资源描述：
《细胞融合病毒全基因序列分析与全长cDNA克隆的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：密级：ｔＵＤＣ：：．编号安徽医科大学学位论文论文题目细胞融合病毒全基因序列分析与全长ｃＤＮＡ克隆的构建英文题目ｕｅｎｃｅａｎａ－ＣｏｍｐｌｅｔｅｅｎｏｍｅｓｅｌｓｉｓａｎｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｆｕｌｌｌｅｎｔｈｇｑｙｇｃＤＮＡｃｌｏｎｅｏｆｃｅｌｌｆｕｓｉｎａｅｎｔｖｉｒｕｓｇｇ姓名：郝嘉男指导教师姓名秦成峰研究员安徽医科大学军事医学科学院微生物流行病研究所申请学位级别硕士专业名称微生物学３论文答辩日期２０１７．提交论文日期２０１７．１０．２．１２０２学位授予单位和日期安徽医科大学答辩委员会主席安静评阅人年月 学位论文独创性声明￣ｋ；＞３本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究。据我所知成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意＾学位论文作者签名：邊表４日期：学位论文使用授权声明本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权允许论文进入学校图书馆被查阅入有关数据库进行，有权将学位论文的内容编。《检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版愿意将本人的学位论文提交中国博士学位论文全文数据库》、《中国优秀硕士学位论文全文数据库》和《中国学位论文全文数据库》中全文发表，并可以以电子、网络及其他数字媒体形式公开出版，并同意编入ＣＮＫＩ《中国知识资源总库》，在《中国博硕士学位论文评价数据库》中使用和在互联网上传播。保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名：曰期： 目录目录缩略词表.....................................................................................................1中文摘要.....................................................................................................2前言............................................................................................................11第一部分细胞融合病毒全基因序列分析.............................................16第二部分细胞融合病毒核酸检测方法的建立.....................................26第三部分细胞融合病毒基因组全长cDNA克隆的构建......................33结论............................................................................................................47参考文献...................................................................................................48附录............................................................................................................51致谢............................................................................................................52综述............................................................................................................53 缩略词表缩略词表英文缩写英文全称中文全称kbkilobase千碱基CPEcytopathiceffect细胞病变效应CFAVcellfusingagentvirus细胞融合病毒CHYVchaoyangvirus朝阳病毒ISFInsect-SpecificFlavivirus昆虫特异性黄病毒MBFVMosequitoBorneFlaviviruses蚊宿主黄病毒mRNAmessengerRNA信使RNASLstemloop茎环结构JEVJapaneseencephalitisvirus日本脑炎病毒ZIKVZikavirus寨卡病毒KRVKamitiRivervirusKamiti河病毒C6/36Aedesalbopictuscellline白纹伊蚊传代细胞Aag2Aedesaegypticellline埃及伊蚊传代细胞UTRuntranslatedregion非编码区PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应RT-PCRreversetranscription-polymerasechain逆转录-聚合酶链式反应reactionPBSphosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液SDMSchneider’sDrosophilaMedium施耐德果蝇培养基FBSfetalbovineserum胎牛血清DMEMdulbecco'smodifiedeaglemediumDMEM培养基Ampampicillin氨苄青霉素1 摘要摘要细胞融合病毒全基因序列分析与全长cDNA克隆的构建细胞融合病毒（cellfusingagentvirus，CFAV）是一种蚊媒病毒，与重要的人类病原登革病毒和黄热病毒同属于黄病毒科黄病毒属。与登革病毒和黄热病毒类似，细胞融合病毒的基因组也由编码区、5´非编码区（5´UTR）和3´(3´UTR)非编码区组成。编码区共编码十种蛋白，三种结构蛋白（C、prM/M、E）和七种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。细胞融合病毒因能够引起白纹伊蚊细胞的融合现象而得名，这种病毒最初是在实验室培养的埃及伊蚊细胞中发现。随后，研究者从自然界蚊虫体内也分离到该病毒。基因组进化分析表明，细胞融合病毒与登革病毒、黄热病毒等黄病毒具有一定相似性。相比其他黄病毒，细胞融合病毒具有蚊虫特异性，不能感染脊椎动物，也不能在蚊细胞外的其他动物细胞内复制。研究发现，细胞融合病毒与登革病毒在自然界蚊子体内存在共感染现象。这种共感染对登革病毒的胞内复制与流行分布的影响目前尚不清楚。目前细胞融合病毒相关研究主要集中在病毒分离鉴定和进化分析，较少涉及其分子机制和生物学意义。这主要是因为缺少可以直接从基因层面操作该病毒的工具—反向遗传学系统，而构建反向遗传学系统的第一步是构建细胞融合病毒的全长cDNA克隆。反向遗传学是在获得生物体基因组全长序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变基因插入缺失、基因置换，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，从而研究生物体基因组的结构与功能。RNA病毒的反向遗传学，是采用病毒的遗传物质，在易感细胞中重新拯救出活病毒，一般是在细菌质粒中插入整个病毒基因组的cDNA拷贝，使得cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA具有感染性。RNA病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列,检测被拯救的人工改造病毒的表型，可以在体内有效地研究病毒基因结构、功能和病毒-宿主相互作用。目前反向遗传2 摘要学技术已经十分成熟，许多RNA病毒的全长感染性克隆构建已经成功。成功构建细胞融合病毒的反向遗传系统可以直接对其基因进行操作，对于认识和深入改造病毒具有重要意义，进一步还可以此作为工具研究病毒特异性感染机制。本研究首先构建了23株黄病毒的系统进化树，明确了细胞融合病毒与其他黄病毒的进化关系，并且重点比较了细胞融合病毒与寨卡病毒，kamiti河病毒，朝阳病毒基因序列差异，同时对其结构蛋白和非结构蛋白进行了同源性比较。进一步我们分析Genbank上两株细胞融合病毒的基因序列，获得其保守序列后，设计了qRT-PCR的引物和探针，利用此引物和探针可以特异的、高效的检测到细胞融合的基因组，并且与寨卡病毒和乙脑病毒无交叉反应，为检测细胞融合病毒提供了有效的技术手段。之后通过体外全基因合成的手段获得细胞融合病毒的全序列DNA分片段，再通过体外连接的方法将其连接成完整的细胞融合病毒的全长cDNA，此研究为细胞融合病毒反向遗传学系统的构建提供了基础。本研究包括如下三个部分：一．细胞融合病毒全基因序列分析:通过Genbank数据库下载到3株细胞融合病毒序列，其中两株基因序列完全一致，本研究还挑选了其他21株黄病毒全基因序列与细胞融合病毒共同构建了系统进化树。通过分析对比确定了细胞融合病毒在黄病毒系统进化树种的位置，后分别比较了细胞融合病毒与寨卡病毒、Kamiti河病毒和朝阳病毒的C、prM/M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5蛋白基因序列和氨基酸序列。发现虽然细胞融合病毒在进化关系上与朝阳病毒接近，但是与寨卡病毒的基因同源性为41.2％，与朝阳病毒的基因同源性为40.7％。细胞融合病毒与寨卡病毒氨基酸序列同源性为25.4％，与朝阳病毒氨基酸序列同源性为25.5％。对细胞融合病毒非编码区的二级结构进行预测后发现细胞融合病毒Galveston株非编码区的5'-UTR长为103nt，其5'-UTR具有帽子结构，并且含有两个保守的茎环（stemloop，SL）结构SLA和SLB。细胞融合病毒Galveston株3'-UTR长为553nt，含有多个保守的线性序列及二级结构，分为A1、A2和A3三个结构域。通过与登革2型病3 摘要毒的5'-UTR和3'-UTR结构对比，对细胞融合病毒二级结构的功能进行预测。二．细胞融合病毒毒检测方法的建立：细胞融合病毒最初是由Stollar和Thomas在实验室培养的埃及伊蚊细胞当中发现的，进一步分析表明，细胞融合病毒对白纹伊蚊细胞的感染可以引起后者发生细胞融合现象，且细胞融合病毒引起细胞融合的能力只有在白纹伊蚊细胞当中有效。我们分析NCBI上两株细胞融合病毒的基因序列，在其NS2A基因序列上获得其保守序列，设计了qRT-PCR的引物和探针。用包含细胞融合病毒NS2A基因序列的质粒标准品来检测所设计的PCR引物和探针的敏感性，检测结果为阳性，检测下限为150拷贝／ml。用登革2型病毒、寨卡病毒和日本脑炎病毒来检测所设计的PCR引物和探针的特异性，检测结果皆为阴性。从以上结果可以看到，我们所设计的检测方法具有较好的敏感性和特异性。在此基础上，本研究对本实验室Aag2和C6/36细胞是否含有内源性细胞融合病毒进行了分析。通过上述实验设计的RT-PCR引物对本实验室的Aag2和C6/36细胞中的RNA进行检测，实验结果证实本实验室Aag2细胞和C6/36当中并不含有内源性的细胞融合病毒。三．细胞融合病毒基因组全长cDNA克隆的构建与鉴定：按照细胞融合病毒Galveston株的全基因序列，通过体外基因合成的手段获得覆盖病毒全基因的3个DNA片段，分别命名为A，B和C。A为长度1-3414nt，B长度为3400-6596nt，C长度为6591-11395nt，每个片段均克隆在pBR002载体中，分别为pBR002-A、pBR002-B和pBR002-C。先利用限制性内切酶XbaI和AgeI将pBR002-B、pBR002-C片段酶切，通过T4DNA连接酶将B和C´连接，挑取含有BC´片段的pBR002-BC´克隆。将pBR002-A通过NotIF和Bst171IR两个引物进行PCR反应获得的A´片段与pACNR载体进行连接，得到pACNR-A质粒。将得到的pACNR-A和pBR002-BC´分别用XbaI和Bst171I酶切，酶切片段BC与pACNR-A连接后即得到具有细胞融合病毒全长cDNA克隆的CFAV-pACNR质粒。通过SnaI酶切鉴定及测序结果分析后，得到了细胞融合病毒全长cDNA克隆。通过对细胞融合病毒系统进化树的构建及全基因组分析，为细胞融合病毒的研究提供了基础数据。基于序列分析，我们针对细胞融合病毒设计了特异性的4 摘要qRT-PCR探针和引物，对引物的灵敏性和特异性进行了评价。获得了细胞融合病毒全长cDNA克隆，为后续病毒的复制和致病的分子机制研究奠定了坚实基础。