西北地区马铃薯主栽品种的抗晚疫病性评价及致病疫霉菌候选核心RXLR效应基因的鉴定

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分类号：S435.121.4+2学校代码：10712UDC：632研究生学号：2011060035密级：公开级2018届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文西北地区马铃薯主栽品种的抗晚疫病性评价及致病疫霉菌候选核心RXLR效应基因的鉴定学科专业：植物病理学研究方向：植物免疫研究生尹军良指导教师：单卫星教授完成时间：2017年11月中国陕西杨凌 Classificationcode:S435.121.4+2_Universitycode:10712UDC:632Postgraduatenumber:2011060035Confidentialitylevel:publicDissertationforDoctorDegreeNorthwestA＆FUniversityin2018EVALUATIONOFMAJORPOTATOVARIETIESINNORTHWESTERNCHINAFORLATEBLIGHTRESISTANCEANDIDENTIFICATIONOFCANDIDATECORERXLREFFECTORGENESFROMPHYTOPHTHORAINFESTANSMajor:PlantpathologyResearchfield:PlantimmunologyNameofPostgraduate:YinJunliangAdviser:Prof.ShanWeixingDateofsubmission:2017.11YanglingShaanxiChina 关于研究生学位（毕业）论文使用授权的说明本学位（毕业）论文的知识产权归属西北农林科技大学。本人同意西北农林科技大学保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；同意西北农林科技大学将本学位（毕业）论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》和《中国学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。本人保证，在毕业离开（或者工作调离）西北农林科技大学后，发表或者使用本学位（毕业）论文及其相关的工作成果时，将以西北农林科技大学为第一署名单位，否则，愿意按《中华人民共和国著作权法》等有关规定接受处理并承担法律责任。任何收存和保管本论文各种版本的其他单位和个人(包括研究生本人)未经本论文作者的导师同意，不得有对本论文进行复制、修改、发行、出租、改编等侵犯著作权的行为，否则，按违背《中华人民共和国著作权法》等有关规定处理并追究法律责任。（保密的学位论文在保密期限内，不得以任何方式发表、借阅、复印、缩印或扫描复制手段保存、汇编论文）研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日 西北地区马铃薯主栽品种的抗晚疫病性评价及致病疫霉菌候选核心RXLR效应基因的鉴定摘要马铃薯是仅次于水稻、小麦和玉米的世界第四大粮食作物，在世界粮食安全中发挥重要作用。由致病疫霉菌（Phytophthorainfestans）引起的晚疫病是马铃薯上危害最为严重的病害，曾引发1840年代的“爱尔兰大饥馑”。使用抗病品种是防治该病害最经济有效和环境友好的策略，但致病疫霉菌频繁变异进而克服品种抗病性，导致晚疫病的周期性爆发和流行，因此被称为“抗病基因毁灭者”（Resistancegenedestroyer）。我国西北地区广泛种植的马铃薯饱受晚疫病危害，在我国大力倡导化学药剂减量增效的背景下，如何快速开发抗病品种和高效、持久地使用它们成为晚疫病防控工作亟待解决的关键问题。由于我们不清楚国内马铃薯主栽品种在西北地区的田间抗病表现，对这些品种在基因水平的抗病遗传背景更缺乏系统的了解，严重阻碍了马铃薯品种的合理布局和推广应用，增加了晚疫病爆发流行的风险。因此，我们对101个马铃薯主栽品种和新育品种（系）进行了田间抗病性鉴定，并以已知致病疫霉无毒基因为工具分析了20个品种中对应抗病基因的组成。此外，靶向保守RXLR效应基因的马铃薯抗病基因其抗性持久的潜力更大，因此鉴定保守RXLR效应基因将为寻找持久抗病基因奠定基础。为鉴定致病疫霉菌侵染早期高表达的保守RXLR效应基因，我们挑选出6个遗传多样性较高的菌株，制备了12小时的叶部侵染材料进行转录组测序，从测序数据中鉴定到一批序列保守的核心RXLR效应基因，并对部分候选在本氏烟和马铃薯上进行了初步的功能分析。主要得到以下结果：1．田间抗病性鉴定发现19个马铃薯品种对晚疫病表现高抗，大部分品种表现中抗到高感。以10个致病疫霉菌无毒基因为工具，分析了20个马铃薯品种的抗病基因组成，发现各品种抗病基因数目和组成不同，含有0到10个与无毒基因对应的抗病基因，平均每个品种含有5个。在强毒性菌株为流行群体的前提下，供试品种抗病基因数目和病情指数（AUDPC）间呈显著负相关（R=0.70**，p<0.05），表明聚合抗病基因越多的品种田间抗病表现越好。2．采用Illumina高通量转录组测序，从6个菌株侵染的马铃薯叶片样品中得到46G数据，其中2,337,987条（1%）序列（reads）属于致病疫霉菌。经基因拼接后从6个菌株中检测到11,911个表达的基因，平均每个菌株中检测到7,000个基因；其中包括245个表达的RXLR效应基因，平均每个菌株中检测到160个。表达特征分析发现，RXLR效应基因的整体表达水平比转录组整体水平高2-3倍，说明在侵染早期阶段有大量的RXLR效应基因高度上调表达。进一步分析发现，在128个效应基因中共检测到468个 单碱基（SNP）变异，其中同义替换183个，非同义替换266个，表明效应基因承受正向选择压力，多态性水平高。基于序列保守且侵染早期阶段高表达的原则，我们鉴定到23个候选核心效应基因。经序列比对分析，最终将它们划分为18个候选的核心RXLR效应因子（CoreRXLReffector，CRE）。选取其中9个CRE进行毒性测试，发现它们均可促进致病疫霉菌的侵染。选取4个CRE在本氏烟和马铃薯叶片瞬时表达，初步功能分析发现它们均抑制由BAX、INF1、NIP、Avh241和Avh238引发的PTI和ETI反应。表明这些效应基因在侵染早期通过抑制植物防卫反应而发挥毒性作用。关键词：马铃薯（SolanumtuberosumL.）；晚疫病；抗病基因；致病疫霉菌；转录组测序；核心RXLR效应基因 EVALUATIONOFMAJORPOTATOVARIETIESINNORTHWESTERNCHINAFORLATEBLIGHTRESISTANCEANDIDENTIFICATIONOFCANDIDATECORERXLREFFECTORGENESFROMPHYTOPHTHORAINFESTANSABSTRACTPotatoisanimportantstaplecroprankingfourthinglobalproductionaftermaize,riceandwheat.Itplaysimportantroleinglobalfoodsecurity.Lateblight,causedbyoomycetepathogenPhytophthorainfestans,isthemostdestructivediseaseofpotatoandseriouslythreatenpotato’ssustainableproduction.Itisnotoriousforcausingthe“Irishfamine”disasterin1840s.Applyingresistancepotatocultivarsisthemosteffectiveandeconomicandenvironmentalfriendlystrategytocontrollateblightdiseases.However,P.infestanscanrapidlyvariatyandescapefrombeingrecognizedbypotatoresistancegenesandcausestheoutbreaksandepidemicsoflateblightconstantly,whichmakesitselfcalled“Resistancegenedestroyer”.NorthwestareaofChinaisoneofthemainpotatoproductionregions,butthepotatoproductionhasbeenconstantlythreatenedbylateblightdisease.Currently,decreasetheusingofchemicalagentsandincreasetheircontrollingeffectarebecomingourpursuinggoalforgreenagriculture.Undersuchkindofbackground,howtoeffectivelyanddurablycontrollateblightdiseaseandbreeddurableresistantpotatocultivarsareemergingtobeouressentialpurpose.BecauselittleinformationisavailableabouttheresistanceperformanceofmajorpotatovarietiesinnorthwestareaofChina,aswellasmajorvarieties’resistancegeneticbackground,whichmakeithardtodeployresistancevarietiesproperlyandresultinthevulnerableofpotatoproduction.Thus,weevaluatedthefieldresistanceperformanceof101varieties.Andthroughusing10knownavirulenceRXLReffectorgenesastools,wealsodissectedtheresistancegene(s)obtainedby20dominantvarieties.Meanwhile,thesepotatoresistantgenestargetingtoconservedcoreRXLReffectorgenesarepotentiallymoredurable.InordertoidentifythecoreRXLReffectorgenesexpressinginearlyinfectionstage,weselectedsixP.infestansstrainswithdiversegeneticbackgroundtopreparethe12hpi(hourspostinoculation)infectedpotatoleafmaterialsandthenperformtheRNA-seqsequencing.AgroupofcandidatecoreRXLReffector(CRE)geneswereidentifiedfromthesequencingdata.AndthenpartofcandidateCREgeneswereselectedtoexaminetheirpotentialvirulencefunctionusingAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransientexpressiononNicotiana benthamianaandSolanumtuberosum.Theresultsaresummarizedasfollows:1.Fieldresistanceevaluationshowedthat19werehighresistantvarieties,whilemostvarietiesperformedmoderateresistanttohighsusceptibletoP.infestans.Byusing10knownavirulencegenesastools,wedissectedtheresistancegene(s)obtainedby20dominantvarieties.Theresultshowedthatthesevarietiescontain0to10resistancegenesmatchingtoclonedAvrgens,withanaverageoffivegenesineach.Whenthefieldepidemicpopulationwasdominatedbyhighvirulencestrains,thecorrelationanalysisbetweenfielddiseaseindex(AUDPC)andresistancegenenumberrevealedsignificantnegativecorrelation(R=0.70**,P<0.05),whichsuggestedthatmoreresistancegenescontributehigherresistancelevelofpotatotolateblight.2.ByIlluminahighthroughputRNA-seqsequencing,46Gdatawasproducedfrom6samples.Amongthem,2,337,987(1%)readsbelongtoP.infestans.Aftergeneassembling,11,911genesweredetectedexpressinginsixstrains,withanaverageof7,000genesineach.Amongthedetectedgenes,245wereRXLReffectorsgenesandaveragely160genesweredetectedineachstrain.ExpressionprofilingindicatedthattheexpressionlevelofRXLReffectorgeneswas2-to3-foldhigherthanthatofwholetranscriptome,suggestingthatmanyRXLReffectorgenesareinducedduringearlyinfectionstage.Atotalof468SNPswasdetectedin128RXLReffectorgenes,including183synonymousand266nonsynonymoussubstitutions,revealingthatRXLRgenesundergopositiveselectionpressureresultinginhigherpolymorphism.Basedontheparametersofsequenceconservationandinfectioninducedexpression,23candidateRXLReffectorgenesweredetermined.Afterthephylogeneticanalysis,thosegeneswerefinallydesignatedas18CREgenes.NineCREswereselectedtotesttheirvirulencecontributionandfoundallofthemcanenhancethecolonizationofP.infestans.VirulencefunctionoffourCREswereperformedonN.benthamianaandS.tuberosumusingAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransientexpressionassay.TheresultsdisplayedthatthetestedRXLRgenesarecapableofsuppressingPTI(PAMPtriggeredimmunity)andETI(Effectortriggedimmunity)defenseresponseinducedbyBAX,INF1,NIP,Avh241,andAvh238.ThosetestssuggestedthatCREscontributetovirulencebysuppressingplantdefenseresponseduringearlyinfectionstage.KEYWORDS:potato(SolanumtuberosumL.),lateblightdisease,resisitancegene,Phytophthorainfestans,transcriptomesequencing,coreRXLReffectorgene 目录第一章文献综述....................................................................................................................11.1马铃薯和晚疫病概述..................................................................................................11.2致病疫霉菌研究概述..................................................................................................21.2.1致病疫霉菌分类学研究....................................................................................21.2.2致病疫霉菌形态学研究....................................................................................41.2.3致病疫霉菌生物学研究....................................................................................61.2.4致病疫霉菌病理学研究....................................................................................81.2.5致病疫霉菌防控研究......................................................................................111.2.6致病疫霉菌群体研究......................................................................................121.2.7致病疫霉菌起源和迁徙研究..........................................................................161.3致病疫霉菌RXLR效应因子研究...........................................................................191.3.1致病疫霉菌RXLR效应因子与植物病原互作.............................................191.3.2致病疫霉菌RXLR效应因子生物学功能研究.............................................231.3.3致病疫霉菌RXLR效应因子基因组学研究.................................................281.3.4致病疫霉菌RXLR效应因子转录组学研究.................................................301.3.5致病疫霉菌RXLR效应因子进化研究.........................................................311.3.6致病疫霉菌RXLR效应因子变异与抗病性丧失研究.................................321.3.7致病疫霉菌RXLR效应因子辅助抗病育种研究.........................................331.4本研究的目的和意义................................................................................................34第二章西北地区马铃薯主栽品种抗晚疫病性评价..........................................................362.1试验材料、试剂与仪器............................................................................................372.1.1试验材料..........................................................................................................372.1.2试剂..................................................................................................................382.1.3仪器..................................................................................................................392.2试验方法....................................................................................................................392.2.1马铃薯田间抗病性试验..................................................................................392.2.2马铃薯抗病基因分析......................................................................................412.3结果与分析................................................................................................................422.3.1抗病性评估结果..............................................................................................422.3.2瞬时表达系统稳定性测试..............................................................................432.3.3抗病基因组成分析..........................................................................................45 2.3.4抗病基因数量与抗病性水平间关系..............................................................462.4讨论............................................................................................................................48第三章致病疫霉菌侵染早期高表达核心RXLR效应基因鉴定........................................513.1试验材料、试剂与仪器............................................................................................533.1.1试验材料..........................................................................................................533.1.2试剂..................................................................................................................533.1.3仪器..................................................................................................................553.2试验方法....................................................................................................................553.2.1致病疫霉菌培养和游动孢子制备..................................................................553.2.2马铃薯培养......................................................................................................553.2.3离体叶片接种..................................................................................................553.2.4染色和观察......................................................................................................563.2.5侵染材料制备和RNA提取...........................................................................563.2.6转录组测序......................................................................................................573.2.7比对和拼接......................................................................................................573.2.8RXLR效应基因拼接和预测...........................................................................583.2.9RXLR效应基因SNPs提取和多态性分析....................................................583.2.10候选RXLR效应基因筛选和初步功能分析...............................................583.2.11RXLR效应基因表达水平定量PCR验证....................................................583.2.12引物设计与合成............................................................................................593.2.13实时荧光定量PCR（Real-timePCR）.......................................................603.3结果与分析................................................................................................................603.3.1致病疫霉菌多样性菌株选择..........................................................................603.3.2致病疫霉菌早期侵染关键时间点确认..........................................................633.3.3致病疫霉菌测序数据比对和拼接..................................................................643.3.4菌株特有RXLR效应基因的确认.................................................................643.3.5RXLR效应基因表达水平确认.......................................................................663.3.6菌株RXLR效应基因表达特征分析.............................................................663.3.7部分RXLR效应基因表达检测.....................................................................683.3.8已知RXLR无毒基因序列变异分析.............................................................693.3.9无毒性RXLR效应基因的表达影响毒性.....................................................703.3.10菌株RXLR效应基因SNPs和dN/dS分析................................................703.3.11RXLR效应基因SNPs、dN/dS和表达水平关联分析................................723.3.12侵染早期高表达序列保守RXLR效应基因候选.......................................73 3.3.13候选核心RXLR效应基因促进致病疫霉菌的侵染和扩展.......................753.3.14候选RXLR效应基因功能初步分析...........................................................753.4讨论............................................................................................................................79第四章结论和创新点..........................................................................................................844.1结论............................................................................................................................844.2创新点........................................................................................................................84参考文献..................................................................................................................................86致谢......................................................................................................................................99作者简介................................................................................................................................101 第一章文献综述1.1马铃薯和晚疫病概述马铃薯（SolanumtuberosumL.），别名土豆、洋芋、山药蛋、荷兰薯等，属于茄科（Solanaceae）茄属（Solanum）一年生草本植物，是目前世界上仅次于水稻、小麦和玉米的第四大粮食作物，也是当今世界最重要的非禾本科作物之一，在世界粮食安全体系中扮演着重要角色(Haasetal.2009)。