携带遗传标记的PCV1-2嵌合病毒感染性克隆质粒的构建

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分类号：S855.3密级：公开论文编号：2014022165贵州大学2017届硕士研究生学位论文携带遗传标记的PCV1-2嵌合病毒感染性克隆质粒的构建学科专业：预防兽医学研究方向：动物传染病病原分子生物学导师：曾智勇教授研究生：代振江中国﹒贵州﹒贵阳2017年6月 国家自然科学基金项目项目编号：31560688贵州省省校科技联合资金项目资助合同编号：黔科合LH字（2014）7670 目录中文摘要.................................................................................................................1Abstract...................................................................................................................4第一章文献综述..........................................................................................................71病原学..................................................................................................................81.1分类..................................................................................................................81.2PCV的形态和理化特性..................................................................................92PCV分子生物学.................................................................................................92.1病毒基因组......................................................................................................92.2PCV2各ORFs及其编码的蛋白质...............................................................102.2.1ORF1及其编码的蛋白质....................................................................102.2.2ORF2及其编码的蛋白质.....................................................................112.3病毒的感染和复制.........................................................................................143流行病学............................................................................................................174PCV2疫苗的研究进展.....................................................................................194.1商品化疫苗....................................................................................................194.2新型疫苗.........................................................................................................214.3V5表位标签概述...........................................................................................275展望...................................................................................................................286试验目的及意义...............................................................................................28第二章PCV2贵州分离株的基因型及生物信息学分析...........................................301材料...................................................................................................................311.1PCV2核苷酸序列..........................................................................................311.2相关分析软件................................................................................................312方法...................................................................................................................312.1PCV2基因型分析..........................................................................................312.2PCV2基因组结构分析..................................................................................313结果....................................................................................................................32II 3.1PCV2基因型分析..........................................................................................323.2PCV2基因组结构分析..................................................................................344讨论....................................................................................................................385结论....................................................................................................................40第三章携带遗传标记的PCV1-2m-V5嵌合病毒感染性克隆质粒的构建.............411材料...................................................................................................................412方法...................................................................................................................423结果与分析.......................................................................................................503.1V5标记PCV2全基因组扩增.......................................................................503.2pMD19-T-PCV2m-V5质粒的PCR鉴定......................................................503.3PCV2-ORF2-V5的扩增.................................................................................513.4pMD19-T-PCV1△ORF2的扩增...................................................................513.5pMD19-T-PCV1-2m-V5质粒的鉴定............................................................523.6pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒的鉴定......................................523.7免疫小鼠PCV1-2m-V5病毒血症的检测结果...........................................533.8第5代PCV1-2m-V5细胞液PCR检测结果...............................................543.9IFA检测结果..................................................................................................554.0WerternBlot试验结果....................................................................................574.1电子显微镜观察结果.....................................................................................575讨论....................................................................................................................586结论....................................................................................................................60参考文献...............................................................................................................61附录一攻读硕士学位期间发表的学术论文.......................................................73致谢..............................................................................................................................74III 携带遗传标记的PCV1-2嵌合病毒感染性克隆质粒的构建中文摘要猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2,PCV2）属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus），是一种单股负链环状的DNA病毒。PCV2能引起母猪繁殖障碍、断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道综合征和PCV2相关性肠炎等多种疾病，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前，疫苗免疫仍是防控PCV2的主要手段，我国市面上的疫苗主要是灭活疫苗，该类疫苗对PCV2的防控起到了重要作用。