关键词:细胞融合病毒蚊媒黄病毒全长cDNA克隆5 AbstractAbstractCompletegenomesequenceanalysisandconstructionofafull-lengthcDNAcloneofcellfusingagentvirusCellfusingagentvirus,(CFAV）isakindofmosquito-borneviruses.CFAVanddenguevirus,animportanthumanpathogen,bothbelongtoflavivirus,flaviviridae.Similartodenguevirusandyellowfevervirus,thegenomeofCFAVisalsocomposedofcodingregion,5'untranslatedregion（5´UTR）and3'untranslatedregion(3´UTR).Thecodingregioncodes10kindsofproteinsintotal,including3structuralprotein（C,prM/M,E）and7non-structuralprotein（NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B,NS5）.CellfusingagentviruswasnamedforcausingAedesalbopictuscellstofuse.Thisviruswasfirstfoundinlaboratory-grownAedesaegypticells.Lateron,researchersalsoisolatedthesamevirusinnaturalmosquitoes.Genomeevolutionanalysisindicates,Cellfusingagentvirushassomesimilaritieswithdenguevirusandyellowfevervirus.Comparedwithotherflaviviruses,cellfusingagentvirusisspecificformosquitoes,sothatitcannotinfectvertebrateorreplicateinotheranimalcellsexceptformosquitocells.Accordingtoresearch,thereiscoinfectionphenomenonofcellfusingagentvirusanddenguevirusinnaturalmosquitoes.Theinfluenceofcoinfectionontheintracellularreplicationandepidemiologicaldistributionofdenguevirusisnotclearyet.Sofar,researchofcellfusingagentvirusmainlyfocusesonisolationandidentificationofvirusandevolutionanalysis,andlittleattentionispaidtoitsmolecularmechanismorbiologicalsignificance.Thisisduetolackingtechniqueformanipulatingthevirusdirectlyongenelevelreversegeneticssystem.Andthefirststepofconstructingreversegeneticssystemistoconstructthefull-lengthclonesofcDNAcellfusingagentvirus.Reversegeneticssystemistoassembleactiveindividualsandstudystructureandfunctionoforganismgenomebymodifyingthetargetgene,suchasinsert/deletesite-directedmutatedgenesandgenereplacement,thenconstructingmodifiedgenome6 Abstractcontainingnecessaryelementsfororganismonthebasisofgettingfull-lengthgenesequenceoforganismgenome.RNAreversegeneticssystemissalvaginglivingvirusfromsusceptiblecellsusingthegeneticmaterialofvirus.TheprocedureistoinsertcDNAcopyofthewholevirusgenomeintobacterialplasmidinordertomakecDNAitselforRNAtranscribedinvitrofromcDNAinfectious.ReversegeneticssystemofRNAviruscandetectthephenotypeofthesalvagedmodifiedvirusbydirectionalmodifyingthegenomesequenceofvirusandcanstudyvirusgenestructure,functionandvirus-hostcellinteractioninvivoefficiently.Nowreversegenetictechniquehasbeenverymature.Manyfull-lengthinfectiousclonesofRNAvirushavebeensuccessfullyconstructed.Constructingreversegeneticssystemofcellfusingagentvirussuccessfullyenablesmanipulatingthegenesdirectlyandplaysanimportantroleinunderstandingandmodifyingvirus.Furthermore,itcanserveasatoolforstudyingthemechanismofvirus-specificinfection.Thisstudyfirstconstructedphylogenetictreeof23flavivirusesandclarifiedtheevolutionaryrelationshipbetweencellfusingagentvirusandotherflaviviruses.ThegeneticsequencedifferencesbetweencellfusingagentvirusandZikavirus,kamitirivervirus,Chaoyangviruswasmainlycompared.Meanwhile,homologycomparisonwasperformedonitsstructuralproteinandnon-structuralprotein.Furthermore,weanalyzedthegenesequencesof2cellfusingagentvirusesfromGenbankanddesignedprimersandprobesforqRT-PCRaftergettingitsconservedsequence.Usingtheprimersandprobeswecandetectthegenomeofcellfusingagentvirusspecificallyandefficiently.Itdoesnotcross-reactwithZikavirusorJapaneseencephalitisvirusandthusprovidedefficienttechniquefordetectingcellfusingagentvirus.Lateron,wegotfullDNAsequencesofviruswithtotalgeneticsynthesismethodinvitroandligatedthemintocompletefull-lengthcDNAofcellfusingagentvirusinvitro.Thisstudyestablishedthebaseforconstructingreversegeneticssystemofcellfusingagentvirus.Thisstudyiscomposedofthefollowing3parts:7 Abstract1.Wholegenomesequenceanalysisofcellfusingagentvirus:Wedownloaded3ofcellfusingagentvirussequencesviaGenbankdatabase.Twogenesequenceswerecompletelyidentical.Ourstudyalsopickedwholegenesequencesofother21flavivirusesandconstructedphylogenetictreewithcellfusingagentvirus.WeidentifiedthepositionofcellfusingagentvirusinphylogenetictreebycontrastiveanalysisandthencomparedtheC,prM/M,E,NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B,NS5proteinsequencesandaminoacidsequencesofcellfusingagentvirusandZikavirus,kamitirivervirus,Chaoyangvirus.WefoundthatalthoughcellfusingagentviruswasclosetoChaoyangvirusinevolutionaryrelationship,itsgenetichomologywithZikaviruswas41.2％，anditsgenetichomologywithChaoyangviruswas40.7％.TheaminoacidsequencehomologybetweencellfusingagentvirusandZikaviruswas25.4％whileitsaminoacidsequencehomologywithChaoyangviruswas25.5％.Afterpredictingthesecondarystructureofnon-codingregionofcellfusingagentvirus,wefoundthelengthof5'-UTRofthenon-codingregionofGalvestoncellfusingagentviruswas103nt.Its5'-UTRcontainedcapstructureand2conservativestemloopstructures(SL):SLAandSLB.thelengthof3'-UTRofcellfusingagentviruswas553nt.Itcontainedmultipleconservativelinersequencesandsecondarystructures,whichweredividedintoA1,A2andA3structuraldomains.Wepredictedthefunctionofsecondarystructureofcellfusingagentvirusbycomparingwiththestructuresof5'-UTRand3'-UTRoftype2denguevirus.2.ConstructingdetectingmethodofcellfusingagentvirusCellfusingagentviruswasfirstfoundinlaboratory-grownAedesaegypticellsbyStollarandThomas.FurtheranalysisindicatedthattheinfectionofcellfusingagentvirustoAedesalbopictuscellscaninducecellfusingphenomenonandthatthefusingcapacityinducedbycellfusingagentvirusonlyexistsinAedesalbopictuscells.Weanalyzedthegenesequencesof2cellfusingagentvirusesfromNCBI,gotthe8 AbstractconservativesequencesfromtheNS2AgenesequenceanddesignedprimersandprobesforqRT-PCR.WeusedstandardplasmidscontainingcellfusingagentvirusNS2AgenesequencetodetectthesensitivityofthePCRprimersandprobeswedesignedandtheresultwaspositive.Thelowerlimitofdetectionwas150copies/ml.Weusedtype2denguevirus,ZikavirusandJapaneseencephalitisvirustodetectthespecificityofthePCRprimersandprobeswedesigned,theresultswereallnegative.Theresultsaboveindicatedthatthedetectingmethodwedesignedhadagoodsensitivityandspecificity.Basedonthat,thisstudyanalyzedwhethertheAag2andC6/36cellsofourlaboratorycontainendogenouscellfusingagentvirus.WedetectedtheRNAoftheAag2andC6/36cellsofourlaboratoryusingtheRT-PCRprimerswedesignedandtheresultindicatedthatnoendogenouscellfusingagentvirusexistsintheAag2andC6/36cellsofourlaboratory.3.Constructionoffull-lengthcDNAclonesofcellfusingagentvirusgenomeAccordingtothewholegenomicsequenceofGalvestoncellfusingagentvirus,wegot3DNAfragmentscoveringthewholegeneofvirusbygenesynthesisinvitroandnamedthemA,BandC.ThelengthofA,BandCwere1-3414nt,3400-6596ntand6591-11395nt.EachfragmentwasclonedinpBR002vectorandwasnamedaspBR002-A,pBR002-BandpBR002-Cseparately.First,weusedrestrictionenzymeXbaIandAgeItodigestpBR002-BandpBR002-Cfragments,thenligatedBandC´usingT4DNAligaseandselectthepBR002-BC´clonescontainingBC´fragment.WeligatedA´fragment,whichwasthePCRproductsofpBR002-AusingNotIFandBst171IRprimers,withpACNRvectorandgotpACNR-Aplasmid.WedigestedpACNR-AandpBR002-BC´withXbaIandBst171IandgotCFAV-pACNRplasmid,whichcontainedfull-lengthcDNAcloneofcellfusingagentvirus,afterligatingthedigestedBCfragmentandpACNR-A.AfteridentifiedbyenzymedigestionSnaIandsequencinganalysis,thefull-lengthcDNAcloneofcellfusingagentviruswasobtained.9 