马铃薯起源于南美洲安第斯山脉一带，其人工栽培历史可追溯到公元前八千年到五千年的秘鲁南部地区(田月娥2015)。我国于17世纪从南洋引入马铃薯，虽然种植历史仅有四百多年(谷茂等1999)，但马铃薯已发展成为我国农作物的重要组成部分，全国种植面积500多万公顷，总产量8900万吨，使中国成为世界马铃薯生产的第一大国(张鹏2015)。近期，我国启动了“马铃薯主粮化”战略，马铃薯已成为继水稻、小麦和玉米外的又一主粮，在保证我国粮食安全和推动缺水地区农作物种植结构调整中发挥着越来越重要的作用(张鹏2015)。马铃薯的安全生产受到晚疫病（Lateblightdisease）的严重威胁。该病害由卵菌病原致病疫霉菌（Phytophthorainfestans(Mont.)deBary）侵染引起，是世界范围内马铃薯生产的头号毁灭性病害。世界范围内马铃薯晚疫病每年造成的经济损失高达170亿美元，且损失金额仍在持续增长中，其中仅晚疫病防治环节每年投入的成本就高达50亿美元左右(Duncan1999)。致病疫霉菌在马铃薯整个生育期内均可进行侵染并造成危害，田间发病通常导致30-60%的产量损失，严重时可导致马铃薯绝收。马铃薯晚疫病是典型的低温高湿病害，其发生与气候条件密切相关，条件适宜时可快速产生大量游动孢子，短时间内完成再侵染循环，并完全毁灭整个马铃薯田(Fryetal.2008)。历史上，最为著名的例子当属1845年马铃薯晚疫病在欧洲大流行造成的“爱尔兰大饥馑”，致使一百万人饿死，一百五十万人被迫流落他乡，向北美地区迁移(Bourke1964)，甚至因此改变了欧洲和北美洲的人口布局，并导致了植物病理学的产生以及病害流行学的出现。我国关于晚疫病流行的最早记载是1940年，发生在我国西南地区（重庆以东地区），造成的产量损失高达80%(Guoetal.2010)。其后，晚疫病不时流行蔓延，在我国的几个马铃薯种植大省，包括内蒙古、黑龙江、甘肃、四川、福建等地，相继爆发，造成了严重的经济损失。目前，国内凡是种植马铃薯的地区几乎均有晚疫病的发生。我国西北地区是国内重要的马铃薯主产区之一，但是该地区每年的降水期主要集中在7月至10月份，其较高1 的气候湿度（>80%）与相对较低的大气温度（10-25oC）出现时期基本相吻合，比较适合马铃薯晚疫病的发生。因此，西北地区是马铃薯晚疫病的常发区，其马铃薯的安全生产受到严重的威胁。近年来，晚疫病的流行趋势有增无减，引起的经济损失也持续增加。随着马铃薯各种经济产业的不断出现，马铃薯种植范围日益增大，晚疫病的发生已成为该产业发展的桎梏(李会平2014)。多年来，马铃薯晚疫病一直受到国际社会的广泛关注。早在1992年，国际马铃薯中心（InternationalPotatoCenter，CIP）根据各国权威科学家的建议将晚疫病列为CIP优先研究目标。联合国粮农组织1996年的年度报告认为，晚疫病造成的危害性、防治难度及对社会的影响已超过水稻稻瘟病和小麦锈病，为国际第一大作物病害。为加强世界各国对晚疫病的研究工作，1996年在CIP总部成立了国际马铃薯晚疫病研究协作网。1996年HubertZandstra博士呼吁大家共同行动起来参与“马铃薯晚疫病的行动计划”，并首次提出了“全球晚疫病防治倡议”（GILB，GlobalInitiativeonLateBlight）这一号召，以期通过协作更好的防治马铃薯晚疫病这一“国际第一大作物病害”(田月娥2015)。1.2致病疫霉菌研究概述1.2.1致病疫霉菌分类学研究致病疫霉菌属于真核生物域（Eukaryota），囊泡藻界（Chromalveolata），不等鞭毛门（Heterokontophyta），卵菌纲（Oomycota），霜霉目（Peronosporales），腐霉科（Pythiaceae），疫霉属（Phytophthora）（引自www.wikipedia.org）。因其形态与真菌有诸多相似之处，Montagne博士在1845年首次对其进行描述时将其命名为Botrytisinfestans，并归类为真菌。1846年，debary研究了其基本生物学特征，并确认为真菌，将其重新命名为Phytophthorainfestans，分类地位初步明确。随着研究的不断深入，研究者发现致病疫霉菌所属的卵菌与真菌在结构、代谢和进化等方面相去甚远。结构上细胞壁主要由纤维素和葡聚糖组成，真菌细胞壁则由几丁质组成；同时卵菌细胞多核、几乎无膈膜、游动孢子具茸鞭和尾鞭，这决定了卵菌与真菌在繁殖、生物学特征及致病机理等方面的诸多不同(张美祥2012)；代谢和进化方面，卵菌与真菌的亲缘关系较远，与褐藻、金藻和硅藻的亲缘关系较近(JudelsonandBlanco2005;BakonyiandÉrsek1997;Tyleretal.2006)；rRNA序列研究也表明卵菌与藻类的亲缘关系相对较近(Judelson1997)（表1-1）。所以2000年以后，《真菌词典》第八版Cavalier-Smith（1981,1988）的八界分类系统将致病疫霉菌从真菌界（Fungi）划分到假菌界（Chromista）(Baldaufetal.2000)，而2008年出版的《真菌词典》第10版分类系统中，致病疫霉菌所在的卵菌纲（Oomycota）2 被移除，并归类到了囊泡藻界（Chromalveolata）的不等鞭毛门（Heterokontophyta或Stramenopiles）（图1-1）。表1-1卵菌与真菌的主要差异。该表引自张美祥博士学位论文(2012)。Table1-1DifferencesbetweenOomycetesandFungi.TableisadaptedfromthePhDthesisofMeixiangZhang(2012).特征卵菌真菌FeatureOomyceteTruefungi邻近分类群硅藻和褐藻动物菌丝结构无隔膜、多核管状菌丝单细胞或有隔单核或多核菌丝菌丝倍性二倍体，配子为短暂的单倍体期典型的为单倍体，有性世代为二倍体基因组大小50-250Mb10-40Mb主要细胞壁多纤维素几丁质糖色素通常无色素非常普遍毒素次生代谢较少报道较普遍物交配激素非肽，脂类小肽或脂肽类主要无性孢子非干燥状态，单细胞孢子囊干燥状态，单细胞或多细胞分生孢子游动无性孢子非常普遍，双鞭毛游动孢子不常见，仅见于壶菌，单鞭毛有性孢子卵孢子，常形成于特化菌丝的末端许多类型，常大量形成，被复杂的包被物包裹孢子主要能量Mycolaminarin和脂类，也可能利用多糖原和海藻糖，还有糖醇和脂类储备磷酸盐图1-1卵菌的分类学地位。图片引自www.google.com.hk网站。Figure1-1Taxonomicstatusofoomycete.Figureisadaptedfromwww.google.com.hk.3 1.2.2致病疫霉菌形态学研究致病疫霉菌整个生活史中共有11种细胞类型（celltype）（图1-2），这些细胞类型特化并参与生命周期各阶段，例如有性和无性繁殖、游动孢子萌发和侵染、活体和死体营养阶段。这些细胞类型包括：游动孢子（zoospore）、休止孢（cyst）、萌发休止孢（germinatingcyst）、带吸器的萌发休止孢（germinatedcystwithappressorium）、带附着胞和侵染囊泡的休止孢（germinatedcystwithappressoriumandinfectionvesicle）、吸器（haustorium）、孢子囊（sporangium）、菌丝（hyphae）、雄器（antheridium）、藏卵器（oogonium）和卵孢子（oospore）(Nowickietal.2011)。图1-2致病疫霉菌侵染循环过程各细胞类型。（A）（i）游动孢子、（ii）休止孢、（iii）萌发休止孢、（iv）带吸器的萌发休止孢、（v）带附着胞和囊泡的休止孢、（vi）吸器、（vii）孢子囊；（B）侵染阶段的发育状态。图片引自Nowickietal.(2011)和JudelsonandBlanco(2005)的综述文章。Figure1-2P.infestanscelltypesduringinfectioncycle.(A)(i)zoospore,(ii)cyst,(iii)germinatingcyst,(iv)germinatedcystwithappressorium,(v)germinatedcystwithappressoriumandinfectionvesicle,(vi)haustorium,(vii)sporangium;(B)developmentstatusduringinfectioncycle.FigureisadaptedfromthereviewsbyNowickietal.(2011)andJudelsonandBlanco(2005).4 图1-3致病疫霉菌各阶段电镜照片。（a）营养体，非产孢菌丝；（b）孢子囊梗；（c）带有成熟和新生孢子囊的孢囊梗；（d）脱落未萌发的孢子囊；（e）孢子囊和游动孢子；（f）孢子囊顶部，游动孢子被释放的位置；（h）释放游动孢子后的孢子囊壳；（i）卵孢子。图中比例尺代表5µm。图片引自JudelsonandBlanco(2005)的综述文章。Figure1-3ElectronicmicroscopephotographofP.infestansdifferentdevelopmentstage.(a)Vegetative,non-sporulatinghyphae;(b)Sporangiophore;(c)Sporangiophorewithmatureandinitialsporangia;(d)Anungerminatedsporangium;(e)Sporangiaandzoospores;(f)Theapicaltipofasporangium,showingtheopeningthroughwhichzoosporesarereleased(operculum);(g)Azoosporewithitstwoflagella;(h)Sporangiaafterreleasingzoospores;(i)Oospore.Thebarineachpanelrepresents5µm.FigureisadaptedfromthereviewsbyJudelsonandBlanco(2005).致病疫霉菌菌丝无色无隔，多核，薄壁，自由分枝，营养菌丝体发达（图1-3a）；菌丝较细，直径约4.9-12.0μm；未见菌丝膨大体。孢囊梗由菌丝生出，但比菌丝细，节状，无色，直立，合轴分枝，直径约5-9μm；各节基部膨大而顶端尖细，顶端稍膨大并着生孢子囊；孢子囊成熟后孢囊梗继续生长，将成熟孢子囊挤向一侧，于顶端形成新的孢子囊；3-5根孢囊梗从气孔伸出，形成肉眼可见的白色霉层症状（图1-3b、c）。5 孢子囊透明，呈卵或长卵形，薄壁，长宽比1.5，自然条件下24-54μm×19-30μm，平均35.6μm×22.6μm，固体培养基上25-47μm×18-37μm，平均35.2μm×23.5μm；脱落的孢子囊带柄短，长1.5-3.0μm；脱落后可继续生长，顶生乳状突起，基部逐渐变细（图1-3d、e、f、h）。条件适宜时，孢子囊原生质体割裂，形成并释放8~12个游动孢子；也可直接萌发产生芽管，侵染寄主（图1-3e）。游动孢子单核，呈卵或肾形，平均直径9.99μm，沟部附生双鞭毛，一尾鞭一绒鞭，可水中游动；约2-3个小时后游动孢子休止，双鞭毛收缩形成细胞壁，呈球形，称为休止孢（图1-3g）。休止孢萌发长出芽管，或通过气孔侵入寄主，或形成附着胞，直接侵入寄主。由附着胞伸出的初生菌丝（primaryhypha）继续生长，产生侵染囊泡，并长出次生菌丝（secondaryhypha），分支并侵入细胞形成吸器；吸器多呈指状，比菌丝细，无核；吸器负责释放毒性相关因子和吸收营养物质。致病疫霉菌有性生殖产生藏卵器和雄器，两者配合形成休眠孢子，即卵孢子。卵孢子呈球状或近球状，于藏卵器内形成，无色至浅色，壁双层，厚壁或薄壁，直径24-56µm，平均30µm，常不满器。藏卵器球形，平均直径38µm，外壁光滑；雄器大小和形状不一，常侧生（着生在藏卵器的侧面）或围生（amphigynous，包裹在藏卵器的柄上）（图1-3i）。致病疫霉菌为异宗配合，分为A1和A2两种交配型。两种交配型菌株人工培育菌落形态存在差异，A1菌株常产生浓密的气生菌丝，形成白色棉絮状霉层；A2菌株气生菌丝少，常贴皿生长，呈分支辐射状。气生菌丝数量可反映菌株产孢能力，A2菌株常产孢能力差，游动孢子释放数量也会偏少。1.2.3致病疫霉菌生物学研究致病疫霉菌为半活体营养型（hemibiotroph），侵染早期活体寄生，后腐生，并在腐生阶段通过无性繁殖产生孢子（图1-4）。致病疫霉菌无性繁殖可产生大量的孢子囊和游动孢子，田间自然条件下3-4天孢子囊可成熟并开始大量释放游动孢子。孢子囊形成的温度为7-25℃，最适温度是16-22℃。当相对湿度达到85%以上时，病原菌从气孔向外伸出孢囊梗，孢子囊需要达到95%-97%的相对湿度才能大量形成。孢子囊产生游动孢子的最适温度为10-13℃。孢子囊和游动孢子需要在水滴或水膜中才能萌发，而温度超过20℃时孢子囊才会直接萌发长出芽管。孢子囊在高温低湿的条件下很快失去生活力，游动孢子寿命更短，但落入土壤的孢子囊，在夏季条件下可维持生活力2个月以上。致病疫霉菌寄主范围相对狭窄，是一种寄生专化性比较强的微生物，在活的寄主植物或薯块上生长良好，在特定的培养基上（如黑麦、菜豆粉、V8等培养基）也可生长并产生孢子囊及释放游动孢子。菌丝生长的最适温度为18-20℃，人工培育时通常将生6 化培养箱温度设定在16-18℃，在黑麦培养基上培养10-14天时进入产孢高峰。甾醇类物质对致病疫霉菌的生长有一定的促进作用，但致病疫霉菌自身无法合成，只能从寄主获得。因此，为提高产孢效率，有时会向黑麦培养基中加入β-谷甾醇。致病疫霉菌也可进行有性繁殖（图1-4）。该菌属于异宗配合卵菌，交配型A1和A2同时存在时通过异宗配合进行有性生殖。同时培养两种不同交配型的菌株，会相互诱导并产生激素，受激素刺激的两种菌丝体分别特化出藏卵器（雌配子）和雄器（雄配子）。激素的前体为叶绿醇（phytol），A2菌株将前体合成α2激素并释放，由A1菌株吸收并合成α1激素(Ojikaetal.2011)；A1交配型菌株产生的α1激素特异诱导A2菌株形成卵孢子，而A2交配型菌株产生的α2激素特异诱导A1菌株形成卵孢子；但是，A1或A2菌株产生的激素仅作用于异种交配型菌株，并不能诱导A1或A2菌株自身形成卵孢子(Harutyunyanetal.2008)；虽然如此，异宗配合的A1和A2交配型在完成相互之间的激素刺激后，既可以通过两者交配形成杂交卵孢子的，也可由A1或A2交配型自身同时形成雄器和藏卵器并配合形成卵孢子(Harutyunyanetal.2008)。有性生殖过程中产生藏卵器的菌丝穿过雄器，并在雄器的上方形成藏卵器，雄器包在藏卵器的柄上，细胞核完成减数分裂后，雄器中的单倍体核通过受精管进入藏卵器，然后藏卵器发展成厚壁的休眠孢子，即卵孢子，卵孢子成熟过程中配子于细胞核进行融合。有趣的是作为前体的叶绿醇既不促进有性生殖，也不提高卵孢子的形成数量，体外增加微量乙醇（0.1%（v/v）EtOH）到培养基中反而对卵孢子形成有促进作用(Ojikaetal.2011)。图1-4致病疫霉菌生活史。图片引自网站www.commons.wikimedia.org。Figure1-4LifecycleofP.infestans.Figureisadaptedfromwww.commons.wikimedia.org.7 田间条件适宜时，也可在寄主植物上观察到卵孢子的形成，通常形成于有2-4个侵染点的马铃薯叶片上，8-15℃的低温利于其形成，5-6天形成藏卵器，8-10天形成卵孢子(Cohenetal.1997)。在过去，A2交配型仅发现于墨西哥地区，1984年Hohi首次报道在瑞士发现A2交配型，1989年日本发现A2交配型，1996年我国也报道了A2交配型的存在，表明A2交配型已经散布世界各地(Fryetal.1993)，国内西北地区致病疫霉菌交配型研究也发现大量A2菌株的出现(田月娥2015)。A2交配型的出现使致病疫霉菌有性繁殖成为可能，基因将会发生遗传重组，对其快速变异和适应环境有利；同时卵孢子壁厚，抗逆性强，可以在土壤中越冬，甚至潜伏数年(Turkensteenetal.2000)，作为新的侵染源进行下一轮循环。一方面，卵孢子可萌发形成孢子囊并释放游动孢子侵染，另一方面，卵孢子可直接萌发产生芽管侵入寄主植物(Drenthetal.1995)。近年来的研究发现，田间出现了大量自育型菌株，仅自身即可完成有性生殖过程(田月娥2015)。对自育菌株产生的原因、遗传与变异机理以及其有性后代对马铃薯致病性变异的影响尚不清楚，亟需开展深入系统的研究工作。至少，自育菌株的出现预示着毒性相关基因通过有性生殖过程发生重组和快速变异并导致新毒性菌株的出现成为可能，而新强毒性菌株的产生，往往给马铃薯生产带来更大的困难和挑战(Fernández-Pavíaetal.2004)。1.2.4致病疫霉菌病理学研究致病疫霉菌的寄主范围相对狭窄，一般仅限于茄科（Solanaceae）物种，其中包括马铃薯、番茄和其他50个茄属植物(Turkensteenetal.2000)，以侵染马铃薯所导致的晚疫病最为著名，同时其也是番茄晚疫病的病原菌。症状致病疫霉菌可以侵染马铃薯的所有部分，包括叶片、叶柄、茎杆和薯块。田间病害发生时症状首先出现在下部叶片。叶片受到侵染后，大部分病斑出现在叶尖和叶缘处，初期侵染位点呈水渍状褪绿斑，后逐渐扩大为圆形暗绿色斑，病斑边缘界限不明显。在空气湿度大时，病斑迅速扩展，4天内可扩展到叶的大半以及全叶。病斑边缘有一环白色稀疏的霉层，雨后或清晨在叶背面尤为明显（图1-5A、B）。茎部受到侵染后，致病疫霉菌沿茎部皮层扩展，并沿扩展部位形成褐色条斑。当田间湿度较大时，发病部位产生白霉，但相比于叶部要稀疏。受害部位组织坏死、软化甚至崩解，造成病斑以上叶片和茎叶死亡（图1-5C）。块茎受到侵染后，侵染部位初为褐色或者紫褐色不规则病斑，表面稍有凹陷。切开病薯可发现，病斑下的薯肉不同程度的褐色坏死，其病健界限不明显。发病部位容易受到其它病害二次侵染而导致腐烂。土壤干燥时，薯块病部发硬，呈干腐状（图1-5D）。8 ABCD图1-5致病疫霉菌侵染症状。(A、B）叶片；（C）茎杆；（D）薯块。Figure1-5InfectionsymptomsofP.infestans.(A,B)leaf;(C)stem;(D)tuber.病害循环初侵染：自然条件下，病株茎、叶上的菌丝体及孢子囊等不能在田间越冬。在我国马铃薯主产区，致病疫霉菌主要以菌丝体形式在病薯中越冬，当病薯作为种薯使用时，就有可能成为田间初侵染来源。病薯播种后，多数病芽不能萌发或者在出土前腐烂，少数病芽可以萌发并形成病苗。此外，病原菌也可以卵孢子形式越冬，卵孢子在土壤中的存活时间最长可达4年，在条件合适时也可成为初侵染来源。在双季作薯区，前一生长季遗留在土壤中的病残体组织和发病的自生苗也可以成为本年度下一季的初侵染来源。番茄也是致病疫霉菌的寄主之一，作为中间寄主植物，番茄上生活的病原菌同样可以成为初侵染来源。播种前淘汰的病薯块茎，任意弃置室外，也可能成为初侵染源。传播：致病疫霉菌的短距离传播主要靠孢子囊完成，病薯、病残体、番茄和卵孢子等初侵染源产生的孢子囊可随气流或水流进行田间的短距离传播。少数带病种薯出苗后，病菌由病薯沿马铃薯茎皮层部分向上生长延伸，产生茎部侵染，并成为田间的中心发病株。该方式形成田间中心发病株的可能性较低，其出现概率甚至低于0.1%。进入土壤中的孢子囊在田间可存活2个月，并通过起垅、耕地等农业操作过程被带到土壤表面；雨水的冲刷过程也同样会让病薯暴露于地表，上面产生的孢子囊会被雨水带到邻近的健康马铃薯上，也可通过雨水飞溅的方式被带到马铃薯的上部叶片，成为田间的中心发病株，通过此种方式出现中心发病的比例相对高一些。而致病疫霉菌的远距离传播（大于500-1000千米）与人类活动关系密切，通常由被感染植物组织（叶片，茎干，或薯块）的人为调运所导致。这种传播非常容易发生在国内不同省份间的种薯和商品薯调运过程，甚至可以跨越洲或大洋传播到更远的马铃薯主产区。9 侵染与发病：孢子囊或孢子囊释放的游动孢子侵染马铃薯后在寄主体内扩展，气候条件适合发病时，致病疫霉菌会迅速从气孔或者受伤组织表面伸出孢子囊梗并在末端发育成孢子囊，在侵染部位形成肉眼可见的白色气生霉层，成熟后的孢子囊很容易脱落，在风、雨水或者人为碰触携带的情况下传播到邻近健康植株，距离有远有近。图1-6致病疫霉菌的无性生活史。（A、B）孢囊梗生长到病组织之外；（C）孢子囊被释放到空气中，或者通过气传或者通过水滴溅射传播；（D）游动孢子释放、休止及萌发侵染，导致植物组织发病；（E）叶片被侵染2-4天后出现病斑。图片引自Fry(2008)综述文章。Figure1-6AsexuallifeofP.infestans.(A,B)Sporangiophoresgrowoutofdiseasedtissue.(C)Sporangiaarereleasedintotheatmosphereforaerialdispersalduringadropinrelativehumidity,ortheycanbedispersedinwatersplashes.(D)Indirectgerminationreleaseszoospores,which,afterencystmentandgerminationonhosttissue,producelesions(E)visibleafter2–4days.FigureisadaptedfromthereviewbyFry(2008).孢子囊通过两种方式侵染寄主植物：当气候条件适宜，叶片表面有水存在且温度低于16oC时，成熟的孢子囊释放产生大量游动孢子，随水的流动而四处扩散，尤其在下雨天，借助雨水的飞溅，游动孢子快速扩散，附着到健康植株上。数个小时后，游动孢子休止并形成休止孢。休止孢萌发形成芽管侵入寄主植物的表皮组织完成侵染循环。温度过高导致孢子囊无法正常释放游动孢子时，致病疫霉菌可通过孢子囊直接萌发产生芽管，末端膨大并形成侵染钉，侵染寄主表皮、气孔或者受伤组织。侵入的初生菌形成侵染囊泡，后形成次生菌丝通过细胞间隙扩张到邻近细胞，菌丝形成具有手指形状的吸器10 并压迫寄主细胞膜内陷而进入寄主细胞。在下雨天气，地下和裸露的薯块也很容易被侵染。孢子囊被雨水冲刷进泥土时会释放出游动孢子，游动孢子可以随水流接触薯块，并通过伤口、皮孔和芽眼等穿透薯块。病原菌可潜藏在块茎中，导致马铃薯贮藏期间腐烂，带病薯块也可以作为下一年病害流行的重要侵染来源。孢子囊和游动孢子都能侵染植物，但是孢子囊对于病害的启动和初期发展作用更大，而游动孢子则是在气候条件合适时帮助致病疫霉菌快速完成再侵染循环过程（图1-6）。生理小种致病疫霉菌存在生理小种分化现象，不同的生理小种（physiologicalrace）在形态特征方面相同，但对寄主的毒性（virulence）不同，早在1919年科学家Gidding和Berg就已经观察到这种生理小种分化现象。目前对生理小种的分类方法采用“致病疫霉菌生理小种国际命名方案”命名(Blacketal.1953)，利用含有不同抗病基因的马铃薯品种作为鉴别寄主，通过接种后病原菌在鉴别寄主发病的表现来进行区分。开始该套鉴别寄主由不含抗病基因的R0以及含有抗病基因的R1、R2、R3和R4这5个马铃薯品种组成。20世纪60年代后，由于致病疫霉菌毒性的变异，4个抗病基因均被克服后，因此又增加了含有R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11以及含有Rx、Ry、Rz抗病基因的马铃薯品种，随着品种的增加，又可以区分出更多的生理小种类型。1.2.5致病疫霉菌防控研究不同于真菌，卵菌具有独特的生理生化特性，目前绝大部分真菌类杀菌剂对卵菌病害的防治效果均较差(Tyler2001)。比如卵菌自身并不合成甾醇类物质，使得以此为靶标的唑类杀菌剂失去了防治作用(ErwinandRibeiro1996)。近年来，卵菌病害防治中最常用的农药主要是苯基酰胺类杀菌剂—甲霜灵，通过特异的抑制卵菌病原RNA聚合酶-I的功能而发挥作用(SukulandSpiteller2000)。但是随着使用年限的增加，甲霜灵对晚疫病的防效在迅速下降，原因是致病疫霉菌抗药性菌株已经十分常见，在我国部分地区高抗菌株已达到90%以上(娄树宝2010)。目前烯酰吗啉对致病疫霉菌仍然具有非常好的防效，病原菌群体中还未出现敏感性下降的抗药性亚群体。即使如此，研究如何更好地应对马铃薯晚疫病害已变得十分重要和迫切。事实上，到目前为止马铃薯晚疫病的防治仍然高度依赖化学农药，定期喷洒防控药剂，控制病害的发生仍是重要防控措施。适当进行药物防控，在发病前进行喷药防治效果比较好，作预防性喷药时，第一次应在马铃薯封垄之前，以后每隔2-3周喷一次。发病后，每隔5-7天喷药1次，连喷2-3次。药剂可选用金雷多米尔、安克锰锌、甲霜灵猛锌、百菌清等，药剂要交替使用以减缓抗药性。在中心病株出现后，或在现蕾期至开花期，每亩用58%甲霜灵锰锌可湿性粉剂200-250g进行灌根处理。但是，化学防治不仅带来环境问题，增加马铃薯的生产成本，同时随着农药的不断使用会出现抗药性菌株，11 可能会导致目前仅有的几种对卵菌有效的杀菌剂失效。预测预报在晚疫病的防治过程中发挥着越来越大的作用。由于晚疫病的发生与气候条件密切相关，通过对气象因子的严密监测，基于气候数据观测结果判断晚疫病发生的可能性并合理指导农药的使用，可取得更好的防治效果。近年来国外开发了许多预测模型，并很好的预测了晚疫病的发生，预测预报与防治相结合取得了很好的防治效果。培育和使用抗病品种是防控马铃薯晚疫病最经济有效和环境友好地策略。世界各国都重视马铃薯抗病种质收集研究和利用，全球茄科茄属（Solanum）植物的种质资源十分丰富，仅马铃薯组（Petotascetion）就含有200多个种，集中分布于美国、墨西哥、秘鲁、阿根廷、智利等国家。SolRgenedatabase数据库中整理和收藏了欧洲和美洲主要马铃薯种质资源中心的所有材料，其中包括登记在册的马铃薯种和品种总计1062个，基因型总计12584个。从田间接种测试和实验室离体叶片接种测试可知，许多马铃薯野生品种对晚疫病抗性水平很高。例如，马铃薯野生品种Solanumdemissum，其含有的抗晚疫病基因R1、R3、R10以及R2和R4，在20世纪中期被广泛引入欧洲马铃薯主栽品种。迄今为止从野生茄科植物中已克隆到21个抗晚疫病基因，已定位的抗病基因有19个，可作为抗源材料提高马铃薯的抗病性(顾彪等2013)。然而在生产实践中，由于病菌毒性快速变异问题突出，目前几乎所有已知的抗晚疫病基因均已丧失抗性，需要寻找具有持久抗病性的的资源培育持久抗病品种迎接晚疫病挑战。还有一些农业措施可配合使用，增加防治效果。种薯是晚疫病的重要初侵染来源，而病薯的调运则是晚疫病远距离传播的重要途径，为防止其发生和流行，首先要从种薯上入手，选用无病小种薯，整薯播种，避免了切种薯时的交叉污染及大田里的侵染。因地制宜，筛选良种，大力选育和推广抗病品种。适当种植隔离防护带，阻止大范围传播。加强田间管理，发现病株要及时清理。但是，传统的品种和药剂防治策略对于疫霉的防治效果有限。因此，对于马铃薯晚疫病的防治至今仍是一个世界性难题。1.2.6致病疫霉菌群体研究研究发现，致病疫霉菌具有独特的基因组结构，而且可进行有性生殖，导致自身变异速度非常快，能够克服抗病品种的单克隆株系在短时间内迅速上升为优势小种，从而导致致病疫霉菌群体的快速动态变化。为了追踪其群体动态变化，分析群体动态变化规律，为防治工作提供指导，需要对致病疫霉菌的群体不断开展分析和研究，追踪致病疫霉菌群体的变化规律和状态。近年来对致病疫霉菌群体的研究工作主要从四个方面展开：交配型（matingtype）、毒性类型（pathotype）、线粒体单倍型（haplotype）和基因型（genotype）。交配型和毒性类型是两种表型相关性状，而线粒体单倍型和基因型是两种基因型相关性状。12 交配型：早在1922年科学家已经发现致病疫霉菌存在性分化（sexualdifferentiation）现象，存在A1和A2两种交配型菌株，A1交配型普遍存在于世界各地，而A2交配型直到1956年才首次在墨西哥中部被发现(Niederhauser1956)，1984年才首次在瑞士发现了A2交配型的存在(HohlandIselin1984)，之后在美洲、欧洲、亚洲及非洲等许多国家都发现A2交配型的分布(朱杰华等2000)。我国于1996年首次在山西和内蒙古地区发现A2交配型，随后云南、重庆、四川、福建、河北、甘肃和黑龙江等地均发现有A2交配型的分布(张志铭等1996)。致病疫霉菌有性生殖过程中基因发生遗传重组，可迅速在后代中累积有利变异，导致高致病力菌株的出现和群体结构的动态变化；同时致病疫霉菌有性生殖产生抗逆性强的厚壁卵孢子，可在土壤中存活多年，增加了次年的初侵染来源。有性生殖赋予了致病疫霉菌快速变异和耐受逆境的能力，寄生适合度的提高往往使晚疫病的发生更加严重，防治工作难上加难。近年来通过对国内西北地区马铃薯主产区致病疫霉菌交配型的研究发现，A1交配型菌株比例迅速下降，而A2交配型菌株的比例上升，同时出现了大量的自育型菌株(田月娥2015)。自育型（Self-fertility）菌株可发生类似同宗配合的有性生殖过程，不需交配就能在纯培养基上产生典型的具有雄器和藏卵器的卵孢子。该类型菌株于1961年在墨西哥被首次报道，20世纪80年代后，世界各国家也陆续发现自育型菌株的存在(赵志坚等2007)。近几年来，我国马铃薯栽培区自育型菌株出现频率越来越高，云南、甘肃、福建等地先后发现了致病疫霉菌自育型菌株的存在，西北各省也发现了自育型的存在(李会平2014;孙银银2010;田月娥2015)。对自育菌株产生的原因、遗传与变异机理以及其有性后代对致病疫霉菌毒性变异的影响尚不清楚，亟需进一步研究。但自育菌株的出现预示着致病疫霉菌发生有性生殖过程的可能性和机会大大增加，更有可能发生基因重组，产生强毒性菌株，给马铃薯生产带来更大的困难和挑战(Fernández-Pavíaetal.2004)。毒性类型：致病疫霉菌存在小种分化现象，通过一套含有不同抗病基因的马铃薯鉴别寄主可以区分不同生理小种的毒性类型。近年来，世界各地致病疫霉菌生理小种分析结果表明，生理小种类型在不断地趋于复杂化，致病力同样显著提高。Andrivon于1994年对采自法国的116个菌株进行生理小种鉴定，发现了19种不同的毒性类型，其中小种1.3.4.7.11、1.3.4.7.10.11和1.3.4.7.8.11发生最为普遍，没有检测到克服R2和R6抗病基因的菌株(Andrivon1994)；Knapova和Gisi在2002年对采自法国和瑞士的122个菌株进行生理小种鉴定，发现这些菌株以小种1.3.4.7.10.11，1.3.4.7.8.10.11，1.3.4.6.7.10.11和1.3.4.6.7.8.10.11为主(KnapovaandGisi2002)。