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《聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1在糖尿病心肌病中的作用及机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
单位代码１０４７５申请编号１０４７５３１３０９６５分类号Ｑ９３皆為义聲硕±学位论文Ｉ：聚腺昔二憐酸核糖聚合酶１在糖尿病私肌病中的作用及机制硏究Ｕ－学科胃、专业；生物学、微生物学硏究方向：糖原病心肌病申请学位类别：理学硕±骨＂．’＂申请人：刘国亮ＩＶ－：：ｔｅ指导教师姬新颖教授．合作导师：张铭湘教梭＿＇：皆二０—－六年Ｈ月－‘＇＇－，．—格：＇．Ｊ产：掛却：曾．；．擊導－＇－－．：甲、拓祥：１客万爲谭 关于学位论文独立完成和内容创新的声明本人尚河南大学捷出硕壬学位辛请。本人舞重声明：巧星吏的学位论丈是本人在导师的指导Ｔ独立宠成的，对辨研究的课毅有新的见解。接我巧知，除＂丈中巧加乂说、＊特＾明抵注和致谢的地清论义申不化扭其他人ｅ经发泉或撰骂过的研究戌采，也不包括其化人为获得化何教實、科研轨我的哮粗或证书巧使用过的材料－－時工讳的岡事对本研究巧做的任何贵献均＆在论义中作。与我了明确的说明并表示了無意。人（：论丈作者）学位串请学担：签左；Ｗ岛企’２０／仁单（月／口＇：关子学位论文暮作权使簡慑权书本人经河南大学审板批准援于硕古学位。作为等植论文的巧老，本入完金了解并同意河南太学有头保留Ｖ化用学植论文的要求．即巧南大学有权尚圈家本图和书巧、科研信息抗构、歡据收藥机构和本校国书巧等提拱学位论史（觀质丈电子文本）ｅｉ供公众检索、奢閑＊本人授权河病大学出子宣搞、展览学校段学保术存发展和进巧学未交流等良舶，可似表取影印、缩邸、担描和拷巧等复刺手、汇瑞学化论文（紙廣文本和电子文本）。（涉及保密巧容的学化论丈在解密盾逐巧本授权书）学化获得肴（学枝论义作者）簽矣：２０＇《年＾月６扫学化论义指导教邪簽名；２〇ｆ层年《６Ｓ THEPOTENTIALROLEANDMECHANISMOFPOLY(ADP-RIBOSE)POLYMERASE1INDIABETICCARDIOMYOPATHYADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByGuoliangLiuSupervisor:Prof.Xin-YingJiCo-supervisor:Prof.Ming-xiangZhangMarch,2016 摘要背景糖尿病是一种慢性，渐进性的代谢性疾病，其主要特征是胰岛素缺乏和/或抵抗，导致血浆葡萄糖水平的升高,并且确实是21世纪人类健康的一大威胁，由于发病率的上升，其状况令人担忧，在过去二十年里，吸引了相当多的关注。糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病患者心功能不全且没有冠状动脉硬化和高血压因素的影响，它也是人类健康的一大威胁，也是亟待解决的临床问题。根据本课题组之前的研究结果，高血糖能够诱导大鼠心肌细胞凋亡，因此本实验使用葡萄糖刺激大鼠心肌细胞，构建高血糖细胞模型，高糖刺激是否引起细胞氧化应激和DNA损伤，并且影响PARP-1表达和活性。PARP-1在高糖导致的炎症反应和凋亡信号通路中扮演着什么样的作用。PARP-1在氧化应激和DNA损伤中扮演者重要的角色。本实验对PARP-1进行干预，以期阐明PARP-1在糖尿病心肌病中的潜在作用机制以及找到治疗糖尿病心肌病的可行的治疗方法。目的构建小鼠糖尿病心肌病疾病模型，研究PARP-1在糖尿病心肌病中的潜在作用机制，同时构建心肌细胞高血糖模型，进一步研究PARP-1在心肌细胞凋亡中的具体调控机制。方法小鼠糖尿病心肌病建模，20只10周龄雄性C57BL/6野生型小鼠和20只10周龄雄性PARP-1基因敲除小鼠（美国杰克森实验室），模型组小鼠给予腹腔注射链脲佐菌素（STZ），剂量为50mg/kg，对照组小鼠腹腔注射等体积的柠檬酸盐缓冲液，连续注射5天。从小鼠尾静取少量血液，使用罗氏血糖仪检测小鼠血糖变化，如果小鼠随机血糖浓度>16.7mmol/l，则认为小鼠糖尿病模型建模成功。老鼠被饲养在无病原微生物的动物房并且确保有足够的食物和水。用琼脂糖凝胶PCR鉴定PARP-1敲基因小鼠的基因型。老鼠取材前进行超声心动图检测，心脏直径和功能用加拿大小动物成像仪检测。检测左心室射血分数，缩短分数，E/A峰（二尖瓣血流速度），左心室舒张末期内径。所有的I 测量必须在统一观测条件下的5个心动周期。尾静脉测量小鼠心率，收缩压和舒张压。之后收集老鼠心肌标本，用WesternBoltandRT-PCR检测基因和蛋白表达情况，HE染色和免疫组化观察心脏形态学变化。培养细胞并造高血糖心肌细胞模型，PARP-1干预之后用WesternBlotandRealtime-PCR检测心肌细胞相关炎症因子和凋亡因子变化，阐明PARP-1在糖尿病心肌病中的潜在作用机制。结果（1）高糖通过诱导DNA损伤增加了PARP-1的活性和表达。（2）PARP-1抑制剂在体外实验中减轻了高糖引起的炎症因子上调。（3）PARP-1抑制剂减轻了高糖诱导的细胞凋亡。（4）PARP-1抑制剂在体外实验中增加了IGF-1R/Akt的磷酸化水平。（5）PARP-1缺失恢复了糖尿病小鼠的心功能并且减轻了高糖血症引起的心肌重塑。（6）高糖血症增加了硝基酪氨酸的水平并且增加了PARP-1的活性和表达。结论1、在体外，高糖刺激增加了氧化应激并且增加了高糖诱导的DNA损伤引起的PARP-1的活性和表达。PARP-1干扰显著地减少了高糖引起的炎症因子表达，包括TNF-α,IL-1β，IL-6，ICAM-1和iNOS。同时PARP-1干扰通过下调乳沟半胱天冬酶和激活IGF-1R/Akt信号通路减轻了心肌细胞凋亡。2、在体内，高糖血症增加了硝基酪氨酸的表达和PARP-1的活性和表达。与正常小鼠相比，PARP-1缺失显著地减少了高糖血症引起的细胞凋亡和炎症反应，并改善了心肌的组织学异常和心功能。关键词：糖尿病心肌病，PARP-1，高糖血症，炎症反应，凋亡II ABSTRACTIntroductionDiabetesisachronic,progressivemetabolicdisordercharacterizedbyinsulindeficiencyand/orresistance,resultinginelevatedplasmaglucoselevels,anditisfirmlyestablishedasamajorthreattohumanhealthinthe21stcenturyduetoitsalarmingriseinincidenceoverthepasttwodecades,whichhasattractedconsiderableattention.Diabeticcardiomyopathy(DCM)isdiagnosedwhenventriculardysfunctiondevelopsinpatientswithdiabeteswhodonotexhibitcoronaryatherosclerosisandhypertension.Itisalsoamajorthreattohumanhealth,butalsoisanurgentclinicalproblemtosolve.Accordingtotheresultsofourteampreviousresearchbefore,Highglucose(HG)caninduceapoptosisinratcardiomyocytes.Weuseglucoseinratcardiomyocytestobuildhighglucoseoncellmodel.WhetherhighglucosestimulationofcellularoxidativestressandDNAdamage,andaffecttheexpressionofPARP-1activity.WhatrolesdoPARP-1playininflammatoryresponseandcardiomyocytesapoptosis.PARP-1playasignificantroleinoxidativestressandDNAdamage.Inthisstudy,PARP-1interveneinordertoclarifypotentialmechanismofactionthePARP-1indiabeticcardiomyopathyandprovideafeasiblestrategyforthetreatmentofdiabeticcardiomyopathy.ObjectiveConstructiondiabeticmousemodelofdiabeticcardiomyopathy,studythePARP-1potentialmechanismindiabeticcardiomyopathy,atthesametimehighglucoseoncellmodelwasconstructedfortofutherclarifytheregulatorymechanismsofPARP-1inmyocardialapoptosis.MethodsToinducediabetes,20malesC57BL/6(WT)miceor20PARP-1-/-mice(10weeksold,JacksonLaboratories,ME,USA)weretreatedwithSTZ(sigma,50mg/kgincitratebuffer,pH4.5)byintraperitonealinjectionfor5consecutivedays,whilethecontrolanimals(maleC57BL/6mice)receivedthesamevolumeofcitratebuffer.MousetailveinbloodglucoselevelsweremonitoredbyanalysiswiththeIII RocheAccu-ChekActivebloodglucosemonitor.Themicewithrandombloodglucoseconcentration>16.7mmol/lwereconsidereddiabetic.Micewerehousedinapathogen-freeanimalcarefacilityandallowedfreeaccesstofoodandwater.PARP-1-/-miceweregenotypedbyPCR.CardiacdiameterandfunctionweremeasuredbyuseoftheVevo770imagingsystem(VisualSonics,Toronto,Canada).Leftventricular(LV)ejectionfraction(LVEF),fractionalshortening(FS),ratioofearlytolatemitralinflowvelocity(E/A),andleftventricularend-diastolicdimension(LVEDd)weremeasured.Allmeasurementswereperformedbythesameobserverandweretheaverageoffiveconsecutivecardiaccycles.Heartrate,systolicbloodpressure,anddiastolicbloodpressureweremeasuredwithanoninvasivetail-cuffsystem(SoftronBP-98A;Softron,Tokyo,Japan)asdescribedpreviously.Meanwhile,harvestingcardiacmuslespecimensforWesternBoltandRT-PCRexperiments,detectthegeneandproteinexpression.UsingHE-stainingandimmunohistochemicalmethodsobservedmorphologicalchangesofcardiacmusle.CellcultureandstimulatewithhighglucoseandusePARP-1tointerfereincardiomyocytesusingWesternBlotandRealtime-PCRtodetectexpressionofinflammatoryfactorsandapoptosisfactors,andtocharifythepotentialmechanismofPARP-1indiabeticcardiomyopathy.Results(1)HGincreasedPARP-1expressionandactivitybyinductionofDNAdamage.