４０２６４４１７０４５１７０１．１１１．７１７１．０１０６０．６４９５０．６２６５０．５６４４０．２１７６０．２７１６０．４８５０．５０２５２．３８４２０．８２７５０．２９６１０７３３３０．４２２５０．４２０８０．６８０５２．５６７２０．５３６４０．４０３７０．１８０２０．３７６２．０．１６３０．１７８５０．２９０．１６９６０．１１８７０．４４７８０．１９９８０．４８７０．４８４５０．１６１６０．１３５７．１６７９０．２２５０．３５４０．２３６３０１５４３０３２７６０．３３８３．１６９４．１５０１０．．０００．１９４４０．１４９３０．１６０６０．２０６９０．２３１４０．２８１７０．１５０４０．２４２２０．３３０．１６４４０．１５７０．３４４１０．３４１９０．１４０８０．１５０５０．１８８３０．１４２９０．１７５３１．００８６０．１５０１０．．２２８６０．１５４２０．２１１７０１７４５０．１８６６０．２１０２０．１８５０．２２２４０．３６６５０．２０９７０．２１７７０．１３３６０．１９２７０．１６９０．１７３６０．２６２４０．１５２４０．２１７７０．１９３６阳性对照阴性对照１．０４７２０．９５９９０．５９７８０．５７１２０．１０６６０．０９８４ ４２扬州大学硕士学位论文２－７２Ｋ－４Ｐ－ＥＬ表５ＩＳＡ检测临床发病鸡群血清样品Ｔａｂ－－－ｌｅ２７５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡｏｒｅｃｔｉｏｎｏｆｓｅｒａｆｒｏｍｃｉｎｉｃａｎｆｅｃｅｄｃｈｉｃｋｅｎｓｆｄｔｅｌｌｌｙｉｔ１８９份临床发病鸡群血清样品０．５２４５０．７８９９０．３６３９０．７４６４０．９１１２０．８６３２１．１２６２０．５７１８０．８８５２０．３８５４１．００３０．５７１６０．７７７９０．３７０２０．８３７６１．２０６８０．８６２２０．６５４５１．０７９６１．１５６２０．５８３８０．４８８５０．９８７６０９０１９０７８４５．７２６７０４４９０．６７３１１．１８１５０．９７１８．．０，６０．９３８９０．８６９３１３２９６１．０６４４０．５７３３０５２１．１０．５．９３６１１．０４３８．．６０５８６４３５００１８０．８３８１１２０１０．８２７９．５３２９．６３０３２．５５４．６２２．６３３７０．４７７２．５６７．００６０９０４９４．０．６４３６．８４２１．１７３４１．０９１５０．７７４６０．６７６８０．６１７２５３０．６７０５０７６３１０，６３０．０．３２０８０５６７０．１６６５．１９．４１４２０．３６６０２６２０．４５７０．２６８４０．１９２３．１００．５１５７０．５３９６０．２１１７０．１６０６０．２２３０．２４３１０．１２３５０．０９３７０．２６０１０．１３５９０．２８９０．１３８３０．１５２３０．１５０５０．３４７２０１４７５．０９８２０．１４２６０．１５９９０．２０９６１．００．４８３７０．２９５０．３８９２０．４０９１．０４１３０．８５０４０．２５３２０．２２８９０．２５９４０．４８４６０．１２０．４４１９１．３７２７０．６２４６０５９１７０．６４０．４４３５１６０．１０．７２０．６１１７０．２５１０．６２４９６８０３０．４６４４１０４４３０４５８１０．２５７３．４７８．５２２５０．５４３９０．６３５３０．．．０９００．３３６８０．７１１５０．３１０５３２１５０３８４５０４００９２３６３０．２５４４０．２６５８０２９３７０．，．０．．０１７１．３４２１０．３９６６０．１８６６０．１６４２２５６３０．１９０１０．２３１５０．２０２０．１９７８．６００．５６９０１６０．１９０３０．２２０９０．５０３５０．３６２３０．５３０．３１１７０．３３３６０．１６３２０．１５６４．１０１９７９０．１４７３０．１９３２０．３３３６．．４２０９，２７１７．３４５９０．４５５４０．２，０３７２８００００１４０．２３０９０．３５５１０．３１６５０．３５８９０．２３６４０．２２６７０．２５０４０．２９４４０．３２３２０．２２３２０．２４６９０．１９０９０．３３６９０．２１９６０．２０４７０．３１５８０．２３０３０．３６７５０．５４３８０．３４７０２６１７０．２２５９０．２０１１０．２９９４０．２６５０．３９４８０．１９１１０．３８６５０２０６，．阳性对照阴性对照０４０６０２２０．５７８０２９０．１０９３００８５７．６８０．１．１．２．２．２纤突蛋白Ｆ２抗体检测结果一－为进步确认检测结果的准确性ｉｂｅｒ２４ＥＬＩＳＡ，用基于结构蛋白Ｆ的检测ＦＡｄＶ抗体的检测１８９份临床发病鸡群血清样品。检测结果显示其中１８２份为阳性，７份为阴性（结果如表２－８。） 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用４３２－８Ｆ２－ＥＬ表ＩＳＡ检测临床发病鸡群血清样品Ｔａｂｅ－－２８Ｆ２ＥＬＩＳＡｒｅｅｃｔｉｏｎｏｆｓｅｒａｆｒｏｍｃｌｉｎｉｃａｌｌｉｎｆｅｃｅｄｃｈｉｃｋｅｎｌｆｏｄｔｙｔｓ１８９份临床发病鸡群血清样品０８．１．．６０．．．３０．８９０３．９８６１１．１９９８０．８５７１８２４１９４７２０７３１３３３１３０１８１８７１２．１１２８４２．１２９６１．３３８８１．７１１４１．２８２５１．９００５０．７２２８１．０７２２１．７２２４１．０１９０．．６９０５０．７７３４２．０４７９１．５５２６２．０４８６１．５７３２２２７５４１．８２０９０．９８０９１．８９５６０８４０１２．０８９３１．２８５４０．６１８１．３４９．９８．８５４５１．１５７１０．４３８４１．１．６０３９０６７７２．０５０４０．６４８５１．３８７１０．６５７８１．４５４９０．４４９９１．０７２８１．４４８６１．１．０００８０４８０．８９２１．７０２６１．７２４１０．４５１４１．３９８８０．５１７２０．４７１８１．２９４１１．４７２８０．７０７９０．６８４２０．９８５１．４２２２１．８３４７０．５９２２０．８２７９０．６９０２１．４１０４１．３５７３１．１５９７０．６７２９０．９８０９１．００４０．６４４９１．８０９０．１７４７０．１８２６０．２２１９０．２０２８０．１５７１０．