2002年，Yigal等对1983-1991年间采自以色列的80个致病疫霉菌株进行测定，鉴定到5个小种13 类型，发生频率最高的小种是1.3.4.7.8.10；从1993-1998年采集的173个菌株中，鉴定到19个小种类型，发生频率最高的小种是1.3.4.7.8.10.11，其发生频率为63%；从1999-2000年采集的71个菌株中，鉴定到42个小种类型，其中34个是新出现的小种(Yigal2002)。2006年，Sliwka等对波兰2002-2004年间采集的93株致病疫霉菌进行鉴定，结果发现大部分菌株含有多个毒力因子（virulencefactor）(Sliwka2006)。2008年，Lehtinen等对2003年采自芬兰和挪威的致病疫霉菌株进行研究，发现1.3.4.7.10.11小种出现频率最高(Lehtinenetal.2008)。2010年Corbière等对2008年采自法国的8株致病疫霉菌株进行测定，发现3株“超级毒性小种”菌株（即可克服所有鉴别寄主抗病基因的小种），平均毒力因子为7.4(Corbière2010)。我国自1981年开展马铃薯致病疫霉菌生理小种研究工作以来，致病疫霉菌群体中生理小种变化的总趋势和国际上一致，即生理小种的数目不断增多，小种组成日趋复杂化。黄河等(1981)研究发现1962-1967年间中国北部的致病疫霉菌生理小种组成简单，小种4为优势小种。此后，刘晓鹏(1995)、姚裕琪(1996)、杨艳丽等(2001)分别对我国湖北、内蒙古、云南等地区的致病疫霉菌进行生理小种研究，结果发现小种组成依然相对简单，平均含有1-2个毒力因子。近年来，对我国河北(朱杰华等2003；韩彦卿等2010)、云南(杨艳丽等2007)、内蒙古(郭军等2007)等地的致病疫霉菌生理小种进行测定，发现小种组成明显复杂，含有7个毒力因子及以上的复合小种大量出现，而且赵志坚等(2007)、韩彦卿等(2010)、马云芳等(2013)均在我国发现了能克服11个抗病基因的“超级毒性小种”。国内外研究结果显示，生理小种类型不断增多，组成日趋复杂化。来自S.demissum的11个抗性基因都能够被克服(Fry2008)，如何寻找和筛选新的抗病性基因成为马铃薯抗晚疫病育种亟待解决的问题。因此，密切监测致病疫霉菌生理小种的组成及分布情况，从而预测现有品种的使用寿命，并及时调整品种布局，最大限度地防止因品种丧失抗性而造成严重损失。线粒体单倍型：线粒体DNA（mitochondrialDNA）是一种核外遗传物质，相比于核内DNA，具有母性遗传、分子量小、结构简单以及无组织特异性等特点，是研究致病疫霉菌起源进化以及系统发育的理想工具(郭瑜和赖松家2004)。20世纪90年代，线粒体DNA分析方法开始用在马铃薯致病疫霉菌的群体分析工作中。研究发现致病疫霉菌线粒体DNA可以分为四种单倍型，即Ia、Ib、IIa和IIb。1990年，Carter等对十余个国家的致病疫霉菌株进行了线粒体DNA单倍型研究，他们利用RFLP技术，采用了EcoRI、ClaI、BglII、HindIII、BclI、HhaI和MspI等限制性内切酶来测定。但是RFLP技术比较繁琐，并不适用于大量菌株线粒体DNA单倍型的测定。1998年，Griffith和Shaw对该方法进行了优化，利用R2和F2与R4和F4两对引物分别扩增致病疫霉菌的线粒体DNA，产14 物片段用限制性内切酶EcoRI和MspI酶切，之后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，根据片段长度将致病疫霉菌的四种线粒体单倍型区分开来。目前，国内外学者普遍采用该方法来鉴定致病疫霉菌线粒体DNA单倍型。1997年，Fry和Goodwin认为Ib菌系相对古老，是马铃薯致病疫霉菌的祖先菌系，该菌系代表之前就已经广泛分布世界的致病疫霉菌“旧”群体，Ia、IIa和IIb三种类型则为致病疫霉菌第二次全球迁移后在墨西哥以外出现的“新”群体。目前，这四种单倍型在世界各国马铃薯种植区均有发现，但不同国家和地区的分布特征不同。Dayetal.(2004)曾利用线粒体DNA单倍型对1995-1998年采集于苏格兰、英格兰、威尔士等地的致病疫霉菌株进行群体分析，只发现Ia和IIa两种单倍型，且Ia单倍型占所测菌株的比例高达91%。Wintonetal.(2007)对2005年采集自美国阿拉斯加的致病疫霉菌进行线粒体DNA单倍型分析，结果发现所测试菌株均为IIb型。我国的许多科学家也曾利用线粒体DNA单倍型分析进行致病疫霉菌的群体研究。赵志坚等于2007年对云南采集的120株致病疫霉菌线粒体DNA单倍型进行分析，发现2000-2003年采集的菌株存在Ia、IIa和IIb三种单倍型，Ia单倍型比例80%，Ib单倍型菌株均来自番茄。陈良华等于2009年对我国部分地区的致病疫霉菌株进行线粒体DNA单倍型分析，发现存在Ia、IIa和IIb三种线粒体单倍型，其中IIa单倍型比例最高。Guoetal.(2010)曾对1998-2004年间采集自中国10个省的致病疫霉菌株进行线粒体DNA单倍型分析，同时发现Ia、Ib、IIa和IIb四种单倍型的存在，出现频率分别为72%、18%、6%和4%。该结果说明，中国致病疫霉菌群体和世界各国的发展趋势是一致的，“新”群体已逐步取代了“旧”群体(马云芳2012)。基因型：由于分子标记多态性水平高，同时多为中性标记，不受环境和其它因素的影响，开发和使用成本低，检测手段快速简单，可重复性好等特点，能够从群体中快速地辨别出更多的等位基因，并根据基因型进行分类分析，是致病疫霉菌群体分析的常用手段之一。杨志辉等(2008)应用AFLP分子标记检测了我国部分马铃薯主要产区致病疫霉菌的遗传多样性及不同地区菌株间的亲缘关系。在200对引物组合中，利用6个菌株筛选出12对多态性好、带型清晰的引物组合。并且利用这12对引物组合对1997-2002年间采自我国黑龙江、河北、四川和云南4省的50株菌株进行了PCR扩增，共扩增出922条谱带，其中多态性标记530条，占57.5%。随后又利用NTSYSpc软件中UPGMA算法构建的我国致病疫霉菌的亲缘关系树状图，聚类分析结果表明我国致病疫霉菌的遗传多样性与病原菌的地理来源有一定的相关性，而与交配型、生理小种和对甲霜灵的抗性无明显的相关性。他们还用POPGENE软件计算了各群体间的遗传多样性参数，结果表明我国致病疫霉菌的遗传多样性程度不高，不同地区种群间分化不明显。姚国胜等(2009)利用两对SSR引物对Pi4B和Pi4G基因位点进行了PCR扩增，测定了来自中国部分地15 区66个致病疫霉菌株和2个参考菌株的SSR基因型，发现F-01基因型为所测菌株中的优势基因型，同时对河北、黑龙江和云南3个不同省份致病疫霉菌遗传多样性的比较发现，河北省和黑龙江省致病疫霉菌群体遗传多样性几乎相同，而与云南省致病疫霉菌群体有较大的遗传差异。此外，姚国胜等(2009)发现致病疫霉菌SSR基因型与菌株的甲霜灵抗性无相关性。黄振霖等(2010)利用RAPD分子标记技术，首次对重庆地区86个致病疫霉菌株进行了DNA指纹分析，根据遗传相似性小于0.80，将供试菌株分为6个遗传谱系，显示出较突出的优势谱系（L1、L2、L3），其遗传多样性并不丰富，推测其可能与该地区种植的马铃薯品种较单一有关。陈昌盛等(2010)用SSR分子标记技术对采集自中国不同地区不同寄主来源的60个致病疫霉菌株的群体遗传多样性分析表明，番茄致病疫霉菌群体遗传多样性高于马铃薯致病疫霉菌群体；由于番茄品种较多，而马铃薯品种较单一，故推测致病疫霉菌群体遗传多样性可能与寄主品种有关。Brurbergetal.(2011)用9对SSR引物分析了北欧四个国家（丹麦、芬兰、挪威和瑞士）的200个菌株，共检测到49个等位基因，其中7对SSR引物将191个菌株划分为169个基因型，结合交配型分布情况（61%的菌株为A1交配型），推测有性生殖在北欧国家致病疫霉菌群体的遗传变异中起着非常重要的作用。我国科学家通过SSR标记和线粒体单倍型分析，初步发现采自中国东北、西北、西南和东南地区的致病疫霉菌可划分为三个克隆谱系(Lietal.2012)，其中一谱系与13_A2菌系高度相似，包含A1和A2交配型；经交配型比率和SSR标记等位基因频率分析，作者推测致病疫霉菌有性生殖可能性很低，目前国内晚疫病群体结构主要受到病菌无性繁殖体迁移和突变等因素的影响。1.2.7致病疫霉菌起源和迁徙研究关于致病疫霉菌的起源地问题一直备受争议，有人认为其发生和演化中心是墨西哥Toluca山谷(BirchandCooke2013)，也有人坚持认为致病疫霉菌起源于南美洲安第斯山脉地区，该地区甚至有时被认为是除墨西哥以外的另一个演化中心(Fryetal.1993)。关于起源中心的两种说法均有证据支持。支持安第斯山脉为起源地的证据：作为寄主的四倍体栽培马铃薯和众多野生马铃薯起源于此，且此地存在多种可作为寄主的茄属植物（Solanum），同时此地分布着一种与致病疫霉菌亲缘关系非常近的安第疫霉菌（Phytophthoraandina）(Olivaetal.2010;Spooneretal.2005;Volkovetal.2003)。事实上在19世纪，科学家认为致病疫霉菌就是起源于南美洲的安第斯山脉，因为最早传入欧洲的三个马铃薯品种就来源于这里，导致1845年“爱尔兰大饥馑”的病原也应该源于此地(Bourke1964)。然而群体分析发现安第斯地区的致病疫霉菌群体多态性较低，仅发现了数量极少的几个无性系（clonallineage），16 这似乎暗示着该群体并非一个祖先群体（ancestralpopulation），使得安第斯起源论备受怀疑(Goodwinetal.1994;GrunwaldandFlier2005)。然而，近期Gómez-Alpizaretal.(2007)通过两个核基因和数个线粒体位点的基因序列分析了来源于美洲南部、中部到北部以及爱尔兰的多个菌株，发现墨西哥群体的多态性低于安第斯群体，而且似乎群体中存在的众多变异均首先发生于安第斯地区，然后扩散全球的。该结果进一步支持了安第斯起源论。支持墨西哥高地的Toluca山谷为起源地的证据：墨西哥存在两个与致病疫霉菌亲缘关系非常近的近缘种Phytophthoraipomoeae和Phytophthoramirabilis，P.mirabilis甚至被推测与致病疫霉菌的分化时间仅有1300年(Flieretal.2002;GoodwinandFry1999;Yoshidaetal.2013)。这两个菌引发地方性病害，侵染两种当地特有的茄科植物(Gossetal.2014)。Toluca山谷的致病疫霉菌群体多样性水平高，且符合哈迪-温伯格平衡（Hardy–Weinbergequilibrium），有性生殖群体中A1和A2交配型的比例接近期望值1:1(Grünwaldetal.2001;Flieretal.2003)。在1970s的致病疫霉菌群体迁移事件发生前，墨西哥以外的世界仅有A1交配型的存在(Fryetal.1992)。此地有众多结薯型茄科马铃薯，且众多来源于此地的抗病基因被应用于马铃薯抗性育种中，是寄主和病原长期协同进化的重要证据(HijmansandSpooner2001;Vleeshouwersetal.2011)。近来一个研究利用多个微卫星标记和4个核基因序列分析墨西哥、安第斯和其它群体的菌株，同时整合分析了P.phaseoli，P.mirabilis，P.ipomoeae和P.andina这四个近缘种，结果发现安第斯群体是墨西哥群体的衍生后代群体(Gossetal.2014)。目前研究认为致病疫霉菌共经历过四次大规模的全球迁移事件。19世纪40代的迁移，导致“爱尔兰大饥馑”的致病疫霉菌株系蔓延欧洲；20世纪70年代的迁移，导致全世界以US-1为代表的“旧群体”被以交配型A2、线粒体单倍型Ia和IIa的“新群体”所取代；20世纪80年代的迁移，使得US-7和US-8蔓延北美；21世纪在欧洲的迁移，导致Blue_13单克隆株系成为欧洲的优势小种。致病疫霉菌1840s年代的迁移曾经造成了历史上著名的“爱尔兰大饥荒”。基于历史资料和遗传学数据推测，病原菌迁移路线可能有两条：直接从墨西哥传入到欧洲，或经由美国传入到欧洲（图1-7）。传入欧洲后，通过马铃薯的国际贸易活动被传播到世界各地。目前研究证明导致“爱尔兰大饥荒”的致病疫霉菌为一个单克隆无性系，典型特征为Ia线粒体单倍型(MayandRistaino2004;Martinetal.2013)。此后出现了毒性和寄生适合度更高的US-1无性系，并迅速蔓延全球，这一无性系的典型特征是A1交配型，线粒体DNA为Ib单倍型。20世纪70年代致病疫霉菌再次发生迁移，也正因为此次迁移，世界范围内的致病疫霉菌群体结构开始发生变化。该次迁移成功的标志性事件是1981年在瑞士首次检测到A2交配型。这也是继1954年A2交配型发现于墨西哥中心后，首次在墨西哥以外的17 地方检测到A2菌株的存在。此次迁移造成A2交配型扩散全球，除澳洲和南极洲外，其它地区均可检测到A2交配型的存在。此次迁移也造成了致病疫霉菌“新”“旧”群体的更替。在短短几年时间内，以US-1为代表的“旧”群体很快被以A2交配型，Ia和IIa线粒体单倍型为代表的的“新”群体替换(田月娥2015)。20世纪80年代的迁移事件导致各种新基因型从墨西哥西北部引入到了美国和加拿大地区。新基因型的传播很可能是因为感染致病疫霉菌的番茄果实由墨西哥西北部向美国的调运导致。从1992年开始，两个新的基因型US-7和US-8出现在美国和加拿大的群体中。由于US-8基因型在马铃薯薯块上很容易定殖，因此二十世纪九十年代后期美国致病疫霉菌群体中US-8的大流行与带菌薯块的调运有很大的关系。这些新引入的基因型属于A2交配型，同时对杀菌剂甲霜灵高抗(田月娥2015)。进入21世纪后，欧洲致病疫霉菌群体发生剧烈变化，以菌株06_3928A为代表的Blue_13单克隆株系在欧洲出现。作为强毒性菌系，Blue_13迅速扩散蔓延，在短短三年时间内取代其他菌系成为欧洲西北地区致病疫霉菌的优势菌系(Cookeetal.2007;Cookeetal.2008)，使得部分抗病性较好的曾经用于生产有机马铃薯的品种抗性丧失(Leesetal.2012)。Cookeetal.(2012)曾对菌株06_3928A进行基因组重测序研究，发现该菌株为代表的Blue_13菌系基因序列多态性高，且与致病相关的毒性基因表达水平变化大，一定程度上解释了其变异和毒性与群体结构动态变化间的关系。图1-7致病疫霉菌最初全球迁移的不同阶段和对遗传多样性产生的影响。图片引自Goodwin(1997)综述。Figure1-7DifferentstagesintheinitialglobalmigrationofP.infestansandtheireffectsongeneticdiversity.FigureisadaptedfromthereviewofGoodwin(1997).18 1.3致病疫霉菌RXLR效应因子研究2004年，Shanetal.(2004)克隆了来自大豆疫霉（P.sojea）的第一个卵菌无毒基因Avr1b。2005年，Rehmanyetal.(2005)克隆了寄生霜霉的第一个无毒基因ATR1NdWsB；同年，Armstrongetal.(2005)克隆了致病疫霉菌第一个无毒基因Avr3a。通过几个基因所编码氨基酸序列的比对分析发现这些无毒基因含有一段由Arg-x-Leu-Arg（精氨酸-任意氨基酸-亮氨酸-精氨酸）组成的保守序列，命名为RXLR基序。这些无毒基因的作用方式符合Flor提出的“基因对基因”模式，可以激发含有对应抗病基因的寄主植物发生过敏性坏死反应（hypersensitiveresponse，HR），是典型的无毒基因。与此同时，研究发现这些基因也具有毒性功能，在侵染阶段由病原通过吸器分泌到寄主细胞，随后靶向互作靶标，通过操纵靶标蛋白的功能来调控寄主的生理生化过程和干扰寄主的免疫防卫反应，从而发挥其毒性功能。考虑到这些无毒基因功能的双重性，即同时具有毒性和无毒性，科研工作者开始采用效应因子（effector）统一称呼这些参与植物病原互作的分子，而卵菌中这些无毒基因均带有RXLR基序，因此被称为RXLR效应因子(Rehmanyetal.2005)。图1-8效应基因中的RXLR基序。图片引自Rehmanyetal.(2005)Figure1-8RXLRmotifofeffectorgenes.FigureisadaptedfromRehmanyetal.(2005).1.3.1致病疫霉菌RXLR效应因子与植物病原互作1.3.1.1植物与病原互作的分子机制植物和病菌在互作过程中相互竞争、协同进化，形成了一系列复杂的互作机制。寄主植物利用这些机制防卫病原菌的侵染，而病原利用这些机制干扰寄主的防卫反应。为抵抗病原的侵染，寄主植物拥有众多防御机制，例如植物表面天然存在的角质层和蜡质层，以及植物释放的众多抗菌物质（例如各种酶类和毒素），这些天然存在的防卫机制被称为被动防卫机制，可以阻止大部分微生物的侵染。但是仍然有少数微生物可以不受这些机制的影响并成功穿透植物表面，此时病原菌的相关分子模式（Pathogen-AssociatedMolecularPatterns,PAMPs）受到位于胞外的众多受体蛋白（PAMPRecognitionReceptors,PRRs）识别，引发植物的防卫反应，这类防卫反应称为PTI（PAMPsTriggeredImmunity）。19 为成功侵染，病原菌会向寄主释放大量毒性效应因子，这些效应因子靶向寄主的防卫机制，阻断寄主对病原的识别以及防卫信号向下游的传递，该过程被称为效应因子引起的感病性（effector-triggeredsusceptibility,ETS）。长期进化过程中寄主植物产生了大量NBS-LRR抗病基因，其编码产物或位于细胞膜上识别病原的胞外效应因子，或位于细胞质中识别病原的胞内效应因子，并导致ETI（effector-triggeredimmunity）。寄主对病原效应因子的识别会对病原产生强大的选择压力，导致效应因子的快速变异，以逃避寄主抗病基因的识别。协同进化过程中，寄主植物与病原菌间此消彼长的竞争关系在两者基因组DNA序列中留下了大量可被追溯的证据(TerauchiandYoshida2010)（图1-9）。图1-9植物与病菌互作过程中植物免疫系统变化的Z字模型。图片引自JonesandDangl(2006)综述。Figure1-9Zigzagmodelillustratesthequantitativeoutputoftheplantimmunesystem.FigureisadaptedfromthereviewbyJonesandDangl(2006).1.3.1.2植物病原菌效应蛋白效应蛋白是指病原分泌的进入寄主植物胞外或胞内发挥毒性功能的分泌蛋白。寄主不含有相应抗病基因时，效应蛋白发挥毒性功能，操纵寄主代谢，营造更加合适的寄生环境；寄主含有相应抗病基因时，效应蛋白被识别并发挥无毒性功能，引发寄主植物的免疫防卫反应(Kamoun2006)。病原效应因子基因与寄主抗病基因之间的互作关系符合“基因对基因”模型(Ellisetal.2009)，而过去的研究已经在众多微生物中发现了效应因子编码的效应蛋白，例如植物病原细菌、真菌、卵菌及线虫在侵染过程中都会释放一定数量、功能各异的效应蛋白，通过与寄主代谢和防卫通路互作而干扰植物的正常生理功能和免疫反应。Flor的“基因对基因”假说提出后，对于无毒基因仅仅是一个概念还是真实存在这个问题，引起了众多科学家的关注(Flor1971)。由于细菌模式系统的优势，在1984年，第一个无毒基因AvrA从丁香假单胞大豆致病变种（Pseudomonassyringaepv.glycinea）中20 被克隆(Staskawiczetal.,1984)，首次用试验证据证明了无毒基因的真实存在性及“基因对基因”假说的正确性。随后大量的无毒基因从模式细菌中被克隆，功能研究发现这些效应因子进入寄主后会干扰其免疫防卫反应，破坏PTI和ETI过程的信号传递，干扰抗病基因的转录和转录后调控，靶向抗病蛋白使其降解，以及干扰寄主的泛素化过程来影响植物的免疫过程(Chisholmetal.2006;GohreandRobatzek2008;Bhavsaretal.2007)。早期细菌效应基因的克隆主要是利用突变体进行，而真菌和卵菌效应基因的克隆则主要依靠经典遗传学策略完成，通过毒性菌株和无毒性菌株间杂交构建遗传分离群体，利用后代表型数据和分子标记进行定位，随后利用BAC文库及染色体步移完成基因的图位克隆，如稻瘟菌的无毒基因AvrPita(Orbachetal.2000)、大豆疫霉菌无毒基因Avr1b(Shanetal.2004)和油菜茎基溃疡病菌无毒基因AvrLm1(Goutetal.2006)，均为利用该策略实现基因的克隆。随后的序列分析发现这些无毒性效应基因多态性水平极高，种内毒性谱不同的菌株间高度分化，想要从其基因组中批量的寻找效应基因候选相对困难，限制了效应基因的大规模鉴定和后续毒性功能分析。1.3.1.3病原卵菌RXLR效应因子同其它病原菌效应因子的研究相比，目前卵菌效应因子的研究工作取得了一定的突破。基于几个卵菌无毒基因的序列分析发现了卵菌RXLR效应因子结构方面的特征，这些结构特征包括：N-terminal存在II型胞外分泌信号肽，长度在20个氨基酸左右；N-terminal信号肽之后存在RXLR和dEER基序；RXLR基序由精氨酸（Arg）+任意氨基酸（x）+亮氨酸（Leu）+精氨酸（Arg）组成；dEER基序由两个谷氨酸残基（Gln）+一个精氨酸残基（Arg），最前面常常跟有一个天冬氨酸残基（Asp）；C-terminal为效应蛋白结构域，负责毒性功能的发挥。基于这些结构特征，研究者从卵菌基因组中预测到大量的RXLR效应因子，例如从致病疫霉菌基因组中预测到563个(Haasetal.2009)，大豆疫霉菌中396个(Tyleretal.2006)，橡树疫霉菌（P.ramorum）中374个(Tyleretal.2006)，辣椒疫霉菌（P.capsici）中357个(Lamouretal.2012)，寄生霜霉菌（H.arabidopsis）中134个(Baxteretal.2010)，樟疫霉菌（P.cinnamomi）中160个(韩长志2015)。在植物与病原互作过程中，卵菌RXLR效应因子扮演着重要角色(Kamoun2007)。当前的研究表明，已克隆的卵菌无毒基因均为RXLR效应蛋白，被相应的NBS-LRR抗病蛋白所识别(VleeshouwersandOliver2014)，表现为无毒功能，即激发子功能，能引起植物细胞发生过敏性坏死反应；若寄主植物不含有相应的抗病基因，则RXLR效应蛋白分子发挥其毒性功能，靶向寄主的生理生化过程及免疫防卫反应过程，增强寄主植物的感病性。例如大豆疫霉Avr3b的C-ternimal含有Nudix水解酶结构域，具有焦磷酸化酶活性，目前研究虽未发现其具体的作用靶标，但是发现其靶向活性氧相关通路，导致活性氧累积受到抑制而增强植物的感病性(Dongetal.2011)；此外，寄生霜霉ATR1和21 ATR13可增强P.syringaeDC3000对拟南芥的致病力，ATR1Emoy2和ATR1Cala2可以加快P.syringaeDC3000在拟南芥中的繁殖速度，从而增前其致病能力，但具体原因未知。ATR13Emoy2和ATR13Emoy5可以抑制细菌PAMP引发的胼胝质沉积，ATR13Maks9可以抑制细菌鞭毛蛋白Flg22引发的拟南芥胼胝质沉积和活性氧爆发(Sohnetal.2007)；大豆中，Douetal.(2008a)研究表明疫霉PsAvr1b-1可以广泛抑制由Bax引起的细胞坏死，不仅可以抑制Bax引发的大豆叶片坏死，而且可以抑制Bax引发的酵母坏死，说明其毒性靶标在真核生物中是非常保守的。除C-ternimal的毒性功能外，卵菌RXLR效应因子中RXLR基序的功能也引起了的大家的关注。Douetal.(2008b)研究发现，RXLR基序在效应蛋白跨膜转运进入寄主细胞的过程中发挥重要作用，他们以GFP荧光蛋白为工具，在GFP蛋白一端融合RXLR基序和dEER基序以及侧翼的几个氨基酸，就足以完成GFP蛋白的跨膜转运，而突变RXLR基序则导致跨膜转运现象消失(Douetal.2008b)。Kaleetal.(2010)进一步研究发现RXLR效应蛋白通过RXLR基序形成特殊的结构域，并通过该结构域与寄主植物细胞膜外的3-磷酸-磷脂酰肌醇（PI3P）结合，通过细胞膜脂筏介导的内吞作用将RXLR效应蛋白转运到寄主细胞中(顾彪2012)。1.3.1.4致病疫霉菌RXLR效应因子基于Flor的“基因对基因”模式，科研工作者成功从细菌中克隆到第一个无毒基因AvrA，坚定了科研工作者从其它病原菌中鉴定无毒基因的信心。致病疫霉菌的无毒基因与抗病基因同样符合Flor的“基因对基因”模式，因此，早期工作中科研工作者利用无毒菌株和毒性菌株间的有性杂交来构建遗传分离群体并进行群体遗传分析，实现了无毒基因的定位：如发现Avr1定位于IV连锁群末端，找到一个与之相距8cM连锁标记；将Avr2定位到VI连锁群中间位置，找到与之紧密连锁的两个分子标记；将Avr4定位到A2-a连锁群，找到一个与之相距1cM的紧密连锁标记；而Avr3、Avr10和Avr11三个无毒基因紧密连锁，并定位到VIII连锁群(VanVerketal.2013)。通过关联基因组学分析和生物信息学分析，2005年第一个致病疫霉菌无毒基因Avr3a被克隆。该基因的编码产物可被R3a所识别，引发过敏性坏死反应，其定位于一段相对古老的染色体片段区域，该区域与寄生霜霉ATRNdWsB所在的区域同源，同时发现该无毒基因存在毒性的Avr3aEM形式，可逃避R3a识别(Armstrongetal.2005)。Guoetal.(2006)利用cDNA-AFLP对致病疫霉菌侵染材料进行表达分析，发现了在毒性菌株中不表达，在无毒基因中高表达的数个EST片段，其中两个片段测序后发现为同一基因，并且通过关联分析认为其极有可能为无毒基因Avr4(Guoetal.2006)。随后，vanPoppeletal.(2008)通过遗传转化在毒性菌株中表达Avr4，导致毒性菌株对含有R4抗病基因的马铃薯失去毒性，进一步证明了该基因为无毒基因Avr4。22 Avrblb1也被称作ipiO，该基因在致病疫霉菌侵染寄主植物初期呈现出短暂的高水平表达(Pieterseetal.1993)，因此研究者推测ipiO基因是致病疫霉菌的致病相关基因。该基因在致病疫霉菌的基因组中有两个同源基因ipi-O1和ipi-O2，但利用SouthernBlot在致病疫霉菌基因组中仅能检测到一个，同时发现该基因不含有内含子(Pieterseetal.1994)。两个基因均编码一个152个氨基酸的蛋白，其序列相似度高达97%。序列比对分析发现两个等位基因间仅存在4个氨基酸位点的差异，位于117、122、134与143位氨基酸处。信号肽位于N-terminal的1-21个氨基酸，属于II型分泌信号肽(Pieterseetal.1994)。与其它无毒蛋白相比，IPIO蛋白有特异的RGD三肽结构（Arg-Gly-Asp），该结构已被证实存在于动物细胞表面附着的纤维蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白和一种凝血因子中，在与这些蛋白质和其受体间的结合起到关键的作用。ipiO与RB同时在烟草中瞬时表达可造成烟草细胞的过敏性坏死反应，从而表明IPIO蛋白具有AVRblb1蛋白的活性，因此，ipiO基因家族就是无毒基因Avr-blb1家族(Vleeshouwersetal.2008)。Gilroyetal.(2011)完成了无毒基因Avr2的克隆工作，他们基于前人的分子作图工作，利用紧密连锁的两个分子标记将候选基因定位到T30-4基因组的supercontig1.16上，序列分析发现一段36.6kb的区段上含有三个RXLR候选基因，其中两个候选序列一致。瞬时表达发现PITG_22870可以引发R2植物的坏死反应，在毒性菌株中表达PITG_22870可失去对R2寄主植物的毒性，确定该基因为无毒基因Avr2。致病疫霉菌的全基因组测序工作于2009年完成，根据RXLR效应因子基因的一系列结构特征进行生物信息学预测，从其基因组中预测到563个RXLR效应基因(Haasetal.2009)，其中表现无毒性且对应抗病基因已知的效应因子有Avr1（PITG_16663）、Avr2（PITG_22870）、Avr3a（PITG_14371）、Avr3b（PITG_18215）、Avr4（PITG_07387）、Avrblb1（PITG_21388）、Avrblb2（PITG_20300）、Avrvnt1（PITG_16294）、AvrSmira1（PITG_07558）和AvrSmira2（PITG_07550）(Haasetal.2009)，但是，更多RXLR效应基因对应的抗病基因目前尚不清楚。1.3.2致病疫霉菌RXLR效应因子生物学功能研究1.3.2.1植物病原卵菌RXLR效应因子功能概述植物对病原卵菌的抗病性表现小种专化抗性，符合“基因对基因”模式，植物抗病基因编码的抗性蛋白可识别卵菌效应基因编码的无毒蛋白，激活免疫防卫反应。目前所有已克隆的卵菌抗病基因，其编码产物均为胞内NBS-LRR抗性蛋白(Tyler2009)。由于卵菌为二倍体，其遗传学研究进展相对缓慢。直至2004年，Shan等才报道了来自于大豆疫霉（P.sojae）第一个卵菌无毒基因Avr1b。目前已有许多表现无毒性的卵菌效应基因被克隆，其中包括致病疫霉菌的PiAvr1、PiAvr2、PiAvr3a、PiAvr3b、PiAvr4、PiAvrblb1、PiAvrblb2、PiAvrvnt1、PiAvrSmira1和PiAvrSmira2，大豆疫霉的PsAvr1a、PsAvr1b、23 PsAvr3a、PsAvr3b、PsAvr3c和PsAvr4/6；寄生霜霉的ATR1、ATR5和ATR13(Rehmanyetal.2005；Sohnetal.2007)。植物免疫过程是涉及各种交联信号和调控过程的复杂网络系统，寄主植物从从基因表达层面，到蛋白修饰及蛋白周期等各个层面对免疫过程进行严格地调控。病原的一系列效应因子在和寄主的协同进化中获得了靶向寄主不同层面防卫反应通路的能力，以更好的生活和获得营养(Mukhtaretal.2011;Weßlingetal.2014)。目前研究已发现了多个被卵菌RXLR效应因子所靶向的植物免疫反应相关过程。例如致病疫霉菌的多个RXLR效应因子可以靶向寄主的MAPK通路，如抑制MAPKKKε功能的PexRD2(Kingetal.2014)。也有研究表明效应蛋白在MAPK信号通路的下游发挥作用，例如可以抑制Flg22引发PTI反应8个RXLR效应蛋白(Zhengetal.2014)。此外，RXLR效应因子Pi03192通过抑制膜定位的NAC转录因子向细胞核的重定位而增强植物的感病性(McLellanetal.2013)；PiAvrblb2则通过与防卫相关的蛋白酶互作而阻止其发挥功能(Bozkurtetal.2011)；PiAvr3a则干扰E3泛素连接酶CMPG1的功能，达到阻止INF1引发细胞坏死的目的(Bosetal.2010)；PiAvr2靶向油菜素内酯信号转导物质BSL1，阻断马铃薯R2抗病基因介导的防卫反应(Saundersetal.2012)；PiAvrblb1则通过粘连植物防卫蛋白LecRK-I.9来增强植物的感病性(Champouretetal.2009)；Pi04089靶向StKRBP1（KHRNA-bindingprotien），通过增加其累积来增强植物的感病性(Wangetal.2015)。这些工作大大拓展了我们对致病疫霉菌RXLR效应因子毒性功能的认识。大豆疫霉菌基因组中也含有大量的RXLR效应因子，且其中的数个效应因子的毒性功能也得到一定程度解析，例如PsAvh18和PsAvh146可以通过抑制植物的小RNA（smallRNA）合成来抑制寄主的RNA沉默机制(Qiaoetal.2013)；另一个大豆疫霉RXLR效应因子PsAvr3b的C-teminal带有ADP-ribose/NADH焦磷酸化酶结构域，通过抑制寄主活性氧累积来增强植物的感病性(Dongetal.2011)。寄生霜霉基因组中也含有大量RXLR效应因子，对其RXLR效应因子的功能研究发现，HaRxL17靶向寄主细胞液泡膜并包围病原吸器，可增强寄主植物的感病性，具体机制未知(Caillaudetal.2012)；对HaRxL44的功能研究发现其与MED19a互作，抑制水杨酸诱导的防卫反应(Caillaudetal.2013)。这些工作进一步加深了我们对卵菌RXLR效应因子毒性作用机制的认识。1.3.2.2致病疫霉菌RXLR效应因子毒性靶标通过对效应因子作用机制的研究可以更好的了解病原的致病机理，为病害防治工作提供新的思路，开发更有效的防治策略。同其它卵菌病原相比，致病疫霉菌RXLR效应因子功能研究进展较快，到目前已有多个效应因子的毒性靶标被确认，其中毒性靶标和作用机制研究相对比较清楚的有以下几个RXLR效应基因：PiAvr3a：Bosetal.