(2)PARP-1inhibitionalleviatedHG-increasedinflammatoryresponseinvitro.(3)PARP-1inhibitionsuppressedHG-inducedcellapoptosis.(4)PARP-1inhibitionincreasedIGF-1R/Aktphosphorylationinvitro.（5）PARP-1deletionrestorecardiacfunctioninDMandalleviatedhyperglycemiainducedheartremodeling.（6）HyperglycemiaincreasednitrotyrosineaswellasPARP-1expressionandactivity.Conclusions1.Invitro,highglucose(HG)stimulationincreasedoxidativestressandinducedDNAdamagetoupregulatePARP-1expressionandactivity.PARP-1siRNAsignificantlyreducedHG-inducedinflammatoryresponse,includingTNF-α,IL-1βandIL-6secretion,andICAM-1andiNOSexpression.Meanwhile,IV PARP-1inhibitionreducedHG-inducedcardiomyocytesapoptosisthroughdownregulationofcleavagedcaspaseandactivationofIGF-1R/Aktpathway.2.Invivo,hyperglycemiaincreasedtheproteinexpressionofnitrotyrosineandPARP-1aswellasPARP-1activity.PARP-1genedeletionsignificantlydecreasedtheinflammatoryresponse,accompaniedbydecreasingcardiacapoptosis,andimprovedhistologicalabnormalitiesandcardiacdysfunctionwithoutaffectinghyperglycemia.KEYWORDS:Diabeticcardiomyopathy,poly(ADP-ribose)polymerase1,hyperglycemia,inflammatoryresponse,apoptosisV 目录摘要...........................................................................................................................................IABSTRACT................................................................................................................................I缩略词表.....................................................................................................................................I引言...........................................................................................................................................2聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1在糖尿病心肌病中的作用及机制研究.....................................21前言.......................................................................................................................................22材料、仪器与试剂.................................................................................................................22.1材料与试剂.......................................................................................................................22.2仪器..................................................................................................................................22.3部分溶剂配制方法..........................................................................................................23实验方法.................................................................................................................................23.1动物模型建立...................................................................................................................23.2动物模型指标检测..........................................................................................................23.3细胞培养与干预..............................................................................................................23.4总RNA提取....................................................................................................................23.5引物设计..........................................................................................................................23.6实时定量PCR检测........................................................................................................23.7小鼠基因型的鉴定..........................................................................................................23.8彗星实验..........................................................................................................................23.9ELISA................................................................................................................................23.10WESRERNBLOT蛋白凝胶电泳.................................................................................23.11流式细胞术....................................................................................................................23.12统计学分析....................................................................................................................2VII 