致病性大肠杆菌引发宿主细胞AE损伤分析方法的建立

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致病性大肠杆菌引发宿主细胞A/E损伤分析方法的建立王海光1,顾江1,余抒1,张卫军1,邹全明1,朱凤才2,毛旭虎1*(1第三军医大学医学检验系临床微生物学及免疫学教研室，重庆400038；2江苏省疾病预防控制中心，南京210009)摘要：目的：建立一种能够对由致病性大肠杆菌引发的宿主细胞病理损伤进行半定量分析的方法，为进一步研究其致病性提供评价手段。方法：以大肠杆菌黏附HeLa细胞作为感染模型。利用姬姆萨染色和荧光肌动蛋白染色试验，通过菌落计数及肌动蛋白聚集数量半定量分析，统计学处理，比较EPEC43095、EHECSakai、弱毒株EHEC00B015以及E.coliDH5“对Hela细胞的黏附能力，评价了它们对细胞的损伤程度。结果：EPEC对细胞的黏附及擦拭性损伤程度大于EHEC(PV0.05)。EHECSakai和EHEC00B015在黏附能力上虽然是相同的(P>0.05),但是，EHECSakai在肌动蛋白聚集形成能力方面却大于EHEC00B015(PV0.05)。结论：建立了一种能够对EPEC或EHEC所引发的宿主细胞黏附及擦拭性损伤进行半定量分析的方法，为进一步研究其致病性提供了帮助。关键词：肠致病性大肠杆菌；肠出血性大肠杆菌；黏附和擦拭性损伤中图法分类号：R-33;R378.2+1;R446.5文献标识码：AEstablishmentofananalyticalmethodofA/ElesionscausedbyenteropathogenicEscherichiacoliWANGHai-guang1,GUJiang1,YUShu1,ZHANGWei-jun1,ZOUQuan-ming1,ZHUFeng-cai2,MAOXu-hu1*(1DepartmentofClinicalMicrobiologyandImmunology,CollegeofMedicalLaboratoryScience,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038;2JiangSuCentersforDiseasesPreventionandControlNanjing210009,China)Abstract:ObjectiveEstablishasemi-quantitativemethodbywhichtoanalyzethepathologicallesionsofinfectedhostcellscausedbyenteropathogenicEscherichiacoli.MethodsHeLacellswereusedasainfectiousmodel.TheinfectedcellswerestainedbyGiemsastainingandFluorescenceactinstaining;thenthenumbersofmicrocoloniesandactinpolymerizationonthecellswerecounted;finally,wecomparedtheabilityofattachingandeffacinglesionswithstrainsEPEC43095,EHECSakai,EHEC00B015andE.coliDH5a.ResultsA/ElesionscausedbyEPEC 43095werestrongestinthesestrains.TheabilityofattachmentofEHECSakaiwassimilartoEHEC00B015(P>0.05).However,theabilityofactinpolymerizaitonofEHECSakaiwasstrongerthanEHEC00B015(P<0.05).ConclusionAsemi-quantitativemethodtoanalyzetheA/ElesionsofinfectedcellscausedbyEPECandEHECwassuccessfullyestablished,whichcouldbeusedtostudypathogenicityoftheenteropathogenicEscherichiacoli.Keywords:EnteropathogenicEscherichiacoli;EnterohemorrhagicEscherichiacoli;attachingandeffacinglesions基金项目：国家自然科学基金(30670107)，“863”课题(2006AA02Z443)，重庆市自然基金(CSTC2006BB5115)作者简介：王海光(1977-)，男，山西平遥县人，硕士研究生，主要从事病原菌与宿主间相互作用的研究(Tel)：023-68752315；(E-mail)：Wanghg_2006@126.com*通讯作者：毛旭虎，(Tel)：023-68752315;(E-mail):mxh95xy@tmmu.com.cn细菌与宿主细胞的相互作用是其致病的前提，肠致病性大肠杆菌EPEC(EnteropathogenicEscherichiacoli)、肠出血性大肠杆菌EHEC(EnterohemorrhagicEscherichiacoli)等许多致病菌能够通过其黏附因子黏附到宿主细胞后与宿主细胞相互作用，通过一系列的信号转导过程，介导宿主细胞的黏附和擦拭性损伤即“A/E”损伤(AttachingandEffacinglesion)，最终导致宿主疾病的发生。A/E损伤的程度与细菌的致病力是密切相关的，因此研究这些细菌A/E损伤及其程度有利于分析细菌的致病力。本文以EPEC与EHEC黏附HeLa细胞作为感染模型，结合姬姆萨染色和荧光肌动蛋白染色试验即"FAS"试验(FluorescenceActinStaining)建立了一种分析致病性大肠杆菌引发宿主细胞A/E损伤的半定量方法，利用该方法以期对不同菌株所致的细胞病理损伤进行分析比较，为进一步研究细菌的致病力奠定基础。1材料和方法1.1菌株、细胞株、试剂和仪器1.1.1相关的菌株和细胞株EHECO157:H7Sakai为野生株(由中国疾病预防控制中心微生物流行病学研究所提供)，EHECO157:H700B015是一株从临床分离到的弱毒株，(由江苏省疾病预防控制中心提供)，EPEC43095(由中国药品生物制品检定所提供)，E.coliDH5”和HeLa细胞(均为 本室保存)。 1.1.1主要试剂DMEM细胞培养基、胎牛血清购自Hyclone公司；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、鬼笔环肽购自Sigma公司。1.1.2主要仪器设备CO2培养箱(ThermoForma3111)，离心机(Eppendorf5810)，正置显微镜(NikonEclipse80i)，激光共聚焦显微镜(LeicaTCSSP5)。1.2方法1.2.1细菌与Hela细胞的黏附将灭菌的盖玻片放入无菌六孔板内，每孔加入1.5ml1x104的HeLa细胞，细胞悬浮于含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液内，37C、5%CO2培养箱内生长过夜。待细胞完全贴附于盖玻片后，吸出培养液，用无菌PBS洗涤3次，加入1X106CFU以DMEM培养液稀释后的菌液，然后补加含3％胎牛血清的DMEM细胞培养液至1.5ml。轻摇混匀，每分钟1000转离心5分钟，37C、5%CO2培养箱内培养5小时，其间3小时换一次液。1.2.2姬姆萨染色细菌与Hela细胞黏附作用后，取出盖玻片，放入到另一干净的容器内。用无菌PBS洗涤4次，然后用无水甲醇固定10分钟。自然干燥后，滴加配制好的姬姆萨染液，染色25分钟。最后用水将多余染液冲洗掉，将片子放于通风处干燥镜检。1.2.3FAS试验细菌与细胞黏附作用后，同样地取出片子，用无菌PBS洗涤4次。2.5％的多聚甲醛固定30分钟。吸出固定液，用PBS洗涤3次，加入0.1％的TritonX-100作用5分钟。吸出液体，用PBS洗涤3次，加入1:1000稀释的DAPI,避光作用30分钟。再用PBS洗涤3次，加入1：100稀释的鬼笔环肽，避光作用40分钟。用PBS洗涤4次，最后用50％的甘油封片，放入湿盒内4℃避光保存，用激光共聚焦显微镜观察。