１６１３０．１５２９０．２０３２０．１８３６０．１２９２０．１４０６０．１２５０．１６１３０．７５９９１．１７０９０．３０８５０．４９１２０．４１１３０．４３９０．６１８０．８３０６０．２５２８０．３１２２０．２７１９０．２２４１０．２７３２０．３３２３０．３０３３０．４７２０．７７７４０．５１７２０．４１０７０．４３４８０．６９１４０．２３９８０．６１５６０．５８７５０．８１４８０．８３２８０．５１７２０．２７８２０．４４０５２．１１０４１．３２５８２．１７４２２．１９３８２．４３７５２３６０２．１９３７０．．１．２４５７．２４３７１．６９０４２．２６．２３７２７１７９８９２．０７２２１．４１５４２．０２１６１．５５８５２．２２２７１．５００６１．６３４２１．４３１５１．４９６４１．８４２７１．３６６１．３１３３１．１１５４０．７７８１．１０６４０．９７１９０．６９９５０．６８２８１．０８９９０．９３０６０．４８３５０．４５６５０．１７９５０．１９６１０．１９３８０．３８３７０．３８１３０．２１１９０．２６８８０．２１８９０．２１８８０．２９２５０．２４８１０．２０５１０．１７６６０．２４５８０．１８２０．１７５５０．３０８２０．１８１３０．１９３０．２４８３０．２２７４０．３０２２０．２７７６０．２７４４０．３０３８０．３５５４０．３４５２０．２４８９０．．２１９５０．５６１６０．２３４７０．１８９１０．２３０２５４５０．２０９０．２２８６０．２２８３阳性对照阴性对照０．９７５２０．９９８１１．０４６６１．０６８３０．１０８５０．１０５６２．２．３间接免疫荧光检测一为进步确认检测结果的准确性，用丨ＦＡ方法检测１８９份临床发病鸡群血清样品。检－测结果显示１７７份均为阳性，１２份为阴性（结果见图２５）。 ４４扬州大学硕士学位论文■■Ｈ｜＾－图２５ＩＦＡ．Ａ、Ｂ分别代表阳性对照和阴性对照、Ｄ１７７份检测阳性和阴性的检测结果；Ｃ分别为样品。－Ｆｉｕｒｅ２５ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＦｌｉｄｔｉｉｉｉｌｄＩＡａｎａｓｓ．ＡａｎＢｒｅｒｅｓｅｎｏｓｔｖｅａｎｄｎｅａｔｖｅｃｏｎｔｒｏｌｓｒｅｓｅｃｔｖｅＣａｎｇｙｐｐｇ，ｐｙ；Ｄｒｅｒｅｓｅｎｉ．ｔ１７７ｏｓｔｉｖｅａｎｄｎｅａｔｉｖｅｓａｍｌｅｓｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌｐｐｇｐ，ｐｙ２－９２２Ｋ－４Ｐ－ＥＬ－表丨ＳＡＦ２ＥＬＩＳＡ和ＩＦＡ比较、检测结果的－ｂ－－－Ｔａｌｅ２９Ｃｏｍａｒｉｓｏｎｏｆｄｔｉｌｔｆ２２ＥＬＩＳＡＦ２ｄｅｔｅｃｏｎｒｅｓｕｓｏＫ４ＰＥＬＩＳＡａｎＩＦＡｐ，－ＩＦＡＦ２ＥＬＩＳＡｉｐｏｓｉｔｖｅｎｅｇａｔｉｖｅｐｏｓｉｔｉｖｅｎｅｇａｔｉｖｅ－－２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡｐｏｓｉｔｉｖｅ１５８４１６１１ｎｅａｔｉｖｅ１９８２１６ｇｉｉＩＦＡｐｏｓｔｖｅ／／１７２５ｎｅａｔｉｖｅ／／１０２ｇ 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＵＳＡ方法建立及应用４５－－－０５２Ｋ４Ｐ－ＥＬ表２１ＩＳＡ、Ｆ２ＥＬＩＳＡ和ＩＦＡ的比较－－－－ＴａｂｄｉＥＬＳＡｌｅ２１０Ｃｏｍａｒｉｓｏｎｏｆｅｅｃｔｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆ５２Ｋ４ＰＩＦ２ＥＬＩＳＡａｎｄＩＦＡｐｔ，－ＩＦＡＦ２ＥＬＩＳＡｏｓｔｖｅｎｅａｔｉｖｅｏｓｔｖｅｎｅａｔｖｅｐｉｉｇｐｉｉｇｉ－－５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡｏｓｔ１６４４１６７１ｐｉｉｖｅｎｅｇａｔｉｖｅ１３７１５６ＩＦＡｐｏｓｉｔｉｖｅ／／１７２５ｎｅｇａｔｉｖｅ／／１０２２．３检测灭活疫苗免疫鸡群血清样品－－２２Ｋ４Ｐ－ＥＬＩＳＡ以及５２Ｋ４Ｐ－ＥＬＩＳＡ对灭将活疫苗免疫鸡群血清样品进行了检测，并ｂｅ２ＦＡｄＶ－４ＥＬ与基于结构蛋白Ｈｒ的检测抗体的ＩＳＡ以及ＩＦＡ方法进行了比较。检测结果－－－－ＥＬ２％－．５％２显示，２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ和５２Ｋ４ＰＩＳＡ的阳性检出率分别为，０结果如表１１，表（－２－Ｖ４１２。基于结构蛋白Ｈｂｅｒ２的检测ＦＡｄ抗体的ＥＬＩＳＡ以及ＩＦＡ的阳性率均为１００％结）（＂＇２－果如表１３。）２．３．１非结构蛋白抗体检测结果－－用建立的２２Ｋ－４Ｐ－ＥＬＩＳＡ５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ方法８１份灭活疫苗免疫鸡群血清以及检测。－－，２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ２７９，２．５％检测结果显示方法检出份为阳性，份为阴性阳性检出率为（结－２－－１１５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ８１，果见表；方法检测，其中份均为阴性阳性检出率为０％（结果见表）２－１２。） ４６扬州大学硕士学位论文２－－－表１１２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ检测灭活疫苗免疫鸡群血清样品－－－ｗＴａｂ２１１２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡｏｆｓｅｒａｏｍｃｈｉｃｋｅｎｓｖａｃｃｉｎａｉｉｎａｉａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｌｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｒｔｅｄｔｈｃｔｖ８１份灭活疫苗免疫鸡群血清样品０．．．．１１０４０．１０８９０．１０５７０１１２３０．１２５５０．１１７２０．１０９６０１５２３０１７９０．１３３８０．１７９２０１１３５０．０９７０．０７２８００５３６０．０９４６０．０８９７．１１７２．１３６０．０５３．．０００．０５２４０．０７９８０．０７５４０．０９７８０．０９５５０．０９５９０．０８０．１１６７０．０８３７０．１０９９０．０８４２００９８０１１９１０．１１９８０１３１２１２０．１１４１００８６７０１０２７０．１１６．１．．０．１．．８０．１３８１０．１２８３０．１０５７０．１２４８０１２５８０．１２０３０．１２１９０．１０２３．０９６０．１２１９．００１４０１１２．１２８４０．１０６２０１０．１２２０．１２３６０．１０１０．１００．１０．５０．６７００４７．７６０９０．１０２０．１０７７０．１１７７０．１２４４０．１１５９０１０５２０．０９１０．１０４５０．１２０．１２０４．４８０．０９４１０．１０７７０．１２７６０１２４４０．１２０７０１１２５０．０８５０１０１５０．１０１０４．．１．１３７．６０．１２６７阳性对照阴性对照．０１００．５０１９０．９４９８０．６６７３１１９０．１０３２．０Ｓ４６２－－＿表１２５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ检测灭活疫苗免疫鸡群血清样品ｂ－－－Ｔａｌｅ２１２５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡｆｏｄｉｓｔｉｒｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｅｒａｆｒｏｍｃｈｃｋｅｎｖａｃｃｉｎａｔｅｄｗｉｈｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｎｅ８１份灭活疫苗免疫鸡群血清样品０．１１２７０１．１１１８０．１００１０．１１１０．１１２１１．１２０．１０．０６６０８０．６３０００．０２９００５８９０．１５７９０．１０３４０９１５０．０６８１０．０５４９０．０８８９０．０８６８０１１５２．１２４．０５４２．０．０８００．０５３０．０７１０７１９０．０８３２．０７．０８６５０．１５０．１１４０．０７６２０．０１．００７００７８００．．１２２８．，１２８３０１７１．．１１０１１７５．０７４７０９８６０．１２２９０００９５５０．００９３５０５２．０．０９６０．１１７５０．１２７６０．０８８５０．１０９６０．１１０１０．１１６６０．０９２６０．０７４４０．０８８７．０８１００．０．０９３４０．１２８７０．１０２９０１０．１１８８０．１２７３．１０９９．１０８８０１２７６０．１１３７０．１３１２０．１４０６０．１０７３０．１３７３０．１３３４００．１３９９．１２０１０．１３６７０．１０３１０．１４０２０．１２１０．１３７０．１３８７０．１２５１．１３０２０．１２．１．１１５５１２０８１０，０７０８４０３９７００．０．１３９１阳性对照阴性对照０．９６０５０．５２２８０．５９０２０．６６０７０．０９６８０．０８２２２．３＿２纤突蛋白Ｆ２抗体检测结果一步确认检测结果的准确性ｅｒ２ＦＡｄＶ－４ＥＵＳＡ为进，用基于结构蛋白Ｆｉｂ的检测抗体的－检测８１份灭活疫苗免疫鸡群血清样品。检测结果显示其中８１份均为阳性（结果如表２１３）。 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用４７２－－表１３Ｆ２ＥＬ１ＳＡ检灭活疫苗免疫鸡群血清样品ｂ－－Ｔａｌｅ２１３Ｆ２ＥＬＡｆｄｔｉｆｈｉｉｔｉｈｉｎａｉｉＩＳｏｒｅｅｃｔｏｎｏｆｓｅｒａｒｏｍｃｃｋｅｎｓｖａｃｃｎａｅｄｗｔｃｔｖａｔｅｄｖａｃｃｎｅ８１份灭活疫苗免疫鸡群血清样品０．４７６６０．６２４０．５３６８０．３４２３０．２７５８１．５５５１０．８０５２２．０８３３０．８９２３１．６３３６３０９４０．５７１８０．５３８５０．６０３９０．６２３４０．４２１８０．５６３１０．４６５１０．３０３９０．４１６７１．０．３７４１．１６４３１．３７２４０．７１９０．７１４８１．６７１１１．７８２１２．０７２．００４７．６８７３１．１．７５５５０．３２９０．６４０４１．４２２１．８９０１２．０１８６０３３７３０．１９４３０．９６４７１．５９７１１．０２２４１．３２１７０．１９９２１．９１２１１．７４３５１．４８４９１．４１３７０．８１６６１．２】８４０．２０９５．３５６７１．７４２９０．４４８７０．２３５８０．２４３２０．２０９４０．２９３９０．２２８３０．２４５８０．２１１１０．２７４８０．２８５７０．１９７５０．１９０２０．２２１６０．１９５２０．２８２３０．２０４４０．２３０７０．２５０６０．１９７２０．２０６１０．１８４８０．２３７１０．２１４５０．２１０．２０９８０．１８３５０．１７５２０．２６７３０．２７４６阳性对照阴性对照０．９７７８０．９５１５１．０２１５１．００３８０．１０４６０．１１７７２．３．３间接免疫荧光检测一为进步确认检测结果的准确性，用ＦＡ１Ｉ方法检测８份灭活疫苗免疫鸡群血清样品。－检测结果显示８１份均为阳性结果如图２６）。（阳性对照ＳＰＦ灭活疫苗免疫鸡图２－６ＩＦＡ检测灭活苗免疫鸡群血清样品结果Ｆ－ｉｕｒｅ２６ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＩＦＡｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｅｒａｆｒｏｍｃｈｉｃｋｅｎｓｖａｃｃｉｎａｔｅｄｗｉｔｈｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｇ３小结及讨论如何通过检测病原特异性抗体水平来区别鸡群处于自然感染状态还是灭活疫苗免疫一状态，对疫病的诊断及免疫防控至关重要。本研究对研究内容部分中构建的基于多肽表２２Ｋ５２Ｋ２２Ｋ－４Ｐ－ＥＬ－－位的分别检测和蛋白抗体的ＩＳＡ和５２Ｋ４ＰＥＬ１ＳＡ能否用于检测区别ＦＡｄＶ＿４自然感染鸡群还是灭活疫苗免疫鸡群进行了评价２４。