4实验结果.................................................................................................................................24.1动物模型的成功构建......................................................................................................24.1.1小鼠基因型的结果鉴定.............................................................................................24.1.2各组小鼠一般情况.....................................................................................................24.1.3小鼠的通用指标检测................................................................................................24.2形态学观察及部分基因检测..........................................................................................24.2.1小鼠心肌HE染色....................................................................................................24.2.2小鼠心动超声结果....................................................................................................24.2.3小鼠心肌凋亡相关指标检测....................................................................................24.2.4小鼠心肌炎症反应相关指标检测............................................................................24.3分子学实验检测..............................................................................................................24.3.1氧化应激以及DNA损伤检测.................................................................................24.3.2细胞炎症因子表达检测.............................................................................................24.3.3流式细胞术检测细胞凋亡........................................................................................24.3.4信号通路蛋白检测....................................................................................................2讨论...........................................................................................................................................2结论...........................................................................................................................................2参考文献.....................................................................................................................................2综述...........................................................................................................................................2致谢...........................................................................................................................................2在读期间参加的学术会议及研究成果.....................................................................................2VIII 缩略词表英文缩写英文全名中文译名STZStreptozotocin链脲佐菌素DMDiabetesmellitus糖尿病DCMDiabeticcardiomyopathy糖尿病心肌病PARP-1Poly(ADP-ribose)polymerase1聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1PARPoly(ADP-ribose)聚腺苷二磷酸核糖IGF-1Insulinlikegrowthfactor1胰岛素样生长因子1IGF-1RInsulinlikegrowthfactor1receptor胰岛素样生长因子1受体HGHighglucose高糖NGNormalglucose正常糖DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜FBSFetalbovineserum胎牛血清DMEMDulbeccomodifiedeaglemedium细胞培养基GAPDHGlyceraldehydephosphatedehydrogenase甘油醛磷酸脱氢酶DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸ROSReactiveoxygenspecies活性氧簇SERCASarco(endo)plasmicreticulumCa2+ATPase肌内质网钙泵ICAM-1Intercellularcelladhesionmolecule-1细胞间粘附分子1VCAM-1Vascularcelladhesionmolecule-1血管细胞粘附因子1NF-κBNuclearfactor-κB核转录因子-κBiNOSInduciblenitricoxidesynthase诱导型一氧化氮合酶PI3KPhosphatidylinositol-3-Kinase磷脂酰肌醇-3-激酶NONitricoxide一氧化氮O-2Superoxideanion超氧阴离子ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验IX 英文缩写英文全名中文译名SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠APSAmmoniumpersulfate过硫酸铵TEMEDN,N,N',N'-TetramethylethylenediamineN,N,N′,N′-四甲基二乙胺HWHeartweight心脏重量BWBodyweight体重BGBloodglucose血糖HRHeartrate心率SBPSystolicbloodpressure收缩压DBPDiastolicbloodpressure舒张压LVEFLeftventricularejectionfraction左心室射血分数FSFractionalshortening缩短分数LVEDdLeftventricularend-diastolicdimension左心室舒张末期内径PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PVDFPolyvinylidenefluoridemembrane聚偏二氟乙烯膜mRNAMessengerribonueleieaeid信使核糖核酸RT-PCRReversetranscription-polymerae反转录-聚合酶链反应H&EHematoxylinandeosin苏木素和伊红TUNELTdT-mediateddUTPNick-EndLabeling转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记DHEDihydroethidium二氢乙啶DCFH-DA2′,7′-dichlorofluoresceindiacetate二氯荧光素二乙酸盐DCFDichlorofluorescein二氯荧光黄EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸DAPI4',6-diamidino-2-phenylindole4，6-联脒-2-苯基吲哚PMSFPhenylmethanesulfonylfluoride苯甲基硫酰氟WTWildtype野生型X 引言糖尿病是一种慢性代谢性疾病，主要特征为胰岛β细胞减少，血清胰岛素降低和高血糖[1]。糖尿病心肌病的主要表现为左心室舒张和收缩功能障碍，是糖尿病发病率和死亡率的最常见的原因之一[2]。炎症因子的增加在糖尿病心肌病的发生发展过程中起着重要作用[3-4]。炎症反应会释放许多的促炎因子，如肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)，这些促炎因子能够刺激炎症介质的表达，作为一个积极有效的反馈机制，诱导心肌细胞的凋亡，最终导致心脏功能紊乱[5]。心肌细胞凋亡是高血糖诱导的炎症反应和氧化应激在心脏中的重要表现[6]。在糖尿病的动物模型中和在病人中收缩和重塑或者心功能紊乱的组织中，其心肌细胞凋亡的增加是已经被证实的[7-9]。持续性的炎症可能导致多种通路的激活进而导致细胞死亡[10-11]。TNF-α已被证明通过激活多种死亡途径引起心肌细胞凋亡和心室重构[12-13]，而心肌细胞的死亡将导致心室重构和心室的收缩[14]。高血糖诱导的氧化应激和亚硝化应激，对活性氧和氮的物种的形成有关，尤其是在糖尿病中的过氧亚硝酸根离子，在心肌细胞凋亡中扮演着重要作用[15-16]。过氧亚硝基阴离子，从一氧化氮（NO）和反应形成超氧阴离子（O2-），可诱导DNA链断裂，蛋白质修饰和改变细胞信号转导[17]。抗氧化剂的合理利用和管理能够使心肌细胞免于死亡，但高血糖诱导的心肌细胞氧化应激和凋亡的机制还没有深入阐明。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP-1），是PARP聚合酶家族表达最广泛的类型，目前已被证实该酶参与多种细胞的生理功能，比如DNA的损伤修复，基因转录调控，细胞凋亡的调控和基因组的稳定[18]。作为DNA损伤的传感器，PARP-1能够被损伤的DNA激活并催化NAD+分裂为烟酰胺和腺苷二磷酸核糖，并在靶蛋白上形成聚腺苷二磷酸核糖[17]。PARP-1的过渡消耗将会导致细胞内NAD+和ATP的衰减，导致细胞能量失衡和不可逆的细胞毒害作用，直至细胞死亡[19]。PARP-1同时能够调控大量关键炎症因子的表达，例如诱导型一氧化氮合酶（iNOS），细胞粘附因子1（ICAM-1）和血管粘附因子1（VCAM-1），这些炎症因子由核因子κB(NF-κB)调控[20]。PARP-1的过度激活是导致各种病理条件下和氧化应激损伤相关组织损伤的重要机制，包括心肌再灌注损伤，中风和休克而PARP-1的抑制剂表现出了对抗这些疾病的保护作用[21-23]。1 抑制PARP-1能够减少细胞的能量消耗来保护细胞免于死亡。另外，最新的证据表明，抑制PARP-1能够通过Akt信号通路的磷酸化来激活细胞的生存信号并放大[24]。