(2010)对致病疫霉菌中Avr3a进行基因沉默，发现该基因对病原24 毒性作用是必需的，说明Avr3a在病原菌致病过中发挥重要作用。靶标筛选发现致病疫霉菌效应蛋白Avr3a靶向E3泛素连接酶CMPG1，通过修饰寄主植物CMPG1发挥其毒性功能，调控植物的免疫反应。具体来说，CMPG1是INF1引发细胞坏死所必需的一个因子，在细胞坏死过程中CMPG1被26S蛋白酶体降解，而CMPG1与AVR3aKI结合后，稳定性增强，导致CMPG1无法被26S蛋白酶体降解而累积，并增强植物的感病性(Bosetal.2010)。但是，AVR3a是否还存在其他靶标有待进一步研究。PiAvrblb1：该基因也称为ipiO，是马铃薯抗病基因RB对应的无毒基因，当马铃薯不含有该抗病基因时ipiO增强致病疫霉菌的毒性。Bouwmeesteretal.(2011)的研究发现植物凝集素受体激酶LecRK-I.9可能是效应蛋白AVRblb1的一个潜在寄主毒性靶标。植物细胞壁-细胞膜间存在通过RGD（Arg-Gly-Asp）三肽介导的粘连作用进行连接，同时，含有RGD三肽的蛋白能够作为配体结合到细胞表面一些受体上，激活下游信号(Gougetetal.2006)。而带有RGD三肽的病原物蛋白能够干扰寄主植物细胞膜和细胞壁之间的连接，从而降低植物的抗病能力(Senchouetal.2004)。AVRblb1除具有RXLR基序和dEER基序外，还具有一组与RXLR重叠的三肽RGD(Pieterseetal.1994)。拟南芥中的LecRK-I.9是一种位于细胞质膜和细胞壁之间的受体激酶，推测AVRblb1效应蛋白通过RGD结构域与之结合而降低植物抗病水平(Bouwmeesteretal.2011)。随后研究发现LecRK-I.9拟南芥缺失突变体和ipiO拟南芥过表达转化子相比于野生型拟南芥（Phytophthorabrassicae）均更加感病，说明LecRK-I.9很可能是IPI-O的靶标。PiAvrblb2：本氏烟叶片瞬时表达Avrblb2可增强烟草对致病疫霉菌的感病性，说明Avrblb2具有毒性功能。定位分析发现致病疫霉菌侵染阶段效应蛋白AVRblb2在吸器周围特异累积，说明其可能于此处发挥功能。为寻找AVRblb2的毒性靶标，Bozkurtetal.(2011)在烟草叶片瞬时表达带Flag标签的AVRblb2，利用Anti-flag抗体，通过pull-down技术获得了五个候选靶蛋白，其中一个是半胱氨酸蛋白酶C14。双分子荧光互补确认AVRblb2与半胱氨酸蛋白酶C14互作，说明C14确为AVRblb2的靶标蛋白，而且AVRblb2可阻止C14向胞外的分泌。C14本身对植物的抗病性具有重要作用，沉默该基因的本氏烟感病性会显著增强。这些结果表明AVRblb2靶向C14，并阻止C14向胞外的分泌，使C14蛋白的抗病功能无法发挥。PiAvr2：Saundersetal.(2012)利用co-IP技术发现AVR2在植物中与磷酸酶BSL1互作，同时用酵母双杂技术进一步确认了AVR2与BSL1互作。BSL1蛋白在拟南芥中的同源基因参与油菜素内酯信号转导，从而推测该基因在茄科植物中有类似的作用。进一步分析发现AVR2与BSL1碳末端具有磷酸酶活性的区域互作，仅该区域就足以保证酵母双杂中与AVR2的互作。定位分析发现AVR2蛋白围绕吸器分布，共表达BSL1时发现其与AVR2蛋白共定位于吸器周围。Avr2家族有数个成员，这些成员同样与BSL1互作。同时R2家族的其他成员，如R2-like、Rpi-abpt和Rpi-blb3也与BSL1互作，这25 些成员的抗病功能均特异依赖BSL1，如果BSL1沉默，则这些基因的抗病能力均将失去。AVR2激活R2介导抗病性的原因是AVR2会促进BSL1与R2的互作，从而激活防卫反应通路。但是Avr2家族毒性等位基因Avr2-like虽然与BSL1互作，却不促进BSL1与R2的互作，从而成功的逃避了R2抗病基因家族的识别。Pi03192：McLellanetal.(2013)的研究发现，Pi03192在侵染寄主马铃薯和番茄前3天特异累积，且在本氏烟叶片瞬时表达Pi03192可增强烟草对致病疫霉菌的感病性，表明Pi03192有毒性作用。随后，McLellanetal.(2013)通过筛选马铃薯侵染材料cDNA库找到与Pi03192互作的候选蛋白16个，序列分析发现其中13个候选编码同一个膜相连NAC转录因子的C-terminal，其余3个编码另一个的NAC转录因子的C-terminal；序列比对和PCR确认该基因在马铃薯、番茄和矮牵牛花中均存在，编码N-terminal带有NAM（NACDNAbinding）结构域、C-terminal带有TM（transmembrane）结构域的蛋白。马铃薯中的这两个基因命名为StNTP1和StNTP2，定位分析发现两者和Pi03192均定位在内质网膜上，双分子荧光互补发现它们在内质网上互作。本氏烟中的NbNTP1和NbNTP2沉默后增强了烟草叶片对致病疫霉菌的感病性，说明两个基因确实参与抗病过程。膜绑定的NAC转录因子（Membrane-boundNACtranscriptionfactors,NAC-MTFs）常在生物和非生物胁迫下诱导TM结构域切割，从ER上脱落并重定位到细胞核，发挥转录因子作用。因此，McLellanetal.(2013)用培养过致病疫霉菌的培养基滤液（culturefiltrate，其中含有大量可激活植物防卫反应的病原分子）处理本氏烟叶片，发现NbNTP1和NbNTP2定位由ER转移到细胞核，而Pi03192与NbNTP1和NbNTP2互作后，由ER到细胞核的重定位被阻止。PexRD2：Kingetal.(2014)研究发现，在本氏烟叶片瞬时表达PexRD2可促进致病疫霉菌的寄生，说明致病疫霉菌RXLR效应因子PexRD2发挥毒性作用，增强本氏烟的感病性。Kingetal.(2014)通过酵母双杂成功筛选到3个与PexRD2互作的片段，测序发现3个片段均为MAPKKKε基因，该基因是一个全长1401个氨基酸，分子量154kD的蛋白，其N-terminal有激酶结构域。该基因在本氏烟中有两个同源基因，分别为Nb-MAPKKKε1和Nb-MAPKKKε2，与马铃薯St-MAPKKKε高度同源，尤其是N-terminal的激酶结构域。通过酵母双杂进一步确认激酶结构域是St-MAPKKKε与PexRD2互作所必需的，且仅激酶结构域就足以与PexRD2进行互作。PexRD2基因家族有18个成员，但其它成员均不与St-MAPKKKε互作。定位分析发现PexRD2与St-MAPKKKε共定位于细胞质膜上，并在细胞质膜上发生互作。Leu109Asp和Leu112Asp氨基酸突变研究发现，这两个氨基酸位点对PexRD2功能发挥非常重要，导致PexRD2无法低聚体化，破坏PexRD2与St-MAPKKKε的互作，突变的PexRD2也失去了毒性功能，不再促进致病疫霉菌在本氏烟上的生长。沉默研究发现，Nb-MAPKKKε沉默会导致本氏烟更感致病疫霉菌，而该基因在本氏烟的瞬时表达会导致细胞坏死，但坏死会被PexRD2所抑制。26 Pi04089：前人研究发现致病疫霉菌RXLR效应基因PITG_04089在侵染马铃薯叶片2天的多个菌株中上调表达(Haasetal.2009;Cookeetal.2012)，在此基础上Wangetal.(2015)进行了更多侵染时间点的定量PCR分析，结果发现该基因在88069菌株侵染感病马铃薯24小时和48小时上调表达，72小时恢复正常表达水平。随后Wangetal.(2015)在本氏烟叶片瞬时表达Pi04089后发现其可促进致病疫霉菌的侵染，说明该基因对病原毒性有贡献。通过酵母双杂，Wangetal.(2015)在马铃薯侵染材料cDNA库中筛选到一个与Pi04089互作的蛋白，由转录本PGSC0003DMT400066837编码，序列分析发现该基因是一类具有KH特征的RNA绑定蛋白（RNA-bindingprotein），命名为StKRBP1，其全长与Pi04089蛋白特异互作。定位分析发现两者共定位于细胞核中，双分子荧光互补表明两者在核中互作。在本氏烟中过表达StKRBP1可促进致病疫霉菌的侵染，说明其为感病基因，而Pi04089与StKRBP1特异互作并使其更加稳定，导致含量累积。不与Pi04089互作StKRBP1突变体失去了促进致病疫霉菌侵染的能力，进一步说明了其促进感病的作用。Pi04314：该RXLR效应基因在活体侵染阶段特异诱导表达，且Boevinketal.(2016)在本氏烟叶片瞬时表达Pi04314后，增强了寄主对致病疫霉菌的感病性，说明该RXLR效应基因对病原菌有毒性贡献。定位分析发现Pi04314定位于细胞核的核仁中。通过酵母双杂试验筛选到18个与Pi04314互作的阳性克隆，测序发现其中三个为PP1c（proteinphosphatase1catalytic）蛋白家族的亚型体（isoforms），分别命名为StPP1c-1、StPP1c-2和StPP1c-3。但是，分析发现PP1c的表达水平在致病疫霉菌侵染的前两天没有显著变化，似乎并不响应免疫反应。为了进一步确认互作，利用PP1c的全长序列和Pi04314再次进行酵母双杂分析，发现确实互作；同时，免疫共沉降试验（Co-IP，co-immunoprecipitation）确认两者在寄主植物中同样互作。对Pi04314进行序列分析，发现其C-terminal存在R/KVxF基序，是与PP1c进行绑定的一个保守区域，该基序突变可导致两者的互作消失。沉默本氏烟的NbPP1c或过表达失去磷酸酶活性的PP1c-1会降低致病疫霉菌的侵染能力，说明PP1c对感病有贡献，表明其可能为一个感病因子，通过与Pi04314的互作促进晚疫病的发生(Boevinketal.2016)。PexRD54：Dagdasetal.(2016)的研究发现PexRD54与自噬相关蛋白ATG8（autophage-relatedproteins）互作，并增强本氏烟对致病疫霉菌的感病性。进一步研究发现，PexRD54利用C-termimal的AIM（ATG-interactionmotif）与ATG8CL互作，干扰了自噬受体（autophagecargoreceptor）Joka2与ATG8CL的正常互作，从而扰乱通过Joka2正调控的抗病相关过程(Dagdasetal.2016)。Pi02860：Yangetal.(2016)在本氏烟叶片瞬时表达和马铃薯稳定表达效应基因Pi02860增强了寄主对致病疫霉菌的感病性，说明Pi02860对病原有毒性贡献。同时Pi02860可抑制INF1引发的细胞坏死，说明其具有抑制PTI的作用；但不能抑制Cf4/Avr427 引发的细胞坏死，说明其不具有抑制胞外受体激活的细胞坏死的能力。酵母双杂发现Pi02860与马铃薯NRL1（NPH3/RPT2-like1）互作，功能预测发现NRL1是一个Cullin-3相关的E3泛素连接酶（Cullin-3-associatedubiquitinE3ligase）。Co-IP证明Pi02860与NRL1在植物中同样互作。在本氏烟瞬时沉默NRL1后，致病疫霉菌的定植能力下降，而INF1引发细胞坏死的能力增强，表明该基因是一个免疫负调控因子；同时，沉默并不影响AVR3a抑制INF1引发细胞坏死的能力，但是影响Pi02860抑制坏死的能力，表明Pi02860的功能发挥依赖于NRL1(Yangetal.2016)。1.3.3致病疫霉菌RXLR效应因子基因组学研究卵菌病原可寄生众多经济作物，如马铃薯、番茄、烟草、大豆等，以及重要的园林作物，如橡树、樟树、咖啡树等，造成了巨大的经济损失，也因此吸引了国内外研究者的关注，在卵菌的全基因组测序及基因组学研究方面投入大量人力和财力，并获得了大量的基因组数据和遗传资源。例如，20世纪90年代美国西海岸森林大面积死亡，震惊美国政府，导致其病原橡树疫霉菌全基因组测序工程的迅速推动，仅四年时间其基因组草图就测序和拼接完成(Tyleretal.2006)。此外，多个其它植物病原卵菌的全基因组测序也已完成，其中包括疫霉属（Phytophthora）的致病疫霉菌(Haasetal.2009)、大豆疫霉菌(Tyleretal.2006)、橡树疫霉菌(Tyleretal.2006)、辣椒疫霉菌（P.cpsici）(Lamouretal.2012)、寄生疫霉菌（P.parasitica），霜霉属的寄生霜霉菌（Hyaloperonosporaarabidopsidis）(Baxteretal.2010)，单轴霉属的太阳花霜霉菌（Plasmoparahalstedii）(Sharmaetal.2015)，假霜霉属的黄瓜霜霉菌（Pseudoperonosporacubensis）(Tianetal.2011)，水霉属的寄生水霉菌（Saprolegniaparasitica）(Jiangetal.2013)，白锈属（Albugo）的白锈菌（A.laibachii）(Kemenetal.2011)、拟南芥白锈菌（A.candida）(Linksetal.2011)，腐霉属（Pythium）的终极腐霉菌（Py.ultimum）(Levesqueetal.2010)、瓜果腐霉菌（Py.aphanidermatum）、强雄腐霉菌（Py.arrhenomanes）、畸雌腐霉菌（Py.irregulare）、岩山腐霉菌（Py.iwayamai）、钟器腐霉菌（Py.vexans）。2011年底，疫霉属测序联盟成立（PhytophthoraGenusSequencingConsortium，PGSC），计划完成150个疫霉属基因组和相应300个转录组的测序工作，基因组测序工作将对研究疫霉的种群进化特征、寄主适应性，及保守的致病相关因子与药物作用靶标等提供重要的信息(叶文武2013)。在目前完成测序的所有卵菌中，致病疫霉菌拥有最大且最复杂的基因组，其大小为240Mb，比已测序的大豆疫霉菌（95Mb）和橡树疫霉菌（65Mb）的基因组大若干倍，比已经测序的真菌病原小麦条锈菌（110Mb）和稻瘟菌（38Mb）基因组要大许多，约为酿酒酵母（12Mb）基因组大小的16倍。研究者通过比较基因组学分析发现不同疫霉菌基因组核心同源序列间存在高度保守的共线性(Haasetal.2009;Tyleretal.2006)。同时分析还发现在基因组的某些位点共线性被打乱，这些位点的特征是基因非常稀疏28 （genespareregion，GSR），侧翼通常富含各种重复序列（repeat-richregion），位于这些位点的基因往往编码一些毒性基因（如RXLR和CRN效应因子），与病原的致病力密切相关，在寄主-病原互作中发挥关键作用(Jiangetal.2008;Jiangetal.2006;Haasetal.2009)。为从基因组水平系统分析毒性相关基因，Raffaeleetal.(2010b)在对致病疫霉菌的基因组结构和基因表达特征进行了系统分析的基础上，通过生物信息学预测找到大批分泌型的毒性相关蛋白候选，统称为“可塑分泌蛋白组”（plasticsecretome）。“可塑分泌蛋白组”基因均编码胞外分泌蛋白，表达模式分析发现它们在致病疫霉菌侵染阶段显著诱导上调表达，因此推测可能参与到致病过程中植物-病原互作的各个层面。它们主要分布于致病疫霉菌基因组的基因稀疏区（GSR，genespareregion），同大豆疫霉菌和橡树疫霉菌相比，在后两者基因组中并不存在共线性同源序列，表明“可塑分泌蛋白组”基因为致病疫霉菌通过近期的基因组快速变异获得。更有意思的是，虽然这些分泌基因仅占基因总数的3%左右，却囊括了致病疫霉菌中62%已知的效应因子基因，例如最为典型的RXLR（67.4%）和CRN（55.2%）效应因子（图1-10）。图1-10致病疫霉菌毒性相关分泌组特征。图片引自Raffaeleetal.(2010b)。Figure1-10CharacterizationoftheP.infestanspathogenicityassociatedsecretome.FigureisadaptedfromRaffaeleetal.(2010b).Haasetal.(2009)通过同源比对分析发现RXLR效应蛋白的序列高度分化，在致病疫霉菌的563个RXLR效应基因中，有70个序列存在严重的序列分歧，其中大约一半的基因在大豆疫霉和橡树疫霉基因组中不表现共线性，从后两者的基因组中无法找到共线性同源片段，该现象的出现可能与致病疫霉菌的基因组快速扩张有关，也暗示了RXLR效应基因经历着较快的“基因代谢”（turnover），推测可能是由于病原和寄主之间“军备竞赛”式的协同进化所导致(Qutobetal.2009)。此外，Hassetal.(2009)也利用TribeMCL软件，基于马尔科夫模型，对来自致病疫霉菌、大豆疫霉菌和橡树疫霉菌的RXLR效应因子进行了聚类分析，将所有的基因归为150多个组（group）。其中，成员最多的一个组含有85个致病疫霉菌的、75个橡树疫霉菌的和53个大豆疫霉菌的RXLR29 基因，这些成员的C-terminal存在功能结构域，且以基序串联重复的方式组合。不同group的RXLR基因间的不同往往决定于C-terminal基序的种类及它们间的组合情况，也最终决定了RXLR基因C-terminal功能结构域的功能。与共线性的核心同源序列相比，这些RXLR基因在致病疫霉菌基因组中散乱排列，偏好分布于染色体的基因稀疏区（尤其存在较多和较长的重复序列的区域），这些区域往往也含有大量的转座子元件（transposableelement），可以通过部分同源重组、转座子元件的插入和删除等多种手段加速毒性相关RXLR效应基因的进化速度，导致效应因子的快速产生和消失，使得致病疫霉菌可以快速演化、适应及克服寄主的抗病性。1.3.4致病疫霉菌RXLR效应因子转录组学研究除了基因组测序外，研究者对致病疫霉菌的不同发育阶段、不同培养条件、不同侵染时期均进行了EST测序(Kamounetal.1999;Fabritiusetal.2002;Randalletal.2005;Sierraetal.2010)，并积累了丰富的EST资源。随着大规模EST测序工作的完成，目前已经有Affymetrix公司商业化制备的含15650个致病疫霉菌基因的基因芯片供研究者使用(Judelsonetal.2008)，为解析致病疫霉菌不同发育阶段及病原菌和寄主植物间的互作提供了重要的研究工具。致病疫霉菌转录组学研究开展较早，但早期研究中主要关注其它类型的毒性相关因子，如Elicitor和Elicitor-like等(Kamounetal.1999)。直到2005年，卵菌RXLR效应因子被发现后，科研工作者才开始在转录组学研究中关注RXLR效应因子的表达特征。研究发现这些RXLR效应因子通常在侵染时期特异高表达，暗示了它们广泛参与植物-病原互作过程，可能发挥毒性相关功能(Haasetal.2009;Cookeetal.2012)。例如，Judelsonetal.(2008)用基因芯片分析致病疫霉菌无性发育过程中各个阶段的转录组特征，发现在休止孢萌发到附着胞形成阶段有4个RXLR效应基因特异高表达，该发育阶段与病菌的侵染密切相关，说明这4个基因可能参与植物病原互作过程(Judelsonetal.2008)。2009年致病疫霉菌株T30-4完成测序后，Haasetal.(2009)对基因组中563个RXLR效应因子的转录特征进行了系统的分析，结果发现，相比于菌丝阶段，其中79个RXLR效应因子在侵染阶段显著上调表达，其中包括已克隆的无毒基因Avr3a、Avr4和Avrblb1（图1-11）(Haasetal.2009)。分析还发现有66%的RXLR效应基因在菌丝中是表达的，但仅有极少数（4%）RXLR效应基因在菌丝中高表达。此外，Cooketal.(2012)分析了强毒菌株06_3928A中RXLR效应因子的表达特征，发现其中104个基因在侵染阶段上调表达，该数目远多于T30-4中的79个和菌株NL07434中的68个，且其中20个RXLR效应因子仅在06_3928A菌株中表达。表明RXLR效应基因的表达模式对菌株的毒性存在影响，毒性强的菌株有更多的RXLR效应基因表达(Cookeetal.2012)。随测序技术的发展，EST测序和芯片技术逐渐被RNA-seq所取代。Zuluagaetal.30 (2015)利用该技术对致病疫霉菌侵染番茄48、96和144小时的材料进行了转录组分析，发现在96小时材料中RXLR效应因子转录本总量最高，其中有无毒基因Avr1、Avr2、Avrblb1和Avrblb2。总计在3个时间点的侵染材料中检测到31个表达的RXLR效应基因，与T30-4侵染阶段上调的79个相比，其中有14个仅发现于该项目中测序菌株US-11中(Zuluagaetal.2015)。这些结果暗示RXLR效应基因的转录特征在菌株间存在极大的不同，并与菌株的毒性密切相关。图1-11RXLR基因侵染阶段特异上调表达。图片引自Haasetal.(2009)。Figure1-11Up-regulationofRXLRgenesduringinfectionstage.FigureisadaptedfromHaasetal.(2009).1.3.5致病疫霉菌RXLR效应因子进化研究Jiangetal.(2008)基于生物信息学预测，从大豆疫霉和橡树疫霉基因组中鉴定到700个左右的RXLR效应因子，它们共同构成一个基因超家族。这些基因的序列是高度分化的，但又都是相关的，绝大部分的RXLR效应蛋白有着共同的进化起源(Jiangetal.2008)。超过一半的RXLR效应蛋白的C-terminal含有保守基序，这些保守基序是W、Y和L模块的相互组合。2009年，致病疫霉菌完成测序后，Haasetal.(2009)同样对基因组中的RXLR效应因子进行了进化分析，发现其基因组中的563个RXLR效应因子序列高度演化，但通过序列比对发现同样有大量的效应因子在C-terminal含有W、Y和L三种保守基序，分析发现其中284个含有典型的W和Y基序，有196个含有典型的L基序（图1-12）(Haasetal.2009)。基于大豆疫霉、橡树疫霉和寄生霜霉RXLR效应基因的序列分析发现，导致其快速进化的选择压力靶向效应基因的C-terminal，基因的该部分也因此表现显著的正选择31 压力，这与C-terminal决定RXLR效应因子毒性功能这一事实相符(Winetal.2007)。2012年，Cooketal的研究结果很好的印证了前人关于RXLR效应基因的发现。他们选择了一个毒性较强的欧洲优势单克隆株系06_3928A进行了基因组重测序工作，结果发现06_3928A菌株中的RXLR效应基因经历了快速的变异，与已测序的T30-4基因组相比，06_3928A菌株中有2个RXLR效应因子获得了4-5个额外的拷贝，10个RXLR效应因子已经从基因组删除，例如Avr2基因所在的染色体片段就已经从基因组删除，而拥有相似功能的Avr2-like被发现于基因组中，同时在基因组中检测到6个新的RXLR效应因子(Cookeetal.2012)。且相比于T30-4菌株，06_3928A菌株中RXLR效应基因的dN/dS比值明显要高于基因组中其它基因的水平，进一步表明RXLR效应基因受到更强的正向选择压力。图1-12RXLR效应因子中3大PSI-结构域。图片引自Haasetal.(2009)。Figure1-12ThreemostprevalentPSI-DomainsamongRXLReffectors.FigureisadaptedfromHaasetal.(2009).1.3.6致病疫霉菌RXLR效应因子变异与抗病性丧失研究寄主马铃薯中含有的抗病基因多编码NBS-LRR类抗病蛋白，并通过识别致病疫霉菌分泌的RXLR效应因子激活自身的免疫防卫反应，导致侵染部位细胞的过敏性坏死反应（即HypersensitiveResponse），限制病菌的扩展和定殖，该过程称为效应因子引发的免疫反应（EffectorTriggeredImmunity，ETI）(JonesandDangl2006)。效应基因是病原微生物在与寄主植物互作过程中产生的致病相关基因，其与抗病基因间直接或间接互作产生的“基因对基因”抗性是植物抗病性的重要形式。马铃薯晚疫菌和寄主植物马铃薯之间的互作也遵循这一模式，即“对应于寄主的每一个决定抗病性的基因，病原菌也对应地存在一个决定毒性的基因”(Flor1971)。绝大多数识别病菌无毒效应因子的抗病基因，几乎都编码植物防卫反应信号转导系32 统中的组分(Mchaleetal.2006)，并存在有特征性的保守结构域，如卷曲螺旋（coiled-coil，CC）、亮氨酸拉链(leucinezipper，LZ)、核苷酸结合位点（nucleotide-bindingsite，NBS）、富含亮氨酸重复（leucine-richrepeats，LRR），以及Toll/白细胞介素-1受体（Tollandinterleukin-1receptor，TIR）同源区域等。目前已克隆的马铃薯抗晚疫病基因，几乎均属于CC-NBS-LRR类抗病基因，例如：R3a、Rpi-vnt1.1、Rpi-blb1和Rpi-blb2等都是CC-NBS-LRR类基因；R1基因是属于典型的nonTIR-NBS-LRR类(Ballvoraetal.2002)；Rpi-blb3基因属于LZ-NBS-LRR类(Huangetal.2005)。NBS-LRR类基因在植物中数量庞大，马铃薯中大约有430个(Jupeetal.2012)，此类蛋白广泛定位在细胞膜系统上，但是他们如何在抗病过程中发挥作用还需要进一步研究(Takemotoetal.2012)。致病疫霉菌的无毒基因与抗病基因的互作符合“基因-基因”模式。目前已经克隆的致病疫霉菌无毒基因均为RXLR效应因子(Cookeetal.2012)，多个无毒基因对应的抗病基因也已经被克隆，但是这些抗病基因已经被毒性菌株克服。目前，表现无毒性的10个RXLR效应因子均通过快速变异，产生了毒性类型的等位基因(VleeshouwersandOliver2014)。例如，1845年“爱尔兰大饥馑”时期的致病疫霉菌均含有Avr3aKI(Yoshidaetal.2013)，可被R3a识别，随着R3a抗病品种的使用，可逃避R3a识别的毒性等位基因Avr3aEM完全替换了无毒性的Avr3aKI，成为群体中的优势基因型；R2可以识别Avr2并激活马铃薯的抗病性，随着R2抗病品种的使用，含有Avr2的基因组片段被毒性菌株完全删除，成功逃避了R2的识别，同时，毒性菌株中还发现了Avr2-like的存在，可与Avr2的毒性靶标保持互作，保证功能的正常发挥，但又不会被R2所识别(Gilroyetal.2011)；Avr4的毒性等位基因则通过引入提前中止密码子而导致无毒蛋白翻译失败，R4基因失去互作靶标而失效(vanPoppeletal.2008)；Avr1在毒性菌株中处于沉默状态，同时毒性菌株表达可逃避R1识别的毒性等位基因Avr1-like，导致R1基因失效(Duetal.2015)；Avrblb1在毒性菌株中正常表达但不引发RB基因的抗病性，原因是毒性菌株可表达与Avrblb1同源的ipiO4，可以通过主动与RB的结合阻止其对Avrblb1的识别，导致RB基因失效(Haltermanetal.2010;Chenetal.2012)；Avrblb2的毒性等位基因69位氨基酸变为Phe，成功逃避了Rpi-blb2的识别，导致其失效(Olivaetal.2015)；至于Avr3b、Avrvnt1、AvrSmira1和AvrSmira2也因为不同原因，存在可以成功逃避相应抗病基因识别的毒性等位基因(VleeshouwersandOliver2014)。1.3.7致病疫霉菌RXLR效应因子辅助抗病育种研究目前，马铃薯晚疫病的防治高度依赖化学农药，导致成本升高、环境破坏和抗药菌株等一系列问题，而使用抗病品种是目前防治晚疫病最经济有效和环境友好的策略。过去几十年育种家主要依靠将野生种质资源中分离的抗病基因导入栽培品种来提高其对晚疫病的抗性。但是，经过多年的推广和种植，众多马铃薯抗病基因已经被毒性菌株克33 服，例如来自野生种S.demissum的11个主效抗病基因均因致病疫霉菌的快速变异而被克服。当前，提高马铃薯抗晚疫病持久性的策略有：①寻找和应用广谱性抗病基因，例如RB（Rpi-blb1）基因(Haltermanetal.2010)；②抗病基因叠加（genestacking），使抗病品种带有多个抗病基因(Tanetal.2010)。致病疫霉菌通过效应因子的快速变异克服抗病基因的识别，但在众多的马铃薯材料中仍可能存在识别变异后效应因子的抗病基因。例如，有人利用PVX介导的瞬时表达系统，以Avr3a有毒的EM和无毒的KI两个等位基因为工具，分析了茄科的各种种质资源，成功找到了识别Avr3aEM的抗源材料(Heinetal.2007)。该研究的意义在于使我们认识到毒性变异类型虽然克服了推广品种中的抗病基因，但是有更多的抗源材料，如野生马铃薯品种和近缘茄科物种中，含有可识别变异后毒性效应因子类型的抗病基因；同时，也凸显了基因瞬时表达系统在抗病基因鉴定中的价值，利用效应因子为工具，可快速寻找毒性变异类型对应的抗病基因，对于应对效应基因的变异非常有意义。致病疫霉菌基因组中存在大量RXLR效应因子，可以利用效应基因瞬时表达在茄科材料中寻找对应的抗病基因，实现从抗晚疫病的野生物种中高效鉴定抗病基因和基因的快速克隆(Vleeshouwersetal.2008)。Champouretetal.(2010)利用RXLR效应基因分析抗晚疫病的野生马铃薯基因型，发现其中一个效应基因PexRD11可被100多个基因型的马铃薯识别，引发坏死反应，通过等位基因克隆得到了6个来源于不同野生马铃薯种的抗病基因Rpi-edn1.1、Rpi-snk1.1、Rpi-snk1.2、Rpi-hjt1.1、Rpi-hjt1.2和Rpi-hjt1.3；其次，可以用效应基因可以对现有的马铃薯主栽品种进行抗病基因组成分析。Rietmanetal.(2012)发现，田间表现持久抗病性的马铃薯品种SarpoMira的抗性是由四个主效抗病基因R3a、R3b、R4和Rpi-Smira1与一个微效抗病基因Rpi-Smira2控制。新鉴定的抗病基因Rpi-Smira1和Rpi-Smira2分别识别效应基因AvrSmira1和AvrSmira2；再次，利用效应基因可以指导品种的合理布局。致病疫霉菌含有的效应基因类型直接决定其在马铃薯植株上的致病表型，实时定量监测致病疫霉菌群体效应基因序列与表达模式，可快速监测病菌致病型的变异情况，针对主栽马铃薯品种中是否含有与效应基因对应的抗病基因，揭示病害流行趋势，防控病害发生；最后，利用效应基因可方便的追踪与效应基因相对应的抗病基因在育种中的传递过程，不管是传统育种还是利用分子手段进行基因叠加获得的材料，只需要利用农杆菌介导的瞬时表达系统在叶片表达效应基因，通过有无坏死即可判断抗病基因的存在性(顾彪等2013)。1.4本研究的目的和意义本实验室前期研究发现，西北各马铃薯主产省份（甘肃、宁夏、青海、陕西）致病疫霉菌的群体结构已经发生的明显的变化，群体结构的变化往往导致大批品种丧失抗病性，因此需要重新鉴定马铃薯品种对新群体的抗病性水平；同时抗病品种中的抗病基因34 遗传背景不清楚是困扰抗性育种的一大难题，导致抗病育种中亲本品种的合理选择困难重重，无法有效的在杂交后代中追踪抗病基因的存在和传递情况；目前众多的抗病品种已经或正在丧失对致病疫霉菌毒性菌株的抗病性，为了更好的应对抗性丧失问题，我们期望从致病疫霉菌中筛选一批序列相对保守、变异速度相对慢、功能相对重要的RXLR效应基因候选，对其进行初步的功能分析，根据功能分析结果，挑选部分候选，在众多茄科材料中寻找对应抗病基因，并引入马铃薯栽培种，以期达到马铃薯品种抗病性更加持久的目的。为解决以上问题，我们进行了以下几个方面的研究：（1）评估了众多马铃薯主栽品种对当前致病疫霉菌群体的抗病性水平；（2）对多个马铃薯主栽品种的抗病基因组成进行了分析，从抗病基因水平理解品种的抗病性，为抗病育种提供便利；（3）挑选遗传背景分化极大的多个菌株，准备早期侵染材料，利用RNA-seq完成了早期侵染阶段致病疫霉菌的RXLR效应基因的表达特征分析，并根据表达特征和序列进化分析从中筛选到多个可用于相应抗病基因筛选工作的候选RXLR效应基因，这些RXLR效应基因候选的特征为：在侵染早期阶段高度上调，且在所有菌株中均高表达，其序列变异水平在群体间变异相对较低，同时具有一定的毒性功能。我们的工作将为抗病育种工作提供便利，同时为晚疫病防治提供新的思路，这些候选的保守效应基因一方面可以用于寻找相应抗病基因和引入抗病品种，以期获得抗病性潜力更加持久的品种，另一方面通过对这些效应因子的监测，可及时判断这些效应基因对应的抗病基因是否被克服，含有对应抗病基因的马铃薯品种是否值得推广。35 第二章西北地区马铃薯主栽品种抗晚疫病性评价马铃薯是目前世界上最重要的非禾本科农作物(Jupeetal.2012)，也是我国四大粮食作物之一，在西北干旱半干旱地区地位尤为重要(Janskyetal.2009)。