对份不同感染时间段采集的 ４８扬州大学硕士学位论文－－－－来自人工攻毒鸡血清的检测发现，２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ和５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ可用于感染早期检测２２Ｋ和５２Ｋ蛋白抗体－－－－。在２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ和５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ中，感染后７天血清样品均呈－１４２１－－，２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ阳性，在感染后天之间抗体水平最高感染２１天后抗体水平开始下降。－４Ｐ－ＥＬＡ对工攻毒鸡血清检测的阳性率分别为和５２ＫＩＳ２４份人８７．５％以及９５．８％。对１８９－ＦＡｄＶ－４感２２Ｋ－４Ｐ－－份临床上染发病鸡群血清检测发现，ＥＬＩＳＡ以及５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ的阳性率分别为８５．７％以及８８．９％。有意思的是，对８１份来自灭活疫苗免疫鸡血清的检测发现，２２Ｋ－４Ｐ－ＥＬ－４Ｐ－ＩＳＡ以及５２ＫＥＬＩＳＡ的阳性率分别为２．５％以及０％。作为比较，基于结构蛋－白纤突蛋白２的Ｆ２ＥＬＩＳＡ以及基于全病毒感染细胞为ＩＦＡ检测中发现－ＥＬＩＳＡ抗原的，Ｆ２以及ＩＦＡ对８１份来自灭活疫苗免疫鸡血清的阳性率均为１００％，对２４份人工攻毒鸡血清００－阳性率均为１，１８９ＦＡｄＶ４感９６３％９３。这％对份临床上染发病鸡群血清分别为．和．７％一－比较检测证明本研究构建的２２Ｋ－４ＰＥＬＩＳＡ５２Ｋ－４Ｐ－ＥＬＩＳＡ，以及能够很好的用于区别－ＦＡｄＶ－４２２ＥＬ感染鸡群以及灭活疫苗免疫鸡群。基于纤突蛋白的ＦＩＳＡ以及基于全病毒抗原的ＩＦＡ虽然对鸡群血清检测的灵敏度较高，但其不能鉴别感染鸡群以及灭活疫苗免疫鸡－－４Ｐ－ＥＬＩＡ比较－群，５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ工感染鸡群血清以及临床。值得注意的是，与２２ＫＳ对人上ＦＡｄＶ－４８１感染发病鸡群血清检测的阳性较高，而且对份来自灭活疫苗免疫鸡血清阳性０－４Ｐ－率为。这些检测结果证明，所构建的５２ＫＥＬＩＳＡ在检测非结构蛋白抗体中具有更高２２Ｋ－－－－的灵敏度以及特异性，比４ＰＥＬＩＳＡ具有更好的应用前景。虽然２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ能用于区别感染鸡群以及灭活疫苗免疫鸡群，但对８１份来自灭活疫苗免疫鸡血清检测中还是一一一－发现了阳性率为２５２２Ｋ４Ｐ－ＥＬＩＡ些低水平抗体阳性鸡（．％）。这检测结果方面提示Ｓ一一可能还需进步优化其检测临界值，另方面也可能与细胞灭活苗的使用有关。另外，本－２２－ＥＬ研宄中使用的基于纤突蛋白的ＦＩＳＡ对ＦＡｄＶ４感染诊断以及疫苗免疫监测同样表现。今后－ＥＬＩＳＡ出良好的应用前景，将检测结构蛋白抗体的Ｆ２与检测非结构蛋白抗体的－－－－２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ以５２４ＰＥＬＩＡ结－及ＫＳ合使用，将为ＦＡｄＶ４有效诊断及免疫监测提供有力技术支撑。 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用４９全文小结－２２Ｋ５２Ｋ１本研宂以ＦＡｄＶ４的非结构蛋白中的和为靶点，通过多肽合成筛选，首次建立－２２Ｋ５２Ｋ蛋白抗体的基于多肽表位的ＥＬ２２Ｋ－４ＰＥＬＩＳＡ以及了分别检测和ＩＳＡ方法，５２Ｋ－－ＥＬ－４Ｐ－ＥＬＩＡ４ＰＩＳＡ方法。２２ＫＳ中包被用多肽序列为ＡＧＥＤＫＥＮＳＰＰＴＩＰＰＫＲＳＲＮＡＶ－－ＫＡＫＰＤＴＶＰＧＤＹＤＲＤＭＭＹＲＳＧＶ。ＳＳ，５２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ中包被用多肽序列为ＱＱ－－－４Ｐ－４ＦＡｄＶ－４人工２将２２Ｋ４ＰＥＬ１ＳＡ以及５２ＫＥＬＩＳＡ对２份感染鸡群血清样品，１８９份临床发病鸡群血清样品以及８１份灭活疫苗免疫鸡群血清样品进行了检测，并与基于结构蛋－－Ｆ，２２Ｋ４ＰＥＬＩＳＡ白ｉｂｅｒ２的ＥＬＩＳＡ以及ＩＦＡ进行了比较。检测结果证明所建立的以及－－ｄＶ４还是处于灭活５２Ｋ－４ＰＥＬＩＳＡ可以有效鉴别鸡群是自然感染ＦＡ疫苗免疫状态，且发现－５２Ｋ－ＥＬ４ＰＩＳＡ具有更高的灵敏度以及特异性。 ５０扬州大学硕士学位论文参考文献ＥＤＴｈ１ｎｄｅＶ．ｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｉｎｅｓｏｆａｎｅｗｆｉｌｔｒａｂｌｅａｅｎｔｗｈｉｃｈｍａｂｅｔｈｅｃａｕｓｅｏｆｂｏｖｉｎｅ［］ｇｇｇｙ－Ｍｉ９４９２ｌｕｍｓｋｉｎｄｉｓｅａｓｅＪ，Ｇｅｎｃｒｏｂｉａｌ１１９４９：１７４．ｐｙ，，３８３［］，（）２张明明．Ｉ群禽腺病毒的分离鉴定和生物特性研究及重组禽腺病毒的构建Ｄ．扬州大［］［］２００８２－１４学．，，－３Ｄ？２００４２１４何秀苗．禽腺病毒载体的构建及其生物学特性的研宄［扬州大学．［］］，，［４］谢泉．基于ｈｅｘｏｎ蛋白的检测禽腺病毒抗体的ＥＬＩＳＡ方法的建立［Ｄ］．扬州大学，２０１７，－１７．５ＨｅｓｓＭ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆａｖｉａｎａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ：ａｒｅｖｉｅｗＪ．Ａｖｉａｎｐａｔｈｏｌｏｇｙ：［］［］－ｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＷＶＰＡ２０００２９３：１９５２０６．ｊ，，（）６４、Ｄ梁广成．血清型禽腺病毒的分离致病性及其抗体间接免疫荧光方法的初步建立［．