胰岛素样生长因子受体（IGF-1R）作为一个对抗多种实体瘤的重要靶标已经渐渐浮现出来，它主要在促生存和抗凋亡途径起着重要的作用[4]。激活IGF-1能够减弱心肌细胞凋亡[14]，IGF-1R的激活进而激活PI3K/Akt通路[25]。在先前的实验中，我们已经证实了PARP-1在高糖血症诱导的细胞凋亡中起着重要作用，但通过何种信号通路发挥这种抗凋亡作用的机制尚不清楚，我们构建糖尿病心肌病动物模型以及高糖血症细胞模型，研究PARP-1的抗凋亡作用，以期找到与信号通路之间的关系，进一步阐明PARP-1的在糖尿病心肌中的调控机制。2 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1在糖尿病心肌病中的作用及机制研究1前言糖尿病心肌病（diabeticcardiomyopathy,DCM）是在高血糖的持续存在下缓慢发展导致的一种心脏病病理性病变，和高血压型心脏病，冠状动脉硬化型心脏病和心脏瓣膜病等其他与心脏病变无关的心肌病变。DCM的主要病程变化主要表现在三个阶段：第一阶段主要是生理性变化，由于高血糖的影响，此时机体会出现各种代谢功能的紊乱，如胰岛素抵抗，钙稳态失衡，内皮细胞功能障碍，并出现轻微的心功能障碍。第二、三阶段主要是病理性变化，到疾病中期，心肌细胞会出现凋亡和坏死，同时心肌细胞也会出现不同程度的纤维化；心肌细胞肥大，心血管系统发生轻微病变，心脏体积变大和室壁增加；心脏的收缩和舒张功能受损；到疾病晚期，心肌细胞大部分纤维化，心肌肥厚加重，心血管系统出现明显病变，心脏体积变大，心脏的收缩和舒张功能明显异常。虽然糖代谢异常是糖尿病心肌病发生的重要影响因素，但是引起糖尿病心肌病的具体分子机制还不太明确，所以研究糖尿病心肌病的病理发生机制，寻找潜在作用的新靶标，依然是临床治疗亟待解决的关键问题。根据之前动物模型的试验结果，PARP-1在高糖诱导的心肌细胞凋亡和炎症反应的中扮演着重要的角色，为了进一步探讨PARP-1在心肌细胞凋亡中的具体作用机制，我们构建了高血糖的心肌细胞模型，同时采用基因沉默技术，包装PARP-1干扰病毒等技术，探讨其在糖尿病心肌病中的抗凋亡作用机制，为潜在新靶标的建立打下理论基础。3 4 2材料、仪器与试剂2.1材料与试剂(1)DMEM低糖培养基，10567-014，美国Sigma公司(2)胰酶（含EDTA），25200056，美国Sigma公司(3)胎牛血清（FBS），10099-141，美国Sigma公司(4)Trizol®Reagent，15596-026，美国Invitrogen公司(5)RIPA，P0013B，北京碧云天公司(6)葡萄糖，G8270，美国Sigma公司(7)PMSF(100mM)，ST506，北京碧云天公司(8)PBS，ZLI-9062，北京中杉金桥公司(9)DHE染色液，S0063，北京碧云天公司(10)ROS检测试剂盒，S0033，北京碧云天公司(11)WB二抗（抗鼠），ZB-2305，北京中杉金桥公司(12)WB二抗（抗兔），ZB-2301，北京中杉金桥公司(13)WB一抗、二抗去除液，P0025，北京碧云天公司(14)DEPC水，R1600，上海索莱宝公司(15)SDS-PAGE上样缓冲液（5X），CW0027A，北京康为世纪公司(16)丙烯酰胺，A1010，上海索莱宝公司(17)DL2000DNAMarker，D501A，Takara公司(18)山羊血清，005-000-001，美国Jackson实验室(19)10%SDS，ST628，北京碧云天公司(20)DMSO，D5879，北京索莱宝公司(21)RIPA裂解液，P0013C，北京碧云天公司(22)PMSF蛋白酶抑制剂，ST506，北京碧云天公司(23)蛋白Marker，SM0671，美国Fermentas公司(24)反转录试剂盒，K1622，美国Fermentas公司5 (25)SYBRGreen实时定量试剂盒，170-8880，美国Bio-Rad公司(26)抗荧光猝灭封片剂，P0126，北京碧云天公司(27)DAPI染色液，C1005，北京碧云天限公司(28)TEMED，T9281，Sigma公司(29)ECL发光液，wbkls0100，美国Millipore公司(30)一抗稀释液，P1013，北京碧云天公司(31)细胞固定液，P0098，北京碧云天公司(32)兔抗GAPDH一抗SAB4300645，美国Sigma公司(33)兔抗β-actin一抗，#4970，美国CST公司(34)兔抗PARP-1一抗，AV33574，美国Sigma公司(35)兔抗iNOS一抗，ab3523，美国abcam公司(36)兔抗NF-KBp65—抗，#3034，美国CST公司(37)兔抗phospho-NF-KBp65一抗，#3033，美国CST公司(38)兔抗Akt一抗，#9272，美国CST公司(39)兔抗phospho-Akt—抗，#9611，美国CST公司(40)鼠抗ICAM-1一抗，sc-71292，美国SantaCruz公司(41)免疫荧光二抗，美国Jacksonimmunoresearch公司(42)AnnexinV-FITCApoptosisDetectionKit，556547，美国BD公司(43)TUNEL试剂盒，S7101，美国MerckMillipore公司(44)PVDF膜，Immobilon®-P，0.45μm，美国MerckMillipore公司(45)乙醇、甲醇、氯仿、甘氨酸、甘油等试剂，天津富宇化工(46)彗星实验试剂盒，美国Trevige公司(47)普通饲料，成分：76%碳水化合物、3%脂肪和18%蛋白，北京华阜康公司(48)DCFH-DA，上海索莱宝公司2.2仪器(1)光学显微镜，BX41，CX21型，日本奥林巴斯公司(2)激光共聚焦显微镜，LSM710型，德国CarlZeiss公司(3)高分辨率小动物超声仪，VisualSonicsVevo770系统，加拿大VisualSonics公司6 (4)罗氏全活血糖仪，ACCU-CHEKActive，上海罗氏诊断公司(5)罗氏血糖仪试纸，ACCU-CHEKActive试纸，上海罗氏诊断公司(6)石蜡包埋机，EG—1160型，德国Leica公司(7)石蜡切片机，RM—2145型，德国Leica公司(8)自动染色机，LeicaST5010XL，德国Leica公司(9)冷冻切片机，LeicaCM1900，德国Leica公司(10)倒置显微镜，TS100，日本Nikon公司(11)细胞二氧化碳培养箱，HERAcell240，德国Heraeus公司(12)微量振荡器，MH—1型，江苏金坛正基公司(13)恒温振荡器，THZ—82型，江苏金坛科学仪器(14)PCR扩增仪，Mastercycler型，德国Biometra公司(15)实时定量PCR仪，Lightcyclerll，瑞士Roche公司(16)多功能酶标仪，VarioskanFlash，美国Thermoscientific公司(17)液氮罐，YDS-35B-125型，中国四川乐山东亚公司(18)超净台，SW-CJ-2FD型，中国苏州净化设备有限公司(19)生物安全柜，HF1200，德国Heraeus公司(20)台式高速冷冻离心机，5417R型，德国Eppendorf公司(21)微量高速离心机，260D，美国美国DenvilleScientific公司(22)高压灭菌器，MLS-3780型，日本SANYO公司(23)恒温水浴箱，DK-S22型，上海精宏实验设备有限公司(24)恒温干燥箱，HS-5001型，上海精宏实验设备有限公司(25)超纯水系统，美国Millpore公司(26)制冰机，SIM-F123，日本SANYO公司(27)电泳仪，PowerpPac500V，美国Bio-Rad公司(28)电泳槽，Mini—PROTEINTetraCell，美国Bio-Rad公司(29)转膜槽，MiniTrans—BlotCell，美国Bio-Rad公司(30)冷柜，BC/BD-429HN，青岛海尔公司(31)冰箱，DW-40L26，青岛海尔公司(32)-80ºC超低温冰箱，MDF-U5411，日本SANYO公司7 (33)变温磁力搅拌器，98-1型，上海梅颖仪器制造有限公司(34)电子天平，AEL-200型，日本岛津公司(35)流式细胞仪，FACSCALIBUR，美国BD公司(36)自动凝胶成像仪，FluorChem，美国AlphaInnotechCorporation公司(37)微波炉，GalanzWP700S型，广东格兰仕电器厂(38)漩涡震荡仪，MS2，德国IKA公司(39)PH计，920A，美国Orion公司(40)拍摄/照相系统，D7000，日本Nikon公司2.3部分溶剂配制方法(1)1×PBS缓冲液的配制：NaCl8gKCl0.2gKH2PO40.2gNa2HPO4.12H2O2.88g称量上述试剂将其加入到800毫升的双蒸水中混匀，调节pH至7.4,，再加入双蒸水定容到1L，室温放置。(2)10×Tris-Glycine缓冲液的配制：Glycine144gTris3.0g称取上述试剂之后加入到800毫升的双蒸水中，混匀后定容至1升。(3)SDS-PAGE相关试剂1、30%A+B溶液配置：称取29.0g的丙烯酰胺（A）和1.0g的甲叉丙烯酰胺（B），加入到80ml的双蒸水搅拌混匀，待完全溶解后补加双蒸水定容至100ml，4°C避光保存；2、1MTris-HCl缓冲液(PH6.8)配置：称取12.11g的Tris-base使其充分溶解在适量的双蒸水中，然后滴加适量的浓HCl调节其PH至6.8，定容至100ml，室温保存；3、1.5MTris-HCl缓冲液(PH8.8)配置：称取18.17g的Tris-base使其充分溶解在适量的双蒸水中，然后滴加适量浓HCl调节其PH至8.8，定容至100ml，室温保存；4、10%的SDS：称取100g的SDS粉末溶解到800ml的双蒸水中，置于水浴锅中加8 热半小时，待其完全溶解后，滴加适量的浓HCl调节其PH至7.2，定容至1000ml，室温保存；5、10%过硫酸铵（APS）：称取1g的过硫酸铵粉末，将其加入到10ml的双蒸水中，充分溶解后4°C避光保存；（4）20ml10%分离胶的配制：蒸馏水（DDW）6.6ml30%A+B8.0ml1.5MTris-Hcl（pH8.8）5.0ml10%APS200μlTEMED8μl溶解之后，用微量移液器将分离胶小心加入到制胶板中，用异丙醇压平胶面。（5）6ml5%浓缩胶的配制：蒸馏水（DDW）4.2ml30%A+B1.0ml1.5MTris-Hcl（pH6.8）760μl10%APS60μl10%SDS60μlTEMED6μl溶解之后，用微量移液器将其加入到制胶板中，小心缓慢插入梳子。（6）伊红染色液配置：称取1g的伊红粉末将其加入到100ml95%乙醇中，充分溶解，过滤；（7）苏木素染色液配置：A液：称取1g的苏木素加入到10ml无水乙醇中，充分搅拌使其溶解，混勾；B液：称取20g的硫酸铝钾加入到200ml双蒸水中，充分搅拌使其溶解，混匀；将A液和B液混匀后加热至沸腾，待其止沸后称取0.5g黄色的氧化汞加入到溶液中，用玻璃棒边搅动边溶至溶液变成暗紫色后，快速把盛有溶液的容器放在冷水中，使其快速冷却然后用滤纸过滤，室温保存，使用之前添加4ml的冰乙酸；（8）盐酸酒精：0.5ml的浓盐酸加入到100ml的75%酒精中混匀，常温保存；（9）4%多聚甲醛溶液：量取100ml的浓度为40%的甲醛溶液将其加入到容器中，再加入双蒸水混匀定容至1L，室温保存；（10）柠檬酸盐缓冲液：A液：50ml双蒸水中加入1.05g柠檬酸；9 B液：50ml双蒸水中加入1.97g柠檬酸钠；使用时，将A、B液1:1比例混合，调节PH至4.5。（11）6%淀粉肉汤：牛肉膏0.3g蛋白胨1.0gNaCl760μl加入100ml的双蒸水然后煮沸溶解，再加入6g可溶性淀粉，边搅拌边加淀粉，高压消毒后分装，4°C保存。