AbstractWeprovidedbasicdataforresearchofcellfusingagentvirusviaconstructingphylogenetictreeofcellfusingagentvirusandanalyzingthewholegenome.Basedonthesequenceanalysis,wedesignedspecificqRT-PCRprimersandprobesforcellfusingagentvirusandevaluatedthesensitivityandspecificityoftheprimers.Weobtainedfull-lengthcDNAcloneofcellfusingagentvirus,andthusestablishedasolidfoundationforfollowingstudyofvirusreplicationandmolecularmechanism.Keywords：CellfusingagentvirusFlaviviruscDNA10 前言前言细胞融合病毒（cellfuisingagentvirus，CFAV）是一种正链RNA病毒，属于黄病毒科黄病毒属，只能在蚊子体内传播，在白纹伊蚊(C6/36)细胞当中培养可以引起细胞融合，而在其他细胞中并没有此现象[1]，此外它在其他细胞如BHK，VERO等细胞中没有复制能力。最初于1975年由Stollar和Thomas在实验室埃及伊蚊（Aag2）细胞中发现，随后又在波多黎各岛自然界蚊子体内鉴定并且分离到这种病毒。到目前为止，研究人员又在印度尼西亚、墨西哥、泰国，美国发现了在自然界蚊子体内存在细胞融合病毒。研究报道细胞融合病毒在蚊子之间传播是通过垂直传播，经过病毒分离及生物信息学分析它可以长时间存在蚊子体内，并且基因片段已经整合到蚊子基因组当中。在泰国的登革病毒流行区的自然界蚊体内分离出细胞融合病毒与登革病毒在蚊细胞内是否存在同源干扰是一个值得关注的问题。虽然细胞融合病毒因其昆虫特异性而对人类健康威胁极小，但是有几点问题值得去研究和注意，细胞融合病毒和其他黄病毒相比只在蚊子体内复制的机制；细胞融合病毒与其他黄病毒的共感染现象及机制；在未来的环境选择下细胞融合病毒是否会进化成对人类健康造成重大威胁的突变体如寨卡病毒的暴发[2]。这些问题的研究都有赖于细胞融合病毒反向遗传学系统的构建。1.细胞融合病毒的生物学特性1.1细胞融合病毒的基因组结构及其功能:细胞融合病毒成熟病毒颗粒是一个直径大约为50nm的球状颗粒，由核衣壳和包膜组成。核衣壳是由病毒RNA和其C蛋白构成，它是病毒完成复制周期图1细胞融合病毒颗粒结构示意图11 前言的主要部分，有转录和翻译等功能[3]。包膜是由E蛋白，M蛋白和膜外脂类物质组成，主要功能是参与病毒与宿主细胞的受体识别、吸附和融合，在细胞融合病毒生物学功能中具有重要的作用。细胞融合病毒基因组的长度为10-11kb，这个长度和其他黄病毒相似，同时包括一个单一的长开放阅读框架（ORF）10023nt。在其5'端有113个非编码核苷酸，在其3'端有559个非编码核苷酸，3'末端没有多腺苷酸化结构，但是发现有多个保守的碱基序列和茎环结构，这些特殊结构可能参与调控病毒基因组翻译，复制以及拮抗宿主的天然免疫反应。细胞融合病毒基因组的ORF编码三个结构蛋白和七个非结构蛋白，它们最初作为一个多聚蛋白被翻译，在病毒和宿主蛋白酶的作用下被切割开。三个结构蛋白为C蛋白、prM蛋白和E蛋白，非结构蛋白为NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5[4]。结构蛋白主要功能是参与病毒的吸附、侵入、融合等，而非结构蛋白与调控病毒的复制和翻译等步骤[5]。图2细胞融合病毒基因组结构示意图1.2细胞融合病毒的蛋白结构和功能细胞融合病毒的C衣壳蛋白含有136个氨基酸的碱性蛋白，在N末端有20个氨基酸残基，这样的现象在其他黄病毒上也有观察到[6]。由于其C蛋白与其他黄病毒的同源性很小，对于C蛋白二级结构的研究报道的较少，只能从其它蚊虫黄病毒的结构功能来进行推测。其功能可能与其他黄病毒类似，主要有参与核衣壳的形成，基因组的包装和辅助RNA的复制等[3,7]。prM蛋白的长度为166个氨基酸，并具有两个潜在的糖基化位点，细胞融合病毒prM具有类似登革病毒KKREKR序列的位置[8]。prM蛋白可以和E蛋白结合，辅助E蛋白正确折叠和组装。12 前言E蛋白含有427个氨基酸，5个潜在的N端连接的糖基化位点和14个Cys酸残基。与登革病毒4型的E蛋白具有13个Cys残基进行了对比，其中有九个Cys残基在两种病毒中定位相似。与登革病毒4型E蛋白比较[9]，推测细胞融合病毒的E蛋白主要功能与prM蛋白形成异源二聚体，参与细胞的融合，病毒颗粒的释放和组装以及诱导宿主的免疫应答等方面起着至关重要的作用[10]。细胞融合病毒的NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5的具体功能还未知，但是通过生物信息学对其核苷酸和氨基酸序列进行分析，细胞融合病毒与其他黄病毒同源性最高蛋白为NS5和NS3,推测其结构和功能类似[11,12]。1.3细胞融合病毒的传播与宿主最初细胞融合病毒是在实验室培养的埃及伊蚊细胞中发现。第一次在自然界发现并且分离到细胞融合病毒是在波多黎各岛[13]，研究人员从一系列蚊子图3细胞融合病毒的流行分布图4细胞融合病毒宿主的生命周期种类（埃及伊蚊，白纹伊蚊和库蚊属）当中分离到了多株野生型病毒。随后研究人员又在印度尼西亚、墨西哥、泰国，美国发现了在自然界蚊子体内存在细胞融合病毒[14-18]，根据以上研究发现细胞融合病毒只可以在蚊子之间垂直传播。对泰国发现的病毒株和宿主进行生物进化分析，发现细胞融合病毒可以长时间的存在于蚊子体内，在这样相对封闭的环境其基因组没有太大变化，同时极其可能与登革病毒在这一区域的蚊子体内存在共感染现象[19,20]。就目前的形势来看，细胞融合病毒可能普遍存在于世界各地。13 前言2.细胞融合病毒的分类研究最近十年来在全球范围内发现了一系列特殊的黄病毒，这些病毒由于只能在单一蚊虫细胞中复制从而变得被人们关注，但是后来这种情况发生了改变。有一些黄病毒只可以在昆虫，主要是蚊虫之间传播，称为经典昆虫特异性黄病毒（classicalInsect-SpecificFlavivirus，cISFs），另外一类与具有脊椎动物宿主的黄病毒的具有更高的同源性，但并不能感染脊椎动物，称为双宿主特异性昆虫黄病毒（dual-hostInsect-SpecificFlavivirus，dISFs[21]），它们共同称为昆虫特异性黄病毒（ISFs）。目前clSFs包括12种病毒而细胞融合病毒正是其中之一，其他的还有如Kamiti河病毒（Kamitirivervirus，KRV)，库蚊黄病毒(CxFV)等。dISFs目前包括9种病毒主要包括朝阳病毒（Chaoyangvirus）,伊洛曼齐病毒（Nounanévirus），拉米病毒（Lammivirus）等[18]。通过研究发现在蚊子基因组里存在类似cISFs的基因序列片段，称之为细胞沉默因子[22]（designatedcellsilentagent）。细胞沉默因子的发现证实了细胞融合病毒序列整合到蚊子基因组的现象是存在的。虽然其它病毒序列整合到宿主基因组中已经为许多文献记录。但是大多数整合的序列是高度片段化或具有内部终止密码子[23]，少数几个会编码完整的ORFs。最重要的是黄病毒的一些基因组整合到宿主基因组后可以转录，因此在生物体中检测到黄病毒的RNA并不一定证明其携带具有感染性的黄病毒[24]。病毒的同源干扰是宿主细胞感染的过程一种病毒感染干扰相同或相似病毒复制和转录的现象[25]。这种现象已经广泛的在病毒感染期间观察到，并且可以在脊椎动物和无脊椎动物宿主中发生。而cISFs诱导的双宿主黄病毒同源干扰现象在蚊子细胞中情况是有变化的。如预先感染C6/36细胞的PCV，它的复制会随着加入的西罗尼病毒（WNV）和墨累谷脑炎病毒（MVEV）复制而显著减少[26]。相比之下，先前感染C6/36的库蚊黄病毒（CxFV），与细胞中加入的西罗尼病毒复制没有关联[27]。这些研究表明cISFs可以对双宿主黄病毒的传播和复制造成影响[28]。细胞融合病毒作为cISFs中的一员，在登革病毒流行区域的蚊子体内存在，对登革病毒的复制和传播有怎样的影响，具体机制还没有研究报道[29]。在蛋白质生物合成时，核糖体在信使核糖核酸(mRNA)的特定序列处，从一个可读框位移至另一个可读框的现象[30]。这是某些RNA病毒在翻译水平上调节蛋白质合成的一种机制。研究发现细胞融合病毒具有程序式-1核糖体移码的现象，14 前言即核糖体移动向旁边移动-1nt，并且核糖体移码位点下游正是其茎环结构[31]。3.细胞融合病毒的反向遗传学感染性全长cDNA克隆是研究RNA病毒功能点位的平台，使用反向遗传学技术定点突变和基因重组会为病毒点位功能的发现和研究提供直接的证据。反向遗传学是通过构建RNA病毒的全长感染性克隆在cDNA水平上直接对病毒的基因进行操作，通过病毒生物学特征的变化来推测所操作基因的作用，从而对病毒的表达调控和致病的分子机制进行直观的研究。目前已经成功构建了很多黄病毒的反向遗传学系统，并利用它对病毒的复制、翻译和毒力进行了研究[32]。本研究基本目的就是构建细胞融合病毒的全长cDNA克隆[33]，并根据此研究为其反向遗传学系统提供平台和手段。4.本课题研究的意义：细胞融合病毒虽然对人类威胁极其小，但是从科学的角度它仍有许多值得研究的地方，因为它可以为对人类生命健康造成影响的其他黄病毒的研究提供独特的角度和见解[34]。但是目前对细胞融合病毒的研究较少，所以本研究对细胞融合病毒从以下方面做研究并取得了一定成果。第一，构建了细胞融合病毒的系统进化树，明确了其在系统进化树当中的位置，并与其他黄病毒核苷酸同源性和氨基酸序列同源性进行了对比。第二，建立细胞融合病毒的检测方法，并对其敏感性和特异性进行了检测。第三，获得了细胞融合病毒基因组全长cDNA克隆。本课题对细胞融合病毒基因组运用生物信息学的方法进行了分析，为其基础研究提供了数据和模型。随后通过设计qRT-PCR的引物和探针为细胞融合病毒的检测提供了有效的方法。最后通过体外合成得到细胞融合病毒的全长cDNA克隆，为其反向遗传学奠定了基础，可以直接通过基因水平对其进行操作及改造，为以后基因相关方面的研究提供了平台[35]。15 第一部分第一部分细胞融合病毒全基因序列分析本部分研究首先构建了23株虫媒黄病毒的系统进化树，由于对于细胞融合病毒病原学研究较少，我们通过系统进化树明确了细胞融合病毒与其他虫媒黄病毒的进化关系。然后对细胞融合病毒的全基因序列进行分析，通过与寨卡病毒，朝阳病毒以及登革病毒进行对比，对其蛋白功能和非编码区二级结构进行了预测分析。1.材料和方法1.1细胞融合病毒及虫媒传播黄病毒系统进化树的构建细胞融合病毒及虫媒传播黄病毒系统进化树的构建都使用最大似然法，使用位点替换／总位点评估病毒株间的距离。进化树分支使用Neighbor-join和BioNJ算法计算，多次计算统计分支生成概率，评估进化树分支可信度。使用MEGA7软件完成所有计算，用于系统进化树的构建的虫媒黄病毒基因组序列下载于Genbank，具体（GenBankID）见下表。表1-1蚊传播黄病毒系统发生树构建所用的病毒株Table1-1FlavivirusvirusstrainsusedforphylogenetictreeVirusGenBankIDAedesflavirusgenomeNC012932Cellfusingagentvirus（Aag2）KU936054Cellfusingagentvirus(Galveston)KJ741267CulexFlavivirusgenomeNC008604ChaoyangvirusNC017086Denguevirus2NC001474Denguevirus3NC001475DonggangvirusNC016997HankovirusJQ26825816 第一部分JapaneseencephalitisvirusNC001437KamitiRivervirusNC005064ModocvirusNC003635OmskhemorrhagicfevervirusNC005062PowassanvirusNC003687PalmCreekvirusKC505248NhumirimvirusNC024017NounanevirusEU159426NienokouevirusNC024299Tick-borneencephalitisvirusNC001672QuangBinhvirusNC012671ZikavirusNC0125321.2非编码区RNA二级结构的预测及分析使用的病毒株为从Genbank上下载的细胞融合病毒（KJ741267），通过在线网站Themfoldwebserver(https://unafold.rna.albany.edu)对非编码区的基因组5'-UTR和3'-UTR分别进行预测分析。2.结果2.1细胞融合病毒与其他虫媒黄病毒基因组序列比对细胞融合病毒与其他虫媒黄病毒的进化关系，在我们构建的23株虫媒黄病毒系统进化树如图1-1中可以看到。最顶端的是由细胞融合病毒、Kamiti河病毒和汉科病毒等共6个病毒组成的ISFVs病毒分类，这类病毒有着相似的特性及只在特定的虫媒体内传播。下面为朝阳病毒（CHYV），东港病毒（Donggangvirus）、伊洛曼齐病毒（Ilomantsivirus）和拉米病毒（Lammivirus）组成的ISFV-like病毒分类，这类病毒有着类似ISFV病毒的特性，只在特定的节肢动物或蚊体内传播。