［］］２０－１５扬州大学，１７，９．［７］罗思思，谢芝勋，等．Ｉ群禽腺病毒分离鉴定及ｈｅｘｏｎ基因的序列分析Ｊ．２０１２，４４（１）：［］５２－５６．８Ｄ－ＢｏｍａｎｓｋａｌｉｃｈａｒｚＫＴｏｍｃｚｋＧ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ［］，ｙｔ－ｉｉｏＪＰｔｒｉ２０１１９０５９８３９ｉｓｏｌａｅｄｆｒｏｍｃｈｉｃｋｅｎｓｗｔｈｇｉｚｚａｒｄｅｒｏｓｎｓ．ｏｕｌｓｃｅｎｃｅ：．［］ｙ，，（）ＭｔＰ－－９ＮａｋａｍｕｒａＫａｓｅＭｅａｌｉｔｉｌ．ａｔｈｏｏｃｓｕｄｏｆｓｅｃｆｉｃａｔｈｏｅｎｆｒｅｅｃｈｉｃｋｓａｎｄｈｅｎｓ］，［，ｇｙｐｐｇｎｏｃｕｌａｔｅｄｗｔｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｈｄｒｏｅｒｃａｒｄｉｕｍｓｎｄｒｏｍｅＪＡｖｉａｎｓｅａｓｅｓ１ｉｉｈａｄｅｎｏｖｉｙｐｉｙ，ｄｉ９９９，［］，４３３４－１４２３：．（）１０ｌＲＪＨａＫＡａｔａｏｖｓｆｅｃｔｏｎｏｆｌｃＷｅｌｓｒｒｉａｎ．ｆｌａｄｅｎｉｒｕｉｎｉｂｒｏｉｅｒｈｉｃｋｅｎｓ：ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄ［］，ｇｙｈｅａｔｔＴＶｔ４－ｉｉｓＪ．ｈｅｅｅｒｉｎａｒｒｅｃｏｒｄ１９７９４２１：４８１２．ｐ［］ｙ，，（）－１Ｊ２０１７３９１２：４４４７１楚电峰刘文亭等．Ｉ群禽腺病毒疫苗研宄进展．中国家禽．［］，，，，［］（）１２颜思通李力复等．巴基斯坦鸽群暴发心包积水综合症Ｊ．广东畜牧兽医科技１９９６［］，，［］，，２１１５０（：．）［１３］ＫｉｍＪＮ，ＢｙｕｎＳＨ，ｅｔａｌ．Ｏｕｔｂｒｅａｋｓｏｆｈｙｄｒｏｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍｓｙｎｄｒｏｍｅａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｅｒ－ｔｉｚａｔｉｏｎｏｆＫｏｒｅａｎｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒａｌｉｓｏｌａｔｅｓＪ．Ａｖｉａｎｄｉｓｅａｓｅｓ：５２．］，２００８５２３６３０［，（）１４Ｄ２０１２国纪垒．Ｉ群禽腺病毒山东株的分离鉴定及其致病性研宄［．山东农业大学［］］，，１－１１．ＳＡ［１５罗思思．Ｉ群禽腺病毒分离鉴定及重组蛋白ＥＬＩ鉴别诊断方法的研宄［Ｄ］．广西大学，］－２０１１３５９．，１６ＪａＫＫ主译２０００１－３５ｉｎ．基因治疗学．世界图书出版社？任斌．０：３２．［］，１７ＳｉｎａｓＣＡｋｕｓａｒｖｉＧｅｔａｌ．ＲｅｉｏｎＥ３ｏｆｈｕｍａｎａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅ［］ｇ？ｊ，ｇ 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用５１－－ｏｎｃｏｅｎｉｃａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ２ＪＧ１９８６５０１７３１８４．ｅｎｅ：．ｇ［］，，［１８］ＣｌａｄａｒａｓＣ，ＷｏｌｄＥＳＭ．ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅＥ３ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｕｎｉｔｏｆａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｖ４０２８－４３ｉｒｏｌｏ１９８５１：．ｇｙ，，－１９曹卫云．鸡禽腺病毒Ｉ群感染的诊断Ｊ？畜牧与饲料科学２００９３０１１１２：９．［］［］，，（）２０王小辉－ＩＤ．２００８１９．．群禽腺病毒的分离鉴定和生物特性研宄［扬州大学，，［］］２ＭＧＡｒｕｓａ－ａｓｓｏｃａｔｅｄｖ１ｏｎｒｅａｉｒｕｓｅｓｏｆｏｕｔｒＪＰｏｕｌｔｒｃｉＲｅｖ１９９２ｌ．ｄｅｎｏｖｉｎｄａｄｅｎｏｉ．ｐｌｙ．ｙＳ［］［］，，４－：１２７．２２ＲａｕｅＲＧｅｒａｃｈＨｅｔａＰｔｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆｔｈｅｈｅｘｏｎｌｏｏ１ｒｅｉｏｎｏｆａｎａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｌ，ｌ．ｈｙｌｏｇｅｎｅ［］，ｙｐｇｆｒｏｍｓｉｔｔａｃｎｅｂｉｒｄｓｓｕｏｔｔｈｅｅｘｉｓｔｅｎｃｅｏｆａｎｅｗｓｉｔｔａｃｉｎｅａｒｕｓＰｓＡＤｖＪ．Ａｒｃｉｐｐｒｐｄｅｎｏｖｉｈｐ（）［］２０１５－Ｖｉｒａｌ１５０１０：１９３３１９４３．，（，）［２３］ＯａｋｓＪＬ，ＳｃｈｒｅｎｚｅｌＭ，ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆｆａｌｃｏｎａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎｂ－ｉｏ４３７３４１３４２０Ｍｉｃｒｏｌ２００５：４．，，（）－ｉｓｓｉｏｏｆｌＪ２００６３２３０２４ＧｒｉｃＨ．Ｓｔｕｄｏｆｖｅｒｔｉｃａｌｔｒａｎｓｍｆｏｗａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．７０：２３３．］ｇｙ［］，（）［［２５］ＭａｔｏｓＭ，ＧｒａｆｌＢ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｏｕｔｃｏｍｅｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙｉｎｄｕｃｅｄｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｈｅｐａｔｉｔｉｓ（ＩＢＨｂｆｏｗｌａｖｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓＦＡｄＶｓｉｓｃｒｕｃｉａｌｌｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄｂｙｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｏｆｔｈｅ）ｙ（）ｙｈｏｓｔＪ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｒｅｓｅａｒｃｈ２０１６，４７（１：６９．