其它试剂的配置可参考《分子克隆实验指南》（第四版）中提供的方法分别配制。10 3实验方法3.1动物模型建立20只10周龄体重约25g雄性C57BL/6野生型小鼠和20只10周龄体重约25g雄性PARP-1基因敲除小鼠（美国杰克森实验室），用凝胶PCR鉴定PARP-1敲基因小鼠的基因型。实验组小鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ），剂量为50mg/kg，对照组小鼠腹腔注射等体积的柠檬酸盐缓冲液，连续注射5天。建模当天禁食8小时，注射STZ一周后从小鼠尾静取少量血液，用罗氏血糖仪测量小鼠的随机血糖变化，如果其随机血糖值大于16.7mmol/l，即可入组。普食喂养小鼠16周以后处死老鼠。获取心脏组织样本分别用于组织学检测和分子生物学检测。最终实验获取动物及分组如下：正常对照组10只，糖尿病足10只，糖尿病基因敲除鼠10只。老鼠被饲养在无病原微生物的动物房并且确保有足够的食物和水。所有的动物喂养以及试验方法都符合山东大学齐鲁医院心内科重点实验室动物伦理委员会以及中华人民共和国卫生部动物管理条例。3.2动物模型指标检测(1)超声心电图检测糖尿病小鼠建模前和取材前分别对小鼠进行超声心电图检测。异氟烷麻醉小鼠，蘸取少量脱毛膏在小鼠前胸部分的皮肤处进行备皮，将小鼠固定好然后使其仰卧在恒温加热板上。使用Vevo770超声成像仪检测每组小鼠的心脏结构变化和心功能。选取RMB712探头，蘸取少量的耦合剂，将探头放在小鼠的前胸部位，在二维影像的指引下，使用M超依次测量小鼠的左心室收缩末期内径(leftventricularend-systolicdiameter,LVESD)，左心室舒张末期内径(leftventricularend-diastolicdiameter,LVEDD)和舒张末期左心室后壁厚度(leftventricularposteriorwallinend-diastole,LVPWD),计算左心室射血分数(leftventricularejectionfraction,LVEF)(LVEF)=(LVvold-LVvods)/LVvold×l00%；在左心室短轴切面处测量左心室短轴缩短分数(FS)=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×l00%，依据LVEF和FS来评价小鼠的心功能。在心尖四腔心脏切面处，使用组织脉冲多普勒模式获取二尖瓣多普勒血流频谱，测量心脏舒张早期血流速度峰值(E)和舒张末期11 血流速度峰值(A)变化并计算E/A比值；使用组织多普勒模式获取二尖瓣前叶瓣瓣环处的组织多普勒图像，测量心脏舒张早期二尖瓣瓣环速度峰值(E)和舒张末期二尖瓣瓣环速度峰值（E’）并计算E/E’比值。连续测量5个心动周期并取其平均值，所有测量均需同一个操作者完成。(2)心率和血压的检测取材之前，使用无创小鼠尾静脉血压检测仪测量小鼠尾静脉的收缩压、舒张压和心率，每只小鼠血压的测量均需同一个操作者完成，检测3次取其平均值。(3)组织取材使用0.8%的戊巴比妥钠注射小鼠腹腔进行麻醉，在小鼠腹部中间位置开口，沿中线向上剪开胸部使心脏暴露，用1ml注射器收集血液置于采血管中，然后离心收集血清于-80ºC冰箱。在左心室心尖部位插入针头使用PBS进行灌注，同时剪开小鼠右心房，等肝脏发白后即可停止灌注，小心取出心脏称重，测量心脏大小并拍照获取心脏的大体图像。沿心脏中央部位将心脏均匀切割成两半，一半冻存在-80ºC冰箱，提取其组织蛋白用作分子生物学检测，另一半固定在4%多聚甲醛溶液中，制备冰冻切片或石蜡切片用于组织病理学检测。(4)石蜡切片的制备心脏组织浸泡在4%的多聚甲醛缓冲液中，固定3-5天后，取出心脏组织稍微冲洗一下，用组织刀片将心脏切割成3-5mm大小的组织块然后置于石蜡包埋盒中，流水冲洗8小时，然后将包含心脏组织的石蜡包埋盒放置在石蜡包埋机中进行石蜡包埋，之后将包埋好的蜡块在石蜡切片机上进行切片，厚度为5μm，切片切完后置于65ºC烤箱中烘烤2小时，常温保存。（5）HE染色HE染色前，先将石蜡切片进行脱蜡至水：1）脱蜡至水具体步骤如下：1、选取好的切片置于65ºC烤箱烘烤1-2h；2、浸泡二甲苯溶液脱蜡15min×2次；3、无水乙醇浸泡5min×2次；4、95%酒精浸泡3min；5、90%酒精浸泡3min；6、80%酒精浸泡2min；7、70%酒精浸泡2min；8、流水冲洗2min。2）将冲洗之后的切片浸泡在盛有苏木素染色液的染缸中染色，时间为5min，染色后再用流水冲洗2min；3）1%盐酸酒精分化约1-2s，流水冲洗1-2min；12 4）伊红染液染色3min，流水冲洗2min；5）70%，80%，90%，95%梯度酒精依次浸泡2min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ依次浸泡5min；6）二甲苯Ⅰ、Ⅱ依次浸泡5min；7）中性树胶封片（6）TUNEL染色1）石蜡切片65ºC烤箱烘烤1-2h；2）石蜡切片按照上述步骤完成脱蜡至水；3）室温滴加0.1%的Triton-X-100，封闭10min，PBS洗2min×2次；4）室温滴加3%H2O2；5）用滤纸条小心吸取切片上多余的液体，滴加几滴平衡液，室温孵育30s；6）用滤纸条吸走周围多余的液体，滴加TdT反应液（TdT酶和反应液按照3:7比例混匀），37ºC孵育1h；7）将切片放进染缸中，滴加37ºC的反应液终止，室温孵育10min；8）1×PBS冲洗3min×3次，小心吸取多余液体，滴加地高辛抗体，室温孵育30min，然后用1×PBS冲洗3min×3次；9）DAB显色，在光学显微镜下观察，当颜色发生变化时立刻终止，甲基绿染色10min，PBS冲洗3min×3次，正丁醇冲洗1min；10）二甲苯脱水3min×3次，中性树胶封片。3.3细胞培养与干预（1）细胞复苏预先将水浴锅加热到37ºC，从液氮罐中小心取出H9C2细胞，快速地将细胞冻存管放进预热37ºC水浴锅中，不断摇动使细胞快速解冻。用75%酒精轻微喷洒细胞冻存管表面然后放进超净台，在超净台内使用无菌吸管小心吸取细胞悬液，将细胞悬液转移到无菌的离心管中，离心弃上清，加入新DMEM培养基，重悬细胞。然后将细胞悬液转移到盛有新培养基的培养瓶中培养，然后将培养瓶放置在37ºC，5%CO2的恒温培养箱中培养。第二天观察细胞的生长状态，换液培养。（2）细胞传代用无菌吸管小心吸走培养基，PBS小心清洗细胞，加入适量胰酶（含EDTA）孵13 箱中消化1min左右，显微镜下观察，当细胞变亮即将分离的时候立即加入完全培养基终止消化，用吸管小心反复吹打培养瓶，使瓶中的细胞能够脱离瓶壁，混匀细胞分别传入3个等体积的培养瓶中继续培养，或者种到6孔板中用于分组刺激。（3）细胞干预1）实验分组：根据糖浓度的高低和刺激时间分组1．1）浓度梯度：正常对照组（5.5mmol/l）、甘露醇对照组（5.5mmol/l葡萄糖+24.5mmol/l甘露醇）和高糖刺激组（33mmol/l）1．2）时间梯度：高糖分别刺激24h，36h和48h进行PARP-1干扰慢病毒转染，分高糖组、高糖+siNC组、高糖+si-PARP-1组PARP-1干扰慢病毒是在上海吉凯基因化学有限责任公司包装的，具体的感染步骤按照病毒操作手册操作即可。具体操作步骤如下：所有操作均需要在生物安全柜中操作，以6孔板为例，事先将PARP-1慢病毒从-80ºC冰箱中取出置于冰上，等病毒缓慢解冻，待病毒解冻之后，从孵箱中取出细胞培养板，酒精消毒后放进工作台，向对照组和实验组加入预先摸索好的浓度病毒体积，轻轻震荡混匀细胞培养板，将其放回孵箱中继续培养，转染12h后更换新鲜培养基继续培养。（4）细胞内ROS的检测：实验步骤按碧云天公司的ROS检测试剂盒操作。高糖分别刺激心肌细胞24h，36h和48h后，弃去就培养基，向24孔板中加入终浓度为l0μMDCFH-DA的DMEM无血清培养基，37ºC孵育0.5h，然后用新鲜的培养基洗涤细胞三次，共聚焦显微镜下拍照，图像使用Image—ProPlus(IPP6.0)图像分析软件（美国；MediaCybernetics公司）进行分析。（5）细胞内O-2检测：实验步骤操作如下：高糖分别刺激心肌细胞24h，36h和48h后，弃去旧培养基，向24孔板中等量加入终浓度5μMDHE的DMEM无血清培养基，37ºC孵育0.5h，再加入终浓度1μM的Hoeechst33342染色液孵育5min，然后使用新鲜的培养基洗涤细胞三次，共聚焦显微镜下拍照，图像使用Image—ProPlus(IPP6.0)图像分析软件（美国；MediaCybernetics公司）进行分析。14 3.4总RNA提取1）收集处理好的细胞或者新鲜组织，将破碎好的细胞或者组织加入到一个新的1.5mlEP中，加入1mlTrizol，慢慢吹打细胞或者组织使其破碎；2）向完成裂解的溶液中加入200μlCHCl3，使用涡旋振荡器使溶液充分混匀，室温放置5min，之后4℃，12000rpm离心15min；3）拿出离心管，小心的吸走上层透明液体，将其转移至另一个新的1.5mlEP中，然后向EP管中加入400μl预冷的异丙醇，上下颠倒EP管，使液体混匀；4）4℃，12000rpm离心10min，弃上清；5）往EP管中加入1ml预冷的75%乙醇，小心吹打均匀，4℃，12000rpm离心10min，小心的吸走上清，用滤纸条吸净EP管底部残留的水，然后将EP管放在通风处大约15min，加然后适量的DEPC水溶解，即得总RNA。6）RNA纯度测定：提取的总RNA按照1:50比例进行稀释，然后使用紫外分光光度计分别测量其在260nm和280nm的吸光度，计算OD260/OD280比值。3.5引物设计大鼠部分基因的引物设计（表3.5-1）：表3.5-1大鼠部分基因引物基因碱基序列Forward：TTGAAAAAGCCCTAAAGGCTCAPARP-1Reward：CTACTCGGTCCAAGATCGCCForward：TTGGAAGCCTCATCCGICAM-1Reward：CAATGTTGCGAGACCCForward：GTTCTCAGCCCAACAATACAAGAiNOSReward：GTGGACGGGTCGATGTCACForward：TGGACATCCGCAAAGACβ-ActinReward：GAAAGGGTGTAACGCAACTA3.6实时定量PCR检测使用Bio-Rad公司的SYBRGreen进行RT-PCR检测，实验操作步骤按照说明书进行操作即可，利用Trizol提取细胞RNA，然后用Fermentas公司的反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录使其成为cDNA，计算基因表达量。15 3.7小鼠基因型的鉴定（1）剪取些许小鼠鼠尾，放置在1.5mlEP中，EP管置于水浴锅中56℃过夜；（2）用天根公司的基因组提取试剂盒（KG203）提取鼠尾DNA；（3）琼脂糖凝胶溶液配置：称取0.5琼脂糖溶解于50ml的电泳缓冲液中，置于微波炉高火加热到完全溶化，取出摇匀；（4）将冷却到大约55℃左右的琼脂糖溶液沿电泳槽一侧缓慢倾倒在水平板上。（5）待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内倒入电泳缓冲液，然后小心翼翼的拔出梳子（6）加样将DNA样品和loadingbuffer按照4：1的比例混匀后，使用微量移液器将已经混匀的混合液加到样品孔中，每孔加10μl，记录样品的加样顺序和加样量（7）电泳安装好电极导线，点样孔的一旁连接负极，另一旁连接正极，打开电源开始电泳，当溴酚蓝跑到距离凝胶前端约2cm处停止电泳。（8）染色和观察取出琼脂糖凝胶，将其放在含有溴化乙锭（EB）的染色液中进行染色，然后在紫外灯下观察，鉴定小鼠基因型。