1.2.4细菌黏附数量的分析姬姆萨染色后，对黏附在细胞上的细菌用油镜进行计数，以黏附在细胞上的菌落集团中细菌数量大于8的则定义为一个微菌落(microcolony，简称“MC”)，试验总共计数20个视野，计算出平均每个视野下的MC数目。计数时，标本从中间向另外一侧缓慢移动，避免重复计数。同时对其相应黏附部位形1.2.5肌动蛋白聚集的分析在激光共聚焦显微镜下对黏附在细胞上的菌落数量进行计数， 成的肌动蛋白聚集数量计数，然后算出肌动蛋白聚集率。试验总共计数20个视野，最后计算出平均每个视野下肌动蛋白聚集形成的百分率。1.1.1统计学处理采用SPSS13.0软件，对组间进行单因素方差分析，以LSD法对不同组别之间的均数进行比较，PV0.05为差异有统计学意义。2结果2.1细菌的黏附EPEC和EHEC感染HeLa细胞后，细菌是成团地黏附在细胞的局部，表现为局灶性黏附。而对照DH5”则是散在地黏附在细胞表面，没有形成局灶性黏附现象。(如图1)图1细菌与HeLa细胞黏附情况图中蓝色深染区(红色箭头所示)是黏附在HeLa细胞上的菌落集团，可以看到EPEC43095(A)、EHECSakai(B)、EHEC00B015(C)在细胞的局部形成了典型的微菌落(MC),而E.coliDH5a(D)只有少量细菌黏附在细胞表面和细胞之间，无MC形成。2.2HeLa细胞肌动蛋白荧光染色利用DAPI来标记细菌，用鬼笔环肽标记肌动蛋白，它能够与细胞内的肌动蛋白结合，将它和异硫氟酸荧光素(FITC)结合后，可产生绿色荧光。绿色荧光浓染处表明细胞内的 肌动蛋白形成了聚集。结果EPEC、EHECSakai、EHEC00B015在感染HeLa细胞后，在细A/E损伤。而DH5a在菌黏附部位处，出现了绿色荧光，表明有肌动蛋白的聚集，形成了感染HeLa细胞后并无此现象发生。（如图2）DAPI肌动蛋白件加效果图图2HeLa细胞FAS试验Z^果EPEC43095（A）,EHECSakai（B）,EHEC00B015（C）,感染HeLa细胞后，在细菌黏附部位出现了肌动蛋白的聚集现象，而E.coliDH5“阴性对照没有出现肌动蛋白聚集的现象（D）。图中细菌和细胞核用蓝色荧光所标记，肌动蛋白用绿色荧光标记，每组最后一张图为前面两张的叠加效果图。2.1EHEC与EPEC黏附能力比较通过计数MC数量对细菌的黏附能力进行比较，结果见图3,从图中可以看出：EPEC与EHECSakai和EHEC00B015之间相差显著（PV0.05）,而EHECSakai和EHEC00B015之间相差不显著（P>0.05）。说明EPEC的黏附能力大于EHEC,而两株EHEC之间的黏附能力无明显差别。（如图3） EPEC43095EHECSakaiEHEC00B015E.coliDH5a图3细菌黏附能力比较图中的柱状图代表了每组数据的平均值及标准差，利用单因素方差分析对三组均数进行两两比较，结果为：EPEC和EHECSakai之间差异显著（Pv0.05）,EPEC43095和EHEC00B015之间差异显著（Pv0.05）,而EHECSakai和EHEC00B015之间差异不显著（P>0.05）。2.1EHEC与EPEC肌动蛋白聚集率比较通过统计学方法对细菌的肌动蛋白聚集率进行分析，结果见图4,从图中可以看出三组数据间相差显著（PV0.05）。这表明EPEC在肌动蛋白聚集率上高与EHEC,而EHECSakai高于EHEC00B015,这也反映了EPEC和EHEC以及两株EHEC之间在A/E损伤程度上的不同。（如图4）野加率分百集聚白蛋动肌00908070605040302010EPEC43095EHECSakaiEHEC00B015E.coliDH5图4肌动蛋白聚集率比较图中的柱状图代表了每组数据的平均值及标准差，利用单因素方差分析对三组均数进行两两比较，结果为：EPEC和EHECSakai之间差异显著（Pv0.05）,EPEC43095和EHEC00B015之间差异显著（Pv0.05）,EHECSakai和EHEC00B015之间差异显著（PV0.05）。3讨论EPEC和EHEC能够定植到宿主肠道黏膜上皮细胞，然后与宿主细胞相互作用，造成肠黏膜微绒毛刷状缘的擦拭性损伤，以及肌动蛋白骨架的重排，并最终导致肌动蛋白的聚集，在细菌的黏附部位形成底座样结构，使细菌和宿主细胞之间形成紧密黏附，这种病理变化被 称为A/E损伤[1]。