但是，目前的灭活疫苗也存在诸如不能有效的诱导宿主产生细胞免疫，其产生的抗体不能同野毒相区别等缺陷。iDNA疫苗作为一种新型基因工程疫苗，其既能发挥核酸疫苗的作用，又能发挥弱毒疫苗的作用，能同时诱导体液免疫和细胞免疫，具有良好的发展前景。鉴于此，本研究通过基因工程技术构建了携带遗传标记的PCV1-2嵌合病毒感染性克隆质粒，拯救获得了携带遗传标记的重组病毒株，并对其进行了初步鉴定，为研发PCV2iDNA标记疫苗奠定了基础，主要研究内容如下：1、PCV2贵州分离株各基因型之间的差异及生物信息学分析本研究首先对PCV2贵州分离株各基因型之间的差异及生物信息学进行了分析，旨在掌握贵州省PCV2流行毒株的分子遗传特征，为构建携带遗传标记的PCV1-2嵌合病毒亲本毒株基因型的选择和PCV2的防控提供参考。构建进化树显示，当前贵州流行株主要为PCV2b和PCV2d基因型毒株。通过对收集的51株PCV2核苷酸序列的比较分析发现，PCV2各基因型毒株的全基因组大小分别为PCV2a（1768bp）、PCV2b（1767bp）、PCV2c（1767bp）、PCV2d（1767bp）、PCV2e（1768bp），ORF2基因组大小分别为PCV2a（702bp）、PCV2b（702bp）、PCV2c（705bp）、PCV2d（705bp）、PCV2e（702bp），根据他们基因组的差异可以将PCV2a/PCV2e、PCV2b、PCV2c/PCV2d进行区分；各PCV2毒株核苷酸序列之间的差异主要存在于ORF2和ORF1内，同种基因型毒株之间的氨基酸序列较为保守，不同基因型毒株之间的氨基酸序列差异较大，其中PCV2a同PCV2d毒株之间的差异最大，PCV2b型毒株与另外2种基因型毒株之间的差异稍小，1 推测PCV2b可能是PCV2a向PCV2d演化的一种过渡基因型毒株；从序列相似性来看，PCV2b型毒株是研发PCV2iDNA疫苗的良好候选疫苗毒株。2、PCV1-2m-V5嵌合病毒感染性克隆质粒的构建及初步鉴定根据序列分析的结果，本研究选择PCV2b型的GZ-RH1株作为亲本毒株，通过设计1对含V5标签的引物，应用PCR技术将V5标签引入到PCV2ORF2末端后，再用携带V5标签的PCV2ORF2置换PCV1ORF2，并将其定向克隆至pcDNA3.1真核表达载体，经系列鉴定证明成功构建了pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒。将该感染性克隆质粒通过肌肉注射接种至昆明小鼠后，分别于第7d、14d、21d、28d、35d、42d断尾采集小鼠血液，并通过PCR对血液样品进行PCV1-2m-V5病原核酸检测，检测结果显示试验小鼠从第7d开始产生PCV1-2m-V5病毒血症，一直持续到第21d，将第14d检测的阳性PCR产物克隆测序，结果显示，该序列与构建的pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒序列存在5个氨基酸的差异，其余序列一致，表明通过小鼠接种试验，成功拯救获得了PCV1-2m-V5病毒。而后，分别将含有PCV1-2m-V5病毒的阳性血清和PCV2GZ-RH1病毒接种至PK15细胞，分别以V5标签单克隆抗体和PCV2阳性血清为一抗，对第5代接毒细胞进行IFA检测。以V5标签单克隆抗体为一抗的IFA检测结果显示，在接种PCV1-2m-V5病毒的PK15细胞中检测到了绿色荧光，接种PCV2GZ-RH1病毒的PK15细胞中无明显荧光；而以PCV2阳性血清为一抗的IFA检测结果显示，接种PCV1-2m-V5和PCV2GZ-RH1病毒的PK15细胞中均有明显绿色荧光。分别收集接种PCV1-2m-V5和PCV2GZ-RH1病毒的第5代细胞培养物，以V5标签为一抗进行WesternBlot检测，结果表明接种PCV1-2m-V5病毒的细胞培养物中有特异性目的条带，接种PCV2GZ-RH1病毒的细胞培养物为阴性，IFA和WesternBlot检测结果表明拯救的PCV1-2m-V5病毒能在感染细胞中产生携带有V5标签的Cap蛋白，利用该特点，可选用血清学方法对拯救病毒与野毒感染进行鉴别。此外，利用携带V5标签的引物分别对接种PCV1-2m-V5和GZ-RH1PCV2病毒的第5代细胞培养物进行ORF2-V5基因检测，能在接种前者的细胞培养物中检测到特异性条带，而在后者中不能检测到特异性条带，表明可利用该对引物对拯救病毒和野毒进行鉴别。PCV1-2m-V5拯救病毒的电镜形态观察结果显示，在以V5抗体进行的免疫沉淀实验样品中，可见与PCV形态2 大小一致的病毒粒子，表明第5代细胞培养物中存在携带V5标签的PCV1-2m-V5粒子。本研究成功构建了pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒，并获得了PCV1-2m-V5拯救病毒株；初步鉴定表明PCV1-2m-V5可在PK15细胞中增殖，利用实验设计的特异性引物可以对PCV1-2m-V5与其他PCV2毒株进行区别，针对拯救病毒既能对V5抗体产生免疫学反应，也能对Cap蛋白抗体产生免疫学反应，提示应用V5蛋白标记的ELISA可对该拯救病与PCV2野毒抗体进行区别，该研究为PCV2iDNA标记疫苗的研制奠定了基础。关键词：PCV2；病毒拯救；遗传标记；感染性克隆；iDNA疫苗3 ConstructionofPCV1-2ChimericVirusInfectiousClonePlasmidWithGeneticMarkersAbstractPorcinecircovirustype2(PCV2)belongstoCircoviridaeCircovirus,asingle-strandednegative-chainDNAvirus.PCV2cancausesowreproductivedisorders,weaningpigletmulti-systemfailuresyndrome,porcinedermatitisnephroticsyndrome,porcinerespiratorysyndromeandPCV2-relatedenteritisandotherdiseases,totheworld'spigindustrycausedhugeeconomiclosses.Atpresent,thevaccineisstillthemainmeansofpreventionandcontrolofPCV2,China'svaccineismainlyinactivatedvaccine,thevaccineonPCV2preventionandcontrolplayedanimportantrole.However,thecurrentinactivatedvaccinesalsohavedefectssuchasinabilitytoeffectivelyinducecellularimmunity,andtheresultingantibodiescannotbedistinguishedfromwildviruses.Asanewgeneticallyengineeredvaccine,iDNAvaccinecanplaytheroleofnucleicacidvaccineandplaytheroleofattenuatedvaccine,whichcaninducehumoralimmunityandcellularimmunityatthesametime,andhasgoodprospectsfordevelopment.Inthisstudy,aPCV1-2chimericviralcloningplasmidcarryingthegeneticmarkerwasconstructedbygeneticengineeringtechnique.Therecombinantvirusvectorcarryingthegeneticmarkerwassavedandidentified.ThePCV1iDNAmarkerVaccinelaidthefoundation,themainresearchcontentisasfollows:1、PCV2GuizhouisolatesandtheirbioinformaticsanalysisInthisstudy,thedifferencesbetweenthegenotypesofPCV2Guizhouisolatesandthebioinformaticswereanalyzed.TheaimofthisstudywastoinvestigatethemoleculargeneticcharacteristicsofPCV2epidemicstrainsinGuizhouprovince.ToconstructthePCV1-2chimericvirusTheselectionofgenotypesandthepreventionandcontrolofPCV2.ThegenomesizeofPCV2a,PCV2bandPCV2dstrainswas1768,1767,1767bpandthegenomesizeofORF2was702,702and705bp,respectively,bycomparingthecollectedPCV2nucleotidesequences.Thedifferences4 amongthenucleotidesequencesofPCV2strainsweremainlyfoundinORF2andORF1.Theaminoacidsequencesofthesamegenotypestrainswereconservedandthegenotypesoftheisolatesweredifferent.ThedifferencebetweenPCV2bandPCV2dstrainwasthelargest,andPCV2bwasdifferentfromPCV2b.ItwaspresumedthatPCV2bmightbeakindofPCV2atoPCV2d.Transitionalgenotypestrain;suggestingthatPCV2bstrainisagoodcandidatevaccinestrainforthedevelopmentofPCV2iDNAvaccine.2、PCV1-2m-V5chimericvirusinfectioncloningplasmidconstructionandpreliminaryidentificationAccordingtotheresultsofsequenceanalysis,theGZ-RH1strainofPCV2btypewasselectedastheparentstrain.Byintroducing1V5-labeledprimer,theV5tagwasintroducedintoPCV2ORF2byPCR.PCV1ORF2wasusedtoreplacePCV1ORF2andclonedintopcDNA3.1eukaryoticexpressionvector.TherecombinantplasmidpcDNA3.1-PCV1-2m-V5wassuccessfullyconstructed.TheinfectedmicewereinoculatedintoKunmingmicebyintramuscularinjectionoftheinfectedclones.Themicewerecollectedatthe1st,2nd,3rd,4thand5thweek,respectively.ThebloodsampleswerecollectedbyPCV1-2m-V5TheresultsshowedthatthetestmiceproducedPCV1-2m-V5viremiafromthefirstweekandcontinueduntilthethirdweek.ThepositivePCRproductwasdetectedbythefirstweek.TheresultsshowedthatthesequencewasConstructionofpcDNA3.1-PCV1-2m-V5infectiouscloneplasmidsequenceisbasicallythesame,indicatingthatthroughthemouseinoculationtest,successfullyrescuedtoobtainthePCV1-2m-V5virus.Then,positiveseracontainingPCV1-2m-V5virusandPCV2GZ-RH1viruswereinoculatedintoPK15cellsrespectively.V5-labeledmonoclonalantibodyandPCV2positiveserumwereusedasprimaryantibody,andthe5thgenerationvirus-receivingcellsweresubjectedtoIFAdetectionTheTheresultsofIFAtestshowedthatgreenfluorescencewasdetectedinPK15cellsinfectedwithPCV1-2m-V5virus,andnosignificantfluorescencewasobservedinPK15cellsinfectedwithPCV2GZ-RH1virus.TheresultsofIFAtestshowedthatthegreenfluorescenceofPK15cellswasinoculatedwithPCV1-2m-V5andPCV2GZ-RH1.The5thgenerationcellcultureof5 