由乙脑病毒，寨卡病毒（ZIKV）及登革病毒组成的蚊宿主黄病毒（Mosequito17 第一部分BorneFlaviviruses，MBFV）分类。Genbank数据库中细胞融合病毒全长序列有三株，一株病毒为最早在实验室Aag2细胞中发现的Aag2病毒株，另外两株病毒均为Galveston病毒株。通过同源性对比，蚊细胞融病毒Aag2病毒株与Galveston病毒株核苷酸序列同源性为96.1%，氨基酸同源性为96.9%，其中不同核苷酸位点有414个，不同氨基酸位点有112个，相对来说不同位点在整个基因组序列和氨基酸序列中分布比较均匀。图1-1.虫媒黄病毒系统进化树Fig1-1Flavivirusvirusphylogenetictree我们从这4个不同的病毒分类里选择了较为常见的几株病毒进行了核苷酸和氨基酸同源性分析。从ISFV-like病毒分类当中选取了朝阳病毒，从MBFV病毒分类当中选取了寨卡病毒，从ISFV病毒分类当中选取了Kamiti河病毒与细胞融合病毒进行核苷酸序列和氨基酸序列对比分析。其中细胞融合病毒Aag2株与Kamiti河病毒核苷酸同源性最高为64.1%，与寨卡病毒和朝阳病毒同源性相分别为41.2%和40.7%。氨基酸序列同源性与核苷酸序列同源性基本一致，细胞融合病毒与Kamiti河病毒同源性为66.9%，与寨卡病毒同源性为25.4%，与朝阳病毒同源性为25.5%。18 第一部分表2-1核苷酸同源性对比Table2-1ComparisonoffullgenomicnucleotidesequenceGalvestonZIKVCHYVKRVCFA（Aag2）96.141.240.764.1表2-2氨基酸同源性对比Table2-2ComparisonoffullgenomicacidsequenceGalvestonZIKVCHYVKRVCFA（Aag2）96.925.425.566.9细胞融合病毒Aag2病毒株与寨卡病毒相同的核苷酸位点有4964个，相同的氨基酸位点有893个，而细胞融合病毒Aag2株与朝阳病毒相同的核苷酸位点有4891个，相同的氨基酸位点有907个。可见虽然朝阳病毒属于ISFV-like病毒分类，有着类似ISFV病毒的生物学特性，但是在核苷酸同源性和氨基酸序列同源性上朝阳病毒与细胞融合病毒为40.7%和25.5%，并没有比寨卡病毒与细胞融合病毒核苷酸同源性和氨基酸序列同源性的41.2%和25.4%相差太多。随后我们进行更进一步的分析，将寨卡病毒、朝阳病毒和Kamtii河病毒结构蛋白C、prM/M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5的核苷酸和氨基酸进行同源性比对分析，如表3-3和表3-2。细胞融合病毒Aag2株与朝阳病毒基因组的C、M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5的氨基酸序列同源性为13.9%、17.2%、18.1%、22.9%、11.8%、9.2%、32.2%、15.2%，11.0%、19.2%，而与寨卡病毒氨基酸序列的同源性分别为16.8%、14.5%、17.0%，20.1%、17.4%、7.7%、33.3%、12.8%、9.3%、12.0%，结果显示细胞融合病毒的C、NS2A、NS3蛋白氨基酸序列的同源性与寨卡病毒更为接近，其余蛋白氨基酸序列同源性与朝阳病毒更为接近。有研究发现黄病毒衣壳蛋白C不仅是病毒颗粒组装过程中的关键步骤，还可能与细胞核中的功能RNA结合，进而调控基因表达和细胞凋亡等生物学功能。在比对细胞融合病毒和寨卡病毒，朝阳病毒及Kamiti河病毒的C蛋白氨基酸序19 第一部分列后可以看到，它们的同源性都在分别为16.83%，13.93%和14.23%，由此可以推测它们的C蛋白功能仅在病毒组装等基本功能上相似，而在病毒基因表达和诱导细胞凋亡等复杂的功能差距很大，这可能是导致它们在不同细胞内表达和复制不一样的部分原因。黄病毒包膜糖蛋白E的结构与功能已经得到了较为充分的研究，其主要的功能包括识别宿主细胞表面的特异性受体以及介导包膜与宿主细胞内含体膜的融合，与其功能密切相关的是在E蛋白上含有众多的中和抗体识别表位以及病毒毒力决定簇。细胞融合病毒和寨卡病毒、朝阳病毒及Kamiti河病毒的E蛋白氨基酸序列同源性分别为17.0%，18.1%和9.5%，在系统进化关系上与细胞融合病毒最近的Kamtiti河病毒同源性反而最低，提示了细胞融合病毒E蛋白可能有向其它黄病毒E蛋白方向进化的趋势。研究表明，黄病毒NS3蛋白具有多种酶活性，且参与病毒增殖过程中的多个重要步骤，以其为靶标的抗病毒药物已经成为研究的重点。细胞融合病毒和寨卡病毒、朝阳病毒及Kamiti河病毒的NS3蛋白氨基酸序列同源性分别为33.3%，33.2%和81.3%，可以发现在所有结构蛋白和非结构蛋白当中NS3是同源性最高的蛋白，与细胞融合病毒亲缘关系最近的Kamiti河病毒更达到了81.3%。根同源性数据对比我们可以推测，NS3蛋白在细胞融合病毒与Kamiti河病毒蛋白酶活性的调节过程及方式可能高度相似，与寨卡病毒和朝阳病毒也存在类似酶活性反应。表2-3蛋白核苷酸同源性对比Table2-3HomologycomparisonofnucleotidesequencesofviralproteinsCFAVZIKVCHYVKRVC30.630.634.9M41.841.353.2E31.434.048.1NS142.241.167.3NS2A43.931.968.1NS2B34.133.963.920 第一部分NS346.744.672.2NS4A38.031.359.5NS4B33.933.868.0NS552.051.071.2表2-4蛋白氨基酸同源性对比Table2-4HomologycomparisonofaminoacidsequenceoftheviralproteinsCFAVZIKVCHYVKRVC16.813.914.2M14.517.253.2E17.018.19.5NS120.122.974.9NS2A17.411.868.6NS2B7.79.261.1NS333.333.281.3NS4A12.815.251.9NS4B9.311.065.0NS512.019.212.2将细胞融合病毒、寨卡病毒和朝阳病毒一起进行序列分析后，a部分（图2-1）结果显示三株病毒株相同的氨基酸序列有731个，占总数的19.6%，这一部分可能影响着三种病毒共同的生物学特性如蚊传播等，b部分为细胞融合病毒与寨卡病毒相同的氨基酸序列，共有893个，占总数的24%，可能影响着两种病毒之间相似的生物学特性，c部分为细胞融合病毒与朝阳病毒相同氨基酸序列，共有907个，占总数的24%，这部分可能决定着细胞融合病毒与朝阳病毒共同的生物学特性如蚊虫特异性，而都没有交集的部分则是细胞融合病毒，寨卡病毒与朝阳病毒各自特有的生物学特性。21 第一部分图2-1三株黄病毒氨基酸比对关系Fig2-1RelationshipbetweenAminoAcidsinThreeFlavors2.2细胞融合病毒非编码区RNA二级结构的预测细胞融合病毒Galveston株非编码区的5'-UTR长为103nt，其5'-UTR具有帽子结构，起始位保守的5'-AC，这样的一线性序列在细胞融合病毒中高度保守。该区可形成两个保守的茎环（stemloop，SL）结构SLA和SLB。SLA为具有二个内环结构和一个顶环结构的长茎环结构，SLB为包含一个内环的长茎环结构。通过对比目前研究较多的登革病毒-2型的5'-UTR结构，可以看到Galveston病毒株与登革2型病毒基本类似，所以由登革病毒2型的5'-UTR一些结构和功能来推测Galveston病毒株。细胞融合病毒的5'-UTR端同样具有帽子结构，帽子结构通常认为在翻译复制当中起到的作用类似真核生物蛋白质翻译过程中与真核起始因子eIF4E等识别及结合的作用，以便形成帽子复合体结构，进而募集核糖体起始后续的翻译过程。虫媒黄病毒的NS5蛋白可与SLA特异性结合并合成子代RNA，可以推测细胞融合病毒SLA可能也具有启动子的功能。22 第一部分G=－26.80Kcal∆G=－28.90Kcal图2-3细胞融合病毒5'-UTR二级结构预测图2-4登革2型病毒5'-UTR二级结构预Fig2-3Secondarystructurepredictionof5'-UTRFig2-3Secondarystructurepredictionof5'-UTR通过对细胞融合病毒核苷酸序列比对及二级结构预测分析发现，细胞融合病毒的3'-UTR长为553nt，含有多个保守的线性序列及二级结构，基因组末端无多聚腺苷酸尾。细胞融合病毒的3'-UTR像登革2型病毒一样可分为3相互独立的区域，各二级结构域的构象不受其他结构域的影响。不同的虫媒黄病毒结构域A1的差异较大。在蚊媒黄病毒中，A1区域包含与病毒亚基因组RNA产生以及宿主适应性密切相关的茎环结构，而细胞融合病毒的A1区域则折叠产生复杂的长茎环结构。这提示我们细胞融合病毒基因组3'UTR的A1区域可能发挥了与虫媒黄病毒相应区域不同的生物学功能。结构域A2在虫媒黄病毒的复制和翻译效率均具有重要意义。将细胞融合病毒的A2结构域与登革2型病毒可以看到，两者的A2结构的构象基本一致，因此可以推测二者具有类似的功能。在所有黄病毒属病毒的3'-UTR最末端的A3区域中均会形成一个保守的稳定长发卡结构3'-SL，对于病毒基因组复制具有极其关键的作用。我们对细胞融合病毒基因组3'UTR的RNA二级结构预测也证实了3'-SL的存在。此外，有研究表明，将登革病毒-2型3'-SL不同长度的区段替换为二级结构相似的西尼罗病毒3'-SL的相应区段，会影响登革2型病毒在不同细胞内的复制能力。因此，我们可以推测23 第一部分3'-SL结构可能与细胞融合病毒的蚊细胞特异性也有一定相关性。图2-5登革2型病毒3'-UTR二级结构预测Fig2-5Secondarystructurepredictionof3'-UTRofCFAV图2-6细胞融合病毒3'-UTR二级结构预测Fig2-6Secondarystructurepredictionof3'-UTRofDENV-23.讨论目前关于细胞融合病毒的病原学研究较少，通过与其他虫媒黄病毒的研究可以在一定程度上推测细胞融合病毒的生物学特性。本研究首先构建了23株虫媒黄病毒的系统发生树，并且明确细胞融合病毒在系统进化树中的位置，通过比细24 第一部分胞融合病毒与寨卡病毒、朝阳病毒及Kamiti河病毒的同源性发现，虽然细胞融合病毒在进化关系上与朝阳病毒接近，但是在同源性上与寨卡病毒的差异和与朝阳病毒的差异并不大。进一步比较了细胞融合病毒与寨卡病毒、kamiti河病毒和朝阳病毒C、M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5蛋白基因序列和氨基酸序列，并从比对结果当中选择了C蛋白、E蛋白和NS3蛋白，通过分析对比推测了细胞融合病毒这三种蛋白可能存在的生物学功能。在非编码区，预测了蚊细胞病毒的5'-UTR和3'-UTR的二级结构，通过与目前研究较为清楚的登革2型病毒的生物信息学对比和分析，对其二级结构的生物学功能进行了探讨和推测。在5'-UTR可以看到Galveston病毒株与登革病毒2型类似SLA和SLB茎环结构可能提示在起始翻译的步骤反应过程相似。在3'-UTR上Galveston病毒株与登革2型病毒整体结构相似，但是在各二级结构上表现出了较大的差距，具体体现在A1区域。细胞融合病毒的A1区域则折叠产生与登革2型病毒差异较大的复杂的长茎环结构，可能是因为其发挥了与虫媒黄病毒相应区域不同的生物学功能。25 第二部分第二部分细胞融合病毒核酸检测方法的建立细胞融合病毒最早发现于实验室Aag2细胞当中，可以造成C6/36细胞融合现象。有报道指出细胞融合病毒感染宿主细胞后会将本身的基因组整合到宿主细胞基因组上，并且细胞融合病毒和登革病毒同时感染Aag2细胞后，可能会影响登革病毒的复制。目前细胞融合病毒在国内尚没有发现报道，本研究部分通过对细胞融合病毒Galveston和Aag2株的NS2A基因序列进行保守性分析，设计了检测细胞融合病毒的qRT-PCR引物，为细胞融合病毒检测提供了可选择的方法。1.材料与方法1.材料和方法：1.1质粒、毒株、细胞系pBRB质粒包含细胞融合病毒的NS1到NS4A的全部基因序列，连入到pBR002载体中，由上海生工公司合成。寨卡、乙脑和登革病毒由本实验室细胞培养传代保存；C6/36细胞，Aag2细胞由本实验室细胞库提供。1.2试剂与仪器表1-1试剂与仪器Table1-1Reagentsandequipment试剂和材料公司RNA病毒核酸提取试剂盒InvitrogenTrizolAmbionLB固体培养基本室自制胎牛血清（FBS）GibcoSDM培养液GibcoNanodrop○RND-1000紫外分光光度计NanodropMyCyclerTMthermalcyclerPCR仪Bio-RadAllegraX-22R高速低温离心机BeckmanImagemaster凝胶成像系统Phamacia26 第二部分37℃CO2孵箱Lab-line2．方法2.3引物和探针设计在NCBI数据库中下载细胞融合病毒全基因组序列所有全部三株，去掉同源性相近的1株。使用ClustalW程序进行比对获得保守序列，使用Primer5.0软件进行引物和探针设计。通过分析在NS2A上选择了一段保守序列作为检测目的片段，其大小约为100bp。表1-2RT-PCR引物物及其序列Table1-2PrimersandsequencesofRT-PCRamplification引物名称序列CFAV-FAGAGCTTTGCGACCCCTTGTCFAV-RAACACGCCCAAGACACTGGACFAV-probATCCAGAGGAGAGGGAGGACGGGAAAGACGGGAACCRP49-FGCTATGACAAGCTTGCCCCCARP49-RTCATCAGCACCTCCAGCT2.4细胞的复苏、冻存与传代2.4.1细胞的复苏提前准备37℃温水，将从液氮罐中取出细胞冻存管迅速放入其中，摇晃冻存管使管内的细胞液融化。融化后将细胞悬液将移至试管中，用培养液吹洗细胞，27 第二部分并且2000g离心5min弃去上清；将含有10%FBS的细胞培养液加入其中，轻轻吹打使细胞液混匀，最后将细胞液移至培养瓶当中，在37℃CO2孵箱中培养。