基因鉴定PCR引物序列如下：基因碱基序列1：CCAGCGCAGCTCAGAGAAGCCAPARP-12：CATGTTCGATGGGAAAGTCCC3：AGGTGAGATGACAGGAGATC基因鉴定PCR反应体系如下：成分用量DNA1μlPrimer11μlPrimer21μlPrimer31μl2×PCRMix10μlDDW6μlTotal20μl基因鉴定PCR反应条件如下：95°C3min；95°C30s；58°C60s；72°C60s，共3516 个循环。3.8彗星实验（1）收集细胞：用预冷的PBS洗涤细胞并收集在1.5mlEP管中，然后4℃，800rpm离心5min，弃上清；（2）用预冷的PBS重悬细胞，计数，使细胞数量达到105cells/ml；取50μl细胞悬液加到500μl的低熔点琼脂糖中；（3）第一层胶的制备：取50μl低熔点琼脂糖凝胶缓慢滴在载玻片上，盖好盖玻片，4℃放置10min等其凝固；（4）第二层胶的制备：取50μl含带有细胞的低熔点琼脂糖，缓慢滴加到第一层胶板上，盖好盖玻片，4℃放置10min等其凝固；（5）第三层胶的制备：在凝固的胶板上面滴加50μl的不含细胞的低熔点琼脂糖，盖好盖玻片，4℃放置10min等其凝固；（6）将胶板浸泡在预先配置的裂解液中，4℃放置40min（7）取出胶板用PBS洗2次，然后将胶板置于碱性溶液中室温孵育40min；（8）在21V、300mA条件下电泳20min；（9）电泳结束后，用PBS冲洗胶板，将胶板放在Tris-HCl(PH7.5)缓冲液中，中和10min，然后在胶板上缓慢均匀滴加50μl的SYBRGreenI染色液，避光染色10min；（10）荧光显微镜观察拍照。3.9ELISA收集经过高糖刺激的细胞和小鼠的血清分别进行ELISA实验，检测TNF-α，IL-1β和IL-6。按照试剂盒操作即可，室温操作。3.10WesternBlot蛋白凝胶电泳(一)细胞或组织蛋白的制备：每个6孔板加入100μlRIPA裂解液，用黄色枪头在6孔板底部均匀轻刮后将液体转移至1.5mlEP管中，冰上裂解30min；对于动物组织，先称取少量组织样本，使用液氮将其研碎，然后按每1mg组织中加10μl的蛋白裂解液，冰上裂解30min；4℃，12000rpm离心10min；吸取上清转移至另一新EP管中，加入四分之一体积的5×蛋白上样17 缓冲液，混匀过后99℃加热10min使蛋白变性，-20ºC保存。(二)SDS-PAGE凝胶配制及电泳1）准备玻璃板和梳子，洗净，晾干，安装配胶板；2）10%分离胶的配置，使用微量移液器小心添加混匀的分离胶到玻璃板中，等加至玻璃板高度的三分之二左右，另行加入1ml异丙醇压线；3）待分离胶凝固后，倒掉异丙醇，用清水小心冲洗掉残留的异丙醇并用吸水纸吸净多余的液体；4）配置5%的浓缩胶，添加在分离胶上面，小心缓慢插入梳子，插入的过程中尽量避免气泡的产生。（三）电泳及转膜1）待浓缩胶凝固后，将玻璃板放入到电泳槽中加入电泳液，缓慢的拔掉梳子，然后加样，一定要记住加样顺序和体积，在样品边缘加入4.5μl的蛋白Marker；2）电泳：盖好电泳盖，接上电极调整90V电压开始恒压电泳，等Marker分开后将电压调整为120V继续电泳，至溴酚蓝染料到达分离胶的底部时，断开电源，准备转膜。3）剪取和凝胶相似大小的PVDF膜，用圆珠笔在膜上写字标记；4）将事先裁好的PVDF膜放进甲醇溶液中浸泡2min，使膜活化；5）切胶，夹子黑胶面向下，从下往上依次放置海绵，滤纸，凝胶，PVDF膜，滤纸和海绵，一定要除去PVDF膜与凝胶之间的气泡，将转膜夹放入盛有转膜液的转膜槽中进行转膜；6）打开电泳仪电源，调整电流至200mA恒流转膜，根据蛋白分子量大小估算并设定转膜时间；7）牛奶封闭：转膜结束后，将膜用双蒸水稍微清洗一下，然后转移到5%的脱脂牛奶溶液中，置于摇床上室温慢摇2h；8）洗膜：封闭结束后，将膜取出，放置在1×TBST的平皿中洗膜，10min×3次；9）孵育一抗：将膜放在用一抗稀释液稀释好的一抗溶液中，4ºC孵育过夜；10）洗膜：一抗孵育结束后，将膜取出放置在平皿中洗膜，5min×3次；11）孵育二抗：将膜放置在已经稀释好的二抗溶液中，室温孵育1-2h；12）洗膜：二抗孵育结束后，将膜取出放置在平皿中洗膜，5min×3次；18 13）发光显色3.11流式细胞术采用BD公司的凋亡试剂盒检测心肌细胞凋亡状况。高糖刺激心肌细胞之后用胰酶（无EDTA）收集各组心肌细胞，用预冷的PBS清洗一遍细胞，然后用1x的BindingBuffer重悬心肌细胞，进行细胞计数，使细胞的数量达到约lxl06cells/ml；吸取100μl细胞悬液，将其转移到5ml的流式细胞收集管中，向收集管内加入5μlFITCAnnexinV和5μl碘化丙啶（PI），轻微的震荡收集管并避光孵育15min，然向每个收集管中加入400μl的1xBindingBuffer，上机检测，用流式细胞仪检测心肌细胞的凋亡情况。3.12统计学分析使用SPSS17.0统计学软件进行数据统计分析，试验数据都采用均数±标准差（Mean±SD）表示，各独立实验组至少重复3次，相关性分析采用Pearson相关系数进行分析，两两之间的数据使用独立样本的t检验统计分析，多组数据之间使用单因素方差分析（ANOVA）统计分析。P值<0.05显示具有统计学差异，P<0.01显示具有显著统计学差异。19 26 4实验结果4.1动物模型的成功构建4.1.1小鼠基因型的结果鉴定只有112bp条带的小鼠是野生型小鼠，只有350bp条带的小鼠是PARP-1基因缺陷型小鼠，含有112bp和350bp条带的小鼠是杂合子小鼠，DNAMarker是100bp；图中左边两个是PARP-1基因缺陷型，右边五个是野生型。Fig1-1Geneidentificationofmice图1-1小鼠基因型的鉴定4.1.2各组小鼠一般情况喂养期间对照组小鼠的精神状况良好，反应灵敏；糖尿病组小鼠整体状态较差，反应迟钝、精神萎靡，垫料极易发霉等表现；糖尿病的基因敲除鼠状态较糖尿病组稍佳，反应迟钝现象改善，垫料干净许多，尿液也在一定程度上减少了，精神状态有所好转。4.1.3小鼠的通用指标检测小鼠的血压和心率没有十分明显变化，糖尿病组与正常组相比，血糖明显升高，体重减轻，心脏重量变大；PARP-1基因缺陷组较糖尿病组血糖没有明显变化，但是心脏体重比明显减轻，表明其对心脏有一定的保护作用。27 表4-1-3-1小鼠血压、心率、心重及体重指标4.2形态学观察及部分基因检测4.2.1小鼠心肌HE染色正常组小鼠心脏形态规则，糖尿病组心脏体积变大，圆钝，心肌宽度较大，心肌肥大；PARP-1-/-组小鼠心脏形态趋于规则，形态趋于正常，心肌宽度较小，心肌肥大减轻，表明PARP-1对心肌有一定的保护作用。（图1-2）Fig1-2HE-stainingofmyocardiumtissuesinmice图1-2小鼠心肌组织HE染色A：Control组B:DCM组C：DCM+PARP-1-/-组28 4.2.2小鼠心动超声结果小鼠心功能变化结果如下图：与正常组的小鼠相比，糖尿病组小鼠的左心室射血分数、缩短分数和二尖瓣血流速度比值都是下降的，而左心室舒张末期内径则是增加的，表明糖尿病组的小鼠心功能明显异常；而PARP-1基因敲除鼠的左心室射血分数、缩短分数和二尖瓣血流速度比值与糖尿病组相比是增加的（*P<0.05vs对照），而左心室舒张末期内径相较于糖尿病组是降低的（*P<0.05vs对照），PARP-1基因敲除鼠的心功能得到了明显的改善，证明PARP-1对小鼠心功能有一定的保护作用。Fig1-3Echocardiographyofheartinmice图1-3小鼠心脏超声图29 4.2.3小鼠心肌凋亡相关指标检测PARP-1基因缺失能够明显减弱高糖血症引起的心肌细胞凋亡（A、B）；PARP-1基因缺失能够减弱高糖血症诱导的乳沟半胱天冬酶-3和乳沟半胱天冬酶-9蛋白表达的上调（C、D、E）；PARP-1基因缺失增加了高糖血症诱导的IGF-1R/Akt磷酸化水平的下降（F、G、H）。*P<0.05vs对照.#P<0.05vs糖尿病。Fig1-4Apoptosisofmyocardiumtissuesinmice图1-4小鼠心肌凋亡指标检测30 4.2.4小鼠心肌炎症反应相关指标检测用ELISA方法检测小鼠血清中的炎症因子变化，PARP-1基因缺失降低了高糖血症引起的TNF-α，IL-1βandIL-6的上调（A、B、C）；PARP-1基因缺失降低了高糖血症引起的ICAM-1和iNOSmRNA水平的上调；PARP-1基因缺失同样也降低了高糖血症引起的ICAM-1和iNOS蛋白水平的上调，表明PARP-1缺失可以降低高血糖症引起的炎症反应。*P<0.05vs对照.#P<0.05vs糖尿病。Fig1-5Inflammatoryresponseofmyocardiumtissuesinmice图1-5小鼠心肌炎症反应指标检测31 4.3分子学实验检测4.3.1氧化应激以及DNA损伤检测按照上述试验方法对H9C2心肌细胞施加高糖刺激和甘露醇对照，先检测高糖刺激后PARP-1蛋白的表达情况，高糖刺激上调了PARP-1的mRNA水平（A），同样上调了PARP-1的蛋白水平（B、C）；用紫外分光光度计方法检测得出高糖刺激同时增加了PARP-1的活性（D）；用ROS试剂盒检测发现高糖刺激增加了心肌细胞的氧化应激（E、F、G）彗星实验检测DNA损伤情况发现高糖增加了心肌细胞的DNA损伤（H、I）。这些结果表明，高糖刺激上调了PARP-1的表达和活性，也引起了DNA的损伤，也增加了细胞的氧化应激水平。.*P<0.05vs对照.#P<0.05vs24h。Fig1-6ROSandDNAdamageincardiomyocytes图1-6心肌细胞ROS和DNA损伤检测32 4.3.2细胞炎症因子表达检测按照上述方法刺激心肌细胞，使用ELISA方法检测细胞上清中的TNF-α,，IL-1βandIL-6的含量，发现PARP-1干扰之后减少了细胞内炎症因子分表达（A、B、C）；PARP-1干扰同样减少了ICAM-1和iNOS的mRNA水平（D、E）和蛋白水平的表达（F、G、H）。*P<0.05vs对照.#P<0.05vs高糖。Fig1-7Inflammatoryresponseincardiomyocytes图1-7心肌细胞炎症因子表达检测33 4.3.3流式细胞术检测细胞凋亡PARP-1基因缺失可以明显减弱高糖诱导的心肌细胞凋亡（A、B）；PARP-1基因缺失可以减弱高糖血症诱导的乳沟半胱天冬酶-3和乳沟半胱天冬酶-9蛋白表达的上调（C、D、E）。*P<0.05vs对照.#P<0.05vs高糖。Fig1-7Apoptosisincardiomyocytes图1-7心肌细凋亡表达检测34 4.3.4信号通路蛋白检测高糖刺激心肌细胞后提取蛋白做WB检测，结果发现PARP-1干扰能上调高糖诱导的IGF-1R下调（A、B）；PARP-1干扰能够上调高糖诱导的Akt下调（C、D）。*P<0.05vs对照.#P<0.05vs高糖。35 36 讨论糖尿病心肌病主要特点表现为心脏结构机械，生化和结构特性的复杂的变化，这可能是导致心脏功能紊乱的主要影响因素。然而糖尿病心肌病的确切分子机制尚未得到深入的研究。在我们的实验中，在体外实验中，我们发现，高糖（HG）增加氧化应激诱导的DNA损伤，伴随着PARP-1的表达和活性增加。抑制PARP-1能够减少高糖诱导的炎症反应，包括TNF-α，IL-1和IL-6的分泌和ICAM-1、iNOS的表达。此外，抑制PARP-1能够通过下调Caspase-3和Caspase-9以及IGF-1R/AKT信号通路的激活来减少高糖诱导心肌细胞凋亡。在体内实验中，PARP-1缺失能够恢复心脏功能和改善心肌重塑。PARP-1缺失也可以减弱高血糖诱导的炎症反应和心肌细胞凋亡。这些结果表明，PARP-1可能是一个治疗糖尿病心肌病的潜在药物靶标。最新的研究表明，高糖血症引起的氧化应激在糖尿病心肌病的初始阶段有着重要作用。