PCV1-2m-V5andPCV2GZ-RH1viruswascollectedandsubjectedtoWesternBlotdetectionwiththeV5tagasaprimaryantibody.TheresultsshowedthattherewasaspecificpurposeincellcultureofPCV1-2m-V5virusTheresultsshowedthattherescuedPCV1-2m-V5viruscouldproduceV5-taggedCapproteinininfectedcells.Usingthisfeature,thePCV1-2m-V5viruscouldbeusedtoamplifythecellcultureofPCV2GZ-RH1virus.Theserologicalmethodidentifiesthevirusandwildvirusinfection.Inaddition,theORF2-V5genewasdetectedinthefifthgenerationcellcultureofPCV1-2m-V5andGZ-RH1PCV2virusbyusingtheprimercarryingtheV5tag,andthespecificbandwasdetectedinthecellcultureoftheformerBand,andinthelattercannotdetectthespecificband,indicatingthatthepairofprimerscanbeusedtosavethevirusandwildvirustoidentify.PCV1-2m-V5rescueviruselectronmicroscopicobservationoftheresultsshowedthatintheV5antibodyimmunoprecipitationoftheexperimentalsample,canbeseenwiththesizeofPCVconsistentwiththesizeofthevirusparticles,indicatingthatthefifthgenerationofcellculturecontainingV5-labeledPCV1-2m-V5particles.Inthisstudy,pcDNA1.1-PCV1-2m-V5infectiouscloningplasmidwassuccessfullyconstructedandPCV1-2m-V5rescuestrainwassuccessfullyconstructed.TheresultsshowedthatPCV1-2m-V5couldproliferateinPK15cellsandtheexperimentaldesignSpecificprimerscandistinguishPCV1-2m-V5fromotherPCV2strains,andcanimmunodeactivatebothV5antibodiesandrescueproteinsagainstCapprotein,suggestingthatELISAwithV5proteinThedifferencebetweentherescueandPCV2wild-typeantibodieswasestablished,whichlaidthefoundationforthedevelopmentofPCV2iDNAlabeledvaccine.Keywords:PCV2;virusrescue;geneticmarker;infectiousclone;iDNAvaccine6 第一章文献综述1974年，科学家Tischer等在PK15细胞系ATCC-CCL31的传代过程中发现了类似乳多空病毒和细小病毒的圆形颗粒状粒子，这类颗粒状的粒子并未导致细胞病变，所以Tisher等认为这些粒子只是一种普通的细胞污染物（Tischeretal.,1974），直至1982年Tischer等通过超速离心机离心后获得了该粒子，并在电镜下观察其形态，最终发现这不是普通污染物，而是一种无囊膜的单链环状DNA病毒，其被命名为猪圆环病毒（Porcinecircovirus,PCV）（Tischeretal.,1982）。随后的调查发现，在德国、加拿大、新西兰、英国和美国等国家的猪群中PCV的血清抗体均为阳性，其广泛存在于猪源细胞系PK15细胞和猪只体内，但其并未引起细胞产生病变，也未导致猪只产生任何临床症状和病理变化，故未引起人们的足够重视（DaftBetal.,1996;SmythJAetal.,2001;OnukiAetal.,1999）。1991年，Clark等在加拿大某些猪场中首次发现了断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS），并分离到了该种病毒，研究发现该病毒与Tischer等报道的PCV类似，但抗原性和致病力与PCV存在较大差异，随后加拿大、法国、西班牙和意大利等国家先后暴发了PMWS（ClarkEetal.,1991;SegalèsJetal.,1997;MadecFetal.,2002）。MeehanBM于1998年首次将PCV分为在PK15细胞系中广泛存在但无致病力的PCV1（Porcinecircovirustype1,PCV1）和能引起猪只产生PMWS的PCV2（MeehanBMetal.,1998）。2000年，郎洪武通过ELISA方法检测到了PCV2在我国的存在，此后PCV2先后在我国各省市被检测到。PCV2主要侵害猪只的免疫系统，会导致猪只的免疫抑制，研究表明当前PCV2的变异速度加快，且临床上存在多种PCV2亚型共感染，常与如猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒等共感染现象，感染情况普遍且复杂，给养猪业造成了巨大的经济损失。另有研究发现，PCV2现不仅在猪群中流行，在人类、牛、啮齿动物、苍蝇、蚊子、贝类等动物种群，且在水、人用疫苗、空气中也分别检测或分离到了PCV2，为猪圆环病毒相关性系统疾病（PCV2-SD）的防控带来新的挑战（ZhaiSLetal.,2014;YangXHetal.,2012;BluntRetal.,2011;NayarGPSetal.,1999;LõrinczMetal.,2010）。目前，疫苗免疫仍是防控PCV2的主要手段，临床上应用的大多为PCV2全病毒灭活疫苗或亚单位疫苗，这类疫苗有一定的免疫效果，但其抗原浓度低、免疫7 后抗体产生较慢、生产成本较高，且其产生的抗体不能与野毒产生的抗体相区别（邵小雪等，2016年）。因此，进一步研发能区分疫苗毒与野毒的PCV2新型基因工程疫苗具有重要意义。1病原学1.1分类猪圆环病毒（Porcinecircovirus,PCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus），是1995年国际病毒分类委员会（ICTV）第六次病毒分类报告上新增的一个病毒科，该科病毒的共同特征为病毒无囊膜，其核酸为单股负链环状DNA，包括一些动物病毒和植物病毒。其中动物病毒包括猪圆环病毒（Porcinecircovirus,PCV）、鸡贫血病毒（Chickenanemiavirus,CAV）、鹅圆环病毒（Goosecircovirus,GCV）、鸭圆环病毒（Duckcircovirus,DuCV）、鹦鹉缘羽病病毒（Psittacinebeakandfeatherdiseasevirus,PBFDV）、鸽圆环病毒（Pigeoncircovirus，PiCV）、金丝雀圆环病毒（Canarycircovirus,CaCV）等；植物病毒有三叶草侏儒病毒（Subterraneancloverstuntvirus,SCSV）、椰树叶腐烂病毒（Cocodutfoliardecayvirus,CFDV）和香蕉束顶病毒（Bananabunchytopvirus,BBTV）等。有研究人员在比较了这些病毒的理化特性后于1998年建议将圆环病毒科分为三个群，PCV和PBFDV为第一群，这两种病毒皆含有和双义病毒（Geminivirus）很类似的双义基因组及数个RNA转录子（Hameletal.,1998）；植物圆环病毒为第二群，这类病毒均含有双义病毒的茎环状DNA结构；CAV、TTV和TLMV为第三个群，其共同特征是仅含一个多顺反子mRNA转录子和有类似启动子和增强子的基因组结构等（祝卫国，2008）。2005年，国际病毒分类委员会第8次国际病毒分类报告将圆环病毒科进一步划分为圆环病毒属（Circovirus）和圆圈病毒属（Gyrovirus），同时将之前圆环病毒科的输血性肝炎病毒（Transfusion-transmittedvirus,TTV）更名为细环病毒（Torquetenovirus,TTV），并单独归为尚未定科的指环病毒属（Anellovirus），该属还包括细小环病毒（Toxquetenominivirus,TTMV）。圆圈病毒属中仅有鸡传染性贫血病毒；圆环病毒属包括PCV、PiCV、CaCV和GCV等（陆承平等，2005）。8 1.2PCV的形态和理化特性PCV病毒粒子由核酸和衣壳蛋白组成，每个病毒粒子包含60个Cap蛋白，无囊膜，呈二十面体对称，直径约为17±1.3nm，纯化的PCV病毒粒子呈球状，边缘清晰且分布比较分散，其沉降系数为52S，病毒氯化铯浮密度为1.37mg/ml（Tischeretal.,1982）。PCV没有血凝性，不能凝结人和猪、牛、羊、鸡等动物的红细胞。PCV对外界的抵抗力较强，可在PH=3的酸性环境和氯仿中不失活；56℃不能将其灭火，在72℃能存活15min；对碘酒、乙醇和甲醛不敏感，但用其处理10min，病毒滴度会下降（Allanetal.,1994；Madsonetal.,2006；O’Connoretal.,2001）；强碱、氧化剂和季胺类化合物能使病毒灭活（Martinetal.,2008；Resendesetal.,2011）。感染PK15细胞后，PCV会在胞浆内形成较多的包涵体，部分被感染细胞内还具有核内包涵体。大部分细胞浆内包涵体散布在细胞核的周围，为卵圆形或圆形，其又可被分为两种类型：较小的胞浆内包涵体呈颗粒状，无膜包围，直径为0.1～0.5μm，边缘与胞质融在一起；较大的一种胞浆内包涵体电子密度比较大，周围有膜包裹，其直径为0.5～5.0μm（Rovira,Aetal.,2002;Segalésetal.,2004）。核内包涵体呈圆形或铃形，直径为0.1～1μm，与异染色质或网状核仁的凝结物有一定关系。将PCV发病猪的脾脏、淋巴结等组织细胞置于电子显微镜下可观察到细胞核内聚集着较多的无囊膜病毒粒子（祝卫国，2008）。2PCV分子生物学2.1病毒基因组圆环病毒基因组由共价结合的闭合环状单股负链的DNA构成。猪圆环病毒包含PCV1和PCV2两种基因型，其中PCV1的基因组大小为1758或1759个核苷酸；PCV2的基因组由1767或1768个核苷酸构成，之后又报道了基因组大小为1766个核苷酸的PCV2（Hardingetal.,2009）。各地报道的PCV1和PCV2的相似性均在90%以上，表明PCV的同种基因型之间的相似性较高。但是，PCV1和PCV2两种基因型之间的基因组核苷酸序列相似性不到80%，两者的氨基酸序列相似性低于76%，且差异主要存在于ORF2和ORF3内部（Kennedyetal.,2000;McIntoshetal.,2006;Nielsenetal.,2003）。PCV1和PCV2的基因组均存在11个人为划分的ORFs，其9 中PCV2的ORF位置如图1所示。位于PCV2病毒基因组正链上的ORF分别有：ORF1、ORF5、ORF7和ORF10，位于PCV2病毒基因组负链上的ORF分别为：ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9和ORF11，这11个编码框有部分互相重叠，使PCV2极为有限的基因组序列得到了充分的使用。图1-1PCV2基因组结构图（代振江，2016）Fig.1-1ThemapofPCV2genomicstructure2.2PCV2各ORFs及其编码的蛋白质2.2.1ORF1及其编码的蛋白质PCV2的ORF1负责编码两种参与PCV2病毒复制的重要蛋白质，被人们叫做复制酶相关蛋白，包括Rep蛋白和Rep’蛋白。Rep蛋白和Rep’蛋白源自于不相同的ORF1转录产物，其中Rep蛋白由有945个核苷酸的ORF1编码的314个氨基酸构成，Rep’蛋白由具有537个核苷酸的拼接转录产物编码的178个氨基酸组成。编码Rep蛋白的基因启动子存在于PCV2正链的第640位～796位核苷酸区域之中，该片段10 内的第742位～753位核苷酸序列之间，存在着一个干扰素的刺激应答元件（IFN-stimulatedresponseelement,ISRE），这表明细胞因子也许对Rep基因具有一定的调控功能（Juhanetal.,2010;MankertzAetal.,2001）。除此之外，Rep和Rep’蛋白内部还存在3个保守基序，分别为Ⅰ(FTLNN）、Ⅱ(HLQG）、Ⅲ(YCSK)，这3个保守基序同典型的滚环复制存在一定的关系。