2.4.2细胞的传代在镜下观察C6/36，Aag2细胞，待单层细胞铺满培养瓶，弃掉旧的SDM培养液，使用新的SDM培养液吹打混匀，按照按1:3-1:5传代细胞，于37℃CO2孵箱中培养2.5C6/36,Aag2细胞中RNA核酸的提取及QRT-PCR从Aag2和C6/36中细胞中提取RNA：a.将六孔板中的细胞吹起后转移至离心管中，12000g离心2min弃掉上清，加入1mLTRIzol混匀以便细胞裂解充分；b.将200μL氯仿加入离心管中，震荡使其混匀，在室温静置下观察到明显分层；c.分层后将离心管在低温离心机4℃12000g离心15min，样品会分为三层，吸取上层水相溶液溶解的RNA至新的离心管，按1:1加入异丙醇，混匀在室温静置10min；d.4℃12000g离心15min低温离心后，倒去上清；e.将1mL无水乙醇加入离心管，并晃动清洗沉淀，4℃12000g离心5min弃掉上清；f.离心管空离2min，用加样枪把上清吸走。室温干燥直到残余乙醇挥发完全；g.加入50μL无RNA酶水溶解即可得到细胞总RNA的溶液。以细胞中提取的RNA为模板，使用CFAV-F、CFAV-R、CFAV-prob引物，同时使用黄病毒RNA通用引物RP49-F，RP49-R作为内参，进行RT-PCR反应。20μL反应体系：2×onestepRT-PCRBufferIII10μLTakaRaExTaqHS(5U/μL)0.4μLPrimescriptRTenzymemixII0.4μL28 第二部分PCR上游引物（4.4nM）0.4μLPCR下游引物(5.0nM)0.4μLTaqMan™探针（4.6nM）0.4μL无RNA酶H2O补足至20μLRNA2μL反应条件为：50Cfor35min：PCR条件:95Cfor15min94Cfor40s,]50Cfor45s,]35个循环72Cfor1min]终止反应：72Cfor10min.2.6病毒RNA提取使用PurelinkRNAMiniKit试剂盒提取病毒RNA：1.将细胞培养的病毒液加入到EP管中，离心1min，12000rpm，取上清200μL；2.将200μL裂解液，1μLβ-巯基乙醇，200μL无水乙醇按顺序加入EP管中，颠倒混匀，使病毒液裂解；3.将混匀病毒液加入纯化柱，12000rpm离心30s，；4.弃掉离心液，用洗涤液Ⅰ750Μl洗离心柱，12000rpm离心30s，弃掉离心液；5.用洗涤液Ⅱ500μL洗离心柱，12000rpm离心30s，重复一次；弃掉离心液，空转12000rpm2min一次；6.将离心柱放入干净的EP管中，加入50μL无RNA酶H2O，室温静置2min；7.将离心柱与EP管离心，12000rpm离心1min，弃掉离心柱，EP管中的溶液即为病毒RNA。29 第二部分2.7特异性和敏感性的检测将含有NS2A基因序列的质粒pBRB作为标准品，用紫外分光光度法检测质粒浓度。将质粒样品以10倍梯度稀释10次，用来评估引物和探针的检测最低拷贝数。用细胞培养的登革病毒，寨卡病毒和日本脑炎病毒检测引物和探针的特异性。3.结果：3.3细胞融合病毒的核酸检测方法首先使用本文设计的qRT-PCR引物和探针对含有检测片段（100bp）的质１０粒标准品pBRB进行检测，将质粒（浓度3.5×10拷贝／ｍＬ）以10倍梯度－１－２－３－４－５－６－７－８－９稀释为10、10、10、10、10、10、10、10、10、10－１０共10个浓度。经过检测后，前8个浓度检测结果为阳性，后2个梯度质粒样品检测Ct值大于35，认为阴性（图1）。对Ct值和质粒拷贝浓度进行拟合，获得标准曲线（图2），检测下限约150拷贝／ｍＬ。图1.PBRB样品RT-PCR梯度稀释图2..PBRB样品核酸定量PCR检测标准线Fig1GradientdilutionofPBRBFig2DetectionofstandardlinesofqRT-PCR随后用寨卡、乙脑和登革病毒来对引物物的特异性进行检测。检测结果显示，本引物对pBRB质粒标准品检测为阳性结果，而对寨卡，乙脑和登革病毒的结果为阴性，表明本检测方法有很高的特异性。30 第二部分图3.检测方法特异性检测结果Fig3Detectionmethodspecificitytest由于最早的细胞融合病毒在实验室培养的Aag2细胞当中被发现，所以利用该检测方法，我们对本实验的Aag2及C6/36细胞当中的RNA进行了检测。将Trizol法提取的RNA进行10倍梯度稀释后与原液一起进行检测。RP49是蚊细胞基因组中共有的一段保守RNA序列，用其作为内参保证实验系统的可行性。由图4可以看到Aag2和C6/36的RP49和RP49标准品检测都为阳性结果，而细胞融合病毒都未阴性结果，可以认为本实验室的Aag2及C6/36中不含有细胞融合病毒。图4.Aag2和C6/36细胞检测结果Fig4Aag2andC6/36Celldetection4.讨论：本研究设计的qRT-PCR引物和探针具有很高的通用性，与登革病毒2型和31 第二部分日本脑炎病毒及寨卡病毒无交叉反应，能高灵敏地检测出细胞融合病毒的质粒阳性样品，可以为细胞融合病毒病毒的检测提供一种有效方法。还尝试通过此方法对本实验室的Aag2和C6/36细胞进行检测，以确认其中是否含有细胞融合病毒。经证实本实验室Aag2和C6/36细胞并没有细胞融合病毒，国内目前也没有报道发现此病毒。32 第三部分第三部分.细胞融合病毒基因组全长cDNA克隆的构建1.材料与方法：1.1质粒、菌株、细胞系pBR002-A、pBR002-B、pBR002-C由上海生工公司合成，大肠杆菌DH5α感受态细胞由本实验传代保存；。1.2试剂与仪器表1-1试剂与仪器Table1-1Reagentsandequipment试剂和材料公司GoTaqGreenMasterMix2XPromegaQ5High-Fidelity2XMasterMixPromegaT4DNALigasePromegaXbaⅠ,SnaⅠTakaraAgeⅠ，NotⅠ，Bst171ⅠTakaraWizard质粒小提试剂盒PromegaWizard胶回收试剂盒PromegaPureLink质粒大提试剂盒InvitrogenTrizolAmbionLB固体培养基本室自制LB液体培养基本室自制GotapPCR酶Takara氨苄青霉素PromegaNanodrop紫外分光光度计NanodropMyCyclerTMthermalcyclerPCR仪Bio-RadAllegraX-22R高速低温离心机Beckman33 第三部分Imagemaster凝胶成像系统Phamacia恒温摇床Lab-line2.方法：2.1细胞融合病毒基因组全长cDNA克隆的分段合成2.1.1细胞融合病毒模板的选择通过NCBI下载后，根据以上实验数据的分析，我们选择了在进化上更具有优势的Galveston病毒株作为模板。2.1.2细胞融合病毒分片段及PCR引物的设计由于片段太长，已现有的技术手段无法一次合成，需要分片段A、B、C进行合成，使用SEQBULIDER软件对全长进行分析，并设计酶切位点。通过酶切后体外连接将分片段连至本实验室载体pACNR上。表1-2扩增所用的引物及其序列Table1-2PrimersandsequencesofPCRamplification引物名称序列（5'-3'）pBR002-FTTAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGpBR002-RAATGGGGAAGGCCATCCAGCCTCGCGTCFAV-AFCGGCGAGGCTTGTATGGTTCAAACGTTCCFAV-BFGGCATGACTTTTATGCTAGAGGAAGCCGCATACAGCFAV-BRCGTCAGAAATAGACGGGTTAGTGTCGATGTTCCFAV-CFCCTCTGATCATAGGTACCTGATCTAAGATCFAV-CRCACGAGCTCCATGAGGTCGCCACGTATGNotI-FCACGTGTCGACGCGGCCGCGCTAGCGATBst171IRCGCGTATACCGCGCCCATGACATAGAGTCCCACC34 第三部分2.2细胞融合病毒全长CDNA克隆的构建2.2.1细胞融合病毒分片段的扩增和提取a.将A.B.C载体片段取100ul，然后接种到500mlLB液体培养基中，37℃200rpm在摇床活化15h;质粒大提:b.平衡：把30ml的平衡液（EuqiliibrationBuffer）加入到过滤筒中,过滤桶插在purelink高纯化大试管中，使其在重力作用下流。c.重悬：加10ml的含有RNaseA的重悬液(ResuspensionBuffer)到菌液沉淀的离心管，轻柔的重悬细胞沉淀直到混匀。d.溶解：加入10ml裂解液(LysisBuffer)到离心管中混合至均质的溶液。不要涡旋，室温下孵育5min。e.沉淀：加10ml沉淀液（PrecipitationBuffer）。立刻轻柔的反向混合离心管直到形成均质的溶液。不要涡旋。f.过滤:把沉淀溶菌产物转移到过滤筒中，让其按重力流下。可选择，用10ml的洗涤液（WashBuffer）洗管子，让其在重力作用下流。g.清洗:在过滤筒下面放一个50ul的无菌离心管。向过滤筒中加入15ml洗脱液（ElutionBuffer）到管子中。让缓冲液在重力作用下流。收集50ul离心管中的已经纯化DNA液体。h.将离心管内加入10.5mL异丙醇，4℃8000rpm离心1h20min；i.弃上清，加入1.5mL75%乙醇，转入小EP管中12000rpm离心10min；j.弃上清，加入200Μl无RNA酶H2O溶解沉淀。2.2.2细胞融合病毒分片段的大小的鉴定将得到的分片段质粒pBR002-A、pBR002-B、pBR002-C进行琼脂糖凝胶电泳实验，鉴定分片段条带的大小。2.2.3细胞融合病毒分片段的酶切连接PRB002-B质粒酶切反应体系：10×buffer5μL，DNA片段30ul，AgeI1.5μL，XbaI1.5μL，H2O12μL。PBR002-C质粒酶切反应体系：10×buffer5μL，DNA片段30μL，AgeI1.5μL，35 第三部分XbaI1.5μL，H2O12μL。反应条件：37℃水浴反应2h。琼脂糖凝胶电泳跑胶后观察条带大小，并挑选正确的条带，使用WizardSVGelandPCRclean-upSystem试剂盒来进行胶回收：a.加入与胶体体积相等的结合液（Bindingsolution），55℃水浴使胶融化，用移液枪吹打混匀；b.冷却后上柱，离心12000rpm1min，弃去离心液，重复一次；c.用洗涤液（Washsolution）600μL洗柱两次，12000rpm1min；d.弃去离心液，空转收集管2min，晾干柱子2min；e.加入60Μl无RNA酶H2O，室温静置2min，充分溶解柱上的样品后离心12000rpm2min；通过紫外分光光度计测定浓度后，使用T4-lingase进行连接，将PBR002-B长度为3200nt的片段与PBR002-C长度为5000nt的片段进行连接。反应体系：酶切回收B片段DNA6μL，C1片段DNA6ul，C2片段6DNAμL，T4-lingase2μL，10×Buffer3μL，ddH2O7μL。反应条件：4℃过夜。转化：选用DH5α感受态细胞对连接产物进行转化。a.取100mL感受态细胞在EP管中，放在冰上融化；b.将连接产物15μL加入感受态细胞中，在超净台内经行，冰上放置30min；c.取出EP管42℃水浴热击1.5min，后立马放置冰上冷却2min；d.将500μL无抗生素的LB液体培养基加入EP管中，37℃摇床培养1.5h；e.使用涂板器将孵育好的样品均匀涂于固体培养基表面，37℃培养过夜；f.第二天观察培养基表面长出的菌落，用10μL枪头挑取10个菌斑，加入5ml的LB液体培养基的试管其含有氨苄，37℃培养过夜。2.2.4单克隆质粒的小提a.取5mL菌液5000rpm离心10min，保留菌液沉淀；b.往沉淀中加入250μL细胞重悬液（cellresuspensionsolution）吹打知道菌液混匀；c.加入250μL细胞裂解液（celllysissolution），上下晃动至离心管混匀；d.加入350μL中和液（neutrationsolution）晃动直到现白色沉淀，离心1200036 第三部分rpm10min；把上清加入离心柱，12000rpm离心1min，进行两次；e.加入750μL洗柱液(columnwashsolution)，12000rpm离心1min，再加入500μL进行两次；f.把离心柱放入新的离心管中，12000rpm离心空转2min，结束后室温放置晾干离心柱子；g.将离心柱子放入新的EP管中，向膜正中加入50μL无RNA酶水H2O，室温放置2min，12000rpm离心2min收集质粒样品；通过琼脂糖凝胶电泳跑胶观察小提质粒DNA条带的大小，并将正确大小的条带用PBRF/BR，BF/CR和CF/PBRR三对引物进行PCR，并把PCR产物送至公司进行测序。2.2.5分片段A与pACRN载体的酶切和连接首先用引物NotI-F和Bst171I-R对PBR002-A质粒进行PCR反应，扩增出分片段A´，再通过胶回收得到纯化的A´片段。PBR002-A质粒的PCR反应体系：50μL反应体系：Q5Hotstart2×Mix25μLNotI-F1μLBst171I-R1μL无NRA酶H2O22μL质粒A1μL反应条件为：98Cfor30s98Cfor15s,]55Cfor30s,]35cycles72Cfor2min]终止反应：72C2.2.6A´片段和PACNR质粒的酶切：A´片段酶切反应体系：10×buffer5μL，DNA片段25μL，NotI1μL，Bst171I37 第三部分1μL，H2O28μL。PACNR质粒酶切反应体系：10×buffer5μL，DNA片段25ul，NotI1μL，Bst171I1μL,H2O10μL。反应条件：37℃水浴反应2h。琼脂糖凝胶电泳跑胶后观察条带大小，并挑选正确的条带，使用WizardSVGelandPCRclean-upSystem试剂盒来进行胶回收。通过紫外分光光度计测定浓度后，使用T4-lingase进行连接，将A´片段长度约为3000nt的片段与PACNR质粒长度为2000nt的片段进行连接。2.2.7A片段和pACNR质粒的连接：A片段DNA4μL，pACNR质粒DNA12μL，T4-lingase1μL，10×Buffer2μL,ddH2O1μL。反应条件：4℃过夜。挑取单克隆菌落，LB培养基37℃摇床过夜，第二天进行质粒的小提。经过琼脂糖凝胶电泳观察，选择正确大小的条带的质粒。用引物CF/AR对挑选的质粒进行PCR，将扩增的PCR产物送至公司测序。