A/E损伤形成后，宿主细胞的通透性和细胞之间的紧密连接结构发生改变，造成肠道黏膜屏障的破坏，细菌所产生的毒素(如志贺毒素等)通过该屏障进入宿主循环系统，然后进入到靶器官内，最终导致靶器官的病理改变[2]。因此，A/E损伤是EPEC和EHEC致病过程中的一个重要特征，它在细菌感染引起的疾病过程中发挥着关键性作用[3]。研究发现，不同基因表型的EPEC或EHEC在A/E损伤程度上是不同的[4,5]，A/E损伤程度越重，其致病力越强。可以说A/E损伤程度的大小与细菌致病力是密切相关的。因此，建立一种能够对由细菌引发的A/E损伤进行半定量分析的方法对于研究其致病力是十分必要的。黏附是细菌与宿主细胞相互作用的关键步骤[6]。细菌通过其黏附因子黏附到宿主细胞表面，然后与细胞相互作用后导致细胞的损伤。因此，细菌黏附能力的大小可以作为其致病力大小的一个重要指标。有些细菌与宿主细胞黏附作用后，却并不引起细胞的损伤，有些细菌虽然在黏附能力上是相当的，但是它们造成的宿主细胞损伤程度却存在差异。因此，在评价细菌致病力大小时，细胞的损伤程度也是一个重要指标。通过把这两个重要指标结合在一起，建立了一种能够对EPEC或EHEC在细胞的黏附及擦拭性损伤方面进行半定量分析的方法，为进一步研究其致病性提供评价手段。利用该方法发现，EHEC与EPEC之间在A/E损伤程度上存在显著差异，与文献报道是一致的[7]。EHECSakai和EHEC00B015在黏附能力上虽然是相当的，但是，它们在肌动蛋白聚集形成能力方面却存在着显著差异，EHECSakai在这方面要强于EHEC00B015。试验结果表明该方法是一种有效的分析手段。利用它能够看到不同菌株之间在致病力上的差异，而且该方法克服了定性试验研究所带来的局限性，在研究A/E损伤方面达到了半定量分析的目的。此外，还能够以它为基础，利用分子生物学、生物信息学等手段对致病性大肠杆菌的致病机制进行研究，为预防和控制其感染提供帮助。参考文献：[1]Nataro,JP,Kaper,JB.DiarrheagenicEscherichiacoli[J].ClinMicrobiolRev,1998,11(1):142-201.[2]Thorpe,CM.ShigaToxin-producingEscherichiacoliInfection[J].ClinInfectDis,2004,38(9):1298-1303.[3]Garmmendia,J,Frankel,G,Crepin,VF.EnteropathogenicandEnterohemorrhagicEscherichiacoliinfections:translocation,translocation,translocation[J].InfectImmun,2005,73(5):2573-2585.[4]Shaw,RK,Cleary,J,Murphy,MS,etal.InteractionofEnteropathogenicEscherichiacoliwithhumanintestinalmucosa:roleofeffactorproteinsinbrushborderremodelingandformationofattachingandeffacinglesions[J].InfectImmun,2005,73(2):1243-1251.[5]Dean-Nystrom,EA,Bosworth,BT,Moon,HW,etal.EscherichiacoliO157:H7requiresintiminforenteropathogenicityincalves[J].InfectImmun,1998,66(9):4560-4563.[6]Finlay,BB,Cossart,P.Exploitationofmammalianhostcellfunctionsbybacterialpathogens[J].Science,1997,276(5313):718-725. 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