Rep蛋白的内部还存在一个对保持Rep蛋白生物学功能具有重要作用的dNTP的P环（P-loop）结构，该结构的突变或缺失都会影响到PCV2病毒的复制，该现象也进一步表明了PCV是按滚环进行复制的（Florenceetal.,2009）。对圆环病毒编码Rep蛋白的相关基因进行系统进化树分析发现圆环病毒的Rep蛋白可能是微小核糖核酸样病毒编码的RNA绑定蛋白同矮化病毒属病毒的Rep蛋白或者原核细胞原性解旋酶的重组产物，且预测的病毒重组位点正好是Rep’蛋白中的移码位点（Cheungetal.,2006）。在许多其余不同的单链DNA病毒中也同样观察到了利用不相同的剪辑方式产生合成不止一个Rep蛋白的现象，但存在不同的是，Rep蛋白不可以独自进行猪圆环病毒复制的启动，其必须通过Rep蛋白与Rep’的同时进行作用才能启动圆环病毒的复制。但是，Cheung等在大肠杆菌细胞内研究PCV质粒复制的时候观察到，在只有Rep蛋白存在时PCV的复制也能进行（Cheungetal.,2006）。2.2.2ORF2及其编码的蛋白质ORF2基因位于圆环病毒基因组的负链上，主要编码圆环病毒的Cap蛋白（衣壳蛋白），Cap蛋白的分子量大小为27.8kDa左右，该蛋白是圆环病毒的主要结构蛋白，同病毒的免疫原性有关，通过与宿主细胞的病毒受体相结合，与病毒的感染密切相关（Trible,B.Retal.,2011）。所以，Cap蛋白是建立PCV2血清学检测方法和研制PCV2亚单位疫苗的靶蛋白。PCV1和PCV2的ORF2序列的比对分析结果表明，PCV1和PCV2的ORF2分别编码230～231个氨基酸残基和233～234个氨基酸残基；PCV1和PCV2ORF2核苷酸序列之间相似性为67%，对应的氨基酸序列相似性为65%，两基因型ORF2之间的差异较ORF1大，这可能与ORF2编码的衣壳蛋白是病毒感染宿主细胞后与其细胞因子产生作用的关键蛋白，ORF2的变异与病毒的抗原性变化相关。氨基酸序列分析结果表明，Cap蛋白的氨基酸N端区序列高度保守，是精氨酸富集（Truong,Cetal.,2001）。Khayat等研究发现，这段氨基酸序列存在于病毒粒子的内表面，猜测其在病毒粒子的组装过程中与病毒基11 因组DNA的互相作用相关（Khayatetal.,2011）。近年来，PCV2亚单位疫苗的开发所用的靶蛋白皆为Cap蛋白，将其用昆虫杆状病毒载体于昆虫细胞内表达时，发现Cap蛋白能够自我包装成病毒样颗粒，该特性对于PCV2亚单位疫苗的研发具有重要意义。有研究人员猜测，Cap蛋白的氨基酸序列变化也许跟圆环病毒的致病性有一定联系，其将一株PCV2分离株接种至PK-15细胞，并连续传代至120代时，发现PCV2分离株的复制能力远远强于亲本毒株，对传代后的分离株进行全基因组测序发现，在Cap蛋白编码的氨基酸序列中产生了2个突变位点，其中第110位的P（脯氨酸）突变成了A（丙氨酸），第191位的R（精氨酸）突变成了S（丝氨酸），将PCV2传代毒株和亲本毒株分别接种至无特定病原的猪只，结果发现，传代毒株没有导致猪只产生病毒血症和相关组织器官的病变，其表明P110A和R191S两个位点的变异有可能导致了PCV2在PK15细胞上的复制能力得到了增强，而其对猪只机体的致病力被弱化了（FenauxMetal.,2004）。2.2.3ORF3及其编码的蛋白质ORF3基因存在于PCVORF1基因的内部，但ORF1与ORF3的转录方向是相反的。PCV1的ORF3编码由206个氨基酸构成的蛋白质，而PCV2的ORF3则编码由104个氨基酸构成的蛋白质，他们编码的蛋白质的分子质量分别是23.2kDa和11.9kDa。PCV1和PCV2的ORF3的差异较大，被认为其与圆环病毒致病力相关。Liu等研究发现ORF3编码的蛋白和ORF1、ORF2编码的蛋白质具有一定的关联，研究人员通过基因工程技术将ORF3缺失掉，并将缺失掉ORF3的PCV2进行了病毒的拯救，进一步研究分析发现PCV2ORF3缺失之后其依然能够正常复制，表明ORF3不参与病毒的复制过程（LiuJetal.,2005;LiuJetal.,2006）。为了进一步研究PCV2ORF3的功能，研究人员将ORF1、ORF2、ORF3基因分别在PK15细胞和Cos-7细胞内进行了表达，结果发现，表达ORF3基因的细胞发生了类似于感染PCV2的细胞凋亡情况，然而将缺失ORF3的PCV2毒株接种PK15细胞却发现细胞的凋亡情况较表达ORF3的细胞有很大程度的改善，由此认为ORF3可能是PCV2诱导细胞凋亡的主要功能基因。Fenaux等提出ORF3可能并不是影响PCV2致病力的唯一因素然，其研究团队分别以PCV1和PCV2为骨架，分别将两者的ORF3和ORF2基因进行互换从而构建出4株嵌合重组病毒，将构建的4株重组病毒分别接种至猪只体内进行动物试验，结果显示4组实验猪皆为PCV2阳性，但其并未出现12 明显的临床症状，由此可知，PCV2ORF2编码的Cap蛋白和ORF3编码的蛋白均不是影响其致病性的决定性因素（Fenauxetal.,2004）。上述研究表明，ORF3与PCV2诱导宿主细胞凋亡有关，但不是唯一决定因素。2.2.4ORF4~ORF11及其编码的蛋白PCV2的ORF4基因大小为180bp，位于ORF3基因的内部，其编码方向与ORF3一致，所编码的蛋白约为6.5kDa。现在已经证明，ORF4所编码的蛋白不是病毒复制所必须的，有研究表明将PCV2的ORF3、ORF4基因一起缺失之后，PCV2的复制就不能正常进行了，推测这或许是因为ORF3、ORF4均位于ORF1的内部，两个突变位点的累加影响了ORF1mRNA的可变剪切（孟凡伟，2014）。有研究人员发现，ORF4编码的蛋白可以抑制Caspase的活性与PK-15细胞的凋亡，表现出一些同ORF3编码的蛋白相拮抗的功能，推断其也许跟病毒的致病性有关。高章照等人的研究显示，ORF4编码的蛋白能够对ORF3mRNA的表达量进行调节，ORF4的缺失会导致ORF3mRNA的表达量上调，ORF4缺失的毒株介导细胞凋亡的能力会大大增强，且被感染的细胞会表现出更强的caspase-3和caspase-8活性，据此推断ORF4编码的蛋白可能参与调节细胞的凋亡（高章照，2013）。ORF5基因位于PCV2的正链上，大小为90bp，其编码方向与ORF1一样。ORF5、ORF11基因位于ORF1与ORF2之间，这两个基因编码的皆为较短的多肽。LucasM等人猜测ORF5跟ORF11基因影响PCV2毒力的方式可能具有两种，一是这两个基因所编码的蛋白能够像锁链一样可以把ORF1和ORF2编码的蛋白捆绑在一起，进而通过两种蛋白的共同作用发挥相应的功能；二是这两种蛋白可作为一种分子伴侣，同宿主细胞的相关蛋白发生作用，类似于传染性法氏囊病毒核衣壳形成的过程一样，其也能参与病毒的感染与释放的过程（Lucas,Metal.,2003）。杨晓农等研究人员将ORF5缺失毒株接种只仔猪，结果发现ORF5缺失株可以在仔猪体内进行复制和增殖，这表明ORF5基因并不是PCV2复制所必须的，他们还发现ORF5的缺失会致使病毒的致病力弱化，但病毒的免疫原性却未受到任何影响，因此，可考虑将ORF5基因缺失的病毒株作为PCV2疫苗的候选疫苗毒株进行进一步的研究（杨晓农，2007）。PCV2的ORF9基因在其基因组的负链上，与ORF2基因有部分重叠，编码方向同ORF2一致，其编码蛋白的分子量为4.5kDa。曾秀等用酶切突变法构建的PCV2ORF9基因缺失株能够感染细胞，并进行复制，但缺失毒株13 的免疫原性有所减弱，证明了ORF9基因不是PCV2复制过程中不可或缺的基因。PCV2ORF10基因位于病毒基因组的正链上，在ORF2基因的内部，同ORF6基因有部分重叠，其编码的蛋白质分子量为4.2kDa（曾秀，2012）。杨晓农等将PCV2的ORF5、ORF9、ORF10和ORF11等基因通过基因工程技术分别进行缺失后发现病毒依然可以复制，表明这些基因不参与病毒的复制过程，然而ORF3、ORF4基因双缺失的毒株和ORF6、ORF7、ORF8基因单独缺失的毒株却不能正常进行复制，表明这些基因与病毒的复制有关，对其进行深入研究发现，PCV2的ORF4、ORF9、ORF10基因缺失后其致病性没有出现明显变化，说明其对病毒的致病性影响不大，而对PCV2的ORF3、ROF5、ORF11基因进行缺失后，发现缺失株的致病力发生了明显的改变，显示其与病毒的致病力相关。根据上述研究结果，参考pmws(AF027217)，本文将PCV2的各ORFs的结构和功能在“表1”中进行了归纳和比较。2.3病毒的感染和复制2.3.1病毒的感染病毒的感染包括吸附、穿入与脱壳、生物大分子合成、组装并释放等过程。有研究表明，PCV2吸附在细胞表面需借助于硫酸皮肤素（Dermatan,DS）和硫酸肝素（Heparansulphate,HS）这两种粘附受体（Hardingetal.,2008;Harmsetal.,2001）。PCV2接种细胞后，附在细胞膜上的病毒在30min内就可以达到最大量，其附着于细胞表面后通过细胞的胞饮作用进入细胞内部（Langohretal.,2010;Rodríguez-Arriojaetal.,2003）。PCV2在不同的细胞内其脱壳机制亦不同，例如在单核细胞3D4/31中，PCV2病毒粒子需经过内涵体酸化之后才能脱壳；PCV2在原代肾细胞和ST、PK15、SK等上皮细胞中脱壳方式有差异，内涵体的PH值降低被阻断后才能促使病毒脱壳。研究证实，丝蛋白酶与PCV2脱壳有关（刘建波，2014）。Cap、Rep和Rep′等蛋白合成后即进入宿主细胞核，Cap蛋白在宿主细胞核内进行PCV2的衣壳化，衣壳化过程需核膜的参与。完成组装的病毒粒子将被转移至细胞质内，成熟的病毒粒子于细胞质中形成包涵体后通过胞吐或出芽的方式从宿主细胞中释放出来（Jacobsenetal.,2009;Kennedyetal.,2003;Segalésetal.,2005）。14 表1-1PCV2各ORFs的基本情况和相关功能Table.1-1ThesituationsandfunctionsofPCV2ORFS所在PCV2基基因组大小编码蛋白质ORF编码蛋白的生物学功能因组位置(bp)(bp)分子量(kDa)151-99594535.7参与病毒复制与病毒感染和致病性有关，与病毒21034-173470227.8的免疫原性密切相关与病毒的致病力密切相关，其缺失3357-67131511.9可使病毒致病力减弱能抑制Caspase的活性，表现出一4386-5651806.5些与ORF3相拮抗的功能，参与细胞凋亡，缺失可使病毒致病力增强与病毒的致病力有关，缺失可使病51016-11771620.76毒致病力减弱61522-1611903.1参与病毒复制71682-1741602.0参与病毒复制8688-753662.4参与病毒复制与病毒复制和致病力无关，暂未发91732-921294.5现有其他功能与病毒复制和致病力无关，暂未发101524-16311084.2现有其他功能与病毒的致病力相关，缺失可使病11989-1033451.8毒致病力减弱2.3.2病毒的复制机制PCV2能在单层PK15细胞上增殖，还会形成胞浆包涵体或核内包涵体，但不会导致细胞病变（CPE），接种PCV2的PK15细胞用D-氨基葡萄糖处理之后能促进病毒核酸进入细胞核，提升病毒的复制能力，此法能提高病毒30%的细胞感染率（周继勇等，2005）。PCV的基因组是单股、负链、环状的DNA，病毒基因组以坩埚滚环模式（Rollingcirclemodel）进行复制（FaurezFetal.,2009;Mankertzetal.,1997）。细菌质粒、噬菌体、植物和动物病毒中均存在该复制模式，且有研究15 表明基因组首尾相连对PCV的滚环复制是不可或缺的。PCV2的复制起始区包含1个茎环结构、2个五核苷酸重复序列、3个六核苷酸重复序列（CGGCAG）和保守的九核苷酸基序（AAGTATTAC）。有茎环结构特征的顺式作用元件是病毒基因组的复制起始原点，其茎部由一段11nt的反向重复序列组成，环部为10~12nt构成，其中PCV1由12nt构成，PCV2由10nt构成，茎环结构右臂附近位置有一个6nt的正向重复序列H1/H2（Khanetal.,2000;Linetal.,2009）。在复制过程中病毒会先形成一个双链的复制型中间体（ds-intermediate,ds-RF），病毒再以中间体的超螺旋结构作为基因组合成的模板，该中间体的任意一条链都可以转录基因和表达蛋白质。有研究提出一个四联体模型，他们发现8nt、11nt和17nt双链反向重复序列可以形成四链DNA结构，该结构具有2个平行排列的单链茎环结构，4条链之间可以互相作用，其中一个茎环解开后能贡献出一条链给其他茎环变成一个3链的茎结构伴随单链的延伸，PCV复制起始处的这11nt回文序列是否也展示了四链结构目前还不清楚（Choietal.,1996;Cheungetal.,2006;Gutierrezetal.,1999）。2.3.3病毒的复制的起始和延伸PCV基因组的复制离不开顺式作用元件与Rep蛋白复合体（Rep-Rep′），单链成为双链基因组需要负链引物启动新生互补链的合成。为起始其合成，Rep蛋白复合体需牢牢地结合于回文结构右臂附近的双链RF六聚体正向重复序列H1/H2之上，该过程引起了分子构象的变化：（1）导致处于环部的八核苷酸基序解旋，为Rep蛋白复合体形成恰当的空间构象，Rep蛋白具有一个解旋酶P环结构域，在八核苷酸基序的解旋过程中扮演重要角色；（2）于ssDNA序列八核苷酸基序（A1x2T3A4x5T6↓A7C8）的T6、A7碱基之间进行切割，二价阳离子的功能对切割的发生具有重要作用，切割是由Rep蛋白RC-III基序上第93个酪氨酸（Tyrpe）的羟基进行的亲核攻击造成的（Steinfeldt,Tetal.,2006）。