［］ｙ，）２６ＭａｓｅＭＮａｋａｍｕｒａＫｅｔａｌ．Ｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｃｈｉｃｋｅｎｓｗｉｔｈｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄ，ｓｙ［］－２０ｉｍｅｄｌｉｈｅａｔｉｔｉｓｉｎＪａａｎ２００９１０Ｊ，ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｖｅｔｅｒｎａｒｉｃａｓｃｅｎｃｅ，２０１２７４８：ｐｐ，ｙ，（）［］－１０８７９．［２７ＯｋｉｃＤ，ＭａｒｔｉｎＥ，ｅｔａｌ．ＧｅｎｏｔｉｎｏｆＣａｎａｄｉａｎｉｓｏｌａｔｅｓｏｆｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓＪ．Ａｖｉａｎ］ｊｙｐｇ［］－ａｔｈｏｌｏ：ｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＷＶＰＡ２００８３７１：９５１００．ｐｇｙ，，）ｊ（２８ＡｎｉＭｌｉＰＪｉｕｍＡＤＳａｂｒＡｅｔａ．Ｈｄｒｏｅｒｉｃａｒｄｉｔｉｓｓｎｄｒｏｍｅｉｎｂｒｏｉｌｅｒｃｈｃｋｅｎｓｉｎａｋｉｓｔａｎ．［，？］ｙｐｙ［］ｖｒｕ－ｓＤｉｓ２０１４２５：１１４１１９．ｉ，（）２９．．Ｊ２０１６３８６：罗玲，赵康，等鸡心包积水综合症病原的分离与鉴定［］中国家禽，，（）［］５６－５８．３０．？！．上海畜牧兽医通讯２０１６［］王慧，程小果，等近期鸡群Ｉ群禽腺病毒的流行与防治［］，，２６２－６３：一３－１孟祥东彬等．例麻鸡心包积水综合症的诊制？！．家禽科学２０１６１：６１６２．［］，崔［］，，［３２］ＭｅｎｄｅｌｓｏｎＣ，ＮｏｔｈｅｌｆｅｒＨＢ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎａｖｉａｎ＇＇ｉｆｉｋｉｍｏｒｔａｆｌｉｌａｄｅｎｏｖｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｄｒｏｍａｓｐｎｇｌｉｔｓｎｄｒｏｍｅｉｅｄｏｕｔｂｒｅａｋｎｂｒｏｉｅｒｓｏｎｔｈｅｙｙＤｅ－ｌｍａｒｖａＰｅｎｎｓｕａＵＡＪ，ＡｖａｎＰａｔｈｏｏ１９９５２４４：７０６．ｉｌ，Ｓｉｌｇｙ，，（）６９３［］３３ＣｈｏｉＫＳ，ＫｙｅＳＪ，ｅｔａｌ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｏｕｔｂｒｅａｋｓｏｆｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ［］ ５２扬州大学硕士学位论文ｃ－ｉｎｆｅｔｉｏｎｉｎｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｃｈｉｃｋｅｎｓｉｎＫｏｒｅａＪ．Ｐｏｕｌｔｒｙｓｃｉｅｎｃｅ２０１２９１１０：２５０２２５０６．［］，，（）［３４ＫａａｎＧＬ，ＫｅｃｓｋｅｍｅｔｉＳ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｙｐｉｎｇｏｆｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｉｓｏｌａｔｅｄｉｎＨｕｎｇａｒｙ］ｊｒｅｃｅｎｎａｒ－－ｔｒｅｖｅａｓｈｖｅｒｓｔＪＶｅｔｅｒｍｃｒｏｂｏｌｏ２０１３１３４：７６３ｌｙｌｉｇｈｄｉｉｙ．ｉｙｉｉｇｙ，，６７３５．，［］（）３５ＭｉｔｔａｌＤ，ＪｉｎｄａｌＮ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ［］ｈｄｒｏｅｒｉｃａｒｄｉｕｍｓｙｎｄｒｏｍｅａｎｄｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｈｅｐａｔｉｔｉｓｉｎｂｒｏｉｌｅｒｃｈｉｃｋｅｎｓＪ．Ｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅｙｐ［］，２０－１４２５１：１１４１１．，）９（［３６］ＮｉｃｚｙｐｏｒｕｋＪＳ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｆｉｅｌｄｓｔｒａｉｎｓ－ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｏｕｌｔｒｉｎＰｏｌａｎｄＪ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ２０１６１６１１：４２ｙｇｙ，，３３．ｐ［］（）［３７］ＹａｔｅｓＶＪ，ＲｈｅｅＹＯ，ｅｔａｌ．Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆｃｈｉｃｋｅｎｓｅｘｐｏｓｅｄｔｏａｔｙｐｅ１ａｖｉａｎ－ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓａｌｏｎｅｏｒｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓＪＡｉｄｉｓｅ１９７７．ｖａｎａｓｅｓ［］，ｓ２１３４０８－４１４：．（）［３８］ＰａｌｌｉｓｔｅｒＪ，ＷｒｉｇｈｔＰＪ，ｅｔａｌ．Ａｓｉｎｇｌｅｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅｆｉｂｅｒｉｓｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｖａｒｉａｔｉｏｎｓｉｎ－ｖｌｔＪＪ１７０５１１５２２ｉｒｕｅｎｃｅｉｎｈｅｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．ｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏｇ９９６８：．［］ｙ，，（）［３９］ＶｅｒａｈｅｒｎＮｄｅｚＰＦ，ＭｏｒａｌｅｓｇａｒｚＮＡ，ｅｔａｌ．ＣｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎａｈｉｇｈｌｙｖｉｒｕｌｅｎｔｆｏｗｌＡｖｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｓｅｒｏｔｅ４Ｊ．ｙｐ［］ＡｖｉａｎＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１５，４５（１）：１．４０ＰＨＬＩｔｌＭ－ａｒｋＳｉｍＳｅａ．ｏｌｅｃｕｌａｒａｎａｌｓｉｓｏｆｔｈｅｈｅｘｏｎｅｎｔｏｎｂａｓｅａｎｄｆｉｂｅｒ２ｅｎｅｓｏｆ［］，？ｙ，，ｐｇＫｏｒｅａｎｆｏｗｄ－ｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｓｅｒｏｔｙｐｅ４ｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍｈｙｒｏｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍｓｙｎｄｒｏｍｅａｆｆｅｃｔｅｄｃｈｉｃｋｅｎｓＶ－Ｊｉ１７１１１．ｒｕｓｅｎｅｓ２０５３：１６．］ｇ，，）［（４一４１．株高致病性血清型禽腺病毒的分离与鉴定Ｊ．中国家禽６Ｊ梁广成，高巍，等，２０１［［］，３８－２８１９：２５．（）［４２］ＹｅＪ，ＬｉａｎｇＧ？ｅｔａｌ．Ｏｕｔｂｒｅａｋｓｏｆｓｅｒｏｔｙｐｅ４ｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｗｉｔｈｎｏｖｅｌｇｅｎｏｔｙｐｅ，ＣｈｉｎａＪ．ＥｍｅｒＭｉｃｒｏｂｅｓＩｎｆｅｃｔ２０１６５５：５０．ｇ，，（）［］［４３］ＷａｎｇＰ，ＺｈａｎｇＪ，ｅｔａｌ．Ａｎｏｖｅｌｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｅｆｉｃｉｅｎｔｌｙｂｌｏｃｋｓｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆ－ｓｅｒｏｔｙｐｅ４ｆｏｗｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｂｙｔａｒｅｔｉｎｇｆｉｂｅｒ２Ｊ．ＶｅｔＲｅｓ，２０１８，４９（１）：２９．ｇ［］４４蔡宝祥．家畜传染病学Ｍ．中国农业出版社，２００１．［］［］４５ＨａＢＷＴｔ－ｅｓｅ．ＴｓＬ４１０ｔｔｔｌｌｉｎＧＧ９ａｌｈｅａｄｅｎｏｖｉｒｕ０ｋｉｌｏｄａｏｎｒｏｅｉｎｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｆｏｒ［，ｅ］ｙｇｐｙ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｒａｎｓｔｌＲＮＡｉＪＪ１９９０２２７４２ｌａｉｏｎｏｆｖｉｒａｌａｔｅｍｓｅｃｅｓ．ｖｉｒａｌ６４６：７３２．ｐ［］，，（）４６ＭｏｒｉｎＮＢｏｕｌａｎｅｒＰ．Ｍｏｒｈｏｅｎｅｓｉｓｏｆｈｕｍａｎａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｔｕｅ２：ｓｅｕｅｎｃｅｏｆｅｎｔｒｏｆ［］？ｇｐｇｐｑｙｏａａｎｄａａｒｔｃ－ｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｒｅｖｉｒｌｖｉｒｌｉｌｅＪ．ＪＶｉｒｏｌ１９８４１３６１：１５３１６７，ｐｐｐ［］，，（）ｔ－ｋ４７ＯｓｔａｃｈｕｋＰｅａｉｌｏｄｔＡｎｄｅｒｓｏｎＭＥｌ．ＴｈｅＬ４２２ａｌｏｎｒｏｔｅｉｎｌａｓａｒｏｌｅｎａｃｋａｉｎｏｆ［］ｐ３，ｉｐｐｙｐｇｇＪ－ｔｈｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｎｏｍｅ．ＪＶｉｒｏｌ２００６８０：６９７３６９８１．ｇ［］，， ４２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬ５３检测血清型禽腺病毒非结构蛋白ＩＳＡ方法建立及应用４８ＯｓｔａｃｈｕＨｅａｒｉｎＰｌｉｌｉｋＰ．ＣｏｎｔｒｏｏｆａｄｅｎｏｖｉｒｕｓａｃｋａｎＪ．ＣｅｌＢｏｃｈｅｍ２００５９６：ｐ，ｇｐｇｇ［，，［］］２５－３５．ＷｕＴＬ４－２２Ｋ４９ＫｒｏｚｃｏＤｅｔａｌ．ｈｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｒｏｔｅｉｎｉｓｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｄｉｓａｎｉｎｔｅｒａｌ］，Ｏ［，ｐｇｔｓ－ｃｏｍｏｎｅｎｔｏｆｉｔＪＶｉ２０１２１０４７４１０４８３ｃｒｕｃｉａｌａｓｅｃｏｆｎｆｅｃｉｏｎ．Ｊｒｏｌ８６：．ｐｐ［］，，－５０ＧｕｉｍｅｔＤＨｅａｒｉｎＰｅｔａｌ．ＴｈｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓＬ４２２Ｋｒｏｔｅｉｎｈａｓｄｉｓｔｉｎｃｔｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅ，ｇ，ｐ［］ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｎｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｅｎｃａｓｉｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｖｉｒａｌｅｎｏｍｅＪ，Ｊｐｇｐｐｇ［］Ｖｏ－ｌ２０１３８７：７６８８７６９９．