与现有的理论相符合，硝基酪氨酸显著表达已经在糖尿病患者心肌活检标本和链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中被发现[14,26]。硝基酪氨酸作为过氧亚硝酸盐形成的标志，是DNA单链断裂的始动因素并可激活PARP-1。在我们的实验中，我们发现高糖或者高糖血症能够增加心肌的氧化应激水平，像二氢乙啶，二氯荧光黄和硝基酪氨酸能够通过激活PARP-1诱导DNA损伤。PARP-1的过渡激活导致疾病的发生发展主要通过两种机制：一是使细胞过渡消耗能量造成细胞能量代谢危机和功能紊乱引起细胞死亡，二是催化激活细胞的促炎症信号通路。大量的研究数据表明药物抑制PARP-1或者PARP-1基因的缺失是一个潜在的疗法用来治疗心血管疾病，炎症和神经退行性疾病[27]。在之前的研究中，我们发现高糖可以增加PARP-1的表达和活性，并且引起炎症反应，但是PARP-1干扰之后能够显著减少炎症因子的分泌和表达，包括TNF-α,IL-1β和IL-6的分泌和ICAM-1和iNOS的表达。其中的确切分子机制需要进一步的研究。同时，在动物模型中，PARP-1基因的缺失能够恢复糖尿病小鼠的心功能和改善心室重构。我们经常用心肌细胞死亡，细胞肥大，间质和血管周围纤维化来解释糖尿病心脏病变以及进展。由于心肌细胞在成人心脏中很少增殖，心肌细胞的缺失将会导致心功能障碍。在37 我们的实验中，我们用高糖或者高糖血症诱导的心肌细胞凋亡，而抑制PARP-1或缺失可明显减少凋亡细胞数，伴随着caspase-3和caspase-9的下调，说明PARP-1抑制之后可以保护心肌细胞损伤，减少心肌细胞凋亡，但其中的具体的分子机制还不是十分清楚。然后，我们调查其中的潜在作用机制。近年来的文献报道胰岛素样生长因子1的过表达已被证实能够减少心梗引起的心肌细胞凋亡，同时还能减少在非闭塞性冠状动脉狭窄的转基因小鼠心梗之后的心肌细胞坏死[28-29]。胰岛素样生长因子受体1，作为跨膜酪氨酸激酶的成员之一，能够和胰岛素样生长因子1特异性结合并促使其行使生理功能[30]。当细胞内的酪氨酸残基配体和胰岛素样生长因子受体1的α亚基相结合，就会激活β亚基使其磷酸化[31]。胰岛素样生长因子1受体能够通过级联发达反应激活Akt信号通路，诱发一系列的细胞反应，包括细胞增殖，以保护细胞免于死亡[32]。我们就推测胰岛素样生长因子1可能在心肌细胞凋亡中扮演着某种作用，我们进而通过试验方法验证该信号通路在糖尿病心肌病心肌细胞凋亡中的作用机制，并且实验结论佐证了我们的猜想。上述实验结果帮助我们深入理解了PARP-1在糖尿病心肌病中的作用机制，包含高糖引起的心肌细胞炎症反应和心肌细胞凋亡，结果表明PARP-1是一个治疗糖尿病心肌病和心肌损伤的一个潜在的药物作用靶点。38 结论1、高糖能够通过诱导氧化应激来激活PARP-1的活性；2、PARP-1抑制剂能够减弱高糖诱导的心肌细胞凋亡；3、PARP-1抑制剂能够减弱高糖诱导的心肌细胞炎症反应；4、PARP-1抑制剂能够激活IGF-IR/Akt信号通路,从而减弱高糖诱导的大鼠心肌细胞凋亡。39 40 参考文献[1]PieperAA,BratDJ,KrugDK,etal.SnyderSH.Poly(adp-ribose)polymerase-deficientmiceareprotectedfromstreptozotocin-induceddiabetes.ProcNatlAcadSciUSA.1999;96:3059-3064[2]TiY,XieGL,WangZH,etal.Trb3genesilencingalleviatesdiabeticcardiomyopathyinatype2diabeticratmodel.Diabetes.2011;60:2963-2974.[3]KandaT,HayashiK,WakinoS,etal.Roleofrho-kinaseandp27inangiotensinii-inducedvascularinjury.Hypertension.2005;45:724-729.[4]WanX,YeungC,HeskeC,etal.Igf-1rinhibitionactivatesayes/sfkbypassresistancepathway:Rationalbasisforco-targetingigf-1randyes/sfkkinaseinrhabdomyosarcoma.Neoplasia.2015;17:358-366.[5]WestermannD,VanLinthoutS,DhayatS,etal.Cardioprotectiveandanti-inflammatoryeffectsofinterleukinconvertingenzymeinhibitioninexperimentaldiabeticcardiomyopathy.Diabetes.2007;56:1834-1841.[6]DasJ,GhoshJ,MannaP,etal.Taurineprotectsrattestesagainstnaaso(2)-inducedoxidativestressandapoptosisviamitochondrialdependentandindependentpathways.ToxicolLett.2009;187:201-210.[7]CaiL,LiW,WangG,etal.Hyperglycemia-inducedapoptosisinmousemyocardium:Mitochondrialcytochromec-mediatedcaspase-3activationpathway.Diabetes.2002;51:1938-1948.[8]WangY,FengW,XueW,etal.Inactivationofgsk-3betabymetallothioneinpreventsdiabetes-relatedchangesincardiacenergymetabolism,inflammation,nitrosativedamage,andremodeling.Diabetes.2009;58:1391-1402.[9]CaiL,WangY,ZhouG,etal.Attenuationbymetallothioneinofearlycardiaccelldeathviasuppressionofmitochondrialoxidativestressresultsinapreventionofdiabeticcardiomyopathy.JAmCollCardiol.2006;48:1688-1697.[10]MezzaromaE,ToldoS,FarkasD,etal.Theinflammasomepromotesadversecardiacremodelingfollowingacutemyocardialinfarctioninthemouse.ProcNatlAcadSciUSA.2011;108:19725-19730.[11]LiuCJ,ChengYC,LeeKW,etal.Lipopolysaccharideinducescellularhypertrophythroughcalcineurin/nfat-3signalingpathwayinh9c2myocardiaccells.MolCellBiochem.2008;313:167-178[12]SunM,ChenM,DawoodF,etal.Tumornecrosisfactor-alphamediatescardiacremodelingandventriculardysfunctionafterpressureoverloadstate.Circulation.2007;115:1398-1407.[13]HaudekSB,TaffetGE,SchneiderMD,etal.Tnfprovokescardiomyocyteapoptosisandcardiacremodelingthroughactivationofmultiplecelldeathpathways.JClinInvest.2007;117:2692-2701.[14]KajsturaJ,FiordalisoF,AndreoliAM,etal.Igf-1overexpressioninhibitsthedevelopmentofdiabeticcardiomyopathyandangiotensinii-mediatedoxidativestress.Diabetes.2001;50:1414-1424.41 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综述糖尿病心肌病的研究进展背景糖尿病心肌病（diabeticcardiomyopathy,DCM）是在糖尿病状态慢慢导致的一种心脏病变，与高血压性心脏病，冠状动脉硬化性心脏病和心脏瓣膜病等其他心脏病变无关的心肌疾病。已经由大量的临床和基础研究来探讨糖尿病心肌病的发病机制，目前已经明确的方向主要是心肌代谢的异常、心肌细胞内稳态的失衡，某些信号通路的改变和基因改变等机制的共同作用影响糖尿病心肌病的发生发展。虽然糖代谢异常是糖尿病心肌病的主要始动因素，但是糖尿病心肌病是由上述多种因素共同作用诱导发生的，其发病机制十分复杂，并且引起糖尿病心肌病的分子机制还不十分明确，本文就糖尿病心肌病的研究进展展开综述。1.心肌细胞代谢功能紊乱1.1糖代谢紊乱高血糖是糖尿病心肌病发生发展的主要始动因素。体内长期的高血糖将会引起4条糖代谢途径的异常：1）晚期糖基化末端产物（advancedglycationendproducts,AGEs）的增加：长期的高血糖能够促进体内的蛋白质发生糖基化形成AGEs，此过程是不可逆的，即使后期通过降低体内的高血糖水平，AGEs在细胞中依然存在，并且对细胞造成病理改变。AGEs主要通过激活信号蛋白和某些炎症因子，包括NF-κB，TNF-α，VCAM-1等，参与体内细胞的炎症反应、氧化应激和细胞凋亡[1-4]。2)蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKC）激活：高血糖能够增强心肌细胞和内皮细胞内二酰甘油的合成，从而激活PKC[5]，PKC是一种钙磷脂依赖性蛋白磷酸化酶，其活性的增强能够使肌钙蛋白磷酸化，使心肌细胞生物学功能发生改变，进而影响心肌的结构和功能。44 3)多元醇通路的激活：多元醇通路作为葡萄糖的代谢旁路，其激活可以导致ROS的产生，引起氧化应激，从而促进细胞凋亡。4）己糖胺通路的激活：己糖胺通路的激活能够促进核蛋白糖基化从而影响心肌细胞肌质网钙泵的功能，减少肌质网钙的吸收，进而影响心肌功能[6]。1.2脂代谢紊乱糖尿病心肌病的脂代谢的紊乱主要体现在游离脂肪酸（FFA）的增加，一方面部分FFA可以积聚在心肌细胞内，增加心肌的耗氧量引起能量失衡进而引起细胞凋亡；另一方面部分FFA升高能够激活PKC，引起胰岛素抵抗影响糖尿病的进展[7]。另外，脂代谢紊乱引起的脂肪酸的代谢异常能够导致线粒体功能障碍和心肌细胞凋亡，与其他因素共同作用影响糖尿病心肌病的发展。1.3能量代谢紊乱线粒体是细胞能量的来源，最近的研究结果表明线粒体的功能障碍在糖尿病心肌病的发生发展中起着重要的作用。线粒体是给细胞提供能量的场所，主要是通过氧化磷酸化为细胞提供能量，为细胞的活动提供了大量的能量。在2型糖尿病小鼠模型中，线粒体氧化磷酸化发生障碍，产生ATP减少，导致心肌收缩功能障碍[8]。,而心肌细胞又是一个高耗能的细胞，当心肌细胞的线粒体功能发生障碍引起心肌细胞的能量代谢紊乱时，就会造成心肌细胞损伤甚至凋亡。2.稳态失衡2.1氧化应激氧化应激是指活性氧（ROS）或者活性氮生成较多和清楚不足引起的一种病理状态。