该片段的核苷酸序列具有较强的特异性，且对病毒的复制来说是必须的，标为x位置处的碱基不保守，其具有多样性，子代PCV的产生不会受其影响。切割完成后，Rep蛋白的酪氨酸磷酸键共价结合到移位的DNA5′末端，形成一个3′-OH末端，此末端即可作为新生链DNA向病毒基因组的合成提供引物。伴随着Rep蛋白复合体不停地结合于回文结构右臂附近的双链RF六聚体正向重复序列H1/H2之上，原有的病毒基因组被逐渐替代，新生链的合成开始（Mankertz,Aetal.,2001）。Rep和Rep′蛋白皆无聚合16 酶的功能，故PCV的复制需依赖于细胞在有丝分裂间期的S期表达的蛋白，其初期DNA链的延伸就是以新形成的3′-OH末端作为引物通过宿主细胞内的聚合酶完成的，其在增殖旺盛、处于有丝分裂过程中的细胞上能更好的复制（周继勇等，2005）。Rep蛋白在病毒起始位置的结合和切开活性对这两种终止方式均有着重要意义。2.3.2病毒的复制的终止PCV复制过程中，其基因组的合成开始后如何终止一直是研究热点，根据当前研究，推测其或许存在下面这种情形：当亲代DNA链被全部替换后，Rep′蛋白将八核苷酸基序从T6与A7的中间进行切割。Rep′结合到新合成的DNA链的5′末端上同时产生一个游离的3′-OH末端，并对亲代Rep蛋白上的第93个酪氨酸（Tyrpe）的羟基进行的亲核攻击从而释放单链的亲代DNA（Musatovetal.,2000）。新合成的子代DNA链上的3′-OH末端将诱导亲核攻击，重建子代DNA链上的八核苷酸基序，同时释放Rep蛋白复合体和一个具有双链中间的子代DNA链，在该模式下，此双链中间体将不会再同Rep蛋白复合体结合，即复制终止（Steinfeldtetal.,2001）。3流行病学PCV1无致病性，PCV2有致病性。PCV2是目前危害养猪业的主要疾病之一，对全球养猪业造成了重大经济损失（Roselletal.,2000;Sahaetal.,2010）。目前，在许多国家都存在PCV2感染，且猪群的PCV2抗体阳性率较高，猪只日龄越大，PCV2感染率越高。PCV2能引起猪只发生皮炎肾病综合征、肉芽肿性肠炎、断奶仔猪多系统衰竭和母猪繁殖障碍等（Kimetal.,2004;Larochelleetal.,2000;Nielsenetal.,2008）。PCV2会导致猪只产生免疫抑制，造成其抵抗力降低，易感染其它疾病，当前易与PCV2共感染猪只的疾病主要有猪瘟（CSF）、猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)、伪狂犬病(PR)、细小病毒病(PP)、附红细胞体、副猪嗜血杆菌病等。其中猪瘟、猪繁殖与呼吸障碍综合征等均可能增强PCV2的相关病变，并增高PMWS的发病率（McNeillyetal.,2002;Okudaetal.,2003）。此外，猪肺炎支原体、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪瘟病毒疫苗的非特异性免疫刺激也有可能加重PMWS的严重性，并增强PCV2的复制水平。还有人发现，PCV217 可以增强猪流行性腹泻病毒（PEDV）的增殖水平，使猪群PEDV的临床症状严重化（Imaietal.,2006）。2000年，郎洪武等对我国的山东、江西、河北和北京等7个省市共计559份猪血清样品进行PMWS的抗体检测，结果表明其阳性率为42.9%，说明当时我国的相当部分地区已普遍存在猪圆环病毒（郎洪武等，2000）。2010~2011年梁鹏帅等在我国华南地区采集了11个猪场不同饲养阶段的猪血清共807份，并用nPCR（巢式PCR）对其进行了PCV2的检测，结果发现所有猪场均检出PCV2，其阳性率为30.61%，证明PCV2在我国华南地区广泛存在并流行。PCV2变异较频繁，其核酸进化率为1.2×10-3位点/年，是单链DNA病毒里面最高的（PattersonARetal.,2010）。在2003年以前，PCV2a是PCV2主要的流行毒株，2003年以后PCV2b逐渐开始替代PCV2a毒株，与此同时，我国开始出现了PCV2d和PCV2e等新的基因型，PCV2在各猪场的感染和流行情况愈加复杂多变，PCV2a向PCV2b型过渡的具体时间尚无明确定论，但大量研究表明，这样的转变也许存在于2002年或更早（王宪文等，2012）PMWS的发生率同PCV2a向PCV2b基因型的转变有一定联系。一般认为PCV2b与PCV2a的致病性无明细差异，但相关体内外试验和病原学研究显示基因型不同的PCV2毒株其致病性有一定差异，如加拿大于2004年在魁北克州的猪场分离出了PCV2b，该猪群中患PCVAD的猪死亡率较感染PCV2a的高。PCV2b的出现使得猪只由单纯的感染PCV2变为PCVAD，Gagnon等根据PMWS临床严重性、流行病学和动物试验发现PCV2b毒株的毒力较PCV2a强(Gagnonetal.,2007)。PCV2可以由个体之间水平传播而引起感染，发病猪、病毒携带猪以及发病后痊愈后的猪只皆是该病的传染源。在感染的早期和痊愈之后均能在患病猪的口腔、鼻腔、尿液和粪便中检测到PCV2的核酸，且患病猪能够通过粪便、尿液、精液和口腔及鼻腔分泌物等持续向外散毒。PCV2主要通过呼吸道和消化道进行水平传播，也能通过精液和胎盘进行垂直传播。饲料中的PCV2病毒可以经过口腔感染仔猪，将PCV2感染猪和易感猪混合饲养后可发生PCV2的水平传播。在配种前3周将PCV2经鼻腔接种至母猪后，病毒能通过胎盘感染胎儿，在流产死胎和新生仔猪体内均能检测到PCV2，流产胎儿和新生仔猪的心肌炎跟PCV2有关（王宪文等，2012）。18 4PCV2疫苗的研究进展目前，对PCV2最有效的防控手段仍是疫苗免疫。通过疫苗接种能减轻猪只淋巴组织的损伤和的病毒血症，并降低PCV2在猪只体内的复制水平。当前市面上流行的疫苗虽能对猪群提供一定的保护，但均不能完全将猪群体内的病毒清除干净，且免疫猪仍有感染PCV2的风险（Hardingetal.,2008）。国外上市的疫苗有Cap蛋白亚单位疫苗、灭活疫苗、PCV1-2嵌合病毒灭活疫苗，均是基于PCV2a基因型。研究表明，PCV2疫苗毒株与流行毒株的亲缘关系越近，疫苗提供的保护效果就越好（Allanetal.,2003;ChristophSchoenetal.,2004）。我国各猪场目前使用的疫苗是PCV2b基因型的灭活苗，与我国现流行的毒株是同一基因型，但其存在成本较高、病毒滴度低和不能诱导细胞免疫等缺点。由于现有疫苗的缺陷，许多新型疫苗逐渐展现出广阔的前景。4.1商品化疫苗最早投入市场用于3周龄以上仔猪和母猪的PCV2疫苗是由法国公司生产的PCV2a灭活疫苗，此疫苗可以减轻仔猪的PCV2病毒血症，还能降低仔猪各组织器官内的病毒量。2006年，美国Intervet公司对其研制的PCV2aCap蛋白亚单位疫苗进行试验发现，较之于对照组，接种PCV2aCap蛋白亚单位疫苗猪群的病毒血症明显较轻，死亡率较低，体重较重。Zoetis公司运用基因工程技术，将PCV1的ORF2用PCV2的ORF2置换掉，构建出了PCV1-2嵌合病毒灭活疫苗，用该疫苗免疫猪群后，猪只的淋巴组织和血液中病毒含量明显降低，猪只死亡率降低，临床症状显著减轻。由韩国的DAESUNG公司研制的PCV2全病毒灭活疫苗可以避免高滴度母源抗体干扰。Boehringer-Ingelhim公司生产的亚单位疫苗免疫猪群后能够刺激机体快速产生高效持久的免疫反应，其具有疫苗粘度小、稳定、安全等优点，在国外得到了广泛应用。硕腾公司最新研发的猪圆环病毒病和猪肺炎支原体二联苗能一针预防多种疾病，减少了工作量又减轻了应激反应。目前，在国外上市的猪圆环病毒疫苗厂家与疫苗类型详见表1-2。19 表1-2国外上市的猪圆环病毒疫苗（ZahraAfghahetal.,2016）Table1-2Theporcinecircovirusvaccinesintheforeignmarket生产商疫苗名称疫苗类型疫苗佐剂免疫说明繁殖母猪或PCV2a株全病Merial（梅里亚）Circovac®TS63周龄以上毒灭活疫苗仔猪Boehringer-IngelhIngelvacPCV2aCap蛋3周龄以上ImpranFLEXTMeim（勃林格）CiroFLEX®白亚单位疫苗仔猪Boehringer-IngelhPCV2a株Cap3周龄以上FLEXcombo®ImpranFLEXTMeim（勃林格）蛋白二联苗仔猪Boehringer-IngelhPCV2a株Cap3周龄以上3FLEX®ImpranFLEXTMeim（勃林格）蛋白三联苗仔猪PCV2a株Cap3周龄以上Intervet（英特威）Circovacvent®蛋白亚单位疫D1-a-tocopherol仔猪苗PCV2a株CapSchering-Plough3周龄以上Porcilis®PCV蛋白亚单位疫D1-a-tocopherol（先灵葆雅）仔猪苗PCV1-2嵌合全Sulpholipo-cyclod4周龄以上Zoetis（硕腾）FosteraTMPCV病毒灭活疫苗extrininsqualane仔猪FosteraTMPCVPCV2a株全病3周龄以上Zoetis（硕腾）MetaStim@MH毒灭活二联苗仔猪DSCircoPCV2全病毒灭MontanideIMS1日龄-3周AESUNGPigvacPCV2活疫苗1313NPR龄仔猪目前，国内上市的猪圆环病毒疫苗株有WH株、SH株、LG株、ZJ/C株和DBN-SX07株，其中除了LG株属于PCV2a型外，其余疫苗株均为PCV2b型，与我国当前流行的PCV2为同一基因型。我国第一个自主研发的PCV2疫苗是由大北农集团生产的DBN-SX07株全病毒灭活疫苗；全病毒灭活疫苗最大的问题在于不能获得高滴度的病毒液，该问题在早期上市的疫苗中表现的尤为突出；ZJ/C株疫苗是我国上市的较晚的疫苗，其病毒滴度可以达到107.3TCID50/mL，是国内同类疫苗中病毒含量最高的疫苗；SH株和ZJ/C株疫苗能够做到2周龄进行首免，这是全病毒疫苗中做的最好的（王一平，2012），当前我国的PCV2亚单位疫苗仅有青岛易邦于2014年上市的易圆净，该疫苗的Cap蛋白含量≥100μg/ml，表达病毒样颗粒抗原（VLPS/CAP），抗原性好，能高效诱导机体产生良好体液免疫与细胞免疫，免疫后15-20天100%转阳，持续时间可达5个月。目前，在国内上市的猪圆环病20 毒疫苗厂家与疫苗类型详见表1-3。表1-3国内上市猪圆环病毒疫苗（赵晨辰，2015）Table1-3Theporcinecircovirusvaccinesinthedomesticmarket名称/参考价病毒含量生产商疫苗类型疫苗佐剂免疫说明格，元/头份（TCID50）PCV2a株全病繁殖母猪维科（10）、哈尔滨维科、105.5毒灭活疫苗水质佐剂或3周龄圆毕净（15）上海海利（LG株）以上仔猪Montanid繁殖母猪洛阳普莱柯、圆健（10）、PCV2b株全病106.0eISA206或3周龄南农高科圆克清（10）毒灭活疫苗双相佐剂以上仔猪（SH株）PCV2b株全病福州大北农、诸欢泰（16）、3周龄以105.5毒灭活疫苗油佐剂成都天邦圆力佳（13）上仔猪（DBN-SX07株）瑞普保定、浙诸元妥（12）、NeB复合江诺倍威、齐圆净诺（12）、PCV2b株全病2周龄以107.3缓释水质鲁动保、杭州圆捷（8）、毒灭活疫苗上仔猪佐剂荐量圆量（8）（ZJ/C株）武汉科前、武科圆宁（12）、MARCO汉中博、南京圆环力康（10）、PCV2b株全病3周龄以107.0L52油佐天邦、广东永圆必宁（12）、毒灭活疫苗上仔猪剂顺、中牧股份圆顺（10）、（WH株）圆满（8）仔猪于2～4周龄青岛易邦生免疫，母Cap蛋白含物工程有限猪圆环病毒2型猪于配种易圆净量水性佐剂公司基因工程亚单位前免疫，≥100μg/ml疫苗种公猪每4个月免疫1次4.2新型疫苗4.2.2弱毒疫苗所谓弱毒疫苗，是指用天然、人工改造的弱毒株或仅具有抗原性的无毒株研制的疫苗。相比于亚单位疫苗和灭活疫苗，弱毒疫苗不仅能够刺激机体产生体液免疫，还能激发机体产生细胞免疫，可以为猪群提供更好的防护效果。将PCV221 病毒接种于PK15细胞进行连续培养至120代后发现其致病力变弱，而复制能力增强，这为PCV2弱毒疫苗的研制提供了很好的科学依据（FenauxMetal.,2004）。PCV1与PCV2基因组大小相近，二者的抗原基因均为ORF2，且皆为702bp，但PCV1无致病力，不会导致细胞产生病变，基于此，有人将PCV1的ORF2用PCV2的ORF2进行置换构建了PCV1-2嵌合病毒，该病毒既保持了PCV1的无毒性，又具有PCV2的免疫原性，能对猪群提供良好的保护，且没有毒力增强的危险，是PCV2疫苗研究的新方向（王一平等，2012）。4.2.3亚单位疫苗仅有病原微生物的抗原部分而不含有核酸，但能刺激机体产生特异性免疫反应的这一类疫苗成为亚单位疫苗。PCV2的主要结构蛋白Cap蛋白是其主要的免疫原性蛋白，能够刺激宿主产生针对PCV2的特异性抗体，且其与PCV1的衣壳蛋白无交叉免疫反应，因此Cap蛋白是研制PCV2亚单位疫苗的理想靶抗原（付强，2015）。目前生产PCV2基因工程亚单位疫苗所采用的主要表达系统为昆虫细胞/杆状病毒表达系统，已有3种Cap蛋白亚单位疫苗上市分别是勃林格、英特威和先灵葆雅公司研发的亚单位疫苗，其临床效果已得到充分肯定，当前我国的PCV2亚单位疫苗仅有青岛易邦于2014年上市的易圆净，该疫苗能在猪只体内表达病毒样颗粒抗原（VLPS/CAP），抗原性好，能高效诱导机体产生良好体液免疫与细胞免疫，免疫后15-20天100%转阳，持续时间可达5个月。用昆虫细胞表达系统进行疫苗的生产成本较高，不利于大规模生产，所以采用能降低成本的表达系统是亚单位疫苗开发过程中需要解决的主要问题。