但是，马铃薯的安全生产受到众多病害和虫害的严重威胁，其中危害最为严重的是由致病疫霉菌引起的马铃薯晚疫病，该病害每年给全球马铃薯产业带来的损失高达百亿美元(Fry2008;Pérezetal.2014)，在我国西北马铃薯种植区频繁流行，造成马铃薯生产重大损失。种植抗病品种是防治晚疫病最经济有效和环境友好的策略(Parketal.2005)。在过去的几十年间，育种家在马铃薯抗病育种方面付出了极大的努力，并成功培育了大批抗病能力优秀的品种(Khuttietal.2015;Nowickietal.2011)。但是，致病疫霉菌具有独特的生活史，分为有性和无性两大阶段，通过有性生殖来快速变异及土壤中越冬，通过无性生殖在短时间内迅速扩散和爆发流行；同时，致病疫霉菌基因组结构特殊，可迅速变异并摒弃激活寄主抗性的无毒基因。这些原因导致致病疫霉菌对抗病品种具有极高的适应性，能快速演化并克服品种的抗病基因，造成晚疫病的再次爆发和流行，致病疫霉菌也因此被称为“抗病基因毁灭者”(GrünwaldandFlier2005;Fry2008)。近年来调查和研究发现，遗传更加复杂、毒性水平更高的“新”致病疫霉菌群体出现在中国西北马铃薯主产区，“新”群体的出现使得马铃薯的安全生产受到威胁。为合理使用和布局抗病品种，亟需重新鉴定国内马铃薯主栽品种对致病疫霉菌新群体的抗病性水平，判断是否有足够的抗病品种应对新群体的挑战(Tianetal.2015a)。目前，国内部分马铃薯主栽品种和新育品系虽对晚疫病表现不同程度抗性，但这些品种含有哪些抗病基因尚不清楚。同时，由于抗性遗传背景不清楚，在品种中所含抗病基因未知的情况下，使得我们无法从基因水平来判断品种抗病性是否丧失，以及品种抗性是否持久等问题。此外，利用这些品种进行抗病育种工作时多靠经验和田间抗病性鉴定，不利于育种过程中抗病基因的追踪和聚合。近年来，10个表现无毒性的RXLR效应基因被克隆（Avr1、Avr2、Avr3a、Avr3b、Avr4、Avrblb1、Avrblb2、Avrvnt1、AvrSmira1和AvrSmira2），并且通过测试发现这些无毒基因可以作为工具，用来检测对应抗病基因在马铃薯中的存在性，利用农杆菌介导瞬时表达后，这些无毒基因会引发含有相应抗病基因马铃薯品种的过敏性坏死反应（HR，hypersensitiveresponse），可快速、有效地分析目前马铃薯主栽品种中的抗病基因组成情况。解析马铃薯品种抗病性遗传背景，可更好的指导抗病品种合理布局，提高抗病育种效率，在基因聚合中辅助抗病育种工作(VleeshouwersandOliver2014)。致病疫霉菌群体结构变化，对抗病品种具有毒性的菌株上升为优势小种，通常导致大批马铃薯品种丧失对晚疫病的抗病性，为评估马铃薯主栽品种对当前致病疫霉菌群体的抗病表现，本研究从2012年到2014年，对101个（次）马铃薯主栽品种和新育品36 种（系）进行了田间抗病性评价；同时利用农杆菌在马铃薯叶片瞬时表达10个RXLR无毒基因，分析主栽马铃薯品种中抗病基因的数量和组成情况；最后关联分析了马铃薯品种抗病基因数目和田间抗病表现之间的关系。2.1试验材料、试剂与仪器2.1.1试验材料2.1.1.1植物材料田间抗病性评估工作从2012年开始，到2014年共进行了3年的抗病性鉴定试验。2012年鉴定了25个马铃薯品种（系）的大田抗晚疫病水平；2013年鉴定41个品种（系）的大田抗晚疫病水平；2014年鉴定了34个品种（系）的大田晚疫病抗病性。包括甘肃农科院马铃薯研究所提供7个品种，西北农林科技大学提供15个品种（系），青海农林科学院提供6个品种（系），天水农科所提供6个品种（系）。2.1.1.2菌种、质粒试验所用农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株为AGL1；10个已知无毒基因，均构建到pK7WG2载体上，2个已克隆抗病基因R3a和Rpi-vnt1，均构建到pBINPLUS载体上（表2-1）。表2-1无毒基因和抗病基因的构建及所用农杆菌株菌株及相应筛选抗生素Table2-1Constructsofavirulenceandresistancegenes,A.tumefaciensstrains,andselectionantibioticsConstrcutVectorStrainExtraplasmidAvr1pK7WG2(spectinomycin)AGL1(carbenicilin)pVig(chloramphenicol)Avr2pK7WG2(spectinomycin)AGL1(carbenicilin)pVig(chloramphenicol)Avr3apK7WG2(spectinomycin)AGL1(carbenicilin)pVig(chloramphenicol)Avr3bpK7WG2(spectinomycin)AGL1(carbenicilin)pVig(chloramphenicol)Avr4pK7WG2(spectinomycin)AGL1(carbenicilin)pVig(chloramphenicol)Avrblb1pK7WG2(spectinomycin)AGL1(carbenicilin)pVig(chloramphenicol)Avrblb2pK7WG2(spectinomycin)AGL1(carbenicilin)pVig(chloramphenicol)Avrvnt1pK7WG2(spectinomycin)AGL1(carbenicilin)pVig(chloramphenicol)AvrSmira1pK7WG2(spectinomycin)AGL1(carbenicilin)pVig(chloramphenicol)AvrSmira2pK7WG2(spectinomycin)AGL1(carbenicilin)pVig(chloramphenicol)pK7WG2emptypK7WG2(spectinomycin)AGL1(carbenicilin)pVig(chloramphenicol)R3apBINPLUS(kanamycin)AGL1(carbenicilin)Rpi-vnt1pBINPLUS(kanamycin)AGL1(carbenicilin)37 2.1.2试剂2.1.2.1酶、抗生素和化学试剂试验中所用的试剂包括各种限制性内切酶（Promega）、ExTaqDNA聚合酶（TaKaRa）、T4DNA连接酶（Thermal）、质粒提取试剂盒（Qiagen）、PCR产物纯化试剂盒（Promega）、DNAmarker（TIANGEN）等。所用酶和试剂的反应条件均按照相应说明书进行。常规化学试剂为分析纯试剂。试验中所用的抗生素包括氨苄青霉素（Ampicillin）100μg/mL、羧苄青霉素（Carbenicilin）50μg/mL、卡那霉素（Kanamycin）50μg/mL、壮观霉素（Spectinomycin）30μg/mL、氯霉素（Chloramphenicol）30μg/mL、利福平（Rifampicin）30μg/mL。2.1.2.2常用试剂和培养基配制主要化学试剂、缓冲液和培养基的配制参照分子克隆实验指南（第三版）。相关培养基配制方法如下：（1）LB培养基的配制液体LB培养基（pH调至7.0，用NaOH或HCl调节pH值）Tryptone10g/LYeastextract5g/LNaCl10g/L固体LB培养基（用NaOH或HCl调节pH值至7.0，后加琼脂）Tryptone10g/LYeastextract5g/LNaCl10g/LAgar10g/L（2）营养液的配制Ca(NO3)247.23g/LKNO350.55g/LKH2PO434.02g/LMgSO4•7H2O98.6g/L（3）乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）100mMAS19.62g/L（溶剂为二甲基甲酰胺，可将0.1962g溶于10ml溶剂中）（4）MES（10mMMgCl2和100μMAS）重悬液的配制2.033gMgCl2•6H2O溶于1L水，调pH值至5.6。用时按1000：1向MgCl2溶液添加100mM/L的acetosyringone，配成MES重悬液。38 2.1.3仪器试验中所用到的仪器包括超净工作台、移液器、PCR仪、琼脂糖电泳系统、水浴锅、金属浴溶胶器、细胞电转仪、低温高速离心机、台式常温离心机、pH计、紫外分光光度计、Nanodrop分光光度计（ND-1000）、涡旋混合仪、震荡培养箱、生化培养箱、高压灭菌锅、Milli-Q型超纯水仪、制冰机等。2.2试验方法2.2.1马铃薯田间抗病性鉴定马铃薯主栽品种（系）田间抗病性鉴定和评估在位于西北马铃薯主产区的甘肃省天水市中梁乡试验站进行（34°36'04.4"N105°38'22.2"E）（图2-1）。选择该地区进行田间抗病性鉴定的原因是此地位于山区和丘陵地带，海拔高度超过1600m，降水主要集中在6-10月份，平均年降水量在550mm以上，这导致该地的夏季气候凉爽，降水集中，日均湿度极高，且降水集中的时期正是马铃薯薯块形成和膨大期，非常适合马铃薯致病疫霉菌的发生和流行（图2-2）。图2-1田间抗病性鉴定试验。（A）天水市中梁试验站地理位置和（B）3年的田间试验设置。Figure2-1Resistanceevaluationinthefield.(A)ThegeographicallocationofZhongliangexprementstationofTianshuiand(B)thedesignoffieldexprementsduring3years.39 图2-22012、2013和2014年天水中梁试验站天气情况。图中红线和蓝线分布代表当日最高和最低气温（℃），柱子高度代表当日降水量（cm）。Figure2-2TheweatherconditionofZhongliangexperimentstationofTianshuiin2012,2013and2014.Theredandbluelinesrepresentthehighestandlowesttemperatureoftheday,respectively(℃).Histogramrepresentstheprecipitationoftheday(cm).2.2.1.1田间试验所有参试抗病性鉴定的品种小区随机排列，每个品种小区重复3次，每个小区面积20㎡，播种5行，行长6.67m，行距60cm，株距33cm。田间调查方法为每小区对角线五点取样统计，每点3株，调查全部叶片，记录病斑面积占叶片面积的百分百比（%）。2012年4月21日播种，9月15日完成马铃薯的收获，生育期总计147天，自7月11日田间出现晚疫病开始记录，每隔7天调查马铃薯晚疫病发生情况。以发病叶片面积百分比（即病斑面积占总叶面积比率）表示病害发生情况，初步评估不同马铃薯品种对晚疫病的抗性。本生长季共调查10次。40 2013年中薯系列12个品种5月20日播种，其他品种4月26日播种。9月25日收获，中薯系列生育期128天，其余品种生育期152天。从7月21日田间出现晚疫病开始记录，每隔7天调查马铃薯晚疫病发生情况。以发病叶片面积百分比（即病斑面积占总叶面积比率）表示病害发生情况，初步评估不同马铃薯品种对晚疫病的抗性。本年共记录数据7次。2014年4月19日马铃薯播种，10月4日完成马铃薯的收获，生育期总计168天。从7月28日田间出现晚疫病开始记录，每隔7天调查马铃薯晚疫病发生情况。以发病叶片面积百分比（即病斑面积占总叶面积比率）表示病害发生情况，初步评估不同马铃薯品种对晚疫病的抗性。2014年共记录数据7次。2.2.1.2田间数据统计和分析通过小区对角线五点取样，获得每小区五个病斑面积百分比数据，并计算其平均值，作为试验品种在该小区的病斑面积百分比。随后，对试验品种在三个重复小区获得的病斑面积百分比数据取平均值，将平均值作为该品种该次调查的病斑面积百分比。根据田间统计数据，计算所有品种的病斑面积百分比，并将田间多次调查的结果绘制抗病性鉴定品种的病害发展曲线（diseaseprocesscurve），计算品种的病害发展曲线下面积（areaunderdiseaseprocesscurve，AUDPC）。利用R语言中的软件包pheatmap，根据各品种的发病统计数据绘制heatmap，具体方法见pheatmap软件包说明文件。2.2.2马铃薯抗病基因分析利用农杆菌介导的瞬时表达系统，通过10个已克隆的无毒基因在马铃薯叶片进行瞬时表达分析20主栽品种的抗病基因构成。在阳性对照和阴性对照反应正常时，统计试验组的反应，并根据统计结果判断品种是否含有无毒基因相对应的抗病基因。流程如图所示（图2-3）。图2-3瞬时表达效应基因分析马铃薯抗病基因流程图Figure2-3TheflowchatofRgenesanalysisbyeffectortransientexpressioninpotatocultivars41 2.2.2.1马铃薯温室培养种薯埋入湿润的沙土中做催芽处理，待薯块发芽后将其切块，若种薯芽发达，可直接切块，保证每块种薯带有至少一个芽，晾24h左右待切面干燥后种植。将基质与蛭石2:1混合，高压蒸汽灭菌后倒入花盆，并混入N、P、K肥，随后埋入薯块，使芽向上，根据土壤干燥程度适时浇水，待马铃薯生长至约4-5周时用于试验。2.2.2.2马铃薯叶片无毒基因瞬时表达（1）农杆菌转化。电击法将质粒导入农杆菌感受态，复苏0.5h后涂于LB平板，28℃培养2天。挑取单克隆于液体LB培养基中，摇床培养2天。菌液与甘油以4：1混合，在菌液保存管做好标记后液氮速冻，于-70℃超低温冰箱长期保存。（2）农杆菌划线培养。接种环蘸取一环菌液，平板划线，当单克隆长至合适大小和密度时取出后置于4℃冰箱备用。（3）农杆菌液体培养。挑取平板单克隆于液体培养基中摇床培养。（4）农杆菌注射菌液制备。4000rpm离心5min收集农杆菌，于MES重悬液中重悬，测OD并调到相同浓度。（5）农杆菌菌液注射。配置好的菌液室温下放置1-2h，选择合适的叶片并注射，套袋保湿，4-7天记录结果。2.2.2.3马铃薯叶片表达结果统计从第4天开始记录结果，到第7天结束。记录阳性对照、阴性对照和试验组的坏死情况。阳性对照和阴性对照反应正常时，对试验组统计结果进行分析，根据坏死和无坏死情况判断R基因是否存在。2.3结果与分析2.3.1抗病性评估结果在3年的田间马铃薯品种抗病性鉴定中，以高抗品种庄薯3号为抗病对照。根据各马铃薯品种的田间发病数据，我们利用R软件包pheatmap绘制热图，并基于各品种田间发病情况，我们将其分为4类：高抗品种（resistant，R）、中抗品种（moderatelyresistant，MR）、中感品种（moderatelysusceptible，MS）和高感品种（susceptible，S）（图2-4）。2012年对25个马铃薯品种田间抗病性鉴定的结果发现：25个品种中，仅5（20%）个为高抗品种（R），它们是庄薯3号、天薯11号、陇薯7号、L0527-4和L0527-7；此外，6个为中抗品种（MR），7个为中感品种（MS），还有7个为高感品种（S）。2013年对41个马铃薯品种田间抗病性鉴定结果发现：41个品种中，有12（29.2%）个品种表现高抗（R），这些品种是庄薯3号、天薯10号、陇薯7号、同薯20号、农天1号、D511、D573、天05-7-5、天06-3-4、L0527-4、L0527-7、L9901-10；此外，1142 个为中抗品种（MR），5个为中感品种（MS），14个为高感品种（S）。2014年对34个马铃薯品种田间抗病性鉴定结果发现：34个品种中，有14（41.2%）个为高抗品种（R），它们是庄薯3号、天薯10号、天薯11号、农天1号、青薯9号、陇薯系列品种（陇薯7号、陇薯10号、陇薯11号、陇薯12号、陇薯13号）和云薯系列品种（云薯103、云薯401、云薯505和云薯807）；6个为中抗品种（MR），9个为中感品种（MS），5个为高感品种（S）。总之，通过对101个品种3年的田间晚疫病抗性鉴定，我们发现其中19个马铃薯在田间表现高抗（R），其中的代表品种有L0527-7、陇薯7号、青薯9号、天薯11号和来自云南省的部分马铃薯品种。图2-4马铃薯品种的田间抗病性鉴定结果。（A）2012，（B）2013，（C）2014。热图小方格中数字代表严重度平均值。R：高抗品种；MR：中抗品种；IS：中感品种；S：高感品种。Figure2-4Fieldresistantceevaluationofmainpotatocultivarstolateblightdisease.(A)2012,(B)2013,and(C)2014.Datainheatmapcellsrepresenttheaveragevalueofthreefiledevaluationresultsofpotatolateblightdiseaseseverityonparticularcultivarinspecificyear.R:highresistantcultivar;MR:moderatelyresistantcultivar;MS:moderatelysusceptiblecultivar;S:highsusceptiblecultivar.2.3.2瞬时表达系统稳定性测试首先，我们利用含有已知抗病基因R1和R3a的马铃薯鉴别寄主MaR1和MaR3进行测试，在其叶片利用农杆菌介导的瞬时表达系统表达无毒基因Avr3a，结果表明无毒蛋白AVR3a在MaR1上引发了3次过敏性坏死反应（HR，hypersensitiveresponse）和22次无反应（NR，noresponse），AVR3a在MaR3上引发了25次HR和4次NR。这些结果表明农杆菌介导的无毒基因瞬时表达系统存在一定的背景反应，在两个品种上均会诱导HR和NR的出现；虽然如此，该系统可以用来分析品种中相应抗病基因的存在情43 况，在MaR3上HR的出现次数明显多于NR，这与该品种含有对应的抗病基因R3a相符，在MaR1上HR的次数明显少于NR，也与该品种不含有对应的抗病基因R1相符（图2-5B、C）。图2-5马铃薯叶片无毒基因瞬时表达体系测试。（A）注射试验的示范照片。瞬时表达系统在马铃薯鉴别寄主（B）MaR1和（C）MaR3上的测试试验。瞬时表达系统在主栽马铃薯品种（D）中薯18和（E）青薯9号上的测试，共注射R3a和Avr3a，以及共注射Rpi-vnt1和Avrnvt1作为阳性对照，注射空载体pK7WG2作为阴性对照。图中数字比例表示坏死反应的出现次数（HypersensitiveResponse，HR）：无反应的出现次数（NoResponse，NR）。Figure2-5Transientexpressionassayonpotatoleaves.(A)Representfigureofinfiltration.Testofthetransientexpressionassaysonpotatodifferentialhosts(B)MaR1and(C)MaR3.Testofthetransientexpressionassaysonmainpotatocultivars(D)Zhongshu18and(E)Qingshu9.Co-infiltrationofR3aplusAvr3aandRpi-vnt1plusAvrnvt1wereusedaspositivecontrols.EmptyvectorpK7WG2wasusedasnegativecontrol.TheratiosshowthenumbersofinfiltratedsitesdevelopedaHypersensitiveResponsecomparingtoNoResponse(HR:NR).44 随后，我们用中薯18号和青薯9号两个主栽马铃薯品种，对农杆菌介导的无毒基因瞬时表达体系进行测试，结果表明阳性Avr3a+R3a在中薯18号上共注射后诱导产生了18次HR，0次NR，阴性对照空载体pK7WG2诱导产生了0次NR，31次HR；在青薯9号上，阳性对照Avrvnt1+Rpivnt1诱导产生了15次HR，3次NR，阴性对照空载体pK7WG2诱导产生了2次HR，10次NR。说明阳性对照和阴性对照在两个马铃薯品种上均可诱导产生正常的反应，瞬时表达系统可用；但是在青薯9号上出现低频率不符合预期的HR和NR，说明该品种对瞬时表达系统存在一定的背景反应，但比例低，系统可用（图2-5D、E）。同时利用无毒基因Avr1在中薯18上测试发现，该无毒基因诱导出现5次HR，37次NR，表明该品种不含有相应的抗病基因R1，无毒基因不被识别而无法引发过敏性坏死反应；利用无毒基AvrSmira1在青薯9号上测试发现，该无毒基因诱导出现了39次HR，13次NR，表明该品种中含有相应的抗病基因Rpi-Smira1，导致无毒基因被识别而引发叶片注射位置的过敏性坏死反应（图2-5D、E）。2.3.3抗病基因组成分析通过表达测试，我们成功构建了无毒基因在马铃薯叶片的瞬时表达系统，随后我们基于田间抗性鉴定结果，挑选其中20个马铃薯品种进行了抗病基因组成分析，结果表明（表2-2）：（1）不同品种中含有的抗病基因数目不同。品种L0528-3中含有所有的10个抗病基因；陇薯8号含有8个抗病基因；庄薯3号和中薯19号含有7个抗病基因；天薯11号、中薯20号和青薯9号含有6个抗病基因；2-2、AKC、中薯11号、中薯18号和中薯901含有5个抗病基因；同薯28、中薯10号、陇薯8号、农天1号、青薯2号、中薯20号和中薯7号含有4个抗病基因；中薯21号含有3个抗病基因；中薯3号不含10个无毒基因对应的抗病基因。总体而言，除品种中薯3号中未检测到已知的10个抗病基因外，其它品种含有3到10个抗病基因（表2-2）。（2）各品种的抗病基因组成不相同。近年来推广的马铃薯品种，例如青薯9号和同薯28号，含有新近报道的部分抗病基因（如Rpi-blb2、Rpi-Smira1、Rpi-Smira2和Rpi-vnt1）；而早期推广的一些品种，例如ACK和青薯2号，含有早期从野生马铃薯品种Solanumdemissum中引入到栽培品种的抗病基因（如R1、R2、R3a、R3b和R4）；而那些在田间抗病性鉴定中表现高抗的品种，例如庄薯3号、L0528-3和陇薯7号，通常既含有新报道的抗病基因，也含有早期来源于Solanumdemissum的抗病基因。这些结果表明：主栽品种中抗病基因在发生替换，且高抗品种含有更多的抗病基因（表2-2）。（3）各抗病基因在品种中的分布频率不同。在测试的品种中，抗病基因R4的出现频率最高，在15个品种中检测其存在；其次是Rpi-Smira1、Rpi-Smira2和Rpi-vnt1这345 个抗病基因，检测其存在于14个品种中；抗病基因Rpi-blb2存在于12个品种中；抗病基因R3a和R3b存在于9个品种中；抗病基因Rpi-blb1和R2存在于5个品种中；抗病基因R1被检测存在于4个品种中；总体看来源于野生马铃薯抗源材料Solanumdemissum的抗病基因R1、R2、R3a、R3b和R4，除R4外，这些最早应用于马铃薯抗性育种中的抗病基因的比例正在下降；而其它后期才应用于抗性育种中的抗病基因（如Rpi-blb2、Rpi-Smira1、Rpi-Smira2和Rpi-vnt1）的比例在上升中；同时发现早期培育的抗病品种通常含有早期应用的抗病基因，而新培育品种多含有后期应用的抗病基因（表2-2）。2.3.4抗病基因数量与抗病性水平间关系图2-6AUDPC与抗病基因数目间的关系。AUDPC为病害发展曲线下面积。Figure2-6CorrelationbetweenAUDPCandresistancegenenumber.AUDPC,areaunderdiseaseprogresscurve.R=0.70**,p<0.05.根据田间抗性鉴定过程中记录的数据，我们计算了各马铃薯品种的病害发展曲线下面积（Areaunderdiseaseprogresscurve，AUPDC）；以无毒基因为工具，借助农杆菌介导的瞬时表达系统，我们解析了20个马铃薯品种中含有的抗病基因。随后，我们对马铃薯品种的AUPDC数据和抗病基因数目间的关系进行了分析，结果发现马铃薯品种的AUPDC与抗病基因数目显著负相关（R=0.70**，p<0.05），含有抗病基因越多的品种AUDPC值越小（图2-6）。该分析结果表明品种的抗病性水平会随抗病基因数目的增加而提高。46 表2-2马铃薯主栽品种抗病基因组成分析Table2-2CompositionofknownRgenesinmainpotatocultivarsControl(HR:NRa)ResistancegeneCultivarPositivebNegativecR1R2R3aR3bR4Rpi-blb1Rpi-blb2Rpi-Smira1Rpi-Smira2Rpi-vnt1Zhuangshu310:21:9Yd14:0Y16:0Ne1:20*fY20:0N0:9Y11:0Y8:0Y8:0Y8:0L0528-312:00:23Y36:5Y14:0Y12:0Y8:1Y7:0Y24:8Y30:1Y30:7Y31:5Y31:0Longshu736:70:26Y28:5N1:12Y22:8Y13:0Y34:0N6:44Y38:7Y20:4Y48:6Y27:3Zhongshu2113:23:18N0:8N0:10N0:15*Y15:0N0:8Y12:0Y15:1*N1:14Tongshu288:10:9N0:15N1:14N0:17*Y13:0N0:10N1:13Y9:1Y13:1Y11:1Zhongshu1024:32:15N0:15N0:8N0:10*Y15:0N0:10N1:5Y10:0Y10:0Y15:0Qingshu915:32:10N4:15N1:12N5:30*Y20:0Y25:7Y22:10Y39:13Y30:10Y41:6Longshu89:25:19N0:12N0:20N0:18*Y21:0N0:11Y11:0N1:12Y16:5Y11:0Tianshu115:03:7N4:14N2:12Y25:6N5:18Y25:0N10:30Y22:6Y14:3Y27:9Y14:4Zhongshu1818:00:31N5:37N10:33N3:30N6:23Y21:0N2:25Y23:1Y25:1Y15:5Y33:3Nongtian19:31:10N0:10N0:18**Y20:0N0:13Y9:2Y11:1N3:13Y9:0Zhongshu90115:20:9N0:21N3:12Y15:5Y10:0*N0:11Y15:4Y12:3N1:9Y10:0Zhongshu2015:62:33N0:18N6:38N13:29Y29:7Y24:5N2:24Y31:1Y24:0N8:32Y21:3Zhongshu1111:21:33N0:26N3:32N2:22Y29:0N0:31N5:21Y29:1Y21:1Y32:2Y23:2Zhongshu317:32:9N0:15N0:10N0:8*N0:10N0:15N1:11N1:10N2:10N0:10Zhongshu1924:32:15NSg10:11Y27:1Y19:1Y8:2Y12:0Y11:0N1:7Y6:0Y12:0N0:15AKC9:21:14N1:12Y8:1Y17:2Y11:2Y12:3N1:16N1:8N2:9Y17:2N4:212-211:13:13N2:11N3:17Y18:3Y9:2N1:7Y15:2N2:13N3:10Y12:1Y11:2Qingshu217:22:12N3:15Y13:2Y9:1*Y12:1N2:17N3:17N2:14Y11:1N2:13Zhongshu79:05:22N1:15N3:20Y12:4Y14:3Y15:0Y11:5N3:40*N3:13N2:14注：（HR:NR（过敏性坏死反应次数:无反应次数））：注射点出现坏死和无坏死的次数；Y：是，品种中有相应抗病基因；N：否，品种中无相应抗病基因；*：未确定。Note:HR:NR:timesofappearinghypersensitiveresponse:timesofappearingnoresponse,thetotalamountofinfiltrationsiteswhereappearsHRorNR;Y:yes,resistancegeneisinferredexistenceinparticularcultivar;N:no,resistancegeneisinferrednoexistenceinparticularcultivar;*:notsure.47 2.4讨论我国西北地区是国内马铃薯的主产区之一，该地区马铃薯的安全生产一直受到马铃薯晚疫病的严重威胁。过去数年间，我们实验室曾对西北地区致病疫霉菌群体结构进行了系统的分析(Tianetal.2015a;Tianetal.2015b;Tianetal.2016)，结果发现西北马铃薯主产区的致病疫霉菌群体结构发生了变化。致病疫霉菌群体结构的动态变化常常导致晚疫病的再次大规模爆发和流行。随着田间致病疫霉菌“新群体”的出现，非常有必要重新鉴定国内主栽品种对西北致病疫霉菌“新群体”的抗病水平，为品种的合理布局和使用提供指导。本研究中，我们对101个（次）马铃薯品种（系）进行了3年的田间抗病性鉴定，结果发现仅19个主栽品种表现高抗，其中包括品种L0527-7、陇薯7号、青薯9号、天薯11号和中薯21号。以无毒基因为工具，通过农杆菌介导的瞬时表达系统，可进行马铃薯品种的抗病性鉴定、抗病基因组成分析以及在抗病育种中追踪抗病基因和帮助抗病基因聚合(VleeshouwersandOliver2014)。在本研究中，我们以10个致病疫霉菌无毒基因（Avr1、Avr2、Avr3a、Avr3b、Avr4、Avrblb1、Avrblb2、Avrvnt1、AvrSmira1和AvrSmira2）为工具，解析了20个马铃薯品种中抗病基因的组成情况。结果表明，推广品种中的抗病基因已经发生替换，“老抗病基因”在品种中出现的频率在下降，而“新抗病基因”在品种中的出现频率在上升（表2-2）。早期育种中使用的抗病基因一般来源于墨西哥野生马铃薯品种Solanumdemissum。该品种中的抗病基因被成功引入到R1到R11这11个马铃薯鉴别寄主中(Blacketal.1953)，其中R1、R2、R3、R4和R10在抗病育种中得到广泛的应用(Vleeshouwersetal.2011)。而国内马铃薯品种中含有的抗病基因情况与早期抗源材料的广泛使用相符，例如早期推广的青薯2号和ACK含有早期广泛应用的R1、R2、R3a、R3b和R4；而近期推广的品种，例如青薯9号和同薯28号则含有近期报道或克隆的抗病基因Rpi-blb2、Rpi-Smira1、Rpi-Smira2和Rpi-vnt1(Vleeshouwersetal.2011)；同时有些近期推广的抗病品种既含有“老抗病基因”，又含有“新抗病基因”，而且田间抗病性鉴定为高抗，如庄薯3号、L0528-3和陇薯7号。前人曾利用无毒基因的瞬时表达系统对多个马铃薯品种的抗病基因组成进行了分析(Kimetal.2012;Rietmanetal.2012)。在他们的研究中，可以100%的观察到预期的结果，即无毒基因诱导含有相应抗病基因的马铃薯品种产生HR，但诱导不含有相应抗病基因的马铃薯品种产生NR。但是，在本研究中，我们均观察到了假阳性和假阴性结果（图2-5）。但这并不意味着表达系统不可靠，因为即使被广泛使用的本氏烟和番茄瞬时表达系统也会因种种原因出现假阳性和假阴性结果，属于正常的误差现象(Duetal.2015;Wroblewskietal.2005)。因此，结合我们的试验结果，我们认为马铃薯叶片的瞬时表达确实会伴随一定的背景反应，这些背景反应的出现可能是由于菌液注射量不够，或注射48 过程带来的机械伤害，或品种特性等原因导致。但是，这些背景反应的出现，并不影响我们通过瞬时表达系统来分析和判断品种是否含有无毒基因对应的抗病基因（图2-5）。前人研究表明单基因控制的抗病性难以持久，品种的抗病性容易被毒性菌株克服(Songetal.2003)，而抗病基因聚合是提高品种持久抗病性的重要策略之一(Rietmanetal.2012)。Kimetal.(2012)的研究发现，在一个品种中聚合两个抗病基因可以显著降低晚疫病的发生和发展速度，并且将抗病谱不同的基因聚合到一起效果更好。此外，Rietmanetal.(2012)曾分析了一个典型持久抗病品种“SarpoMira”的抗病基因组成，结果发现该品种抗性持久的原因是多个抗病基因（至少五个抗病基因）聚合到了一起。本研究中，我们通过分析马铃薯品种的AUDPC数据和抗病基因数目间的关系发现马铃薯品种的AUDPC与抗病基因数目负相关（R=0.70**，p<0.05）（图2-6），且AUDPC越小的品种含有更多的抗病基因。