2.2.8pACNR-A质粒与pBR002-BC质粒的酶切：pACNR-A质粒酶切反应体系：10×buffer5μL，DNA片段30μL，XbaI1μL，Bst171I1μL，H2O13μL。pBR002-BC质粒酶切反应体系：10×buffer5μL，DNA片段35μL，XbaI1μL，Bst171I1μL,H2O8μL。反应条件：37℃水浴反应2h。琼脂糖凝胶电泳跑胶后观察条带大小，并挑选正确的条带，使用WizardSVGelandPCRclean-upSystem试剂盒来进行胶回收。通过紫外分光光度计测定浓度后，使用T4-lingase进行连接，将pACNR-A质粒长度约为5000nt的片段与pBR002P-BC质粒长度为8000nt的片段进行连接。2.2.9pACNR-A目的片段和BC片段的连接：BC片段DNA3μL，pACNR-A´质粒DNA12μL，T4-lingase1μL，10×Buffer2μL,ddH2O2μL。反应条件：4℃过夜。38 第三部分挑取单克隆菌落，LB培养基37℃摇床过夜，第二天进行质粒的小提。经过琼脂糖凝胶电泳观察，选择正确大小的条带的质粒。用引物CF/AR，AF/BR对挑选的质粒进行PCR，将扩增的PCR产物送至公司测序，同时酶切鉴定CFAV-pACNR质粒。3.结果3．1细胞融合病毒全长CDNA克隆的分段合成本实验选择的细胞融合病毒全长10682bp，分为A、B和C三个片段，分别连接到载体pBR002当中，其中pBR002-A为5423bp，pBR002-B为6902bp，pBR002-C为8531bp大小。pBR002-A用NotI-F和Bst171I-R两对引物通过PCR将长度为3301bp的A´片段扩增回收，由于pBR002-A没有Bst171的酶切位点，所以在Bst171I-R末端加入了Bst171I酶切位点，并加入了保护碱基。回收的A´片段与通过Bst171I和NotI酶切后回收的2059bp的PACNR质粒片段连接为pACNR-A。pBR002-B设计的酶切位点为XbaI和AgeI，酶切后回收3217bp的B片段。pBR002-C设计的酶切位点为XbaI和AageI，酶切后回收8519bp的C´片段。由B片段和C´片段连接而成的pBR002-BC大小为11736，设计的酶切位点为XbaI和Bst171I，酶切后回收7987bp的BC片段。pACNR-A用XbaI和Bst171I酶切，回收5375的pACNR-A´片段。最后把BC片段与pACNR-A´片段连接获得细胞融合病毒全长CDNA克隆CFAV-pACNR，如图1。39 第三部分图1全长CDNA克隆的设计示意图Fig1Designoffull-lengthCDNAclone3.2细胞融合病毒CDNA克隆的构建3.2.1细胞融合病毒分片段质粒的鉴定及酶切首先我们对包含细胞融合病毒分片段的三个质粒pBR002-A，pBR002-B，pBR002-C进行酶切及鉴定。将三个质粒pBR002-A，pBR002-B，pPR002-C通过1%琼脂糖凝胶电泳进行大小的鉴定，长度分别为pBR002-A为5423bp，pBR002-B为6902bp，pBR002-C为8046bp，电泳结果如2所示。图2三种质粒的大小鉴定Fig2Identificationofthreeplasmids40 第三部分pBR002-A作为模板，NotI-F做为上游引物，Bst171I-R做为下游引物进行PCR，获得长度为A´片段3301bp，电泳结果如图3所示。pBR002-B和pBR002-C用XbaI和AgeI进行酶切反应，pBR002-B回收长度为3217bp的B片段，pBR002-C回收长度为7987bp的C´，电泳结果如图4所示。图3PCR产物A´片段图4XbaⅠ和AgeⅠ酶切产物的鉴定Fig3ProductionAofPCRFig4IdentificationoftheproductofXbaⅠandAgeⅠ3.2.2细胞融合病毒连接片段的鉴定及酶切用T4连接酶将B片段与C´片段进行连接，经过多次挑选单克隆，并增加了胶回收浓度和优化了连接体系之后，在其中25个克隆质粒小提电泳后得到8个条带大小与目的质粒pBR002-BC相仿的克隆，分别是2、6、8、9、10、12、13、14、16，如图5所示。图5BC´单克隆的挑选Fig5SelectionofPlasmidofBC41 第三部分将电泳条带大小正确的8个单克隆送至诺赛公司测序，所用引物为pBRF/BR，BF/CR。pBRF在C´载体3´端距离与B接头500bp处，BR在B片段5´端距离与C´载体接头处600bp。BF在B片段3´端距离与C´载体接头处500bp，CR在C´载体´5´端距离与B片段接头处600bp。通过2号质粒测序结果分析（如图6），可以看到测序结果处在B与C´的接头位置，且质粒大小正确，认为将B片段连入C´载体。图6BC连接处测序结果Fig6ConcatenationresultsofthejunctionofBC长度为3301bp的A´与2059bp的pACNR载体经过T4连接酶连接，经过单克隆的挑选，在其中8个单克隆当中发现有与目的片段大小的条带，分别为3、4和8号克隆，但是其中都有1条15000bp大小以上的条带，如图7。图7PACNR-A单克隆的挑选Fig7SelectionofPlasmidofPACNR-A为了排除15000bp大小的条带，通过胶回收的方法得到了5000bp的条带，并用引物AF/AR对其进行了PCR反应将PCR扩增出2600bp大小条带（图8所示），送至诺赛公司测序，测序引物为AF/AR。42 第三部分图8引物AF/ARPCR产物Fig8productionofPCRofAF/AR测序结果如图9.a和9.b，从图可以看到AF测序结果a部分与pACNR-A在5000bp位置相匹配，而b部分在1000bp左右相匹配。测序结果表明，A´片段和pACNR载体接头处相吻合，我们确定A´与pACNR连接成功。图9.aPACNR-A测序结果分析图Fig9.aConcatenationresultsofthejunctionofPACNR-A图9.bpACNR-A测序结果分析图Fig9.bConcatenationresultsofthejunctionofPACNR-A43 第三部分得到长度为5409bp的pACNR-A质粒，如图10。用XbaI和Bst171I对B片段和C´片段连接的pBR002-BC进行酶切，将全长为11737bp的pBR002-BC切为三段，回收7987bp的BC片段，电泳结果如图11。pACNR-A用XbaI和Bst171I酶切，回收5360bp的pACNR-A´片段。图10质粒鉴定图11XbaI和Bst171I酶切鉴定Fig10IdentificationoftheplasmidFig11IdentificationoftheproductofXbaIandBst171I3.2.3细胞融合病毒全长CDNA克隆的连接及鉴定获得pACNR-A´和BC片段后，我们通过T4连接酶将其连接，通过单克隆挑选，在24个单克隆当中挑选到了3个符合预期条带大小，如下图13。图12pACNR-CFAV单克隆的挑选Fig12SelectionofPlasmidofPACNR-A44 第三部分将2，6，18号用AF/CR，BF/CR，CF/AR进行PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳后，只有18号克隆得到了预期大小的电泳条带，如图14。图13pACNR-CFAV单克隆的PCR产物Fig13TheproductofPCRofPACNR-CFAV用SnaI对18号质粒进行酶切鉴定，全长为13341bp的CFAV-pACNR质粒酶切为两段，如图18所示。图14质粒及SnaI酶切鉴定Fig14IdentificationoftheplasmidandSnaI同时用引物AF/CR，BF/CR，CF/AR对18号质粒测序，测序结果如图16所示。通过测序结果可以看到AF测序部分在pACNR载体与A片段接头部分，CF测序结果同样在pACNR和BC´接头部分，两部分的测序结果完全与预期目的片段所匹配，确认得到了CFAV-PANCR的全长cDNA克隆。45 第三部分图15CFAV-PACNR克隆的测序结果Fig15ComparisonofthesequenceofCFAV-PACNR4.讨论本部分研究中，采用体外合成技术，获得了含有细胞融合病毒的DNA分片段，运用体外连接，质粒扩增再酶切连接的一系列生物技术手段，将细胞融合病毒的全长cDNA连入到本实验室pACNR载体上。本研究成功构建了以pANCR为载体并包含Sp6转录启动子，病毒序列为细胞融合病毒Galveston病毒株的cDNA克隆。在构建克隆前期pBR002-C质粒酶切时总是多出一个3000bp左右大小的条带，经过分析认为pBR002-C质粒样品当中混入其他菌种，导致菌液不纯。本研究通过感受态细胞转化挑取单克隆的方式获得了单一的pBR002-C。pBR002-A质粒在测序时发现引物AF和AR测序后结果显示AR为正向引物，而AF为反向引物。使用seqman软件分析后得出结论，pBR002-A在pBR002载体与A片段连接时将A片段按照3´-5´方向连入载体，导致测序结果与预期不一致。中期胶回收浓度不高，以至于连接效率偏低，后通过优化实验步骤，增加回收胶体量等方法提高了胶回收的浓度。总体来看本部分研究获得了细胞融合病毒全长cDNA克隆，为细胞融合病毒的研究提供了反向遗传学的平台。通过此平台可以直接对细胞融合病毒进行定点突变，插入及重组等直接改造基因的手段，来对病毒的表达调控和致病的分子机制进行直观的研究。46 结论结论本研究通过分析构建一系列虫媒传播黄病毒系统进化树，对细胞融合病毒与其他黄病毒的结构蛋白核苷酸同源性及氨基酸同源性做了对比。通过比对朝阳病毒和寨卡病毒，发现细胞融合病毒在同源性上与寨卡病也比较接近。同时对朝阳病毒，寨卡病毒和细胞融合病毒的氨基酸序列进行了比对，经过分析后对三种病毒氨基酸序列相互关系有所了解。随后设计了可以定量、高效、特异的检测到细胞融合病毒的RT-PCR引物和探针，为细胞融合病毒的检测提供了一个可行的方法。最后通过生化合成的方法，运用体外连接等生物技术的手段，获得了细胞融合病毒的全长cDNA克隆。1.通过将细胞融合病毒基因组序列与其他黄病毒基因组进行进化分析和同源比对，我们发现细胞融合病毒在进化关系上与朝阳病毒更接近，而同源性与寨卡病毒和朝阳病毒差距并不大。序列比对表明，在核酸水平，蚊细胞融合病与Kamiti河病毒相似度达到64.1%，而与朝阳病毒相似度只有40.7%；在氨基酸水平上，细胞融合病毒与Kamiti河病毒相似度最高，达到66.9%。鉴于登革病毒和乙脑病毒的反向遗传学系统已经存在，它们之间的高水平相似为细胞融合病毒全长克隆构建的可行性提供了理论支持。2.基于序列分析，我们针对细胞融合病毒设计了特异性的qRT-PCR探针和引物，对引物的灵敏性和特异性进行了评价。对实验室已有蚊虫细胞的qRT-PCR检测发现，实验室蚊虫细胞并不携带细胞融合病毒基因组。因此，我们无法直接从蚊虫细胞克隆细胞融合病毒全基因组。3.基于进化优势考虑，我们选择Galveston病毒株基因组进行全序人工合成。为降低合成难度，我们将基因组序列分为三段（A、B、C），并在三段末端分别引入酶切位点方便后期片段连接。我们首先通过酶切连接，成功获得pACNR-A克隆；再次基础上将BC´片段加入，从而获得了全长细胞融合病毒cDNA克隆，并通过测序确认。4.我们获得全长细胞融合病毒cDNA克隆为细胞融合病毒为反向遗传学系统构建提供了极为重要的技术基础，为细胞融合病毒的遗传学研究做出了重要贡献。47 参考文献参考文献1.Stollar,V.andV.L.Thomas,AnagentintheAedesaegypticellline(Peleg)whichcausesfusionofAedesalbopictuscells.Virology,1975.64(2):p.367-77.2.Takeuchi,O.andS.Akira,Innateimmunitytovirusinfection.ImmunolRev,2009.227(1):p.75-86.3.Davey,M.W.,D.P.Dennett,andL.Dalgarno,Thegrowthoftwotogavirusesinculturedmosquitoandvertebratecells.JGenVirol,1973.20(2):p.225-32.4.Sang,R.C.,etal.,Isolationofanewflavivirusrelatedtocellfusingagentvirus(CFAV)fromfield-collectedflood-waterAedesmosquitoessampledfromadamboincentralKenya.ArchVirol,2003.148(6):p.1085-93.5.Ye,Q.,etal.,AsinglenucleotidemutationinNS2AofJapaneseencephalitis-livevaccinevirus(SA14-14-2)ablatesNS1'formationandcontributestoattenuation.JGenVirol,2012.93(Pt9):p.1959-64.6.Flamand,M.,TheflavivirusNS1protein'smysteriesunveiled?:(CommentonDOI10.1002/bies.201400182).Bioessays,2015.37(5):p.472.7.Zhai,Y.,etal.,Immune-enhancingeffectofnano-DNAvaccineencodingageneoftheprMEproteinofJapaneseencephalitisvirusandBALB/cmousegranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor.MolMedRep,2015.12(1):p.199-209.8.Upadhyay,A.K.,etal.,Crystalstructureoffull-lengthZikavirusNS5proteinrevealsaconformationsimilartoJapaneseencephalitisvirusNS5.ActaCrystallogrFStructBiolCommun,2017.73(Pt3):p.116-122.9.Paulke-Korinek,M.andH.Kollaritsch,Japaneseencephalitisandvaccines:pastandfutureprospects.WienKlinWochenschr,2008.120(19-20Suppl4):p.15-9.10.Daep,C.A.,J.L.Munoz-Jordan,andE.A.Eugenin,Flaviviruses,anexpandingthreatinpublichealth:focusondengue,WestNile,andJapaneseencephalitisvirus.JNeurovirol,2014.20(6):p.539-60.11.Qi,W.B.,etal.,EffectiveinhibitionofJapaneseencephalitisvirusreplicationbysmallinterferingRNAstargetingtheNS5gene.VirusRes,2008.132(1-2):p.145-51.12.Lu,G.andP.Gong,CrystalStructureofthefull-lengthJapaneseencephalitisvirusNS5revealsaconservedmethyltransferase-polymeraseinterface.PLoSPathog,2013.9(8):p.e1003549.13.Cook,S.,etal.,IsolationofanewstrainoftheflaviviruscellfusingagentvirusinanaturalmosquitopopulationfromPuertoRico.JGenVirol,2006.87(Pt4):p.735-48.14.Hoshino,K.,etal.,IsolationandcharacterizationofanewinsectflavivirusfromAedesalbopictusandAedesflavopictusmosquitoesinJapan.Virology,2009.391(1):p.119-29.15.Espinoza-Gomez,F.,etal.,DetectionofsequencesfromapotentiallynovelstrainofcellfusingagentvirusinMexicanStegomyia(Aedes)aegyptimosquitoes.ArchVirol,2011.156(7):p.1263-7.16.Yamanaka,A.,etal.,Geneticandevolutionaryanalysisofcell-fusingagentvirusbasedonThaistrainsisolatedin2008and2012.InfectGenetEvol,2013.19:p.188-94.17.Bolling,B.G.,etal.,Insect-specificvirusesdetectedinlaboratorymosquito48 参考文献coloniesandtheirpotentialimplicationsforexperimentsevaluatingarbovirusvectorcompetence.AmJTropMedHyg,2015.92(2):p.422-8.18.Pan,X.,etal.,Wolbachiainducesreactiveoxygenspecies(ROS)-dependentactivationoftheTollpathwaytocontroldenguevirusinthemosquitoAedesaegypti.ProcNatlAcadSciUSA,2012.109(1):p.E23-31.19.Luplertlop,N.,etal.,InductionofapeptidewithactivityagainstabroadspectrumofpathogensintheAedesaegyptisalivarygland,followingInfectionwithDengueVirus.PLoSPathog,2011.7(1):p.e1001252.20.Calzolari,M.,etal.,Insect-specificflaviviruses,aworldwidewidespreadgroupofvirusesonlydetectedininsects.InfectGenetEvol,2016.40:p.381-8.21.Katzourakis,A.andR.J.Gifford,Endogenousviralelementsinanimalgenomes.PLoSGenet,2010.6(11):p.e1001191.22.Hackett,B.A.,etal.,RNASEKisrequiredforinternalizationofdiverseacid-dependentviruses.ProcNatlAcadSciUSA,2015.112(25):p.7797-802.23.Hobson-Peters,J.,etal.,Anewinsect-specificflavivirusfromnorthernAustraliasuppressesreplicationofWestNilevirusandMurrayValleyencephalitisvirusinco-infectedmosquitocells.PLoSOne,2013.8(2):p.e56534.24.Kent,R.J.,M.B.Crabtree,andB.R.Miller,TransmissionofWestNilevirusbyCulexquinquefasciatussayinfectedwithCulexFlavivirusIzabal.PLoSNeglTropDis,2010.4(5):p.e671.25.Firth,A.E.,etal.,Evidenceforribosomalframeshiftingandanoveloverlappinggeneinthegenomesofinsect-specificflaviviruses.Virology,2010.399(1):p.153-66.26.Xi,Z.,J.L.Ramirez,andG.Dimopoulos,TheAedesaegyptitollpathwaycontrolsdenguevirusinfection.PLoSPathog,2008.4(7):p.e1000098.27.Bolling,B.G.,etal.,Insect-specificflavivirusesfromCulexmosquitoesinColorado,withevidenceofverticaltransmission.AmJTropMedHyg,2011.85(1):p.169-77.28.Bolling,B.G.,etal.,Insect-SpecificVirusDiscovery:SignificancefortheArbovirusCommunity.Viruses,2015.7(9):p.4911-28.29.Cook,S.,etal.,IsolationofanovelspeciesofflavivirusandanewstrainofCulexflavivirus(Flaviviridae)fromanaturalmosquitopopulationinUganda.JGenVirol,2009.90(Pt11):p.2669-78.30.Preugschat,F.,E.M.Lenches,andJ.H.Strauss,Flavivirusenzyme-substrateinteractionsstudiedwithchimericproteinases:identificationofanintrageniclocusimportantforsubstraterecognition.JVirol,1991.65(9):p.4749-58.31.StGeorge,T.D.,etal.,TheisolationofSaumarezReefvirus,anewflavivirus,frombirdticksOrnithodoroscapensisandIxodeseudyptidisinAustralia.AustJExpBiolMedSci,1977.55(5):p.493-9.32.Pletnev,A.G.,InfectiouscDNAcloneofattenuatedLangattick-borneflavivirus(strainE5)anda3'deletionmutantconstructedfromitexhibitdecreasedneuroinvasivenessinimmunodeficientmice.Virology,2001.282(2):p.288-300.33.Li,K.,W.W.Phoo,andD.Luo,FunctionalinterplayamongtheflavivirusNS3protease,helicase,andcofactors.VirolSin,2014.29(2):p.74-85.34.Grubaugh,N.D.,etal.,TransmissionbottlenecksandRNAicollectivelyinfluencetick-borneflavivirusevolution.VirusEvol,2016.2(2):p.vew033.49 参考文献35.Heiss,B.L.,O.A.Maximova,andA.G.Pletnev,InsertionofmicroRNAtargetsintotheflavivirusgenomealtersitshighlyneurovirulentphenotype.JVirol,2011.85(4):p.1464-72.50 硕士期间撰写的论著51 致谢致谢本文是在秦成峰研究员及李晓峰博士的精心指导下完成的。秦成峰老师科研思路开拓创新并富有远见，他不仅在科研上给与我指导，在生活中也给我提出许多宝贵意见，让我受益匪浅。李晓峰老师科研认真，态度严谨，是我学习的榜样。在三年的时间里，我在这里感受到了作为科学工作者真正的态度和责任感，感受到了所有人积极学习进取的精神，这些经历将是我人生当中宝贵的财富，是以后的日子里激励着我前进的动力和学习榜样。在此特别对他们表示真诚的谢意！感谢年庆功博士对我在实验当中的教导和指引，让我对科研工作有了初步的认识和想法，同时可以做生活当中的朋友一起开怀大笑，也可以聆听他对事物的见解和看法。感谢徐炎鹏博士在我的课题当中给与我的帮助，有许多问题都是其帮助下解决的，同时作为平时娱乐的搭档也是值得依靠的。感谢刘忠钰博士对我所有的帮助和宽容，同时他丰富的学识和见识让我钦佩不已，每次同他的谈话后我都获益匪浅。感谢姜涛老师，邓永强博士，赵慧博士，韩剑锋博士在课题研究与实验技术上的热心帮助！同时感谢田敏，张娜娜，黄星耀，叶青，纪雪，董好龙，解东洋，程梦丽，刘龙，祝琴，杨金霖等在工作和生活上的帮助。最后感谢我的家人对我的鼓励和支持，希望在以后的日子里能让你们看到我的努力和进步！52 综述综述细胞融合病毒研究进展摘要：细胞融合病毒（cellfusingagentvirus）是一种蚊媒黄病毒，最初在实验室培养的埃及伊蚊细胞中发现，并且可以造成白纹伊蚊细胞的融合，随后又在一些地区的自然界蚊子体内分离并且鉴定到这种病毒。基因进化分析比较细胞融合病毒与其他黄病毒的基因序列和蛋白序列发现细胞融合病毒蛋白与其他黄病毒蛋白的同源性最高为NS5（45％）和NS3（34％），而结构蛋白的同源性很小，在黄病毒属里与其他黄病毒亲缘关系较远。在实验室细胞培养中发现，细胞融合病毒只在蚊细胞内复制如Aag2，在BHK，KB和Vero中缺乏复制能力，在节肢动物及哺乳动物体内也不传播。细胞融合病毒这种特性近年来在一些其他蚊媒黄病毒中也有发现，后来将他们归类为特殊虫媒黄病毒（Insect-SpecificFlavivirus），这些病毒除了南极洲在全球的各地都有发现。研究报道一些ISFs病毒与某些黄病毒共感染会影响后者的传播与复制能力。在泰国的登革病毒流行区的自然界蚊体内分离出细胞融合病毒病毒，其是否对登革病毒的流行及分布造成影响也是一个值得关注的问题。本文将对细胞融合病毒生物学特性，流行分布，研究进展以及前景展望做简要介绍。关键词：CFAV蚊媒黄病毒复制Abstract：CFAV（cellfusingagentvirus）isonekindofmosquito-borneflavivirus.ItisinitiallyfoundinAedesaegypticellwhichisdevelopedinlaboratoryandcancausefusionofaedesalbopictuscells.Afterwards,itisalsoseparatedandauthenticatedinsomenaturalmosquitos.BycomparisonbetweenCFAVandotherflavivirus’sgeneorderandproteinorder,homologybetweenCFAVproteinandotherflaviviruscanreachNS5（45％）andNS3（34％）.However,homologyofstructuralproteinislowandhavefaraffinityrelationshipduringflaviviridae.Duringtheprocessoflabcelldevelopment,itisfoundthatCFAVcanonlyreplicationincellslikeAAG2andlackofreplicationabilityinBHK,KB,Vero.Italsocannotbespreadinthebodyofarthropodsandmammal.ThiskindofcharacteristicsofCFAVwasalsofoundfromothermosquito-borneflavivirusinrecentyears.Thenpeopleclassifiedthemasakind53 综述ofInsect-SpecificFlavivirus.AllthesevirusesdistributeateverycontinentexceptAntarctica.Accordingtosomereports,someISFsviruseswhichareco-infectedwithsomekindofflaviviruscaninfluentthelaterone’sabilityofspreadandcopy.ItisalsoaquestionworthytobediscussedthatCFAVviruswhichisfoundatDenguevirusepidemicareainThailandwhethercanaffectthepopularityanddistributionofDenguevirus.ThisarticlewillmakeabriefintroductionofCFAV’sbiologicalcharacteristics,epidemicdistribution,researchprogressandprospect.Keyword：cellfusingagentvirusmosquito-bornflavivirusreplication一．