针对该问题，O'Neill等将Cap基因组链接至pPIC9K载体后转化至甲醇酵母GS115内，通过甲醇酵母GS115表达后Cap蛋白质量浓度达到了174μg/mL，且具有良好的免疫原性（O'Neilletal.,2011）。郎洪武等用家蚕表达系统表达的Cap蛋白制备的PCV2亚单位疫苗能够刺激仔猪和小鼠产生特异性抗体，还能抑制PCV2在仔猪和小鼠机体内的复制，表明其具有开发的潜力。有研究者利用Trichoplusianilarvae表达的Cap蛋白免疫猪只，能有效的抑制PCV2病毒血症的产生，对猪只有良好的保护作用（蔡杰等，2016；郎洪武，2013）。4.2.4活载体疫苗以无毒或弱毒病原微生物为表达载体，并将外源插入载体内，将其制成疫苗22 后接种动物，诱导机体产生特异性免疫反应，这类疫苗称为活载体疫苗。活载体疫苗能实现几种病毒的联合免疫，用较小的免疫剂量就能使机体产生较强的免疫效果，对进行免疫的动物有良好的保护作用（张家明，2010）。当前，有研究者将伪狂犬病毒的毒力基因缺失之后作为表达载体，构建表达PCV2Cap蛋白的重组伪狂犬病毒，该病毒安全无害，遗传性状稳定，免疫猪和小鼠后能诱导机体产生特异性免疫应答，还能抵御强毒。杆状病毒是很好的候选病毒载体，有人将哺乳动物细胞表达框引入杆状病毒，成功地于哺乳细胞内表达出了Cap蛋白（Jucetal.,2005）。腺病毒接收外源基因的能力较强，宿主广泛，可在多种哺乳动物组织和细胞内表达重组蛋白，表达效率可观，且能对表达的外源蛋白进行良好的修饰，是一种极具潜力的基因转移载体。目前，腺病毒载体已被许多研究人员用于基因工程疫苗的开发。Liu等构建了能融合表达PCV2ORF2和猪IFN-γ基因的重组腺病毒，该病毒能诱导小鼠产生针对PCV2的特异性抗体，且其特异性抗体产生效率要高于单独表达ORF2基因的重组腺病毒（Liuetal.,2010）。但是，腺病毒作为表达载体还是存在以下不足：①其靶向性较差；②难以整合到靶细胞基因组中，表达不稳定；③腺病毒颗粒容易被肝脏细胞吸收，出现很强的首过效应。此外，相继研究报道的活载体疫苗还有：假型杆状病毒载体疫苗、噬菌体载体疫苗、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒载体疫苗、PCV2细菌活载体疫苗、博德特氏菌载体疫苗、乳酸菌口服活载体疫苗等，这类疫苗均是将PCV2ORF2基因插入至相应载体进行重组表达，重组的病原微生物均能产生针对PCV2的特异性抗体，具有良好的应用前景（王一平等，2012）4.2.5PCV1-2嵌合疫苗嵌合病毒疫苗是近年来新研发的一种疫苗，目前已有多家外国公司研发的PCV1-2嵌合病毒疫苗上市，其原理是利用基因工程技术，用PCV2的ORF2置换PCV1的ORF2从而构建出PCV1-2嵌合病毒，再将其灭活制成PCV1-2嵌合病毒疫苗，临床试验证明该疫苗免疫猪群后大大减轻了猪只血液和淋巴组织中的PCV2病毒载量，PMWS的发生率在保育猪和育肥猪中皆明显降低。仔猪体内母源抗体的存在将会影响疫苗的免疫效果，为了探究母源抗体对PCV1-2嵌合病毒疫苗免疫效果的影响，Opriessning等用PCV1-2嵌合病毒疫苗对存在母源抗体的仔猪进行免疫，结果发现，同对照组相比即使存在母源抗体嵌合病毒疫苗依然能23 明显提升仔猪对PCV2的免疫力，表明PCV1-2嵌合病毒灭活疫苗能够抵抗母源抗体的干扰（Opriessningetal.,2006）。Fenaux等于2004年研制了PCV1-2嵌合病毒DNA疫苗，将其免疫仔猪，对免疫组和对照组进行攻毒21d后观察发现对照组仔猪的淋巴结肿大，淋巴组织衰竭并伴随有病毒血症，而免疫组仔猪只是淋巴组织轻微受损，未出现病毒血症和其他病理变化，表明其研制的PCV1-2嵌合病毒DNA疫苗有较好的免疫保护效果（Fenauxetal.,2004）。Grau-Roma等为了对比嵌合PCV1-2弱毒疫苗和灭活疫苗对母猪的免疫效果，分别对着两种疫苗进行了动物试验，结果发现灭活疫苗和弱毒疫苗皆对母猪具有良好的保护作用（Grau-Romaetal.,2002）4.2.6标签疫苗PCV2标记疫苗是指通过基因重组技术将相关分子标记引入PCV2基因组中而研制的一种新型疫苗，该疫苗的最大亮点是能够区分野毒抗体和疫苗抗体。Beach等分别将GLU和KT3标签序列通过基因工程手段引入至PCV2Cap蛋白的末端，将其接种小鼠后发现其能同时产生针对PCV2和两种标签和抗体，因此通过检测其是否产生标签抗体就能区分宿主体内是野毒还是疫苗毒（Beachetal.,2011）。黄立平等将源自猴副流感病毒（Simianvirus5,SV5）的V5表位作为标签，通过基因工程技术将其引入至PCV2的Cap蛋白末端，构建了携带V5标签的PCV2重组病毒克隆质粒，将该质粒转染至PK15细胞，连续盲传10代，发现其与亲本毒株的增殖特性相似，说明标签的插入并未影响PCV2的增殖，用PCV2阳性血清和V5单克隆抗体作为检测抗体，分别检测标签毒株和亲本毒株感染的PK15细胞，结果发现，PCV2阳性血清可以同标签毒株和亲本毒株进行抗原抗体反应，V5单克隆抗体只能与接种标签毒株的细胞进行特异性血清学反应，因此可以通过血清学试验将标签毒株和亲本毒株进行区别（黄立平，2013）。4.2.7核酸疫苗核酸疫苗（Nucleicacidvaccine）是上世纪90年代初从基因治疗（Genetictherapy）领域中新发展起来的疫苗，也叫DNA疫苗（DNAvaccine）或基因疫苗（Geneticvaccine）。该疫苗是将能够编码某种抗原蛋白的外源基因通过基因工程技术连至表达载体上，然后将构建的重组质粒接种到动物细胞内，再利用宿主细胞自身的转录系统让外源基因在宿主体内表达出相应的抗原蛋白，诱导宿主机体24 产生针对该抗原蛋白的免疫应答，从而达到治疗和预防疾病的目的（J.F.Toussaintetal.,2007）。核酸疫苗是一种新型的基因工程疫苗，具有成本低廉、免疫效果好、制备简便、安全稳定、免疫应答持久和方便规模化生产等特点，现已成为PCV2疫苗研究的热点。上世纪90年代，美国研究者将裸DNA注射至小鼠肌肉中，无意中发现其能在肌细胞中表达外原蛋白（ToshiyukiTakai，1990）。随后，Wellenberg等在注射表达人生长激素基因质粒的小鼠体内检测到了人生长激素的特异性抗体，再进行多次注射之后发现生长激素的抗体效价得到了增加，据此，研究人员提出了在动物体内注射质粒DNA可以诱导动物机体产生特异性免疫反应的概念(Wellenbergetal.,1992)。1993年Ulmer等分别对雏鸡和小鼠进行流感病毒基因质粒的肌肉注射，结果发现，雏鸡和小鼠均产生了针对流感病毒的特异性保护抗体（Ulmeretal，1993）。在1994年的疫苗会议上，人们正式提出了核酸疫苗（nucleicacidVaccine）这个术语，也被称作DNA疫苗（DNAVaccine）或基因疫苗（GeneticVaccine）。在这之后人们开始了核酸疫苗的全面研究应用。有人将构建的含有PCV2ORF2基因的质粒注射小鼠，发现其能诱导小鼠体内的PCV2特异性抗体阳转，还能刺激仔猪产生保护性免疫反应，并且其诱导小鼠产生抗体的能力比用Cap蛋白免疫小鼠要强，ORF2重组质粒免疫组小鼠体内的病毒载量明显降低，其病理变化和临床症状也显著减轻。核酸疫苗由目的基因（通常是病原微生物的免疫原性基因）与真核表达载体构成。核酸疫苗的构建就是一个将病原微生物免疫原性基因片段链接至真核表达载体的过程。在该过程中，目的基因的选择最为重要，其可以是某个病原体的基因，也可以是某几个病原体的几段基因的组合（BlanchardPetal.,2012）。一般来说，目的基因应选择编码能诱导动物机体产生免疫反应的抗原蛋白的基因，比如编码糖蛋白的基因，这是因为在宿主体内产生的抗原蛋白在糖基化后才会引起机体对病原体的免疫应答，在有条件的情况下最好选择其编码抗原蛋白基因的保守部分，这样能最大程度地减少因为病原体变异而导致的免疫效果不理想的情况。用于构建核酸疫苗的载体方面的条件是其要能在细菌内进行高效的复制，在动物机体内则不复制，但要能高效的协助目的基因进行表达，同时其不跟宿主细胞内的基因组发生整合等现象。当前被广泛运用的载体有细菌、病毒、质粒，其中质粒最常用（金宁一等，2005）。用于构建核酸疫苗的质粒载体应具备下列条件：25 一是要有选择性标记基因，利于构建质粒时阳性质粒的筛选，比如大肠杆菌TOP10的耐药性基因；二是其能在菌体内进行自我复制；三是具有能够在真核细胞中进行表达的启动子、内含子、增强子、终止子等调控原件。相比于传统疫苗，核酸疫苗具有一系列优势。1、其无需对目的病原体进行大量的体外培养；2、其进行研发时可以选择病编码原体抗原蛋白的保守区域的基因作为目的基因，从而能够消减病原体变异对免疫效果的影响；3、其能够在菌体内进行大量的复制，生产工艺简单，成本较低，便于大量生产，且制作成干粉后无需对其进行冷藏，便于运输和保存，还能在上面加入标记，为后续的抗体检测提供便利；4、该类疫苗易于使用，能通过多种方式进行接种；5、核酸疫苗能够在动物机体内持续产生抗原，诱导其发生免疫反应。同时，作为一种新兴疫苗，其也存在着一些隐患：1、核酸疫苗的基因有整合到宿主细胞基因组的可能；2、作为外源基因在动物机体中长期存在并表达，持续诱导机体产生免疫应答，有可能导致机体对抗原产生免疫耐受（宋云峰等，2005）。4.2.8感染性克隆疫苗感染性克隆疫苗（iDNA疫苗）作为最近才提出的新型核酸疫苗，其既具备核酸疫苗的优势，又避免了核酸疫苗在宿主体内抗原蛋白表达量不理想的劣势，iDNA疫苗是通过将没有毒力或者毒力弱化的病毒株全基因组连至真核表达载体后接种动物，诱导动物机体产生同自然毒株同等反应应答的核酸疫苗（刘光清等，2009）。该疫苗是以致弱毒株的病毒核酸方式进入宿主机体的，具有正常病毒的复制过程，故其在宿主细胞内的抗原表达量较传统核酸疫苗有很大提高。在对PCV2基因组的解析日益清晰的基础上，许多科研单位开始通过基因工程技术，对PCV2基因组进行改造，如基因缺失、突变、嵌合等，而不是仅仅局限于利用其抗原基因进行疫苗的研制。通过基因改造的PCV2既保留了在宿主体内良好的复制机制，又具有良好的免疫原性，是制备PCV2疫苗的理想素材。Fenaux等将两个拷贝的PCV2基因组连至pBluescriptSK质粒，构建了PCV2的感染性克隆，并将其转染至PK-15细胞，结果显示其能在细胞内产生具有感染性的PCV2病毒粒子；将其注射SPF猪后，发现其与感染PCV2野毒组的SPF猪具有相似的病理变化和临床症状（Fenauxetal.,2002）。我国的金宁一等将制备的PCV2iDNA疫苗免疫小鼠后，诱导其产生了体液免疫和细胞免疫，对小鼠提供了良好26 的免疫保护。杨顺利等以pcDNA3.1(+)真核表达质粒为载体也构建了PCV2的单拷贝和双拷贝感染性克隆，并将其免疫小鼠后，对免疫后不同天数小鼠的血清用ELISA检测，结果显示在免疫后35d几乎都能检测到病毒衣壳蛋白特异性抗体，小鼠致死后在其体内也能检测到病毒DNA，表明无论是PCV2单拷贝还是双拷贝感染性克隆质粒均具有感染性（杨顺利等，2011）。韩凌霞等将PCV2单拷贝基因组插入到pMD18-T中，将获得的pMD18-T-PCV2克隆质粒免疫40日龄仔猪，发现其能够在体内产生与PCV2自然感染的大体病变和病理组织学变化，并能够激发机体较强的体液免疫应答（韩凌霞等，2006）。邵小雪用反向PCR技术敲除掉PCV1的ORF2基因，并用PCV2的ORF2进行替换，再将PCV1-2基因组连至S-PSK载体，构建了重组质粒S-PSK-PCV1-2，将该重组质粒转染至PK15细胞盲传5代后，其TCID6.0550达到了10/mL，说明重组感染性质粒具有良好的感染性，将嵌合病毒重组质粒接种至健康仔猪，结果显示，仔猪接种PCV1-2后未出现明显的临床症状和病理变化，仔猪增重和饲料转化效率未受影响（邵小雪等，2016）。宋益将构建的PCV1-2嵌合病毒质粒转染至Dulac和PK15细胞，盲传5代后在两种细胞中均能检测到PCV2的ORF2基因，用间接免疫荧光（IFA）检测发现，细胞中存在PCV2的抗原；同时其将嵌合病毒质粒接种至BALB/c小鼠，通过ELISA方法对接种的小鼠进行PCV2抗体检测，结果显示接种小鼠的血清中存在PCV2特异性抗体，表明其能激发宿主产生体液免疫反应（宋益等，2008）。4.3V5表位标签概述可以被特异性抗体识别的一些蛋白质和部分较短的多肽片段被称为表位标签，1984年Munro等首先提出了表位标签技术，他们把一段多肽连到一个基因的C端并进行表达，再用针对该段多肽的抗体对表达产物进行检测（MunroSetal.1984）。大部分情况下，人们是将长度在6到30个氨基酸残基之间的多肽片段当做表位标签，以最大程度地减少标签蛋白对目的蛋白结构与功能的影响。如今，表位标签已经变得较为成熟，在生物领域得到了广泛的运用，其常被用来同免疫检测技术相结合用于目标蛋白的检测和定位，很多表位标签的单克隆抗体和多克隆抗体均已商品化（谢浩等，2008）。由14个氨基酸构成(GlyLysProIleProAsnProLeuLeuGlyLeuAspSerThr)的V527 表位标签蛋白（V5-Tag），源于副黏科病毒猿猴病毒5的P和V抗原表位，是一种很成熟人们运用较多的一种标签，其单克隆抗体已商品化。杨晨等将V5标签蛋白同雄性激素受体在酵母细胞中进行融合表达，用V5单克隆抗体为一抗对表达产物进行Westernblot检测，发现跟V5标签蛋白融合的雄激素受体在酵母细胞中成功表达，且V5并未影响AR的生物活性（杨晨等，2013）。