生理条件下，ROS正常产生和代谢以确保ROS保持在正常水平以免引起细胞或者组织功能障碍[9]，但是在病理条件下，机体清除ROS能力不足导致ROS在体内大量积累，导致细胞内细胞器的损伤、细胞生理的改变和代谢的异常造成细胞的凋亡进而引发心功能障碍。在糖尿病患者和动物模型的心肌中具有氧化应激的存在。有文献表明，在糖尿病心肌患者的血清中，氧化应激8-羟基脱氧鸟苷的水平明显高于对照组，随着患者心肌功能的加重，8-羟基脱氧鸟苷的水平将会进一步的升高[10-11]。多种因素都可导致氧化应激的产生，高血糖和高血脂是最常见的因素，有实验和临床研究表明，高血糖是一个重要刺激因素在其诱导产生的氧化应激水平下，ROS的积累导致细胞的直接凋亡[12-14]。当45 外因引起细胞或者组织ROS增加时，ROS将会损伤心肌细胞诱导心肌细胞凋亡进而影响心功能。2.2内质网应激蛋白质的折叠和修饰主要在内质网上进行。蛋白的折叠和修饰功能可能因为外界因子施加于内质网而中断，从导致未蛋白质的折叠不完全，这些折叠不完全的蛋白将会影响细胞的功能甚至凋亡。在糖尿病的动物模型中发现，内质网应激可以促进心肌细胞凋亡。Ozcan等[15]研究发现，在2型糖尿病和胰岛素抵抗的发生发展中内质网应激扮演了重要角色。C/EBP同源蛋白（CHOP）是内质网应激中与凋亡通路有紧密联系的信号分子，在糖尿病心肌病中有着至为重要的作用。Wu等[16]研究发现，在STZ诱导的大鼠糖尿病心肌病模型中，其心肌组织中的CHOP的表达是上调的，并且心肌细胞出现纤维化和心室重构，这表明内质网应激参与了糖尿病心肌病的发生。2.3Ca2+稳态Ca2+是心肌细胞内的一种极为重要的与心脏收缩功能相关的调节因子[17]。心肌细胞内的钙代谢的调节是保证正常心功能的保障，Ca2+稳态失衡是心功能改变的直接因素。机体在病理条件下产生的多种毒素分子，比如氧化应激等可以导致Ca2+稳态失衡。在2型糖尿病小鼠的心肌中发现Ca2+失衡，其衰变率下降，从肌浆网漏出，进而造成肌浆网Ca2+负载[18]，这表明糖尿病心肌病可能与Ca2+稳态失衡有关。2.4自噬和凋亡自噬是机体的一种生理过程，自噬水平的高低在机体的生理过程中十分重要，低水平的自噬在细胞功能的维持和去除受损的细胞器方面扮演着重要的作用，自噬水平的激活在不同阶段作用不一致。自噬在细胞死亡死亡中的作用机制越来越被人民所认识，它调控着蛋白质的周转并且保护细胞免于饥饿和其它外界压力[19-21]。但是，自噬的紊乱可能导致细胞过度死亡，在不同的疾病中的机制十分复杂，比如癌症，神经退行性疾病，还有更广泛的糖尿病[21-23]。比如，在胰岛素抵抗和糖尿病患者的胰岛细胞里自噬空泡的密度（自噬异常的指示）是增加的[24-25]。目前来看自噬在心肌中的作用是有益的还是有害的还存在很大争议，应当用矛盾的观点来看待自噬在心肌功能紊乱和心肌细胞死亡中的作用[26]。在多种心脏病变和糖尿病中细胞程序性死亡是有缺陷的。凋亡是最常见的细胞程序性死亡形式；凋亡的紧密调控在正常生理条件下维持组织稳态是十分必要的[27-28]。胰岛46 β细胞凋亡在一型和二型糖尿病中是十分常见的[29]。心肌细胞凋亡和高血糖的水平高低是息息相关的，并且在高血糖引起的代偿性肥厚性心脏病的病变组织中心肌细胞凋亡是增加的。持续的高血糖将会导致心肌功能紊乱，线粒体功能紊乱和内质网应激等都将诱导心肌细胞的凋亡[18]。心肌细胞不具备增殖的能力，心脏功能由代偿向失代偿转变的过程中心肌细胞凋亡起着重要作用[30]。越来越多的临床数据和实验数据表明心肌细胞凋亡在糖尿病心肌病的发生和发展中扮演着十分重要的作用，高糖血症诱导的心肌细胞凋亡在其他病变组织中也是十分常见的，比如间质纤维化，肌纤维紊乱和高糖血症引发的半胱天冬酶-3的激活。最新的研究发现聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1在心肌细胞的凋亡中同样扮演着一定的作用。3.基因调控变化microRNAs的表达异常越来越多的数据显示，一种称作microRNAs（miRNA）的小片段非编码基因在许多疾病中有重要的意义，可能导致糖尿病心肌病的发生。最近的研究表明在糖尿病心肌病小鼠模型中和糖尿病心衰患者的细胞和组织中确定有miRNAs的表达。miRNAs是一类大约22个核苷酸单链非编码RNA并且在动物和植物中广泛表达，在哺乳动物中保守存在。miRNAs在许多疾病的发生发展中起作用，他们主要通过mRNA降解或者抑制蛋白合成来调控基因活性[31-32]。大量的研究完成了miRNAs在STZ诱导的一型糖尿病小鼠中的表达谱分析用来鉴定miRNAs的表达和他们的靶基因，其中一项研究表明在糖尿病模型中的组织中大量的miRNAs发生改变，在这些发生改变的miRNAs中，一种肌肉特异性的miRNAs，miR-133a是显著下调的。miR-133a的潜在作用机制可能是通过调控血清及糖皮质激素调控激酶1（SGK1）和胰岛素样生长因子受体（IGF-1R）作用的[33-35]。miRNAs在疾病中的作用机制还处于研究初期，其具体作用机制还不是明朗，还需要更深入的研究。4.其它机制4.1微血管病变糖尿病心肌病中心肌功能衰弱能够引起微血管病变，进而导致冠状动脉血管内皮损伤，而这又可加重糖尿病心肌病的发展进程。持续的高糖血症和内皮细胞功能紊乱有着十分紧密的联系[36-37]。长时间的微血管将会损害微血管的血流和随之而来的组织缺血的47 风险也是增加的[38-39]。微血管病变最终将影响血管的结果和功能，导致细胞损伤或者凋亡，最终导致糖尿病心肌病的发生。4.2肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RASS）异常RASS在心功能中的作用十分重要，其激活可以促进心室的重构，醛固酮在心肌细胞纤维化和心肌肥厚方面的作用也十分明显。血管紧张素能够通过其受体作用于心肌细胞和成纤维细胞，引起心肌纤维化和心肌肥厚[40]，因此通过血管紧张素的抑制剂能够减少心肌纤维化和肥厚，延缓心室的重构，改善心功能。4.3胰岛素抵抗高血糖对细胞或者动物的刺激能够引起胰岛素抵抗，使得胰岛细胞对高血糖不敏感，进而引发一系列的反应。在胰岛素抵抗时期能够观察到心肌功能紊乱，包括左心室肥大，纤维化和心肌细胞紊乱等变化在动物模型的组织中[41-43]。尽管把许多精力致力于阐明外围胰岛素抵抗的成因，但是心肌胰岛素抵抗的原因还是不清楚的。在糖尿病心脏中，葡萄糖转运蛋白4（GLUT-4）活性的减弱导致葡萄糖的利用率降低并且损伤胰岛素信号，这增加了能量需求，增加需氧量并且降低心肌效率，这些都是由血脂的异常和脂毒性引起的[44-45]。另一个引起心肌胰岛素抵抗的潜在因素包括线粒体功能障碍，炎症，细胞因子上调，内质网应激和激酶信号的激活[46]。因为代谢紊乱和胰岛素抵抗发生在心功能紊乱和心室重构之前，而这可能是引起心肌损伤的因素。5.小结心血管疾病的发病率依然是糖尿病人群死亡的重要因素。除了罹患大血管疾病如冠状动脉疾病风险的增加，越来越多的证据表明，糖尿病患者也容易受到特异性心肌病的侵扰，比如心肌舒张功能障碍，心肌肥厚和心肌纤维化。尽管许多药物有针对性的改善血糖控制、恢复心血管功能，但是目前在糖尿病换这种，心血管疾病的发病率还是在不断上升。进一步了解糖尿病心肌病的发病机制，了解病理状态下细胞和分子的作用机制，包括增加氧化应激、凋亡激活和蛋白通路的研究有助于我们更好的理解糖尿病心肌病，进而为糖尿病心肌病提供一个更广泛的治疗策略。氧化应激是一个主要引发糖尿病的影响因素，并且在疾病早期的作用不容忽视，减少ROS的产生，或增加其降解，补充抗氧化剂可预防糖尿病诱导的心肌功能障碍和心室重塑。ROS可能是预防糖尿病的一个重要突破口，其在糖尿病中的具体作用机制需要更能深入的探讨。48 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52 致谢时间过得真快，转眼之间三年的研究生学习生涯已经接近尾声。在研究生阶段我学到了很多东西，也和同学们建立了深厚的友谊，可谓收获颇丰，在这个收获的季节，籍此论文完成之际，我特向指导过和帮助过我的老师、同学、朋友及关心我的家人表示真诚的感谢。首先要感谢我的导师姬新颖教授和李涛老师长时间以来的全心培养和教诲。也十分感谢姬教授给我提供了一个去山东大学齐鲁医院学习的机会，在山东大学极大的提高了我的视野和实验技能，学到了许多受用终身的知识，也让我交到了许多好朋友。在这里，我体会到了同学友情和亲如一家的师生之情，深感自己在各方面都得到了很大的提升。其次感谢程相树老师，在课题的设计以及完成的过程中，老师的指点总是那么及时与贴切，特别是刚开始的具体的实验细节的操作，让我由不懂实验到实验的独立操作学到了许多，深刻的体会到了独立操作的重要性。另外，也要向马远方老师表示真诚的感谢，在马院长的努力下，河南大学医学院建成了“河南省抗体药物工程实验室”省级重点实验室，在课题条件如此优越的实验室中学习深感荣幸，感谢马老师在我学习期间给我提供的方便和帮助，使我快速的完成我的学业。感谢实验室的刘广超、齐义军、卢峰、王耀辉、刘瑞敏、柴立辉、王明丽、李淑莲、张军、刘峰涛和崔秀坤等老师在我实验前期的指导！感谢医学院的付建民老师、杨永杰老师和蒋杞英老师对我研究生生活上无微不至的关心和帮助。祝福他们身体健康！特别感谢山东大学齐鲁医院心血管功能与重构重点实验室主任张铭湘教授以及王旭平老师在具体实验细节操作方面给予的指导与帮助，同时感谢在齐鲁医院学习与生活期间对我倍加关怀照顾的梁尔顺、陈雪英、董文倩、王凌波、田洪亮等师兄师姐的帮助！感谢曹承华师兄和贺雅静师姐，他们在我的实验开始阶段给予的指导和帮助，才保证我的实验顺利开展。感谢我的同窗祝芳、郑小丽和同门李小全、赵云岗、陈希、许瑞、刘慧媛、郭康文、韩文秀、谷娟、杨菲、郑晓伟、霍雨佳、张赛男等在学习和生活中给予的帮助，带给了我温馨的回忆！53 感谢我的舍友杜炜、吕勋、廖湘南的陪伴与照顾，此后的某个时刻回想在宿舍或者在学校的点点滴滴也是一种幸福！另外，在此我还要深深的感谢我的家人多年来对我学业和生活上的关心和支持！他们给予我坚强的后盾，他们的默默支持促使我在学业的道路上越走越精彩。要时时刻刻谨记他们无私的支持与奉献！最后，十分感谢各位评审专家和答辩委员老师的辛劳付出！刘国亮2016年3月18日54 在读期间参加的学术会议及研究成果研究生期间参加的课题：国家自然科学基金面上项目（编号81270142和81470545）国家自然基金重大研究计划重点支持项目（编号91439201）国家973重大基础研究项目（编号2015CB553604）研究生期间参加的学术会议：2014年中国第三届免疫学会暨第九届全国免疫学学术大会（济南）2014.10。研究生期间发表的文章：1、Bx02等位基因的鉴定及家系遗传分析，中国实验血液学杂志，2015(06)：141-144。2、InhibitionofMEF2Apreventshyperglycemia-inducedextracellularmatrixaccumulationbyblockingAktandTGF-β1/Smadactivationincardiacfibroblasts.IntJBiochemCellBiol.2015Dec;69:52-61.第二作者。3、Poly(ADP-ribose)polymerase1inhibitionprotectscardiomyocytesfrominflammationandapoptosisindiabeticcardiomyopathy.Oncotarget.第二作者。主持课题：河南大学研究生优秀学位论文培育计划（理硕）、Y1425021、内皮细胞与动脉粥样硬化相关基因表达谱分析及功能研究。55 －二＾．，．畔啤．．．ｓ溢．Ｋ：：－．．．．ｉ－禱．零．／澤．Ｖ．＇Ｖ．＇＞＇＼＃ｉｉ？＇－掉＃＇世ｖｗ＇ｖ．＂’．．，＇．Ｉｖｖｓ，：．着＇？．．．ｉ２至－．．＾／％：＇－．瓦這＇ＪＴ．．＞＝．，參ｖ诗＼＜知＼－ｖ．．＇Ｖ７５＇＂；参＇ｖ．ｒ．、１選＇韦