表明品种中抗病基因的增加可以提高品种的抗病水平，因此，在抗病育种工作中可通过向马铃薯品种中聚合更多的抗病基因来提高品种的抗性水平。然而，抗病育种工作中向单个品种聚合多个抗病基因并非易事，存在多种问题。例如：不清楚亲本材料和抗源材料中含有哪些抗病基因，因此在抗病育种中无法从基因水平选择合适的品种作为抗病亲本使用；育种中缺乏有效手段追踪抗病基因，很难回答抗病基因是否传递到杂交后代中，而且杂交后代中传递了几个抗病基因也不清楚，而通过田间抗病性鉴定等策略费时费力；明确育成品种中到底含有哪些抗病基因更是困难重重。针对这些问题，常用的解决策略是标记辅助选择（markerassistedselection，MAS）育种(Lenmanetal.2015)。目前，科研工作者已经从致病疫霉菌中克隆到10个无毒基因，将这些无毒基因在含有相应抗病基因的马铃薯叶片上瞬时表达后可诱导细胞坏死。因此，作为具有生物学表型的分子标记，这些无毒基因开始应用在马铃薯MAS育种中，可用来进行主栽品种抗病基因数目和组成分析、抗源材料中抗病基因的鉴定和克隆、育种后代中抗病基因的追踪以及抗病基因的功能分析。在本研究中，我们通过10个无毒基因在马铃薯叶片的瞬时表达，系统说明了20个马铃薯品种（系）的抗病基因组成，揭示了品种所含有的抗病基因（表2-2）。对抗病品种在基因水平的了解，可帮助育种家选择合适的品种作为亲本材料进行抗病育种和品种选育(Lenmanetal.2015)；利用10个无毒基因为工具，可以在育种过程中对抗病基因的传递、组合以及聚合情况进行有效的追踪。我们的研究结果将有效地指导这20个品种在抗病育种中的应用。同时，在本研究中，我们发现部分测试品种含有超过5个的抗病基因。事实上，品种中含有较多抗病基因的情况早有报道。例如Kimetal.(2012)曾解析马铃薯鉴别寄主MaR8和MaR9中的抗病基因组成，发现MaR8中含有至少四个抗病基因R3a、R3b、R4和R8，而MaR9中含有至少七个抗病基因R1、Rpi-abpt1、R3a、R3b、R4、R8和R9。另一个研究分析了持久抗病品种“SarpoMira”的抗病基因组成，发现其至少含有四个主效抗病基因（R3a、R3b、R4和Rpi-Smira1）和一个田间抗病基因（Rpi-Smira2）(Kim49 etal.2012)。同时，研究发现部分无毒效应因子可被多个抗病基因识别，例如Avrblbl1可以被RB、Rpi-sto1、Rpi-plt1、Rpi-pta1和Rpi-pta2识别，Avr2也可同时被Rpi-blb3、Rpi-abpt、R2和R2-like识别(Lokossouetal.2009;Wangetal.2008)。因此，本研究中测试的部分品种也可能存在功能冗余但序列不同的抗病基因，下一步需利用PCR和Sanger测序技术对品种中的抗病基因进行确认。品种抗病基因组成情况的成功解析使我们可以从基因水平分析品种的抗病性。结合相应无毒基因的毒性变异情况分析，多个基因的抗病效果已经丧失，致病疫霉菌群体中已经存在可克服其抗性的毒性菌株。例如，通过沉默Avr1，表达有毒性的Avr1-like，毒性菌株克服了R1抗病基因(Duetal.2015)；通过删除Avr2位点的染色体片段，表达有毒性且逃避R2识别的Avr2-like，毒性菌株克服了R2抗病基因(Gilroyetal.2011;Cookeetal.2012)；致病疫霉菌群体中无毒性的Avr3aKI已被毒性的Avr3aEM所替换，毒性菌株克服了R3a抗病基因(Armstrongetal.2005)；通过提前引入中止密码子，翻译截短的AVR4，毒性菌株克服了R4抗病基因(vanPoppeletal.2008)；通过ipiO4干扰广谱抗病基因RB对无毒基因Avrblb1的识别，毒性菌株在完整保留Avrblb1情况下克服了RB抗病基因(Haltermanetal.2010;Chenetal.2012)；毒性菌株中Avr3b和Avrvnt1也在以各种形式的变异来逃避识别(VleeshouwersandOliver2014)。虽然如此，这些无毒基因的毒性变异类型并非同时出现在一个毒性菌株，毒性菌株仅能成功克服单个或部分抗病基因，在品种中含有多个抗病基因时，品种对毒性菌株仍然保持抗病性。通过田间抗性鉴定的AUDPC结果和抗病基因数目的关联分析，我们发现这两者是显著负相关的，说明品种中抗病基因的增加确实会显著提高品种的抗病性水平。该结果从抗病基因水平证明了“基因聚合”或者“基因垛叠”在马铃薯抗病育种中的必要性及对晚疫病防治工作的重要意义。50 第三章致病疫霉菌侵染早期高表达核心RXLR效应基因鉴定马铃薯是全世界最重要的非谷类作物，在全球粮食安全中发挥核心作用(Xuetal.2011)。然而，马铃薯的安全生产受到晚疫病的严重威胁，该病的病原为致病疫霉菌，是目前公认的马铃薯上最具毁灭性的病害(Yoshidaetal.2013)。晚疫病危害马铃薯产业由来已久，例如历史上非常著名的“爱尔兰大饥馑”就由该病害所导致，不仅导致马铃薯的产量损失严重，而且造成储藏期带病薯块损失殆尽，食物的短缺最终导致一百万人饿死，一百五十万人远迁北美，甚至因此改变了全世界人口的分布格局(Haasetal.2009)。时至今日，晚疫病每年给马铃薯产业造成的损失仍然十分巨大，保守估计高达67亿美元(Nowickietal.,2011)。尽管世界范围内，人们在晚疫病防控中投入了巨大的人力物力，该病害依然是马铃薯产业持续发展的巨大挑战(Fryetal.2015)。目前，植病和育种工作者普遍认可种植抗病马铃薯品种是防治晚疫病最安全有效和环境友好的策略(RodewaldandTrognitz2013)。从分子层面来说，田间布局的抗病马铃薯品种中含有抗病基因，可以识别致病疫霉菌含有的无毒基因（即无毒性功能已知的RXLR效应因子基因），激活马铃薯的免疫防卫反应，限制致病疫霉菌的侵染和扩展。然而，许多马铃薯品种田间推广后，在很短的时间内（甚至仅一个生长季后），其抗病能力就会丧失。原因是抗病基因靶向的无毒基因可通过有无变异（presentandabsent，PAV）、插入和缺失（insertionanddeletion，Indel）、单碱基多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNPs）以及基因沉默（genesilencing）来逃避与抗病基因的互作，导致品种的抗病性被克服(Raffaeleetal.2010;VleeshouwersandOliver2014)。也正是因为致病疫霉菌拥有如此高的克服抗病基因的能力，它也被称为“抗病基因毁灭者”（resistancegenedestroyer）(Fryetal.2015;Haasetal.2009)。为了有效的控制晚疫病，科学家需要研究致病疫霉菌无毒基因的结构与功能及其与抗病基因的互作机制，育种家需要开发新的策略和技术，以便更快速地鉴定抗病基因和将抗病基因导入新的品种，更便利地开展基因功能研究，以及更准确地指导抗病基因的田间布局(VleeshouwersandOliver2014)。在过去的十五年中，我们对RXLR效应因子基因的认识越来越清楚。2004年，Shanetal.(2004)克隆了大豆疫霉菌的第一个无毒基因Avr1b。随后，另外三个卵菌无毒基因Avr3a、ATR13和ATR1NdWsB相继被克隆(Allenetal.2004;Armstrongetal.2005;Rehmanyetal.2005)。通过四个无毒基因的序列比对分析发现它们序列的N末端（N-terminal）中存在RXLR和dEER基序(Rehmanyetal.2005)。这两个基序的发现为我们高通量识别卵菌病原中的RXLR效应因子提供了可能。通过生物信息学预测，科研工作者从致病51 疫霉菌基因组中预测到563个RXLR效应基因(Haasetal.2009)，从大豆疫霉菌基因组中预测到385个RXLR效应基因(Jiangetal.,2008)。目前，一些致病疫霉菌RXLR效应基因的毒性作用机理已经得到解析，其中包括PiAvrblb1(Champouretetal.2009)、PiAvr3a(Bosetal.2010)、PiAvrblb2(Bozkurtetal.2011)和PiAvr2(Saundersetal.2012)等。另外一些RXLR效应基因，例如可以抑制Flg22引发的早期免疫反应（SuppressorofearlyFlg22-inducedImmuneresponse，SFI）的RXLR效应基因SFI1、SFI2、SFI3、SFI4、SFI5、SFI6、SFI7和SFI8的毒性功能也得到初步的分析(Zhengetal.2014)。这些研究结果表明，RXLR效应因子在寄主植物和病原菌的互作过程中发挥重要功能，特别是在侵染和定殖阶段发挥毒性功能(Cookeetal.2012)。然而，除了毒性功能外，RXLR效应因子同样发挥无毒性功能(Birchetal.2008)。在寄主马铃薯和致病疫霉菌长期协同进化过程中，得以幸存的马铃薯品种进化出抗病基因，可以识别致病疫霉菌中相应的无毒基因，通过激活免疫防卫反应，引发侵染部位局部细胞坏死而成功限制病原菌的扩展(Olivaetal.2015)。迄今为止，致病疫霉菌中鉴定到的十个无毒基因（Avr1、Avr2、Avr3a、Avr3b、Avr4、Avrblb1、Avrblb2、Avrvnt1、AvrSmira1和AvrSmira2）均为RXLR效应基因(Armstrongetal.2005;Champouretetal.2009;Gilroyetal.2011;vanPoppeletal.2008;Vleeshouwersetal.2011)。随着我们对这些RXLR效应基因认识的加深，使得将这些具有无毒功能的效应因子作为工具应用在现代马铃薯抗病育种工作中成为了可能，可以加速和完善我们对抗病基因的鉴定、功能分析和田间布局工作(VleeshouwersandOliver2014)。近年来，Dangletal.(2013)提出了“核心效应因子”的概念，并基于此提出了升级版的抗病育种策略，通过生物信息学手段从病原菌基因组中鉴定核心效应因子，将其作为工具应用于持久抗病基因的鉴定和育种过程中抗病基因的追踪。事实上，在其之前，Bartetal.(2012)已经开展过相关工作来鉴定核心效应因子，他们通过测序细菌病原黄单胞菌（Xanthomonasaxonopodispv.manihotis）的全基因组，利用生物信息学手段从数个菌株中鉴定一批序列保守的核心效应基因。目前，Bart等人鉴定到的这些核心效应因子已作为工具应用于从野生木薯品种和大戟科近缘物种中鉴定抗病基因的工作中。尽管核心效应因子是鉴定和布局持久抗病基因的理想工具，但我们对致病疫霉菌中核心RXLR效应因子的认识极为有限，限制了我们在抗病性育种中对核心效应因子的有效利用。因此，为了高效的寻找持久抗病基因和长期有效的控制晚疫病，非常有必要开展致病疫霉菌核心RXLR效应因子的鉴定工作。在本研究中，考虑到：（1）对病原菌具有重要毒性功能效应因子基因序列保守且在病原菌群体中广泛分布；（2）已知的致病疫霉菌无毒基因均为侵染阶段诱导表达的52 RXLR效应因子基因。我们从我国西北致病疫霉菌群体中挑选了6个多态性相对较高的菌株，制备了早期侵染材料（12hpi，hourspostinoculation），并利用二代测序技术完成了侵染材料转录组的高通量深度测序。基于以下标准：（1）基因序列在菌株间保守；（2）在早期侵染阶段，基因具有较高的表达水平；（3）潜在的重要毒性功能。我们完成了致病疫霉菌中核心RXLR效应因子的鉴定。通过以上分析，我们鉴定到18个核心RXLR效应基因候选（CoreRXLREffectors，CRE）。选取部分CREs在本氏烟叶片进行瞬时表达，24h后接种致病疫霉菌，结果发现这些CREs具有毒性功能，可显著促进致病疫霉菌的侵染和定殖。坏死抑制分析发现，这些CREs可以抑制本氏烟和马铃薯的PTI和ETI免疫防卫反应，与核心效应因子具有潜在的重要生物学功能相符。本研究中识别到的CREs可作为有效的工具，应用于现代的马铃薯抗病育种工作中，从野生马铃薯品种和近缘茄科植物中快速的鉴定晚疫病持久抗病基因，并在育种中有效的追踪抗病基因。3.1试验材料、试剂与仪器3.1.1试验材料3.1.1.1致病疫霉菌株致病疫霉菌材料为本实验室从2007年开始，在甘肃、宁夏、陕西、重庆和青海这5个西北省份连续多年采集到的致病疫霉菌样品，并通过材料交换获得了南方福建、云南和贵州3个省份的菌株样品，总计2115份。3.1.1.2植物材料用于转录组测序分析的植物材料为基质中生长4-7周的马铃薯鉴别寄主MaR3试管苗。用于细胞坏死抑制分析的植物材料为生长5周左右的本氏烟和生长4-7周的马铃薯鉴别寄主MaR3。3.1.2试剂3.1.2.1化学试剂试验中所用的化学试剂包括台盼蓝染液（苯酚10g，甘油10mL，乳酸10mL，无菌水10mL和台盼蓝10mg），水合氯醛（2.5g水合氯醛溶解于1mL灭菌蒸馏水），TrizolKit(Promega,USA)等。RNA提取、琼脂糖电泳相关化学试剂和缓冲液的配制参照分子克隆实验指南（第三版）。3.1.2.2培养基配制（1）RSA培养基（即黑麦汁培养基）称取黑麦粒120g，放入干净的2L三角瓶中，用水淘洗两次后，加入800ml左右53 的蒸馏水，瓶口用封口膜封住，于121℃高温蒸汽灭菌30-60min。汤水通过两层纱布过滤后倒入烧杯，并定容到2L，分装到4个500ml的玻璃瓶，每个玻璃瓶加入蔗糖10g，琼脂3.75g。若以产孢为目的，培养基应为配置不超过一周的新鲜培养基。每升RSA培养基添加0.075g的β-谷甾醇即为RSB培养基。试验过程中RSA和RSB各培养数皿，选择产孢数量多的皿进行游动孢子制备。（2）MS（MurashigeSkoog）培养基按下表组分配制固体MS培养基，用NaOH调pH值至6.8左右，后按比例加入蔗糖和琼脂，于锅中煮沸，匀入三角瓶中，高压蒸汽灭菌备用（表3-1）。表3-1MS培养基组分和用量Table3-1ComponentsofMSculturemedium成分分子量使用浓度(mg/L)大量元素硝酸钾KNO3101.211900硝酸铵NH4NO380.041650磷酸二氢钾KH2PO4136.09170硫酸镁MgSO4·7H2O246.47370氯化钙CaCl2·2H2O147.02440微量元素碘化钾KI166.010.83硼酸H3BO361.836.2硫酸锰MnSO4·4H2O223.0122.3硫酸锌ZnSO4·7H2O287.548.6钼酸钠Na2MoO4·2H2O241.950.25硫酸铜CuSO4·5H2O249.680.025氯化钴CoCl2·6H2O237.930.025铁盐乙二胺四乙酸二钠Na2.EDTA372.2537.25硫酸亚铁FeSO4·7H2O278.0327.85有机肌醇100甘氨酸2盐酸硫胺素VB10.1盐酸吡哆醇VB60.5烟酸VB5或VPP0.554 蔗糖sucrose342.3130g/L琼脂agar7g/L3.1.3仪器试验中所用的仪器包括植物光照培养箱、生化培养箱、4℃展示柜、-20℃冰箱、-70℃超低温冰箱、组织研磨仪、4℃离心机、琼脂糖电泳系统、Nanodrop分光光度计（ND-1000）、涡旋混合仪、高压灭菌锅、Milli-Q型超纯水仪、制冰机等。3.2试验方法3.2.1致病疫霉菌培养和游动孢子制备黑麦培养基微波炉融化后倒入90cm培养皿中，每皿约25ml。为防止污染，可向培养基中加入氨苄青霉素（50mg/ml）和/或利福平（10mg/ml）预防细菌污染，加入制霉菌素（9mg/ml）预防真菌污染。用灭菌牙签挑取致病疫霉菌菌丝块到RSA培养基平板，封口后置于16℃黑暗培养，3-5天转皿一次，活化2-3次后，转到RSA和RSB培养基平板各数皿。培养10-12天后，在超净工作台中打开培养皿，用牙签从平板的不同位置挑取菌丝块，置于载玻片上，用显微镜观察孢子囊的产生情况，选择其中孢子囊数量较多的一皿进行后续试验。用移液枪向培养皿中加入5mL在4℃预冷的灭菌水，或通过移液器吹吸，或用涂布器反复擦拭，使孢子囊从菌丝上脱落下来。得到的孢子囊悬浮液转移到4℃冰箱静置1.5-2h，通过低温促使孢子囊释放游动孢子，并得到游动孢子悬浮液；用血球计数器统计游动孢子的浓度，并用无菌水将浓度调至4×104个/mL左右备用。3.2.2马铃薯培养鉴别寄主MaR3是一个高感晚疫病的马铃薯品种，本实验中用于制备早期侵染材料。将无菌试管苗切下带有两到三个小叶的一段茎，插入三角瓶中无菌MS培养基中封口，并于22℃，置于光周期16h/8h光照/黑暗的光照培养箱中进行培养。培养大约4周后洗干净根部的MS培养基，移入纯蛭石培养基中进行炼苗。大约4周后苗子连同根部的蛭石一起移入大花盆中，继续培养大约4周后，完全展开的成熟叶片即可用于后续试验的侵染试验以及瞬时表达分析。3.2.3离体叶片接种植株中部第3-5对健康复叶的成熟小叶剪下后快速浸泡到冷凉的自来水中，用于叶片保鲜。带回实验室后，将叶片表面的水滴甩干，用无菌水浸湿的脱脂棉包裹叶片的叶55 柄，摆放于塑料盘中。游动孢子悬浮液接种到叶片背面二级叶脉之间，每个叶片接种20µl。接菌完成后，塑料盘用保鲜膜封口，盘内湿度保持90%以上，先于16-18℃下黑暗培养24h，以确保成功侵染，次日将接种点的菌液拭干，并翻转叶片，塑料盘重新用保鲜膜封口后置于光照生化培养箱中（光照时间：14h/天；光照强度：2000-4000Lux），适当保持湿度，继续放置4-7天（图3-1）。第四天开始统计发病结果，并连续观察到第七天(孙洁平2012)。图3-1致病疫霉菌毒性测试流程图Figure3-1FlowchartofP.infestansvirulencedeterminationprocess3.2.4染色和观察台盼蓝（Trypanblue）染色：将病组织剪下，放入2mL离心管，加入1mL台盼蓝染色液，于沸水中加热2min，冷却后继续沸水加热2min。加热后，将样品在染色液中放置过夜。水合氯醛脱色：将染色液倒掉，向样品中加入1mL水合氯醛；室温放置，过夜脱色。将脱色后的样品取出置于载玻片上，滴加一蒸馏水，盖上盖玻片，共聚焦显微镜（OlympusBX51，Shinjuku-ku，Tokyo，Japan）下进行观察并拍照。3.2.5侵染材料制备和RNA提取制备游动孢子并接种到马铃薯鉴别寄主MaR3的离体叶片，置于16℃生化培养箱，12小时后（hourspostinoculation，hpi）收集病组织，并提取RNA，质检合格后送到公司进行转录组测序（图3-2）。56 图3-2侵染材料制备流程Figure3-2Flowingchatofinfectiontissuepreparation3.2.6转录组测序用Trizol法（Promega,USA）提取总RNA后，用RNase-freeDNaseI（TakaraBio，Japan）37℃下处理30min，去除残留的DNA。后利用Agilent2100Bioanalyzer（AgilentTechnologies，SantaClara，CA）进行RNA质量检测和定量；利用oligo-dT磁珠法（Qiagen）富集总RNA中的Poly(A)mRNA，重复两次，可保证残留rRNA比例低于1%；向mRNA中加入片段化缓冲液并将其片段化成200nt的小片段；使用随机六聚体引物通过反转录合成cDNA的第一条链，后用RNaseH和DNApolymeraseI合成cDNA的第二条链；纯化回收cDNA片段，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收200bp±25bp的片段，通过PCR扩增富集和建库。cDNA文库利用IlluminaHiSeq™2000平台进行双端测序。测序工作由联川公司完成（中国杭州）。3.2.7比对和拼接利用质控软件HTQC进行测序数据的质量控制，利用指令`ht-stat`进行测序数据质量的整体评估，利用指令`ht-trim-Sboth-C13-W5`进行测序序列两端低质量测序碱基的切除，利用指令`ht-filter--filterlength-L35`过滤序列并去除长度小于35bp的序列(Yangetal.2013)。利用短序列比对工具Tophat2（v2.0.9）（http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml）将测序序列与致病疫霉菌T30-4基因组序列（http://www.broadinstitute.org/）进行比对(Kimetal.2013;Haasetal.2009)。自定义参数`-r0--mate-std-dev80`，其余均采用默认参数。转录本拼接和表达水平计算利用软件包Cufflinks（v2.1.1）（http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/）进行，通过计算获得每个表达基因的FPKM（mappedfragmentsperkilobaseofexonregionpermillionmappablereads）值(Trapnelletal.2012)。Cufflinks完成转录本拼接和表达水平计算后，利用perl脚本提取所有表达的RXLR效应基因及在每个菌株中对应的表达水平；利用R绘制每个菌株转录组中所有基因和RXLR效应基因表达水平分布的boxplot图；根据Cufflinks计算的表达水平，利用R软57 件包gplots中的heatmap.2绘制5个菌株中RXLR效应基因的heatmap图；根据5个菌株中RXLR效应基因的共表达情况，利用在线工具绘制venn图（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）。3.2.8RXLR效应基因拼接和预测利用Tophat2将测序数据与马铃薯基因组进行比对分析（PGSC_DM_v4.03，http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml）(Xuetal.2011;Kimetal.2013)；未比对到马铃薯基因组的reads用perl脚本成对提取，并利用Trinity进行denovo拼接(Grabherretal.2011)；利用TransDecoder寻找拼接序列中最长的编码区域(Haasetal.2013)，并切除第一个甲硫氨酸（Methionine）之前的部分；氨基酸序列长度超过70aa的序列利用Python脚本进行RXLR效应基因预测(Bhattacharjeeetal.2006;Whissonetal.2007)。3.2.9RXLR效应基因SNPs提取和多态性分析从Tophat2输出的比对结果accepted.bam文件中，利用Samtools提取RXLR效应基因的SNPs，自定义参数为`DP=4,QUAL=20`，其余参数默认；利用perl脚本组装各菌株中带有SNPs的正确RXLR序列，利用MEGA6.0(Tamuraetal.2013)计算效应基因在菌株间的dN/dS比值，同时提取各效应基因的覆盖度，并利用R软件中的coplot功能进行SNPs数量、dN/dS比值和测序深度三者间的关联分析。3.2.10候选RXLR效应基因筛选和初步功能分析对候选RXLR效应基因筛选标准进行设定，其具体条件和要求如下：侵染早期在所有或者多个菌株中共表达，且在菌株中的表达水平非常高；序列在所有的菌株间不含有SNP，或仅含有同义替换的SNP。对筛选出的候选通过农杆菌介导的烟草叶片和马铃薯叶片基因瞬时表达进行初步的功能分析。本氏烟叶片RXLR效应因子基因瞬时表达测试方法详见2.2的试验方法。坏死抑制测试中，首先注射RXLR效应因子基因，24h后在相同的位置注射坏死诱导因子BAX、PiNIP、INF1、Avh238和Avh241，从第三天开始观察反应结果，到第八天结束。3.2.11RXLR效应基因表达水平定量PCR验证RNA提取：本试验中侵染材料的总mRNA使用Trizol提取试剂盒（TIANGEN公司）提取，方法参照试剂盒的使用说明。取1µlRNA稀释十倍，混匀后取2µl于NanoDrop2000超微量紫外-可见分光光度计（ThermoFisher）测定其浓度、260/280和260/230，剩余8µl用1%RNA-free琼脂糖凝胶进行电泳检测（120V，200mA)，其余RNA保存于-80℃冰箱中备用。反转录和cDNA合成：使用诺唯赞公司（Vazyme，Nanjing，China）的反转录试剂58 盒完成反转录和cDNA的合成，具体步骤如下：(1)基因组DNA去除组分和反应体系如下：模板RNA200ng4×gDNAwiperMix2µl用RNAasefreeddH2O将体系补足到8µl，轻弹PE管将体系混匀。瞬时离心后置于42℃反应2min。(2)反转录反应组分和反转录体系如下：去除基因组DNA获得的反应液8µl5×QrtSuperMixII2µl轻弹PE管，将体系混匀。瞬时离心后将PE管置于PCR仪中，程序设定为25℃，10min；42℃，30min；55℃，30min。程序结束后，从PE管中吸取1µl溶液，用NanoDrop2000超微量紫外-可见分光光度计（ThermoFisher）测定其浓度、260/280和260/230，根据cDNA浓度用RNase-FreeddH2O进行统一稀释，将终浓度稀释至同一浓度水平（100ng/µl）。3.2.12引物设计与合成根据致病疫霉菌T30-4基因组数据库中的基因序列利用引物设计软件Primer5进行特异引物的设计，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成（表3-2）。表3-2测序数据确认所用引物Table3-2qRT-PCRprimersforthevalidationofsequencingdataGeneIDCode5`-3`PITG_08327PiUBCFCATCAATCGGCGTATCTGTCTCAPiUBCRCACCAAGTCGGCGAATAGCACPITG_09585PiaFACAATGACCCCGTTATCCAAPiaRCTTCTCTACCATCGCTACCGPITG_09732PibFTTTACTGCAAGCAACCTGAAPibRCACCAACCTGCGTAGACATCPITG_18215PicFGAGATTGGTTGATGCCCCGPicRACATCTTTTCGCCCCTTACAGPITG_22804PidFAAATGTCAAAACTGGAACCCPidRAAACCTCTTAAATCCCGAAGPITG_17063PieFCACTCCAAGCAATCAAAGCGPieRGCCACTCACTGTAGAGCCTGPITG_04196PifFTGACTGAAGTGTCCGCATCCPifRGCTCTTCGCTTTCCGTGATT59 PITG_14783PigFGAGGTCTCTATCTAAAGCCGAPigRAAATGGTAGAAAGTAGGTGGCPITG_07630PihFAAAGAGGGGCTGCCGTTCPihRATTGTGGGTTTCCTTGTATGTCPITG_11507PiiFCGTTGCCGTCTCCCTTCTTPiiRTCGTATGGGCTAGTTTCGCPITG_09216PijFTGAGACAGGCAATCACAGCAPijRACCACCGATAGTAGCACCAA3.2.13实时荧光定量PCR（Real-timePCR）实时荧光定量PCR在Bio-Rad公司的CFX96实时荧光定量PCR仪上进行，所用SYBR@GreenMasterMix购买自诺唯赞公司（Vazyme，Nanjing，China）。Real-timePCR反应体系：PrimerF0.4µlPrimerR0.4µlcDNATemplate2µlACQQpcrSYBRGreenMasterMix10µlddH2Oupto20µl3.3结果与分析3.3.1致病疫霉菌多样性菌株选择表3-3实验室收集的致病疫霉菌分离物Table3-3P.infestansisolatescollectedbyourlaboratory年份省份20072008200920102011甘肃0127144160217宁夏9321249268273陕西00104215重庆000160青海011018417福建0001070云南000940贵州0001130基于Dangletal.(2013)对“核心效应因子”的定义，核心效应因子通常会具有重要的毒性功能，也因此广泛存在于病原菌群体中。为从群体水平寻找致病疫霉菌保守的核心60 RXLR效应因子基因，我们前期搜集了大量的致病疫霉菌菌株。从2007年开始，本实验室连续多年多地（甘肃、宁夏、陕西、重庆和青海）采集致病疫霉菌样品，也通过材料交换获得了南方福建、云南和贵州3个省份的菌株样品，总计2115份（表3-3）。我们系统地测定了这些菌株的基因型、线粒体单倍型、交配型和毒性类型。综合考虑这些群体生物学特征数据，最终从2000多个菌种中挑选出13个遗传背景多样性高的代表性菌株（菌株的详细信息见表3-4）。基于SSR基因型数据，我们构建了这13个菌株的系统发育树，并根据它们在系统发育树上的分布情况，最终挑选了其中6个多样性水平高的代表性菌株，制备它们的侵染材料，进行高通量二代转录组深度测序，同时进行了群体水平的核心RXLR效应因子的鉴定（图3-3）。6代表性菌株中，P31329（P3）、Pa21106（Pa）、Pc51265（Pc）和Pd21410（Pd）这4个菌株来源于中国西北马铃薯主产区，F48（F4）菌株来源于中国南方马铃薯主产区，80029（80）菌株来源于欧洲。图3-3遗传背景多样性高的6个代表性菌株。利用R软件包poppor，基于Bruvo距离，构建13个代表性菌株的系统发育树(Bruvoetal.2004)，挑选图中用红色标识的6个菌株（80029、F48、P31329、Pa21106、Pc51265和Pd21410）进行后续的转录组测序分析；图中标红菌株命名方式：编号（交配型_线粒体单倍型_毒性类型）。交配型：A1和SF；线粒体单倍型：Ia和IIa；毒性类型：通过Black的鉴别寄主测定的生理小种。Figure3-3SixdiverseP.infestansstrainswithhighlydivergentgeneticbackgrounds.ThirteenrepresentativestrainswereusedtobuildaphylogenetictreeaccordingtotheBruvodistanceusingtheRpackage“poppor”(Bruvoetal.,2004).Thestrains80029,F48,P31329,Pa21106,Pc51265,andPd21410markedasredbranchesinthefigure,wereselectedtoconductRNA-seq.strainnamesshowedinthefigureweretermedas:code(matingtype_haplotype_pathotype).Matingtype:A1andSF(self-fertilization);haplotype:IaandIIa;pathotype:virulenceraceindicatedbyBlack'spotatodifferentials61 表3-4代表性菌株的SSR基因型、交配型、线粒体单倍型以及毒性类型Table3-4DetailedinformationaboutSSRgenotype,matingtype,haplotype,andpathotypeofrepresentativestrainsSSRprimersandgenotypesStrainHMSSR1RacePi02Pi04Pi4BPi16Pi33Pi56Pi63Pi70Pi89D13G11SSR4SSR81A150/1166/1257/2174/1206/2186/1172/1243/2187/1178/1205/2278/2248/2332/3T30-4Ia15066577406867243877805784832NDA148/1150/1257/2174/1206/2184/1172/1240/2187/1164/1205/2274/2248/2332/380029Ia148505774068672408764057452322.4.7A150/1152/1255/2174/1206/2184/1170/1240/2187/1197/1278/2248/2318/388133NAIa2505855740684704087977848301.3.7.10.11Pa211IIA146/1158/1251/2174/1209/2184/1172/1240/2187/1164/1199/1270/2256/2330/31.2.3.4.5.6.7.8.9.106a146585974098472408764997056420.11P1126IIA148/1156/1251/2174/1209/2186/1172/1240/2187/1164/1197/1268/2258/2330/36a14856597409867240876497685844NDP2110A148/1150/1253/2176/1209/2184/1170/1240/2187/1180/1197/2266/2250/2330/3Ia824858537609847040878001665044NDP2120S150/1158/1253/2174/1206/2184/1170/1237/2187/1180/1197/2266/2250/2334/3Ia2F5058537406847037878001665044NDP3132IIA150/1152/1251/2174/1209/2180/1172/1237/2187/1148/1199/1266/2254/2334/39a15058537409807237874899705434NDPc512IIA146/1152/1251/2174/1209/2180/1172/1237/2187/1164/1199/1266/2252/2330/33.4.6.865a14658597409807237876499666044Pd112IIA148/1152/1253/2174/1209/2180/1172/1237/2187/1164/1199/2264/2254/2330/328a14858617609807237876407745444NDPd214S148/1150/1253/2172/1209/2182/1168/1237/2187/1180/1199/2266/2254/2338/31.2.3.4.5.6.7.8.9.1Ia10F48585376098268378780056654460.11IIA148/1154/1259/2182/1209/2180/1172/1240/2187/1156/1185/2266/2254/2328/32.3.4.5.6.7.8.9.10.F48b1485859820980724087560366543811S148/1154/1255/2180/1209/2182/1168/1243/2187/1180/1207/2266/2254/2338/31.2.3.4.5.6.7.8.9.1G29IaF48545582098268438780156654460.11Note:H,Haplotype;M,Matingtype.NA,notavailable;ND,nodata.62 3.3.2致病疫霉菌早期侵染关键时间点确认为了确认致病疫霉菌侵染马铃薯叶片早期阶段关键时间点，我们对致病疫霉菌的侵染过程进行了系统的分析。