李平花等通过融合PCR技术，分别将TC12、V5、3×FLAG、KT3标签引入至口蹄疫病毒的结构蛋白VP1G-H环，构建质粒并将其转染BSR/T7细胞进行病毒的拯救，结果显示，表达3×FLAG和KT3标签蛋白的重组病毒未拯救成功，成功拯救了能表达V5和KT3标签蛋白的重组病毒，但两个标签的插入影响了口蹄疫病毒的复制能力。（李平花等，2016）。5展望目前市面上流行的疫苗在一定程度上可以有效防控PCV2感染，能显著降低PCV2感染猪群的临床症状，提高猪的生长性能，但这些疫苗诱导的免疫应答主要为体液免疫，不能完全阻断PCV2传播，亦不能完全清除体内已感染的病毒，且使用该疫苗免疫猪群后不能与野毒相区别，难以对PCV2进行净化，此外全病毒灭活疫苗还存在不能获得高滴度的病毒液的问题。因此，新型PCV2疫苗的研制依然不能放松，PCV2感染性克隆疫苗作为一种新型基因工程疫苗，具有成本低廉、免疫效果好、制备简便、安全稳定、免疫应答持久和方便规模化生产等优点，为PCV2疫苗的研制提供了良好的思路和方向。6试验目的及意义目前我国流行的PCV2毒株以PCV2b基因型为主，我国的疫苗也基本是采用PCV2b基因型疫苗株，PCV2各基因型毒株之间的抗原性存在一定差异，为了解当前贵州PCV2流行情况及其同国内流行情况的区别，选择一株与当前流行基因型相符的PCV2病毒株作为本研究中构建携带标记的嵌合病毒感染性克隆质粒的亲本毒株，本研究对已公布的国内各地具有代表性的PCV2毒株进行了基因型的划定和统计，并对其基因组序列进行了分析，以期为携带标记的嵌合病毒感染性克隆质粒的构建提供参考。为了研发一种既能区分野毒和疫苗毒、疫苗抗体和野毒抗体，又能充分诱导体液免疫和细胞免疫，兼具核酸疫苗和减毒活疫苗的优点候选疫苗，本研究拟将28 V5标记引入PCV2ORF2末端，并用携带V5标记的PCV2ORF2置换PCV1ORF2，构建带有遗传标记的PCV1-2感染性克隆质粒，通过小鼠体内拯救及细胞内增殖等试验对构建的质粒进行系列鉴定，以期为PCV2iDNA新型标记疫苗的研发奠定前期基础。29 第二章PCV2贵州分离株的基因型及生物信息学分析猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，PCV2)是目前严重危害养猪业的疾病之一，对我国养猪业造成了严重的经济损失。PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属，其无囊膜，直径约为17mm，呈二十面体对称，是目前为止所发现的最小的动物病毒，基因组为单股闭合环状，可以在宿主体内完成自我复制，PCV2能引起猪只发生皮炎肾病综合征、肉芽肿性肠炎、断奶仔猪多系统衰竭和母猪繁殖障碍等。史岩等于2008年对我国华东地区规模化猪场进行了PCV2的血清流行病学调查，其分别采集了620、60份健康猪和疑似PMWS猪的血清样品，通过IPMA检测发现健康猪和疑似PMWS猪的血清样品的PCV2阳性率分别为74%和100%，对样品随机取样通过限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术进行分型发现国华东地区PCV2流行株主要为PCV2b型（史岩，2008）；赵春容等于2010～2011年收集了四川省11个地区猪场收集了264份样品，通过PCR技术对其进行病原核酸检测发现，PCV2阳性率为75.4%，其中PCV2a和PCV2b的阳性率分别为9.4%和75.4%，说明四川地区PCV2感染以PCV2b型为主（赵春容，2013）；董烨等于2014～2015年共采集了辽宁省各猪场共1548份猪血清样品，其中已免疫猪群960份，未免疫猪群588份，分别对其进行ELISA检测发现，2014、2015年已免疫猪群和未免疫猪群的PCV2抗体阳性率分别为：96.88%和63.06%、98.44%和81.25%，说明未免疫猪群的PCV2抗体阳性率在逐年升高（董烨等，2015）；赵津等于2008～2012年间在我国东南地区120家规模化猪场共收集了1990份未免疫PCV2疫苗的猪群血样，和441份疑似PCV2发病猪组织样品，血清学抗体检测结果显示，血样的总阳性率为71.21%，PCR病原核酸检测显示组织样品的PCV2阳性率为38.1%，对其中的52株PCV2进行分型发现除了3株为PCV2a外，其余皆为PCV2b型，以上调查表明PCV2在我国大部分地区的猪场广泛存在，且主要流行株为PCV2b型（赵津，2015）。从2003年以来，全球各地PCV2出现转型的趋势，PCV2b基因型开始逐渐取代PCV2a基因型，PCV2的感染情况变得更加复杂多变。崔亚兰等对2007~2011年收集的4980份贵州各地区猪只血清样品进行PCV2抗体检测，发现阳性率为43.45%，且呈逐年上升趋势，对2011年收集的133份猪组织样品进行了PCV2病原核酸检测，发现其阳性率高达77.44%，说明PCV2在贵州省广泛流行且日30 益严重（崔亚兰等，2013）。为了解贵州地区PCV2的分子流行病学，及分析PCV2各基因型之间的差异，本文共收集了51株PCV2序列进行分析，包括本实验室分离的16株PCV2序列和35株NCBI上报道的序列，以期为PCV2的防控、流行病学研究和下一步构建嵌合重组毒株亲本毒株的选择提供参考。1材料1.1PCV2核苷酸序列本研究中共用到51株PCV2毒株的全基因组核苷酸序列，其中16株系本实验室克隆测序得到，其余序列均来自NCBI。1.2相关分析软件生物信息学软件DNAStar7.0、MEGA5.0。2方法2.1PCV2基因型分析通过MEGA5.0软件构建PCV2核苷酸序列的遗传进化树，并参考2008年欧盟猪圆环病毒疾病委员会（www.pcvd.org）提出的PCV2基因分型的统一标准对51株PCV2毒株进行分型，方法如下：委员会将PCV2分为了PCV2a、PCV2b、PCV2c等3个基因型，且每种基因型都指定了相应的标准毒株，并规定在以PCV2全基因组序列构建的遗传进化树上两病毒株间的遗传距离>0.02，或在以PCV2ORF2序列构建的遗传进化树上两毒株间遗传距离>0.035时可将其划为不同基因型（Corteyetal.,2011）。进化树的构建方法和相关参数设置如下：构建方法采用Neighbor-Joining，替换模型为Kimura2-parametermodel，检测方法用Bootstrap并将其重复数设置为1000。2.2PCV2基因组结构分析应用DNAStar软件中的EditSeq和MegAlign功具对收集的所有PCV2序列进行比对分析，包括变异位点的分析和各分离株ORF2编码框的比对。31 3结果3.1PCV2基因型分析通过MEGA5.0软件，以51株PCV2全基因组序列为分析对象构建了PCV2核苷酸序列的遗传进化树（图2-1）。根据进化树的分析结果结合欧盟猪圆环病毒疾病委员会的PCV2分型标准发现，51株分离株中共有11株属于PCV2a型，其中贵州有3株；21株属于PCV2b型，贵州有5株；18株为PCV2d型，贵州有8株。就进化树分析结果来看PCV2d已经逐渐成为贵州地区的主要流行毒株，而我国的主要流行毒株是PCV2b和PCV2d。32 60GZ-JS201599KJ139962.1GZ-KY201491GZ-XX201478JQ809464.1GZ-RH201456HM776448.1Liaoning77KF742553.1Chongqing46DQ346683.1Shandong99GZ-MJ2015GU233804.1Fujian4797FJ623185.1Changchun96GU450330.1ShanghaiKP081556.1Sichuan99AF201311.1Spain92AJ623306.1FranceKJ679446.1Germany47AF055394PCV2b95AY686764.1ZJ21EF421973.1GuangzhouEU266598.1ZhejiangHM038027.1SHHM641752.1DBN-SX07-243AY556477.1HunanEU547460.1Lanzhou83EF524517PCV2dGZ-XY201651AY556476.1Hainan83AY484410.1UnitedKingdomAY556473.1JiangsuFJ870973.1Hubei90KC245149.1XinjiangGZ-XW201597KC788504.1GZ-KY2013HM776439.1HeilongjiangGZ-QX201415GU252370.1AnhuiJQ809463.1GZ-QZ12012GZ-XW201483GZ-MT2015GZ-XY12015EU148503PCV2cHM776452.1Yunnan50AF055392PCV2a100AF264041.1NorthAmerica5873AF109397Canada.1100AB426905.1Japan87HM038034.1LG100GZ-SY2016GZ-YY2015100JX0602PCV2e9281JQ809462.1GZ-CS12012KM880089.1Guangdong0.0200.0150.0100.0050.000图2-1PCV2核苷酸序列遗传进化树Fig.2-1PhylogenetictreeofthegenomesequencewiththePCV2isolates33 3.2PCV2基因组结构分析通过DNAStar软件的MegAlign功具分析51株PCV2毒株之间的核苷酸序列的差异，结果显示（如表2-2），各PCV2毒株的核苷酸序列之间的主要差异主要存在于ORF2和ORF1内，但从差异率来看，差异率较大的是ORF6（32.22%）、ORF10（29.63%）、ORF2（24.11%）、ORF5（21.60%）、ORF7（20.00%）。表2-2PCV2各ORFs的变异情况分析Tale2-2ThevariationanalysisofPCV2ORFSsequenceORF正链位置(bp)大小(bp)保守位点变异位点变异率151-99594584310010.58%21030-173470553217024.11%3357-6713152753812.06%4386-5651801542413.33%51016-11771621273521.60%61521-161090612932.22%71681-174060481220.00%8688-753666069.09%91731-92129122129.30%101523-1573108763229.63%11989-10334535715.56%PCV21-17671767146530317.15%通过DNAStar软件的EditSeq工具对各分离株的全基因组序列和ORF2序列进行分析发现（如表2-3），各基因型之间的全基因组序列大小和ORF2序列大小有一定的差异。其中PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e毒株的全基因组大小分别为1768bp、1767bp、17677bp、1767bp、1768bp，他们的ORF2基因组大小分别为702bp、702bp、705bp、705bp、702bp。34 表2-316株贵州分离株情况Table2-3PCV2isolatesinGuizhouprovince全基因组大小分离株名称基因型分离病毒的样品序列号分离时间(ORF2大小)GZ-CS1PCV2a未知1768（702）JQ809462.12012NotyetGZ-SYPCV2a脾、肺、肾、淋巴结1768（702）2016uploadNotyetGZ-YYPCV2a脾、肺、肾、淋巴结1768（702）2016uploadGZ-RH1PCV2b流产胎儿1767（702）JQ809464.12012KaiyangPCV2b未知1767（702）KJ139962.12014NotyetGZ-JSPCV2b猪血清1767（702）2015uploadNotyetGZ-MTPCV2b脾、肺、肾、淋巴结1767（702）2015uploadNotyetGZ-XYPCV2b脾、肺、肾、淋巴结1767（702）2016uploadGZ-KY1PCV2d肺、肾、淋巴结1767（705）KC788504.12012GZ-QZ1PCV2d未知1767（705）JQ809463.12012NotyetGZ-QXPCV2d猪血清1767（705）2014uploadNotyetGZ-XW1PCV2d猪血清1767（705）2014uploadNotyetGZ-MTPCV2d脾、肺、肾、淋巴结1767（705）2015uploadNotyetGZ-XWPCV2d脾、肺、肾、淋巴结1767（705）2015uploadNotyetGZ-XY1PCV2d脾、肺、肾、淋巴结1767（705）2015uploadNotyetGZ-XYPCV2d脾、肺、肾、淋巴结1767（705）2016upload如图2-2，PCV2a的全基因组大小为1768bp，比PCV2b和PCV2d的全基因组多1个碱基，通过多重比对发现，其多出的碱基T位于PCV2a基因组正链的第1044位，相应的多出的氨基酸G位于第494位氨基酸。35 图2-2PCV2ORF2核苷酸序列和氨基酸序列多重比对Fig.2-2Themultiplecomparisonofnucleotideandaminoacidsequence如图2-3，通过对贵州省分离的PCV2的相似性进行分析发现，PCV2a之间的氨基酸序列相似性为98.1%~99.8%、PCV2b之间的氨基酸序列相似性为98.4%~99.8%、PCV2d之间的序列相似性为98.1%~99.8%，说明PCV2的同种基因型之间的相似性较高。PCV2a与PCV2b之间的氨基酸序列相似性为94.7%~95.5%、PCV2a与PCV2d之间的氨基酸序列相似性为93.8%~94.7%、PCV2b与PCV2d之间的氨基酸序列相似性为95%~96.5%。