细胞融合病毒的发现及病原学研究：细胞融合病毒由STOLLAR和THOMAS在埃及伊蚊细胞来自建立起的细胞系（源自Peleg的蚊子胚胎）当中发现[1]。他们将埃及伊蚊细胞的培养液低速离心，然后在上清液加入未稀释的白纹伊蚊单层细胞液。在室温孵育60分钟后，去除残留白纹伊蚊细胞液，培养液继续在28℃环境下用MM培养基培养。当细胞融合已经变得充分（约72小时后），低速离心培养液，获得的上清液即为细胞融合病毒的病毒液。通过梯度沉降速率实验对比Sindbis病毒[2]发现细胞融合病毒类似B类披膜病毒。经过脱氧胆酸盐和乙醚处理的细胞融合病毒在感染白纹伊蚊细胞后的细胞病变效应消失，提示细胞融合病毒具有包膜必需的脂类物质。在细胞融合病毒感染白纹伊蚊细胞后60小时，可以观察到明显的细胞病变效应CPE，到76小时后90％以上的细胞出现CPE。通过观察细胞融合病毒的生长曲线，发现其在12h之内有一段潜伏期类似B类披膜病毒，而通过电镜观察到病毒颗粒大小约为50nm，也与B类披膜病毒类似[3]。由于没有检测到细胞融合病毒与其他黄病毒成员有血清交叉反应，只是通过生物表征进行推测，此时将细胞融合病毒暂时归类为B类披膜病毒。Cammisa-Parks和Ciasr确定了细胞融合病毒基因组的核苷酸序列，并且通过预测了细胞融合病毒蛋白氨基酸序列，并与其他Genbank中的病毒蛋白序列进行对比，经过生物信息学分析，细胞融合病毒蛋白与其他黄病毒的NS5（45％）和NS3（34％）蛋白同源性最高，而结构蛋白的同源性很小，但是它们的疏水性结构非常相似[4]。他们用禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶和随机引物合成细胞融合病毒的第一条cDNA链，第二链通过用大肠杆菌ColipolI和RNaseH54 综述（Boehringer-Mannheim试剂盒）来合成，然后使用逆转录酶和Ampli-TaqDNA聚合酶扩增细胞融合病毒的cDNA。同时将培养细胞融合病毒的白蚊伊纹细胞液通过蔗糖梯度离心，在1.2μg/ml的密度条件下获得细胞融合病毒的病毒颗粒，再由SDS-PAGE分离病毒蛋白后转移到Imobilon-P膜，最后使用气相序列仪进行测序分析[5]。经过与其他病毒基因序列对比分析，正式将细胞融合病毒分类到黄病毒科黄病毒属。以下将对细胞融合病毒的生物学特性、流行分布及研究进展做出介绍。二．细胞融合病毒生物学特性1.基因组结构：细胞融合病毒属于黄病毒属，它与其它黄病毒基因组结构一样，起始和末尾分别为3'UTR和5'UTR，中间共编码十个蛋白，三个结构蛋白和七个非结构蛋白。三个结构蛋白分别为C蛋白，E蛋白，prM蛋白，非结构蛋白NS1，NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5。prM蛋白在病毒成熟后形成膜蛋M后固定干病毒包膜内层。E蛋白是病毒包膜的主要糖蛋白，与病毒的细胞嗜性、病毒颗粒吸附和侵入和病毒颗粒的组装和释放以及诱导细胞的免疫应答。PrM和E蛋白的共表达可形成病毒样颗粒（viruslikeparticle，VLP）。细胞融合病毒基因组包括一个单一的长开放阅读框架，大约为10023nt。在其5'端有113个非编码核苷酸，而在其3'端有559个非编码核苷酸，3'末端没有多聚腺苷酸化结构。在3'末端发现了几个10到20nt左右的重复序列，在其他蚊媒黄病毒的3'末端非编码区没有发现类似的高度保守序列。还在3'末端大约94nt的位置发现存在茎环结构，与其他黄病毒的茎环结构相比细胞融合病毒的茎环结构似乎更加简单[6]。2.宿主与流行分布：最初细胞融合病毒是在实验室培养的埃及伊蚊细胞中发现，当时认为它是可以引起白纹伊蚊细胞融合的一种试剂，后来经过研究才确定将其归类为黄病毒。第一次在自然界发现并且分离到细胞融合病毒病毒是在波多黎各岛（2002），研究人员从一系列蚊子种类（埃及伊蚊，白纹伊蚊和库蚊属）当中分离到了多株野生型病毒[7]。通过病毒筛选，细胞培养和分子实验鉴定受感染的蚊子后发现，复制起始于其基因组3'末端，还预测了病毒的基因序列可以整合入蚊子基因组。随后研究人员又在印度尼西亚（2004）、墨西哥(2007)、泰国(2008)，美国(2012)发55 综述现了在自然界蚊子体内存在CFAV[5,8-10]。对泰国发现的病毒株和宿主进行生物进化分析，发现细胞融合病毒可以长时间的存在于蚊子体内且传播通过垂直传播，在这样的特定环境其基因组没有太大变化，同时极其可能与登革病毒在这一区域的蚊子体内存在共感染现象。就目前的形势来看，细胞融合病毒可能普遍存在于世界各地。3.细胞融合病毒基因组功能的研究：最近十年来在全球范围内发现了一系列特殊的黄病毒，这些病毒由于只能在单一蚊虫细胞中复制从而变得被人们关注，但是后来这种情况发生了改变。有一些黄病毒只可以在蚊子之间传播，称为classicalISFs(cISFs)，另外一些可以在蚊子和脊椎动物之间传播称为dual-hostaffiliatedISFs(dISFs)。目前clSFs包括12种病毒而细胞融合病毒正是其中之一，其他的还有如KamitiRivervirus（KRV)[11]等。dISFs目前包括9种病毒主要包括Chaoyangvirus,Nounanévirus，Lammivirus等[12]。通过研究发现在蚊子基因组里存在类似clSFs的基因序列片段，称之为细胞沉默因子（designatedcellsilentagent）。细胞沉默因子的发现证实了黄病毒序列整合到蚊子基因组的现象是存在的，虽然许多文献已记录过病毒序列整合到宿主基因组中[13]，但是大多数整合的序列是高度片段化或终止密码子，只有少数几个会编码完整的ORFs。最重要的是黄病毒的一些基因组整合到宿主基因组后可以转录，因此在生物体中检测到黄病毒的RNA并不一定证明其携带具有感染性的黄病毒。病毒的同源干扰是宿主细胞感染的过程一种病毒感染干扰相同或相似病毒复制和转录的现象。这种现象在病毒感染期间已观察到，并且可以在脊椎动物和无脊椎动物宿主中发生。而cISFs诱导的双宿主黄病毒同源干扰现象在蚊子细胞中情况是有变化的，如预先感染C6/36细胞的PCV，它的复制会随着加入的WNV和MVEV复制而显著减少[14]。相比之下，先前感染C6/36的CxFV，与细胞中加入的WNV复制没有关联[15]。这些研究表明cISFs可以对双宿主黄病毒的传播和复制造成影响。细胞融合病毒作为cISF中的一员，在登革病毒流行区域的蚊子体内存在，对登革病毒的复制和传播有怎样的影响，目前还未报道其可能机制。在蛋白质生物合成时，核糖体在信使核糖核酸(mRNA)的特定序列处，从一个可读框位移至另一个可读框的现象，这是某些RNA病毒在翻译水平上调节蛋56 综述白质合成的一种机制。研究发现cISFs具有程序式-1核糖体移码的现象，即核糖体移动向旁边移动-1nt[16]，并且核糖体移码位点下游正是其茎环结构。三．前景与展望虽然细胞融合病毒等cISFs病毒因其昆虫特异性而对人类健康威胁极小，但是从科学的角度有几个问题不应该被忽视。首先细胞融合病毒和其他黄病毒相比为什么只在蚊子体内复制，而在其他动物如哺乳动物和脊椎动物体内没有复制能力；其次类比其他cISFs病毒，细胞融合病毒是否也会对其他双宿主黄病毒的转录和复制造成影响如细胞融合病毒与登革病毒共感染。最后，细胞融合病毒在未来的环境选择下会不会进化成对人类健康造成重大威胁的突变体如寨卡病毒[17]的爆发。总而言之，对细胞融合病毒的研究还是很必要的，因为它可以为对人类生命健康造成影响的其他黄病毒的研究提供独特的角度和见解。相信在不远的将来黄病毒的致病机制会被人类进一步认识。参考文献：1.Stollar,V.andV.L.Thomas,AnagentintheAedesaegypticellline(Peleg)whichcausesfusionofAedesalbopictuscells.Virology,1975.64(2):p.367-77.2.Boulton,R.W.andE.G.Westaway,Comparisonsoftogaviruses:Sindbisvirus(groupA)andKunjinvirus(groupB).Virology,1972.49(1):p.283-9.3.Davey,M.W.,D.P.Dennett,andL.Dalgarno,Thegrowthoftwotogavirusesinculturedmosquitoandvertebratecells.JGenVirol,1973.20(2):p.225-32.4.Cammisa-Parks,H.,etal.,Thecompletenucleotidesequenceofcellfusingagent(CFA):homologybetweenthenonstructuralproteinsencodedbyCFAandthenonstructuralproteinsencodedbyarthropod-borneflaviviruses.Virology,1992.189(2):p.511-24.5.Espinoza-Gomez,F.,etal.,DetectionofsequencesfromapotentiallynovelstrainofcellfusingagentvirusinMexicanStegomyia(Aedes)aegyptimosquitoes.ArchVirol,2011.156(7):p.1263-7.6.Peiris,J.S.,J.S.Porterfield,andJ.T.Roehrig,MonoclonalantibodiesagainsttheflavivirusWestNile.JGenVirol,1982.58(Pt2):p.283-9.7.Cook,S.,etal.,IsolationofanewstrainoftheflaviviruscellfusingagentvirusinanaturalmosquitopopulationfromPuertoRico.JGenVirol,2006.87(Pt4):p.735-48.8.Hoshino,K.,etal.,IsolationandcharacterizationofanewinsectflavivirusfromAedesalbopictusandAedesflavopictusmosquitoesinJapan.Virology,2009.391(1):p.119-29.9.Yamanaka,A.,etal.,Geneticandevolutionaryanalysisofcell-fusingagentvirusbasedonThaistrainsisolatedin2008and2012.InfectGenetEvol,2013.19:p.188-94.57 综述10.Papa,A.,etal.,DetectionofWestNilevirusandinsect-specificflavivirusRNAinCulexmosquitoes,centralMacedonia,Greece.TransRSocTropMedHyg,2014.108(9):p.555-9.11.Newman,C.M.,etal.,CulexFlavivirusDuringWestNileVirusEpidemicandInterepidemicYearsinChicago,UnitedStates.VectorBorneZoonoticDis,2017.17(8):p.567-575.12.Blitvich,B.J.andA.E.Firth,Insect-specificflaviviruses:asystematicreviewoftheirdiscovery,hostrange,modeoftransmission,superinfectionexclusionpotentialandgenomicorganization.Viruses,2015.7(4):p.1927-59.13.Katzourakis,A.andR.J.Gifford,Endogenousviralelementsinanimalgenomes.PLoSGenet,2010.6(11):p.e1001191.14.Hobson-Peters,J.,etal.,Anewinsect-specificflavivirusfromnorthernAustraliasuppressesreplicationofWestNilevirusandMurrayValleyencephalitisvirusinco-infectedmosquitocells.PLoSOne,2013.8(2):p.e56534.15.Kent,R.J.,M.B.Crabtree,andB.R.Miller,TransmissionofWestNilevirusbyCulexquinquefasciatussayinfectedwithCulexFlavivirusIzabal.PLoSNeglTropDis,2010.4(5):p.e671.16.Firth,A.E.,etal.,Evidenceforribosomalframeshiftingandanoveloverlappinggeneinthegenomesofinsect-specificflaviviruses.Virology,2010.399(1):p.153-66.17.Yun,S.I.andY.M.Lee,Zikavirus:Anemergingflavivirus.JMicrobiol,2017.55(3):p.204-219.58