我们连续观察了致病疫霉菌侵染马铃薯叶片后不同时间点的马铃薯叶片的表型以及致病疫霉菌菌丝的微观发育状态（图3-4）。结果发现，致病疫霉菌游动孢子接种到感病品种MaR3叶片后2hpi即形成附着胞，叶片无可见症状出现（图3-4A、B）；6hpi菌丝已通过气孔并开始在叶肉组织快速生长，叶片可见微弱的水渍状出现（图3-4C、D）；12hpi可观察到吸器的形成，标志着病原菌定植的开始，叶片可见水渍状加重，并伴随小黑点的出现（图3-4E、F）；30hpi可观察到大量的菌丝出现，叶部围绕接种点周围出现严重的水渍状（图3-4G、H）；到72hpi未成熟的孢子囊已经形成，叶片接种点周围出现白色气生菌丝（图3-4I、J）。，我们认为12hpi是早期活体阶段进行转录组分析相对合适的关键时间点，该时间点菌丝体比例不是太低，同时吸器开始形成，正是病原菌和植物互作最剧烈的时刻(SivakandShaw1969;Judelsonetal.2008)。因此选择了12hpi制备致病疫霉菌侵染材料来进行转录组测序。图3-4侵染过程连续观察。Cy：休止孢，Gt：芽管，Ap：附着胞，St：气孔，PH：初级菌丝，Ha：吸器，Sp：孢子囊；（A、B）2hpi休止孢萌发并延伸出芽管，芽管末端形成附着胞，开始侵入寄主细胞；（C、D）6hpi初生菌丝通过气孔侵入寄主，并在寄主内扩展；（E、F）12hpi菌丝广泛扩展并形成吸器，叶片侵染部位可观察到小的黑色斑点；（G、H）30hpi侵染部位开始变黑，可以观察到较为严重的侵染症状；（I、J）72hpi可观察到气生菌丝出现，且幼嫩的孢子囊开始形成；黑色条代表0.5cm，白色条代表10um。Figure3-4Observationoftheinfectionprocess.(A,B)At2hourspostinoculation(hpi),theCy(cyst)germinatedandextendedoutGt(germtube)toformAp(appressorium)andwasreadytoinvadeintohostcells.(C,D)At6hpi,somepathogenPH(primaryhyphae)invadedintohostthroughthehostSt(stoma),anddevelopedinsidethehost.(E,F)At12hpi,younghyphaebroadlyspreadandhaustoriaformed,butonlyverysmallblackspotscouldbemacroscopicallyobservedontheleaf.(G,H)At30hpi,theinfectionsiteturnedtodarkandobviousdamagecouldbeobserved.(I,J)At72hpi,airhyphaeappearedandyoungSp(sporangium)wasreadytoform.(Blackbar,0.5cm;whitebar,10μm).63 3.3.3致病疫霉菌测序数据比对和拼接本研究准备了6个多样性菌株的12hpi侵染马铃薯叶片材料，通过Illumina二代高通量测序后总计获得460,748,254条reads，利用HTQC过滤低质量数据后获得高质量序列414,424,440条（89.9%）(Yangetal.2013)。利用Tophat2将高质量reads与致病疫霉菌T30-4基因组进行比对，其中2,337,987条reads被成功比对到基因组序列上(Kimetal.2013)。基于比对结果，我们发现比对到致病疫霉菌基因组的reads数较少，平均比例在有1%左右，最高的一个样品是Pa，比例为2.509%，最低的一个样品是P3，比例仅有0.129%（表3-5）。尽管测序数据中属于致病疫霉菌的比例非常低，我们还是从中检测到大量的表达基因。利用拼接软件Cufflinks进行比对序列的拼接和基因表达水平FPKM值的计算(Trapnelletal.2012)，从6个样品中共成功检测到表达的特异基因11,911个，平均每个样品中检测到7,000个左右的基因表达。这意味着在侵染早期12hpi，致病疫霉菌中有近一半的基因表达，说明该阶段致病疫霉菌的各种代谢和生理生化过程十分活跃。其中Pa21106菌株中检测到表达的基因10,748个，Pc51265菌株中7,973个，80029菌株中7,817个，F48菌株中6,906，Pd21410菌株中6,562个，P31329菌株中3,526个（表3-5）。对侵染早期高表达的核心RXLR效应因子的分析发现6个菌株中总计检测到特异表达的RXLR效应基因243个，其中样品Pa21106中检测到的表达的RXLR效应基因数量最多，达到了224个；样品80029、F48、Pc51265和Pd21410中检测到的表达的RXLR效应基因数量相似，在160个左右；样品P31329中检测到的表达的RXLR效应基因数量最少，仅有55个，考虑到该样品中属于菌的测序数据量较少，因此后续多个分析中并未包含该样品（表3-5）。表3-5测序数据比对情况统计Table3-5OverviewofreadsmappinginformationStrainRawreadsCleanreadsMappedReadsRatio(%)GenesRXLRgenes8002981,170,14078,088,447209,1510.2687,817166F4876,156,50067,813,237121,1890.1796,906147P3132981,698,26672,180,85693,3940.1293,52655Pa2110671,809,64462,860,4541,577,1342.50910,748224Pc5126560,289,33653,667,578189,8410.3547,973167Pd2141089,624,36879,813,868147,2780.1856,562162All460,748,254414,424,4402,337,9870.56411,911243注：Strain，菌株；Rawreads，原始数据；Cleanreads，高质量数据；MappedReads，比对到基因组的数据；Ratio(%)，比对到基因组数据的比例；Genes，拼接识别到的基因数；RXLRgenes，拼接识别到RXLR基因的数目。64 3.3.4菌株特有RXLR效应基因的确认除T30-4基因组中报道的563个RXLR效应基因外，近年来的研究报道了11个新发现于其它致病疫霉菌菌株中的RXLR效应基因。其中5个发现于菌株Blue_13中，该菌株是近年来欧洲地区致病疫霉菌的优势小种(Cookeetal.2012)。另外6个发现于一些历史标本菌株中，这些菌株曾经引发“爱尔兰大饥馑”，现在被命名为“HERB-1”(Martinetal.2013;Yoshidaetal.2013)。以这11个RXLR效应基因为参考序列，进行测序数据的比对分析发现，仅RXLR效应基因PiRXLRe在测序数据中比对到2条测序reads，其余10个RXLR效应基因无比对成功的测序reads。说明除PiRXLRe外，这些新发现的RXLR效应基因在测序的菌株中可能不存在，或者至少在侵染早期阶段在我们测序的6个菌株中不表达。遗传差异大的菌株往往各自含有一些特异的基因，而本研究中用到的菌株与他人研究所用的菌株差异较大，因此推测这6个菌株中可能存在特有RXLR效应基因。通过对测序数据的Denovo拼接和比对分析发现，成功拼接并预测到含有信号肽（Signalpeptide，SP）的序列达到2092条（P>=0.9），其中含有RXLR效应基因特有基序RXLR-dEER的序列67条。在这有67条序列中，4条序列是已知的非RXLR效应基因，62个条是已知的RXLR效应基因，仅1条序列是新发现的RXLR基因，命名为“comp858_c1_seq1”（表3-6）。comp858_c1_seq1为Pa21106菌株特有，在其它菌株中未检测到，与已知的RXLR效应基因PITG_08174同源（e-value2.00E-06）。Denovo拼接表明除comp858_c1_seq1外，本研究用到的菌株中可能不存在其它特有的RXLR效应基因，或者虽然存在其它特有的RXLR效应基因，但早期侵染阶段在本研究所用菌株中不表达。表3-6新鉴定到的RXLR效应基因Table3-6DetectionofanovelRXLReffectorgeneGene_IDcomp858_c1_seq1NCBInumberMG269997NucleotideCGATCTCAACGCGCAAGCACGCTACATAGGACCATGCGCGCTTCGCCCATCGsequenceCCATAGCTTTTCTCATGGCCATCTCCACAGCAAGTGAAGCCACTGTCGCTAACTCTGATCGTGCTAGGAAATCCAACGCTGATGACAGTATGAGGAACAACCACCGATTCCTGAGGGACAACGAAATTGATATCGAAGCCGAGGATCGAATGGCCTGGTCCTTTAACTTTAAAAAAGATGGACTTGCGGACAGGATTATAAGGGCCACGCAGTGGGATTCAAAGGTCGCGATTCTCAAGGATATGAAGGAAGGTCAGATGAACTACGCGTTCGACGACTTGGTACGAACCATACAATTGTTCATCCCCAGTTACGAAGCAGGCATGAACAAGGGCGCGTTTATAminoacidMRASPIAIAFLMAISTASEATVANSDRARKSNADDSMRNNHRFLRDNEIDIEAED65 sequenceRMAWSFNFKKDGLADRIIRATQWDSKVAILKDMKEGQMNYAFDDLVRTIQLFIPSYEAGMNKGAF注：Gene_ID，基因ID号；NCBInumber，NCBI号；Nucleotidesequence，核酸序列；Aminoacidsequence，氨基酸序列。3.3.5RXLR效应基因表达水平确认为确认转录组测序获得的RXLR效应基因表达水平的可靠性，我们随机挑选其中10个RXLR效应基因进行qRT-PCR验证（表3-2），结果表明，RXLR效应基因的qRT-PCR结果与转录组测序结果显著负相关，ΔCt值与log2换算后的FPKM值间的相关系数R=-0.937172（p-value<2.2e-16）。说明转录组测序计算得到的RXLR效应基因表达水平与定量数据相符，即FPKM值是可靠的（图3-5）。图3-5qRT-PCR结果和RNA-seq数据间相关性分析。根据RXLR效应基因和内参基因的Ct值计算RXLR效应基因的ΔCt值，并将ΔCt值与log2(FPKM)值进行关联分析，获得回归曲线y=-0.7616x+8.8623。图中含有5个样品中10个RXLR效应基因的数据（总计50个点）。Figure3-5CorrelationanalysisbetweenqRT-PCRresultandRNA-seqdata.ΔCtvalueswerecalculatedbytheCtvaluesoftenselectedRXLRsminustheCtvalueofreferencegene.ThenthecorrelationanalysisbetweenΔCtvaluesandlog2(FPKM)valueswasperformedandtheregressionequationy=-0.7616x+8.8623wasobtained.Thedatasetsincludedtheinformationof10RXLReffectorgenesfrom5samples(totally50pionts).3.3.6菌株RXLR效应基因表达特征分析从6个菌株中总计检测到特异表达的RXLR效应基因245个，对其在侵染早期不同菌株间的表达特征进行分析发现，每个菌株中RXLR效应基因的表达水平显著高于转录组中所有基因整体的表达，其表达水平是整体表达的水平3倍左右；RXLR效应基66 因表达水平中位数超过6，而整体基因的表达水平中位数仅达到4（图3-6A、B）。说明在侵染早期阶段致病疫霉菌会大量高表达与毒性相关的RXLR效应基因，以增强毒性和促进侵染。图3-6样品中RXLR基因的表达特征。（A）沙盒显示RXLR效应基因和转录组中其它基因的表达水平（图中表达水平以log2转换后FPKM值表示），比较发现RXLR效应基因的表达水平显著高于整个转录组的平均水平；（B）venn图展示RXLR基因在菌株和菌株间的表达情况；（C）热图显示RXLR基因在菌株间的表达模式。80，80029；F4，F48；Pa，Pa21106；Pc，Pc51265；Pd，Pd21410。Figure3-6ExpressedRXLRgenesinsamples.(A)BoxplotshowstheoverviewofRXLReffectorgenesandallgenesdetectedintranscriptomerepresentedbyFPKMvalue(log2transformed).ComparingbetweenRXLRgenesandallgenesconvinceusthattheexpressionlevelofRXLRgeneshigherthanallgenessignificantly.(B)VennmapshowsnumbersofRXLRgenesexpressedineverystrainsandco-expressiondetails.(C)HeatmapshowsexpressedRXLRgenesandtheirexpressionlevelsineachstrain.基于RXLR效应基因的表达水平和在菌株间的共表达情况，可将这些侵染早期阶段表达的RXLR效应基因分成三类：第一类是47个表达水平极高的RXLR效应基因，67 在全部菌株或大多数菌株中表达；第二类是73个在多个菌种中表达的RXLR效应基因，但其表达水平相对较低；第三类是123个仅在个别或少数几个菌株中表达的RXLR效应基因，其表达水平通常较低（图3-6B）。利用venn图分析除P3以外的5个菌株，发现，108个RXLR效应基因在5个菌株间共表达，占到了所有表达RXLR效应基因的一半，并且这些共表达的RXLR效应基因通常具有较高的表达水平；41个RXLR效应基因仅被单个菌株表达，这些RXLR效应基因通常具有较低的表达水平（图3-6C）。说明在侵染早期阶段致病疫霉菌大量高表达的RXLR效应基因具有一定的特异性，菌株间具有一定的普遍性。3.3.7部分RXLR效应基因表达检测图3-7已知无毒性和毒性RXLR效应因子基因在菌株中的表达检测。heatmap通过R软件包“gplots”绘制，图中包含18个RXLR效应因子，其中10个已知的无毒基因，8个抑制Flg22诱导的早期免疫反应的SFI毒性基因；F4，F48；80，80029；Pd，Pd21410；Pc，Pc51265；Pa，Pa2110。Figure3-7ExpressionofknownavirulenceandvirulenceRXLReffectorgenesintheexaminedP.infestansstrains.EighteenRXLReffectors,includingtenknownavirulencegenesandeightSFI(SuppressorofearlyFlg22-inducedImmuneresponse)virulencegeneswereincludedintheheatmapgeneratedusingRpackage“gplots”.Strainnames:F4,F48;80,80029;Pd,Pd21410;Pc,Pc51265;Pa,Pa2110.68 到目前为止，致病疫霉菌中有10无毒性已知的RXLR效应基因被克隆(VleeshouwersandOliver,2014)。本研究中，我们分析了这10个基因在5个多样性菌株中的表达情况（P31329未包含在分析中），结果发现，Avr1仅在欧洲菌株80029中检测到表达，在F48、Pa21106、Pc51265和Pd21410这4个中国菌株中未检测到表达；Avr2、Avr3a、Avrblb1、Avrvnt1和AvrSmira1在所有的5个菌株中均检测到表达；Avr3b、Avr4、Avrblb2和AvrSmira2在2到4个菌株中检测到表达（图3-7）。前人研究发现致病疫霉菌的8个RXLR效应基因可抑制由PAMP分子Flg22引发的PTI，它们在植物-病原互作过程中起到毒性因子的作用(McLellanetal.2013)。本研究中，我们分析了这8个基因在5个多样性菌株中的表达情况（P31329未包含在分析中），结果发现：SFI2、SFI3、SFI4到在所有菌株中均被检测表达；SFI1和SFI6在所有的菌株中均未检测到表达；SFI8仅在菌株Pa21106中检测到表达；SFI7存在菌株偏好性，在80029和Pa21106中表达，其它菌株中不表达（图3-7）。3.3.8已知RXLR无毒基因序列变异分析除Avr1外，我们对其余已知RXLR无毒基因序列的变异情况进行了分析（该分析未包含P31329菌株），结果发现：Avr3a在国内5个菌株中均是毒性的E80M103形式；Avr4在19位氨基酸处发生变异，导致终止密码子的出现而提前翻译结束；Avr3a和Avr4的变异导致其无毒性丧失，从而克服其对应抗病基因的抗病性；其它基因的序列变异对功能无影响（表3-7）。表3-75个菌株中发现的RXLR无毒基因氨基酸替换情况Table3-7AminoacidsubstitutionsofknownAvirulenceRXLReffectorsgenesinT30-4referencegenomeand5strainsSubstitutionPositionT30-480F4PaPcPdAVR2(PITG_22870)31NKKKKNAVR3a(PITG_14371)80EEEEEE103MMMMMM124RGRRRGAVR4(PITG_07387)19T*****AVRblb1(PITG_21388)122RIRRRRAVRblb2(PITG_20300)79PPAAVRvnt1(PITG_19264)96AAVAA69 AVRSmira1(PITG_07550)131KKKRRR170RRRQQR199KTKTKT209HHHRHHAVRSmira2(PITG_07555)64MVMMM注：Position，无毒基因中氨基酸序列位置；Substitution，氨基酸替换情况；*，终止密码子。3.3.9无毒性RXLR效应基因的表达影响毒性5个菌株在16个马铃薯品种上的毒性测试发现：菌株80的毒性水平最低、菌株Pd的毒性水平最高；毒性由低到高排列依次为80、Pa、F4、Pc和Pd（图3-8）。如果将菌株的毒性与10个已知RXLR无毒基因的表达情况相关联，可发现毒性水平越高的菌株其表达RXLR无毒基因的个数越少，基因的表达水平越低（图3-7、图3-8）。表明无毒性RXLR效应基因的表达会影响菌株对马铃薯品种的毒性。图3-8菌株对16个马铃薯品种的毒性测试。根据病斑面积百分比将病斑分成5级，柱形图中数字代表某一级的品种数目。Figure3-8Aggressivenesstestingof5P.infestansisolateson16mainpotatocultivars.Lesionsizewasindexedinto5levelsbasedonthepercentageofdiseasearea.Numbersinhistogramrepresentedhowmanycultivarswereindexedintoparticularlevel3.3.10菌株RXLR效应基因SNPs和dN/dS分析研究发现已克隆的多个马铃薯主效抗病基因靶向致病疫霉菌分泌的RXLR效应基因，表现无毒性的RXLR效应基因会受到抗病基因施加地选择压力，通过快速演化和变异来逃避抗病基因的识别，最终结果表现为抗病基因被克服，抗病品种抗性丧失(VleeshouwersandOliver2014)。核心效应基因序列相对保守，无SNP或仅有同义替换70 SNP，dN/dS比值小于RXLR基因家族的整体水平。为寻找保守的核心RXLR效应基因，利用Samtools工具从序列中提取到30,000个SNPs，perl脚本将SNPs定位到RXLR效应基因序列中，发现468个定位到134个RXLR效应基因上，其中同义替换SNPs共183个，非同义替换SNPs共266个，整体而言，有100个RXLR效应基因在6个菌株间没有任何的SNPs被检测到；多数RXLR效应基因有1-5个SNPs，非同义替换SNPs在1到3个之间，同义替换SNPs在0到2个之间；少数几个RXLR效应基因拥有多于5个的SNPs，最多者SNPs数量达17个；非同义替换多于同义替换（图3-9）。图3-9SNP统计和分析Figure3-9StatisticandanalysisofSNP从T30-4参考基因组中可提取每个RXLR效应基因的标准序列，通过转录组测序可获得每个RXLR效应基因的菌株特异序列，同一个基因的多条序列可用于计算该基因在群体水平的dN/dS值，用以说明基因受正选择压力作用还是负选择压力作用，而受负选择压力作用的RXLR效应基因相比于受正选择压力的RXLR效应基因相对更加保守，若找到识别这些保守RXLR效应基因的抗病基因，那么抗病基因功能持久的预期高，在抗病品种中应用的潜力就相对高一些。通过计算，我们获得了128个RXLR效应基因的dN/dS值，另有120个RXLR效应基因的dN/dS值无法计算；统计发现RXLR效应基因的dN/dS值的中值介于0.3-0.4之间，关联分析Blue_13菌株RXLR效应基因的dN/dS值发现其中值同样介于0.3-0.4之间；对RXLR效应基因的dN/dS值分类统计发现，分布在小于0区间的基因有18个，分布在0-0.3区间的基因有20个，分布在大于0.3区间的基因有90个。这些发现说明，致病疫霉菌RXLR效应基因dN/dS值的整体水平在0.3-0.4之间，而小于0.3的38个RXLR效应基因其受到负选择压力的概率相对高（图3-10）。71 图3-10dN/dS值及其分类统计Figure3-10StatisticandclassificationofdN/dSvalues3.3.11RXLR效应基因SNPs、dN/dS和表达水平关联分析基因表达水平高的基因会有更多的测序reads，其测序深度相对高，基因覆盖全长的可能性也会更高，理论上讲可以更全面的检测到基因中存在的SNPs，而检测到SNPs的多少会影响一个基因的dN/dS值。为了从整体上判断测序情况是否足以检测SNPs，我们对RXLR效应基因SNPs、dN/dS和表达水平三者进行了关联分析，结果发现：随测序深度增加（表现为基因的表达水平升高），仅极少数RXLR效应基因中被检测到的SNPs数量有所增加；RXLR效应基因的log2(FPKM)值大于2时足以检测到基因中绝大部分的SNPs；dN/dS值受到了测序深度的影响，但当log2(FPKM)值大于2时几乎没有影响。因此，当RXLR效应基因的log2(FPKM)值大于2时可以检测到基因中存在的SNPs，根据SNPs计算获得的dN/dS值可以反映RXLR效应基因的正负选择压力（图3-11）。图3-11RXLR效应基因SNPs、dN/dS和表达水平关联分析72 Figure3-11TherelationshipbetweendN/dSandSNPforgivenFPKM(log2formed)3.3.12侵染早期高表达序列保守RXLR效应基因候选表3-7候选的RXLR效应基因Table3-7CandidatesofRXLReffectorgenesGeneIDRXLRfamilyIntergenicSNPNonsyn(n)Syn(s)dN/dSPITG_00821RXLRfam108InBtw000NAPITG_04196RXLRfam47GSR000NAPITG_05750RXLRfam29InBtw000NAPITG_05910RXLRfam52InBtw000NAPITG_06308RXLRfam23InBtw000NAPITG_07451RXLRfam116InBtw101-1PITG_08133RXLRsng158InBtw000NAPITG_09160RXLRfam42GSR000NAPITG_09224RXLRfam55InBtw101-3.95PITG_13452RXLRfam108InBtw000NAPITG_14954RXLRfam21GSR000NAPITG_14959RXLRfam21GSR000NAPITG_14960RXLRfam21GSR000NAPITG_14961RXLRfam21GSR000NAPITG_14962RXLRfam21GSR000NAPITG_16233RXLRfam9InBtw000NAPITG_16240RXLRfam9InBtw000NAPITG_17063RXLRfam45Not000NAPITG_17316RXLRfam1InBtw101-2.63PITG_23014NAGSR000NAPITG_23015RXLRfam100GSR000NAPITG_23042RXLRfam25GDR000NAPITG_23226RXLRfam100Not000NA注：GeneID，基因的ID号；RXLRfamily，基因所属的RXLR家族；Intergenic，RXLR效应因子在染色体上所处的位置；SNP，单核苷酸多态性；Nonsyn(n)，非同义替换；Syn(s)，同义替换；dN/dS，dN与dS间的比值。为了鉴定保守的RXLR效应因子，我们对它们进行了共表达分析，发现其中108个基因在5个菌株间均表达。随后我们对它们的表达水平进行比较，从中筛选到47个73 即在菌株间共表达，又高水平表达的基因。随后，我们根据log2(FPKM)值大于2，无SNP或仅有同义替换SNP，dN/dS比值小于0，进行进一步的筛选。最终我们从245个RXLR效应基因中挑选其中23个候选核心RXLR效应因子（表3-7）。随后，我们对这23个基因进行了序列比对分析，结果发现PITG_14954、PITG_14959、PITG_14961和PITG_14962虽然被分配了不同基因ID，但它们具有相同的核酸序列，因此统一命名为CRE11（CoreRXLREffector11）。此外，PITG_16233和PITG_16240具有相同的核酸序列，统一命名为CRE13。PITG_23014和PITG_23015也具有相同的核酸序列，统一命名为CRE16。最终，通过序列分析我们将这些候选命名为18个核心RXLR效应因子基因（图3-12）。图3-1218个核心RXLR效应因子的序列分析。使用MEGA6.0构建系统发育树（Bootstrap值为1000）；PITG_14954、PITG_14959、PITG_14961和PITG_14962具有相同的核酸序列，统一命名为CRE11（CoreRXLREffector11）；PITG_16233和PITG_16240具有相同的核酸序列，统一命名为CRE13；PITG_23014和PITG_23015具有相同的核酸序列，统一命名为CRE16。Figure3-12Sequencephylogeneticanalysisof18coreRXLReffectors.ThephylogenetictreewasconstructedbyMEGA6.0(Bootstrapvalue=1000).PITG_14954,PITG_14959,PITG_14961andPITG_14962,designatedasCRE11(CoreRXLREffector11),havesamenucleotidesequence.MembersofCRE13(PITG_16233andPITG_16240)andCRE16(PITG_23014andPITG_23015)alsohavesame74 nucleotidesequence.3.3.13候选核心RXLR效应基因促进致病疫霉菌的侵染和扩展为了测试候选核心RXLR效应因子是否具有潜在的重要毒性功能，我们挑选部分候选（CRE1、CRE2、CRE3、CRE5、CRE6、CRE8、CRE9、CRE10、CRE14），将其构建到农杆菌介导的植物瞬时表达载体上，在5周左右的本氏烟（Nicotianabenthamiana）叶片上瞬时表达，24hpi后接种致病疫霉菌游动孢子悬浮液，120hpi统计病斑直径。结果发现：这些RXLR效应因子在本氏烟上均不引发细胞坏死，说明它们都是不细胞坏死诱导因子；与阴性对照GFP相比，这些RXLR效应因子均促进了致病疫霉菌的定殖和扩展，120hpi时瞬时表达RXLR效应因子的本氏烟叶片病斑直径明显大于对照（图3-13）。图3-13瞬时过表达RXLR效应因子基因增强致病疫霉菌的定殖。（A）叶片病斑直径。误差线代表对至少30个生物学重复计算获得的标准误。星号代表Dunnett检验的显著性水平（p<0.005）。（B）致病疫霉菌侵染本氏烟叶片表型分析。通过在本氏烟叶片瞬时表达GFP和RXLR效应因子后接种致病疫霉菌游动孢子完成，代表性照片拍摄于120hpi。Figure3-13TransientoverexpressionofselectedRXLReffectorgenesenhancesP.infestanscolonization.(A)Averagelesiondiametersoftheinoculatedleaves.Errorbarsrepresentstandarderrorscalculatedfromatleast30independentbiologicalreplicates.AsterisksindicatesignificantdifferencesdeterminedusingDunnett’stest(p<0.005).