ｉｒ，，Ｓｏ－－５ｌｏｗａｔｌＡｄｉＬＩ５２ｄ５５ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎｔｉｉｄ１ＨａｓｓｏｎＴＢＰＤｅａ．ｅｎｏｖｒｕｓａｎｒｏｅｎｓａｒｅｒｅｕｒｅ，ｙ，ｐｑ［］－ｒａｓｓｅｍｉｉＪＶｉｒ９８９６３３６２３６２１ｆｏｂｌｏｆｖｒｏｎｓＪ．ｏｌ１：１．ｙ［］，，５２ＧｕｓｔｉｎＫＥａｎｄＩｍｅｒｉａｌｅＭＪ．ＥｎｃａｓｉｄａｔｉｏｎｏｆｖｉｒａｌＤＮＡｒｅｕｉｒｅｓｔｈｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓＬＩ［］ｐｐｑ－ｋ－５２／５５ｉＪＪＶ１７２７８６０７８７０ｌｏｄａｌｔｏｎｒｏｔｅｉｎ．ｉｒｏｌ９９８：．ｐ［］，，ｒｅ－５３ＰｅｚＲｏｍｅｒｏＰＴｌｌｉｈｅｉｎｉｈｅｄｅｎｏｖｉｌｅｒＲＥｅｔａ．ＡｎａｓｓｏｆｔｔｅｒａｃｔｏｎｏｆｔａｒｕｓＬＩ５２／５５，ｙ，ｙ［］－ｋｉｈｉｔｒ．ＪｉｌｏｄａｌｔｏｎａｎｄＩＶａ２ｒｏｔｅｉｎｓｗｔｔｈｅａｃｋａｉｎｓｅｕｅｎｃｅｉｎｖｉｖｏａｎｄｎｖｉｏＪＶｒｏｌ２００５ｉｐｐｇｑ，ｇ［］，７９－：２３６６２３７４．５４２００４－．鸡腺病毒的保存与鉴定［Ｊ］．中国兽药杂志２３６：２７２９．范书才，黄建华，等，，（）［］［５５］智海东，杨志，等．鸡包含体肝炎病毒ＣＥＬＯＶ株的鉴定研究［Ｊ］．中国兽药杂志．２００９，４３－（１：６９．）５６邓显文罗思思３３Ｋ－ＥＬＩＳＡＪ．Ｉ检测方法的建立［．南方农业学］，等群禽腺病毒间接［，］２０－４０８１２４３９：１４０５１．报，，（）５７］陈善真曹仁棋，等．以偶联多肽为抗原建立检测０型猪口蹄疫病毒抗体的ＥＬＩＳＡ方［，－Ｊ１４４５５．广东农业科学０：１３６１．法，２，［］５８生ＩＳＤ．小反刍兽疫病毒Ｎ蛋白抗原表位多肽的合成及竞争ＥＬＡ方法的建立．［］印春［］－２００７．中国兽医药品监察所１２１４，， ５４扬州大学硕士学位论文攻读学位期间发表的学术论文及申请专利一、发表论文申秋平，田晓彦，邹海涛，邵红霞，秦爱建，叶建强．新型环形病毒ＡＧＶ７的ＶＰ３基因克２０－１８４０１１２１５隆、表达及其多抗制备．中国家禽：．，，）（二、专利申请一ＶＶＰ３１．种Ｇｙ７环形病毒蛋白制备方法（专利申请号：２０１６１０９３７１０４．４，叶建强，，邵红霞，秦爱建申秋平，田晓彦，万志敏）－２－．源于鸡传染性贫血病毒ＶＰｌａａ２３４３多肽作为高效细胞穿膜肽的应用：（专利申请号２０１７１０２４８３８６．１，叶建强，呼高伟，邵红霞，秦爱建田晓彦，），申秋平，金甫，刘敏—３－－．种源于鸡传染性贫血病毒ＶＰｌａａ１１９多肽作为高效细胞穿膜肽的应用（专利申请号：２０１７１０２４８３８７．６，叶建强，呼高伟，邵红霞，秦爱建，刘敏，申秋平，田晓彦，金甫） 检测血清４型禽腺病毒非结构蛋白２２Ｋ、５２Ｋ抗体的ＥＬＩＳＡ方法建立及应用５５致谢三年时光弹指一瞬，回首研宄生生涯，刚入学踏入校园时的那份欣喜依然清晰可寻。滴水穿石，岁月如歌，在这里生活和奋斗的点点滴滴都将成为我美好的记忆。千教万教教“”“”人求真，千学万学学做真人，扬大以其求是、求实、求新、求精的校风、坚苦自立的精神时刻鼓舞着我求真、成人、奋进。值此研宄生毕业论文完成之际，我谨在此向所有给予我关心、支持和帮助的领导、老师、同学、亲人和朋友们表示最诚挚的感谢和最衷心的祝愿。。，首先，向我最敬爱的导师叶建强教授表示衷心的感谢在三年的学习、工作和生活中导师渊博的学科知识、敏锐的学术视点、严谨的科研态度和不懈的人文追求让我感佩至深、一终身受益。实验的推进和论文的完成过程中，每次的进步都离不开导师的指导、关心与帮助！。在此谨向叶老师表示最衷心的感谢和最崇高的敬意真诚地感谢在学习和科研上给予我热心指导和帮助的秦爱建老师、邵红霞老师、金文杰老师、钱琨老师。感谢呼高伟、邹海涛、李拓凡、谢泉等博士在实验上的帮助和指导；感谢张建军老师、周扬师兄在动物实验上的帮助和指导、、、；感谢己经毕业的田晓彦范中雷周晓祥梁广成、！施洋洋、田雪、刘阳等师兄师姐给予的关心和帮助，祝您们工作顺利感，生活幸福美满谢同级小伙伴鹿亚男、刘敏、王萍、郑文铝、王伟康、王瑶瑶、李敏、张媛媛、朱婷、武奇、孙舒、程晓薇，！、金甫等在实验和生活中的相互理解和支持希望大家能够友谊长存感谢路浩、李占萍、谢菁、张琳婧、董晓妹、吕璐、陆文静、马靖雯、金芳、任丹、朱敏、王鹏等师弟师妹在实验上给予的支持！，祝学业进步、有成一直支持我的家人和男友一在这三年里我还要感谢。衷心感谢在我的求学生涯中直默默关心支持并无怨无悔付出的父母，感谢成长路上携手共进、相互帮助的妹妹。感谢在学习、工作和生活中时刻给予我鼓励、支持和关心的男友。你们是我硕士期间的莫大支持，你们永远是我前进道路上的坚强后盾与动力源泉！最后再次衷心地感谢所有领导！！、老师、同学、亲人和朋友谢谢顿． ５６扬州大学硕士学位论文４扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研宄工作所取得的研宄成果。除文中己经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研宄成果。对本文的研宄做出贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：，科个签字曰期：年（月匕曰学位论文版权使用授权书本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研宄所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。学位论文作者签名：今轉个导师签名：签字曰期：年（月（５曰签字曰期：？咖年（月５曰｜（本页为学位论文末页。如论文为密件可不授权，但论文原创必须声明。）
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