(B)N.benthamianaleafphenotypesuponP.infestansinfection.DetachedleavesofGFP-andRXLReffector-transgenicplantswereinoculatedwithP.infestanszoospores.Theserepresentativephotographsweretakenat120hpi.3.3.14候选RXLR效应基因功能初步分析为分析RXLR效应基因的毒性功能，我们在5周左右的本氏烟（Nicotiana75 benthamiana）叶片上瞬时表达一系列激发植物PTI（PAMPtriggeredimmunity）和ETI（Effectortriggeredimmunity）过程的细胞坏死诱导因子，包括BAX、INF1、NIP、Avh238和Avh421，24h后瞬时表达RXLR基因，观察其对PTI和ETI的抑制能力。挑选候选基因中的CRE2、CRE3、CRE5和CRE8进行测试，结果发现：这4个候选RXLR效应基因本身均不诱导坏死，但均可以抑制PTI和ETI。说明这4个早期高表达且保守的RXLR效应基因不是“无毒基因”，通过抑制PTI和ETI抗病过程发挥毒性功能（图3-15、3-16）。同时，我们也将CRE2、CRE3、CRE5和CRE8在马铃薯鉴别寄主MaR3（含有R3抗病基因）上进行了测试，结果发现：这4个候选基因均可抑制由Avr3a在马铃薯鉴别寄主MaR3引发的细胞坏死。说明这4个候选基因可通过抑制ETI发挥其毒性功能，增强病原菌的毒性（图3-14、3-15）。76 图3-14致病疫霉菌RXLR效应基因抑制植物的防卫反应。挑选侵染早期阶段高表达的候选RXLR效应基因并利用农杆菌系统在本氏烟（A-F）和寄主马铃薯叶片瞬时表达这些基因（G-N）。在本氏烟上，测试的RXLR效应基因均抑制一系列激发子引发的过敏性坏死反应，这些激发子包括：（A）BAX、（B）致病疫霉菌PAMP激发子INF1、（C）致病疫霉菌坏死诱导蛋白NIP、大豆疫霉菌RXLR效应基因Avh238（D）和Avh241（F）。红色圆圈中注射携带激发子的农杆菌细胞；白色圆圈注射携带RXLR效应基因的农杆菌细胞，包括：CRE2（PITG_04196）、CRE3（PITG_05750）和CRE5（PITG_06308），以及阴性对照GFP（A、E）和阳性对照Avh240（B、C、D)；致病疫霉菌RXLR效应因子Avr3aKI在马铃薯鉴别寄主MaR3上引发细胞坏死，瞬时表达RXLR效应因子（K）CRE2、（L）CRE3、（M）CRE5、（N）CRE8和（PITG_09160）可以抑制其引发的坏死；（G）阳性对照Avr3aKI；（H、I、J）阴性对照Avr3aEM、GFP及Avr3aKI+GFP；图中数字代表坏死出现次数和总注射次数间的比值。Figure3-14PlantdefensesuppressionactivitiesofselectedP.infestansRXLReffectorgenes.CandidateRXLReffectorgenesthatwerehighlyexpressedattheearlystageofplantinfectionwereselectedandA.tumefaciens-mediatedtransientexpressionassayswereperformedonN.benthamiana(A-F)andhostpotato(G-N).InN.benthamiana,allexaminedRXLReffectorgenessuppressedHRmediatedbyarangeofelicitorsincluding:(A)BAX;(B)theP.infestansPAMPelicitorINF1;(C)theP.infestansnecrosis-inducingproteinNIP;theP.sojaeRXLReffectorsAvh238(D)and(E)Avh241.TheredcircleindicatestheareainfiltratedwithA.tumefacienscellscarryingelicitorconstructs.ThewhitecircleindicatesA.tumefacienscellscarryingtheRXLReffectorgeneCRE2(PITG_04196),CRE3(PITG_05750),andCRE5(PITG_06308),thenegativecontrolGFP(A,E),andthepositivecontrolAvh240(B,C,D).InS.tuberosum,theP.infestansRXLReffectorAvr3aKIinducesHRinthedifferentialhostline‘MaR3’,whichwassuppressedbytransientexpressionofRXLReffectorgenes(K)CRE2,(L)CRE3,(M)CRE5,and(N)CRE8(PITG_09160);(G)thepositivecontrolAvr3aKI,and(H,I,J)thenegativecontrolAvr3aEM,GFP,andAvr3aKIplusGFP.Thenumbersshowtheratioofinfiltratedsitesthatdevelopedcelldeathversusthetotalnumberofinfiltratedsites.77 图3-15农杆菌介导的CRE8瞬时表达试验。（A）激发子包括：BAX、致病疫霉菌PAMP激发子INF1、致病疫霉菌坏死诱导蛋白NIP、大豆疫霉菌引发细胞坏死的RXLR效应因子Avh238和Avh241；抑制细胞坏死的大豆疫霉菌RXLR效应因子Avh240作为阳性对照；GFP和不抑制细胞坏死的RXLR效应因子PITG_22804作为阴性对照；图中数字代表坏死出现次数和总注射次数间的比值；（B）确认在本氏烟和马铃薯叶片上的瞬时表达试验。Figure3-15A.tumefaciens-mediatedtransientexpressionassaysofcandidateRXLReffectorCRE8(PITG_09160)wereperformedonN.benthamiana.(A)TheelicitorsincludeBAX,theP.infestansPAMPelicitorINF1,theP.infestansnecrosis-inducingproteinNIP,theP.sojaeRXLReffectorsAvh238andAvh241thattriggernecrosis.TheP.sojaeRXLReffectorAvh240thatsuppressescelldeathwasincludedasapositivecontrol,whileGFPandPITG_22804thatdisplayedneutralactivitytocelldeathwereincludedasnegativecontrols.Thenumbersshowtheratioofinfiltratedsitesthatdevelopedcelldeathversusthetotalnumberofinfiltratedsites.(B)ConfirmationofthetransientexpressionassaysinN.benthamianaandS.tuberosum.78 3.4讨论植物病原菌的核心效应因子是科学鉴选和利用持久抗病基因的理想靶标，但是我们对致病疫霉菌核心效应因子知之甚少。为了能够实现马铃薯中持久抗病基因的鉴定，加速其在育种中的应用，最终实现晚疫病的持久控制，本研究基于生物信息学分析，寻找致病疫霉菌侵染马铃薯早期高表达、核酸序列相对保守的候选RXLR效应基因，并通过初步的功能分析验证了部分候选RXLR效应基因在侵染早期可能发挥重要作用。考虑到：（1）对病原菌具有重要毒性功能效应因子基因序列保守且在病原菌群体中广泛分布；（2）已知的致病疫霉菌无毒基因均为侵染阶段诱导表达的RXLR效应因子基因，在本研究中，我们挑选了6个多态性相对较高的致病疫霉菌株，制备了早期侵染材料（12hpi，hourspostinoculation），并利用二代测序技术对侵染材料进行了转录组的高通量深度测序。基于（1）基因序列在菌株间保守；（2）在早期侵染阶段，基因具有较高的表达水平；（3）潜在的重要毒性功能三个标准。我们完成了致病疫霉菌中核心RXLR效应因子的鉴定。我们从国内多个马铃薯主产省份连续多年采集和分离致病疫霉菌系中，通过对2000多个致病疫霉菌分离物的群体分析，对国内马铃薯主产区的致病疫霉菌群体有了系统的认识，也为从群体水平鉴定致病疫霉菌的核心RXLR效应因子奠定了基础(Tianetal.,2015a;Tianetal.,2015b;Tianetal.,2016)。基于群体分析数据（例如SSR基因型、线粒体单倍型、交配型及毒性类型），我们从中挑选了6个代表性菌株用于下一步的分析，它们是：Pa21106、Pc51265、Pd21410和P31329（选自我国西北马铃薯种植区的致病疫霉菌群体），以及F48（选自我国南方马铃薯种植区的致病疫霉菌群体）。同时，我们的研究发现国内西北致病疫霉菌群体与欧洲群体区别明显，因此选自欧洲群体的菌株80029也用于下一步分析中(Tianetal.2016)。到2006年，卵菌上的几个无毒基因被成功克隆克隆，研究者通过这几个无毒基因的序列比对分析，从中发现了一个被称之为RXLR的基序（motif），随后发现了一系列N-端带胞外分泌信号肽中间含有RXLR的基序的基因，被统称为RXLR效应基因(Shanetal.2004;Armstrongetal.2005;Rehmanyetal.2005)。2009年致病疫霉菌完成基因组测序，从中发现了563个RXLR效应基因(Haasetal.2009)。同时研究还发现大豆疫霉菌（P.sojae）和橡树疫霉菌（P.ramorum）中也含有770个RXLR效应基因，它们构成了一个快速演化的基因超家族(Jiangetal.2008)。这些发现暗示着这些基因在致病过程中发挥重要作用(Birchetal.2006)。79 在进入后基因组时代（post-genomestage）之前，许多研究对致病疫霉菌的转录组特征进行过分析，发现了许多RXLR效应基因在侵染阶段上调表达，因此研究者推测RXLR效应基因可能与病原菌的致病性密切相关。例如基于芯片技术研究致病疫霉菌生活史中无性发育各阶段的转录组特征的分析就发现：在萌发休止孢和附着胞阶段有4个RXLR效应基因上调表达，而菌丝到休止孢阶段仅有1个RXLR基因上调，故推测这些基因对病原菌的成功定殖和完成侵染循环有贡献(Judelsonetal.2008)。围绕大量致病疫霉菌和茄科植物亲和及非亲和互作的测序数据进行的数据挖掘研究，也发现了大量在侵染植物阶段上调表达的基因，其中17个为RXLR效应基因(Sierraetal.2010)。Haasetal.(2009)通过对致病疫霉菌侵染寄主2-5天转录组特征进行分析，发现了更多在寄主-病原互作过程中上调表达的基因，其中79个是RXLR效应基因(Haasetal.2009)。Cookeetal.(2012)研究致病疫霉菌侵染马铃薯2-5天后致病疫霉菌转录组特征的分析发现，菌株06_3928A上调表达104个RXLR效应基因，而菌株NL07434则上调表达68个RXLR效应基因(Cookeetal.2012)。Zuluagaetal.(2015)利用454测序技术研究致病疫霉菌和番茄互作48小时、96小时和144小时的研究，发现了31个表达的RXLR效应基因(Zuluagaetal.2015)。本研究中，为了鉴定侵染早期高表达的RXLR效应因子，我们准备了12hpi侵染材料，并进行了Illumina高通量深度测序，获得了超过四千万条的测序reads。其中，有大约两百万条测序reads成功比对到致病疫霉菌T30-4的参考基因组上。转录组测序结果共检测到245个表达的RXLR效应基因，平均每个菌株中160个，说明RXLR效应基因在早期侵染阶段（12hpi）存在普遍诱导表达的现象。此外，同前人的研究相比，我们检测到更多的RXLR效应因子在侵染早期表达。这可能是由于测序平台的不同，我们采用了Illumina高通量测序平台，而前人采用芯片平台(Haasetal.2009)；此外，在测序平台相同的情况下，但我们的数据量远高于前人的研究(Zuluagaetal.2015)，其原因尚待明了。表达水平分析发现RXLR效应基因的表达水平明显高于转录组中的其它基因，这与RXLR效应基因的功能相符，即在病原-寄主互作阶段其分泌毒性因子到寄主细胞发挥毒性功能抑制植物免疫防卫反应(Haasetal.2009)，因此在侵染阶段显著的上调表达。有趣的是，几乎一半的（108/245）RXLR效应因子在所有检测的菌株间均表达（该分析未包含P31329）。此外，许多的RXLR效应因子（44/108）为单个菌株特异表达。Cooketal.(2012)曾比较菌株中RXLR效应因子的表达情况和菌株毒性间的关系，发现毒性高的菌株表达更多的RXLR效应因子，因此他们认为RXLR作为毒性因子可以决定或增80 强菌株的毒性。结合我们的分析结果，我们认为作为毒性因子，共表达的RXLR效应因子在一定程度上决定菌株的基础致病能力，而菌株特异表达的RXLR效应因子在一定程度上决定菌株间的毒性分化。而至于哪些RXLR效应因子在菌株毒性分化中发挥作用，还需要开展深入和系统的功能分析工作才能予以回答。为了鉴定序列保守的核心RXLR效应因子，我们挑选了侵染早期5个菌株间均高水平表达的部分基因（47/108）进行进一步的分析。Bartetal.(2012)通过基因序列的SNPs分析挑选保守的核心效应因子，本研究也采取了类似的策略，提取245个RXLR效应因子的SNPs并计算其dN/dS比值。通过该分析，我们鉴定到了23个致病疫霉菌侵染早期在菌株间普遍高水平表达且蛋白编码序列高度保守的RXLR效应因子。随后我们对这23个基因进行了系统发育分析，发现PITG_14954、PITG_14959、PITG_14961和PITG_14962虽然被分配了不同基因ID，但它们具有相同的核酸序列，因此统一命名为CRE11（CoreRXLREffector11）。此外，PITG_16233和PITG_16240具有相同的核酸序列，统一命名为CRE13。PITG_23014和PITG_23015也具有相同的核酸序列，统一命名为CRE16。最终，通过序列分析我们将这些候选划分为18个核心RXLR效应因子基因。核心效应因子与病原菌的毒性密切相关，为了确认本研究中鉴定到的核心RXLR效应因子是否对致病疫霉菌具有毒性贡献，我们挑选其中9个核心效应因子在本氏烟叶片瞬时表达，随后接种致病疫霉菌。结果发现，相比于表达对照GFP，表达核心RXLR效应因子的叶片病斑直径明显更大，说明测试的核心效应因子可以促进致病疫霉菌的侵染和扩展，从而证明这些效应因子在寄主-病原互作过程中是有毒性贡献的。BAX、INF1、NIP、Avh238和Avh241为细胞坏死诱导因子，可以激发植物的PTI和ETI过程(Wangetal.2011)。为了进一步揭示核心RXLR效应因子的毒性功能，我们将这些细胞坏死诱导因子在本氏烟叶片瞬时表达，随后在叶片相同位置瞬时表达4个RXLR效应因子，结果发现，测试的4个效应因子均抑制所有细胞坏死诱导因子引发的坏死，表明测试的效应因子可以通过抑制植物的PTI和ETI过程而发挥其毒性功能。同时，我们也在马铃薯上测试了核心RXLR效应因子的细胞坏死抑制能力。马铃薯鉴别寄主MaR3含有R3抗病基因，可以识别Avr3aKI，激活防卫反应并最终导致细胞坏死。测试发现在MaR3瞬时表达测试的4个核心RXLR效应因子可以抑制Avr3aKI引发的过敏性坏死反应，表明这些侵染早期高表达且序列保守的核心RXLR效应因子在抑制寄主马铃薯的ETI反应过程中发挥重要作用。Cooketal.(2012)研究致病疫霉菌和马铃薯互作2dpi和3dpi侵染材料时，在三个81 致病疫霉菌菌株中（06_3924A、NL07434和T30-4）发现了45个侵染阶段普遍诱导表达的核心RXLR效应因子，其中包括5个无毒性的RXLR效应因子（目前研究已发现这5个无毒性的RXLR效应因子已发生变异并重新获得毒性的，且毒性的变异类型广泛存在于现在的致病疫霉菌群体中，暗示了Cook等识别到的核心RXLR效应因子并不保守）。本研究中，我们通过生物信息学分析鉴定到18个在5个致病疫霉菌中均普遍高水平表达且序列保守的RXLR效应因子，它们中不含有10个已知无毒基因中的任何一个。且测试的部分核心RXLR效应因子具有重要的毒性功能，可以促进侵染和抑制植物的免疫防卫反应。综合这些结果来看，我们鉴定到的RXLR效应因子更符合核心效应因子的定义，也与功能重要的基因进化上往往受到负选择压力而导致序列保守这一事实相符(Dangletal.2013)。更重要的是，本研究中鉴定到的18个核心效应因子均为侵染早期高表达（12hpi），若鉴定到相应的抗病基因并导入马铃薯品种中，可在侵染早期阶段就实现抗病过程的激活，并迅速控制病害的发生和发展，降低病害发生造成的损失。到目前为止，致病疫霉菌中已经克隆到10个无毒性的RXLR效应因子，研究者也已经对它们的毒性变异类型进行了系统的分析(VleeshouwersandOliver2014)。然而，这10个无毒基因在我国致病疫霉菌群体中的毒性变异类型信息较少。因此，本研究中，我们进行了10个无毒基因序列变异模式和表达模式的分析（因菌株P31329测序数据不足，未包含在该分析中）。Avr1仅在欧洲菌株80029中检测到表达，国内菌株Pa21106、Pc51265、Pd21410和F48中均未检测到表达。Cooketal.(2012)的研究同样发现Avr1在菌株06_3928A侵染阶段不表达，且基因组重测序发现，该基因已经被菌株从基因组中删除。据此，我们推测Avr1在国内菌株中同样被删除，或者至少在侵染早期阶段不表达。Avr2在5个菌株中均高水平表达，序列分析发现在菌株80029、F48、Pa21106和Pc51265中31位氨基酸发生变异（Asparagine变为了Lysine），菌株Pd21410中31位氨基酸未发生变异，前人研究已发现该变异与无毒性没有关系(Gilroyetal.2011)。Avr3a在5个菌株中均高水平表达，且均为E80M103型等位基因（80位氨基酸为Glutamicacid，103位氨基酸为Methionine）(Armstrongetal.2005)。Avr4在菌株Pa21106和F48中低水平表达，序列分析发现196位核苷酸变异导致终止密码子提前出现。虽然本研究中未在80029菌株中检测到Avr4终止密码变异（原因是Avr4在该菌株中的低水平表达或不表达），但前人研究已经证明Avr4在菌株80029菌株中也是存在终止密码子变异的(vanPoppeletal.2008)。综合这些结果，我们认为带有提前终止密码子而截短的AVR4广泛存在于致病疫霉菌群体中。Avrblb1在5个菌株中普遍高水平表达，ipiO4也检测到普遍高表达，而且ipiO4可以抑制抗病基因Rpi-blb1识别Avrblb1而激活的防卫反应82 (Champouretetal.2009;Chenetal.2012)。Avrvnt1、AvrSmira1和AvrSmira2在5个菌株中高表达，序列变异分析虽然在基因中检测到了SNPs的存在，但均与它们的无毒性不相关(Pel2010;Rietmanetal.2012)。总的来说，国内致病疫霉菌群体仍含有多个表现无毒性的效应因子，它们可以激活含有抗病基因R2、Rpi-blb2、Rpi-vnt1、Rpi-Smira1和Rpi-Smira2的马铃薯品种的抗病反应。本研究也分析了8个具有抑制Flg22激发的早期免疫反应（SuppressorofearlyFlg22-inducedImmuneresponse，SFI）的RXLR效应因子(Zhengetal.2014)。结果发现SFI2、SFI3和SFI4在5个菌株中均检测到高水平表达，表明它们可能在侵染早期阶段普遍发挥毒性功能，抑制植物的防卫反应。SF1、SF6和SFI8未检测到表达，或在个别菌株中低水平表达，表明它们可能不在侵染早期发挥功能。SFI5和SFI7的功能在菌株间可能存在差异，原因是其表达水平在菌株间差别较大。例如SFI7在菌株80029和F48中高水平表达，但在菌株Pa21106、Pc51264和Pd21410中未检测到表达。虽然这8个SFIRXLR效应因子在抑制植物的PTI中发挥作用，但它们均不符合我们对核心效应因子的筛选标准，说明它们的毒性功能或许对病原的致病性不是必须的，至少可能在早期侵染阶段不是必须的。10个无毒性和8个毒性RXLR效应因子的变异分析表明我们可以从群体水平监控病原菌的毒性结构，基于所有的RXLR效应因子的变异分析追踪菌株的毒性变异情况，并基于该分析结果更合理的在田间布局相应的抗病基因，最终实现马铃薯晚疫病的有效控制。但是，我们必须说明的是本研究仅对侵染早期的一个时间点进行了RXLR效应因子基因的序列变异和表达模式分析，而更多时间的样品（例如9hpi、12hpi和15hpi）同时分析，会使我们对RXLR效应因子的表达情况有一个更全面的认识。在后续研究中，我们将开展更多致病疫霉菌菌株和更多早期侵染时间点RNA-seq工作，以期更全面的理解RXLR效应因子的表达模式和变异类型。目前，针对这些保守的RXLR效应基因候选的研究工作仍在进行中，我们希望不仅从生物学功能和作用机理方面更好的分析这些基因，同样希望能够找到这些RXLR效应基因对应的抗病基因，并通过抗病育种将其引入新的抗病品种，实现持久抗病性。83 第四章结论和创新点4.1结论我们对101个马铃薯主栽品种和新育品种（系）进行了田间抗病性评价，并结合10个已克隆无毒基因的瞬时表达来分析研究主栽品种的抗病基因构成。同时对遗传背景高度分化的6个致病疫霉菌株进行转录组分析，初步筛选致病疫霉菌侵染早期高表达且序列相对保守的核心效应基因，并对部分效应基因的功能进行了分析，获得以下结论：1．田间抗性鉴定发现19个马铃薯品种表现高抗，大部分品种表现中抗到高感。无毒基因瞬时表达分析发现，在20个马铃薯品种中，除中薯3号中未检测到已知的10个抗病基因外，其它品种含有3到10个抗病基因；主栽品种中抗病基因发生替换，早期推广的抗病品种含有早期应用的抗病基因，新推广品种多含有后期应用的抗病基因；高抗品种含有更多的抗病基因，一般即含有早期应用的抗病基因，也含有后期应用的抗病基因。2．采用Illumina高通量转录组测序，从6个样品中得到46G数据，其中2,337,987条（1%）序列（reads）属于致病疫霉菌。经基因拼接后从6个菌株中检测到245个表达的RXLR效应基因，平均每个菌株中检测到160个。表达特征分析发现，RXLR效应基因的整体表达水平比转录组整体水平高2-3倍，说明在侵染早期阶段有大量的RXLR效应基因高度上调表达。通过生物信息学分析，在128个效应基因中共检测到468个单碱基（SNP）变异，183个同义替换，266个非同义替换，表明效应基因的多态性水平高，有众多替换发生，而非同源替换多于同义替换说明正选择高于负选择。基于序列保守且侵染早期阶段高表达，我们鉴定到23个候选核心效应基因。经序列比对分析，将它们最终划分为18个候选的核心RXLR效应因子（CoreRXLReffector，CRE）基因。选取其中9个CRE进行毒性测试，发现它们均可促进致病疫霉菌的侵染。选取4个CRE在本氏烟和马铃薯叶片瞬时表达，初步功能分析发现它们均抑制由BAX、INF1、NIP、Avh241和Avh238引发的PTI和ETI反应。表明这些效应基因在侵染早期通过抑制植物防卫反应而发挥毒性作用。这些核心CRE候选可作为重要工具，用于持久抗病基因的鉴定和抗病育种中。4.2创新点本研究结合大田评价和室内分析，系统地对我国西北主栽马铃薯品种的晚疫病抗性水平进行分析，包括大田的晚疫病抗性表现，利用根癌农杆菌介导的基因瞬时表达技术，分析了20个主栽马铃薯品种对10个已知无毒基因的识别情况，据此认识了马铃薯品种中已知抗病基因的存在情况，这些结果为基于品种合理使用和布局的马铃薯晚疫病防治84 提供了参考；初步鉴定获得18个致病疫霉菌致病关键的候选核心RXLR效应基因。通过对致病疫霉菌侵染早期（12hpi）的转录组分析，鉴定到致病疫霉菌侵染早期高表达、序列保守的候选核心RXLR效应基因18个，对其中9个基因在本氏烟上的测试表明它们可以通过贡献毒性功能而促进病原菌的侵染和定殖，对其中4个基因在本氏烟和马铃薯上的毒性功能分析表明，这些候选基因抑制PTI和ETI。这些结果为认识致病疫霉菌致病机理和马铃薯抗晚疫病基因挖掘奠定了重要的基础。也为有效地追踪抗病基因，辅助抗病基因聚合提供了高效地手段。85 参考文献谷茂,马慧英,薛世明.1999.中国马铃薯栽培史考略.西北农业大学学报,27(1):80-84.顾彪.2012.植物病原卵菌和真菌效应蛋白转运机制研究.[博士学位论文].陕西杨凌:西北农林科技大学.顾彪,尹军良,单卫星.2013.利用晚疫病菌效应基因辅助马铃薯抗病育种.2013年中国马铃薯大会论文集.重庆,192-200.韩长志.2015.全基因组预测樟疫霉的候选效应分子.南京林业大学学报（自然科学版）,39(2):69-74.李会平.2014.抗病性鉴定圃马铃薯晚疫病菌群体遗传多样性分析.[硕士学位论文].陕西杨凌:西北农林科技大学.娄树宝.2010.马铃薯晚疫病菌抗药性研究现状.黑龙江农业科学,32(7):165-168.马云芳.2012.西北马铃薯主产区致病疫霉菌线粒体DNA单倍型分析.[硕士学位论文].陕西杨凌:西北农林科技大学.孙洁平.2012.西北马铃薯主产区晚疫病菌毒性分析.[硕士学位论文].陕西杨凌:西北农林科技大学.孙银银.2010.西北部分地区致病疫霉菌的交配型分布和遗传多样性初步分析.[硕士学位论文].陕西杨凌:西北农林科技大学.田月娥.2015.我国马铃薯主产区致病疫霉菌群体遗传多样性研究.[博士学位论文].陕西杨凌:西北农林科技大学.叶文武.2013.疫霉菌基因组与转录组的生物信息学研究.[博士学位论文].南京:南京农业大学.张美祥.2012.寄生疫霉菌结构独特的质膜氢离子通道蛋白基因PnPMA1功能的初步研究.[博士学位论文].陕西杨凌:西北农林科技大学.张鹏.2015.我国薯类基础研究的动态与展望.生物技术通报,31(4):65-71.张志铭,李玉琴,田世民,朱杰华,王军,宋伯符.1996.中国发生马铃薯晚疫病菌(Phytopthorainfestans)A2交配型.河北农业大学学报,19(4):65+62-65.赵志坚,曹继芬,李灿辉,孙道旺,杨明英,王军.2007.云南致病疫霉菌交配型、甲霜灵敏感性、mtDNA单倍型及其群体演替研究.中国农业科学,40(4):727-734.朱杰华,张志铭,李玉琴.2000.马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)A2交配型的分布.植物病理学报,30(4):375-375.ArmstrongMR,WhissonSC,PritchardL,BosJIB,VenterE,AvrovaAO,RehmanyAP,BöhmeU,BrooksK,CherevachI,HamlinN,WhiteB,FraserA,LordA,QuailMA,ChurcherC,HallN,BerrimanM,HuangS,KamounS,BeynonJL,BirchPRJ.2005.AnancestraloomycetelocuscontainslateblightavirulencegeneAvr3a,encodingaproteinthatisrecognizedinthehostcytoplasm.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,102(21):7766-7771.BourkePMA.1964.Emergenceofpotatoblight,1843-46.Nature,203(4947):805-808.86 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致谢时光飞逝，如白驹过隙，转瞬间到了毕业的这一刻，回首过去的几年，内心激动不已，回忆往昔，一切犹如昨日般历历在目。2011年，我非常荣幸地成为了单卫星老师的博士研究生，在过去的几年里，我得到了单老师悉心的教导和培养，在学习、工作和生活等方方面面，均得到了极大的成长。同时认识了好多同学和朋友，自我们相识一路走来，总是感觉充满欢声笑话，让生活充满快乐，总是相互打气和加油助威，让内心充满力量。博士五年的生活，曾受到老师和同学们太多无私的帮助和关怀，对你们的感激之情难以言表。首先，对培养和教导我的恩师单卫星教授表示真挚的感谢，是您的谆谆教诲培养了我的能力，使我在科研工作上向高峰攀登；是您在生活上对我的关心，使我感到无限的温暖，让我在科研道路上无畏风雨，勇往直前；是您严谨的科研和工作态度，深深的影响了我，使我不断的提醒自己要细心仔细，少了许多马虎大意；是您勤奋的作风激励了我，让我可以沉下心来，扎扎实实的在科研道路上前行。老师您在这些方面对我的培养和影响，将成为我人生最宝贵的财富，将深刻的影响和激励我的人生，在未来的人生道路上，这些收获将让我走的扎实、稳定。其次，感谢实验室的各位老师、师兄、师姐、师弟、师妹，在过去的工作、学习和生活中，受到了你们太多无私的帮助，是你们让我博士阶段的生活变得生动、饱满和热情，感谢在我试验设计和开展过程中，给予我的帮助和指导。感谢实验室的权军利老师，对实验室所付出的辛勤努力和认真管理，使我们毫无后顾之忧的开展工作；感谢顾彪师兄和张美祥师兄对我的指导和帮助，使我从你们身上学到了知识，也非常怀念我们探讨科研问题的那些时光，使我受益匪浅，同时也被两位师兄渊博的知识和深厚的底蕴所震撼；感谢刘君老师，对我来说刘君老师犹如一位大姐姐般关心着我们，回首我们一起工作、学习和生活的点点滴滴，总是感到特别的温暖；感谢刘巍和赵华师姐；感谢王燕和邓风艳师姐；感谢王秦虎、孟玉玲和曹华同学，感谢实验室的师弟樊光进、张强、贾津布、王钢、罗世志、黄一华、蓝星杰、杨志远，师妹李婷婷、黄桂艳、李卫卫、钟成承、文曲江、许俊洁、勾秀红、路文琴和李金芳；感谢马铃薯晚疫组的成员田月娥师姐、李会平、马红梅、马云芳和吴鹏同学。感谢甘肃省天水市中梁实验站的吕汰所长、王鹏所长以及全体工作人员为田间试验提供的大力支持。再次，在漫长的求学道路上家人同样给予了我无私的支持和关爱，使我坚定执着的走到今天，他们的理解和支持总是使我内心充满力量和斗志。感谢我的爱人朱永兴，感谢一直以来你对我的关心和帮助，感谢你无微不至的体贴和关怀，无论外面多大的风雨，走近你的身边总是让我可以卸下疲惫，感到无限的温暖。在即将毕业的这一刻，许多的99 人和许多的事从内心深处不断浮现，有尊敬的老师，有可爱的同学，有满怀期待的父母，有叮咛的亲朋好友。每念及此，总会使我内心充满对你们的感恩，值此毕业之际，在此万分诚挚的对你们说一声：谢谢！尹军良2017年11月于陕西杨凌100 作者简介尹军良，男，中共党员，1985年11月出生，山东省安丘市人。2008年6月毕业于青岛农业大学植物保护学院，获得农学学士学位；2011年6月毕业于西北农林科技大学植物保护学院植物病理学专业，获农学硕士学位，硕士期间师从井金学教授从事小麦抗锈病遗传机制研究；2011年9月保送到西北农林科技大学植物保护学院攻读植物病理学专业博士学位，师从单卫星教授，主要从事致病疫霉菌和马铃薯互作研究。攻读博士期间，主要参与了国家自然科学基金“致病疫霉菌致病关键的效应蛋白基因的鉴定和初步利用研究”（#No.31301644）和国家现代农业产业体系“北方晚疫病防控”（#No.CARS-10）等项目。攻读博士研究生期间已发表论文：1.YinJL,GuB,HuangGY,TianYE,QuanJL,Lindqvist-KreuzeHandShanWX.2017.ConservedRXLReffectorgenesofPhytophthorainfestansexpressedattheearlystageofpotatoinfectionaresuppressivetohostdefense.FrontierinPlantScience,8:2155.2.TianYE,YinJL,SunJP,MaYF,WangQH,QuanJL,andShanWX.2016.PopulationgeneticanalysisofPhytophthorainfestansinnorthwesternChina.PlantPathology,65(1):17-25.3.TianYE,YinJL,SunJP,MaHM,MaYF,QuanJL,andShanWX.2015.PopulationstructureofthelateblightpathogenPhytophthorainfestansinapotatogermplasmnurseryintwoconsecutiveyears.Phytopathology,105(6):771-777.101