由此说明，3种基因型中PCV2a与PCV2d之间相似性最低，PCV2b与PCV2d之间相似性最高，且PCV2b同PCV2a和PCV2d的相似性处于较高水平，提示PCV2b可能是PCV2a向PCV2b过度的一种基因型。如表2-4所示，通过对PCV2a、PCV2b、PCV2d这3种基因型的ORF2氨基酸序列进行多重比对发现，16株毒株间ORF2的氨基酸差异一共有48处，其中因基因型不同而引起的差异有31处，其余17处不同皆是因为某一株病毒的一个氨基酸的不同而导致的，进一步表明了PCV2同种基因型之间较为保守。对差异进行具体分析发现，在3种基因型存在差异的位置上，PCV2a跟PCV2b有8处相同（表2-4中标记为绿色的部分），PCV2a与PCV2d有4处相同（表2-4中标记为橙色的部分），PCV2b与PCV2d有17处相同（表2-4中标记为红色的部分），这说明PCV2d是由PCV2b演化而来，PCV2b可能是PCV2a演化到PCV2d的过度基因型，与之前的相似性分析得出的结论一致。36 图2-3PCV2氨基酸序列的相似性分析Fig.2-3Thesimilarityanalysisofaminoacidsequence表2-4PCV2a、PCV2b、PCV2d基因型ORF2的氨基酸差异Table2-4TheaminoaciddifferencesofPCV2a、PCV2b、PCV2dgenotypeORF2ORF2氨基酸84753575963666872778688899091121位置PCV2aYSFVATSALDTKISISP/PCV2bYTFIKRAMNSPRSVSSPCV2dFTIVKRSNMNSPLTVTORF2氨基酸位置130131134151169185187190191201206210215232234PCV2aFPTPSMISKAKDVK.PCV2bVTTTSLLTGA/VIEA/VN.PCV2dVTNTR/GLLTGAIDINR/K37 如图2-4所示，对PCV2ORF2氨基酸序列进行相似性分析发现，PCV2a之间的氨基酸序列相似性为98%~100%，PCV2b之间的氨基酸序列相似性为98.3%~99.3%，PCV2d之间的氨基酸序列相似性为98.6%~99.9%。PCV2a与PCV2b之间的氨基酸序列相似性为91.3%~92.6%，PCV2a与PCV2d之间的氨基酸序列相似性为89.2%~90.0%，PCV2b与PCV2d之间的氨基酸序列相似性为93%~94.6%，该结果显示，即使负责编码PCV2的衣壳蛋白的氨基酸序列在同种基因型之间也具有较高的保守性，而在不同基因型之间的差异性则较大，其中PCV2a与PCV2d的衣壳蛋白的氨基酸相似性最高仅为90%，这说明不同基因型之间的抗原性可能存在较大的差异，而PCV2b与PCV2a、PCV2d的衣壳蛋白氨基酸相似性明显高于PCV2a与PCV2d的相似性，而当前主要流行的PCV2的基因型又为PCV2b和PCV2d，这提示我们PCV2b作为候选疫苗具有很好的优势。图2-4PCV2ORF2的氨基酸相似性分析Fig.2-4Thesimilarityanalysisofaminoacidsequence4讨论PCV2在我国猪群中普遍存在，自2003年在我国报道有PCV2以来，PCV2从最初的PCV2a型，演变成了广泛流行的PCV2b型，现在PCV2d型又开始逐渐被报道。本研究运用相关生物信息学软件对PCV2贵州分离株的基因型进行了分析，并且具体分析了不同基因型之间的差异和特征。对收集的51株PCV2核苷酸序列进行进化树分析发现，51株分离株中共有11株属于PCV2a型，其中贵州有3株；21株属于PCV2b型，贵州有5株；1838 株为PCV2d型，贵州有8株。就进化树分析结果来看PCV2d已经成为贵州地区的PCV2主要流行毒株。核苷酸序列分析发现，各PCV2毒株的核苷酸序列之间的主要差异存在于ORF2和ORF1内，但从差异率来看，差异率较大的是ORF6（32.22%）、ORF10（29.63%）、ORF2（24.11%）、ORF5（21.60%）、ORF7（20.00%），其中ORF6和ORF7参与病毒的复制，ORF10跟病毒的复制和致病力无关，暂未明确其具体功能，ORF5与病毒的致病力有关，其缺失可致病毒致病力减弱，ORF2编码PCV2的结构蛋白，决定其抗原性，同时也可能跟病毒的致病性有关。由此可以推测，在不同的PCV2分离株之间，他们的抗原性、致病力、复制能力可能都会有一定的差异。本研究中通过对PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e这5种PCV2基因型的对比分析发现，这5种PCV2基因型之间的全基因组序列大小和ORF2序列大小有一定的区别。就论文中目前分析的序列而言，PCV2各基因型毒株的全基因组大小分别为PCV2a（1768bp）、PCV2b（1767bp）、PCV2c（1767bp）、PCV2d（1767bp）、PCV2e（1768bp），ORF2基因组大小分别为PCV2a（702bp）、PCV2b（702bp）、PCV2c（705bp）、PCV2d（705bp）、PCV2e（702bp），根据他们基因组的差异可以将PCV2a/PCV2e、PCV2b、PCV2c/PCV2d进行区分。对贵州分离株各基因型的PCV2毒株进行氨基酸序列的相似相分析发现，在PCV2a、PCV2b、PCV2d这3种基因型中，同种基因型之间的全病毒氨基酸序列相似性和编码抗原蛋白的ORF2氨基酸序列相似性都较高，该结果提示同种基因型之间的PCV2较为保守。对3种基因型之间的全病毒氨基酸序列和编码抗原蛋白氨基酸序列相似性进行分析发现，不同基因型的PCV2之间的氨基酸序列相似性不高，这说明PCV2的不同基因型之间包括抗原性在内的其他特性会有部分差异。对3种基因型的ORF2氨基酸序列进行多重比对分析，结果显示，3种基因型在ORF2氨基酸在特定位置上存在差异，且这些差异占据了3不同基因型间ORF2氨基酸全部差异的大部分（65%），只有少部分差异是由于毒株的突变造成（35%），这进一步说明了PCV2同种基因型之间具有较高的保守性。而且，从由不同基因型造成的这些差异之中可以看出，PCV2b同PCV2a、PCV2d的差异远小于PCV2a与PCV2d的差异，且PCV2b的相似性与PCV2a、PCV2d都保持在较高的水平，再结合这3种基因型的流行时段来看，PCV2b可能是PCV2a39 向PCV2d演变的一个过渡基因型，该基因型同PCV2a和PCV2d都具有较高的相似性，这就提示我们，将PCV2b作为PCV2的疫苗毒株，对PCV2防控可能会具有较好的效果。5结论（1）当前PCV2流行株主要以PCV2b、PCV2d型为主，其中贵州省以2d为主；PCV2各基因型毒株的全基因组大小存在差异，根据他们基因组的差异可以将PCV2a/PCV2e、PCV2b、PCV2c/PCV2d进行区分。（2）PCV2的同种基因型之间的保守性较高，不同基因型之间的保守性相对较差。PCV2b与PCV2a、PCV2d的氨基酸序列相似性大于PCV2a与PCV2d，结合各毒株的流行时间推测PCV2b可能是PCV2a向PCV2d过渡的一种基因型，就序列相似性来看，选择PCV2b型毒株作为构建PCV1-2嵌合病毒感染性克隆质粒的亲本毒株或许更好。40 第三章携带遗传标记的PCV1-2m-V5嵌合病毒感染性克隆质粒的构建猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，PCV2)是目前危害养猪业的主要疾病之一，对全球养猪业造成了重大经济损失。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原，同增生性坏死性肺炎、猪皮炎与肾炎综合征、猪呼吸道综合征、先天性颤抖、繁殖障碍、肠炎等疾病等疾病有密切联系（Segalesetal.,2012）。PCV2主要侵害猪的免疫系统，导致其免疫力下降，使其更容易感染其他病原体，甚至会加重其他病原体对猪只的侵害，比如其同猪蓝耳病病毒混合感染猪只时，其能增强猪蓝耳病病毒的复制能力。该病毒基因组大小为1767~1768bp，含有两个主要的开放阅读框ORF1和ORF2，ORF1负责编码与病毒复制相关的蛋白（Rep和Rep’），参与病毒的复制；ORF2负责编码病毒的衣壳蛋白（Cap），参与病毒的组装、感染和免疫等过程（Cheungetal.,2012）。当前国内市面上流行的针对PCV2的疫苗主要是PCV2全病毒灭活苗和亚单位疫苗，iDNA疫苗作为一种新型基因工程疫苗，结合了核酸疫苗和减毒疫苗的优点，能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，生产成本低廉，稳定安全，制备简便，具有广阔的应用前景。本研究拟以实验室之前分离的PCV2GZ-RH1为亲本毒，通过基因工程技术将V5标签引入至PCV2的ORF2末端，以此来区分疫苗抗体和野毒抗体以及疫苗毒和野毒，再以PCV1为骨架，利用基因工程技术用携带V5遗传标记的PCV2的ORF2置换掉PCV1的ORF2，从而构建出携带V5遗传标记的PCV1-2m-V5嵌合病毒感染性克隆质粒。通过将该感染性克隆质粒注射小鼠，拯救出PCV1-2m-V5病毒株，并将该毒株接种至PK15细胞，通过试验探索其是否能够在体外培养的过程中表达出PCV2的Cap蛋白和能区分疫苗抗体和野毒抗体的V5标签蛋白，进而验证PCV2iDNA新型嵌合标记疫苗构建策略的可行性，为PCV2iDNA疫苗的研制提供参考和素材。1材料1.1毒株、质粒和细胞41 pCDNA3.1-PCV2GZ-RH1质粒和pMD19-T-PCV1质粒由实验室之前构建保存；真核表达载体pcDNA3.1(+)系Invitrogen公司产品；pMD19-TSimpleVector购自宝生物工程（大连）有限公司；无PCV1、PCV2污染的猪肾细胞系PK-15细胞系中国兽药监察所惠赠。1.2主要试剂DNA提取试剂盒，LATaq聚合酶，限制性内切酶SpeI、SphI、HindⅢ和BamHI，T4DNA连接酶等系宝生物工程（大连）有限公司产品；E.Z.N.A.TMGelExtractionKit(50)胶回收试剂盒系Omega公司产品；普通质粒小提试剂盒系TIANGE公司产品；脂质体转染试剂盒LipofectamineTM2000系Invitrogen公司产品；HRP-羊抗猪IgG和HRP-羊抗鼠IgG购自北京索莱宝科技有限公司；猪PCV2阳性血清由本实验室鉴定保存；无PCV1、PCV2感染的昆明试验小鼠购自贵州医科大学实验中心，其他试剂均为国产分析纯。1.3主要实验仪器CO2培养箱（3111）和-80℃超低温冰箱（702），美国ThermoFisher有限公司；高速冷冻离心机，Heraens有限公司；PCR扩增仪（TC-512），TECHNE公司；电泳仪和电泳槽（DYY-7C），北京市六一仪器厂；GelDOCXR凝胶成像系统(UniversityHoodⅡ)，美国BIO-RAD有限公司；SW-CJ-IFD型单人单面超净工作台，苏州净化设备有限公司；倒置显微镜（CKX-41），OLYMPUS公司；2方法2.1引物设计根据GenBank中PCV2序列以及有关文献，设计了5对引物，引物序列如表3-1。表3-1本研究中所使用的引物Table3-1TheprimersusedinthisresearchPrimerSequenceRestrictionenzymeFa(PCV1)5′-CCCAAGCTTCTTTTTTGTTATCACATCGTAATG-3′BamHⅠRa(PCV1)5′-GGTGGATCCACTCAGTAATTTATTTTATATGGG-3′HindⅢ42 F1(PCV2-V5)5′-GGATCCACTCAGTAATTTATTTCATATGGA-3′BamHⅠ5′AAGCTTCTTTTTATCACTTCGTAATGGTTTTTATTATTCR1(PCV2-V5)ATTACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAHindⅢGGCTTACCAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3′F2(PCV2-ORF2-V5)5’-CGGACTAGTATGACGTATCCAAGGAGGCGTT-3’SpeⅠR2(PCV2-ORF2-V5)5’-CATGCATGCTTACGTAGAATCGAGACCGAGG-3’SphⅠF3(PCV1△ORF2)5’-CGGACTAGTCCTATAAAAGTGAAAGAAGTG-3’SpeⅠR3(PCV1△ORF2)5’-CATGCATGCAAATAAAAACCATTACGATGTG-3’SphⅠF4(PCV2)5′-CCCAAGCTTTAGTTTGTAGTCTCAGCCAGAG-3′BamHⅠR4(PCV2)5′-GGTGGATCCTATAACCGATGGTGCGGGAGA-3′HindⅢ注：带下划线的引物序列系V5标签序列，斜体加粗部分为限制性核酸内切酶酶切位点。NOTE:ThesequencewithunderscoresisV5sequence,andthesequencesinbolditalicsrepresentrestrictionenzymesitesintroduced.2.2pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒构建策略PCV1-2m-V5嵌合病毒感染性克隆质粒的构建策略如图3-1所示。首先，通过PCR技术将V5标签引入PCV2ORF2的末端，再分别通过PCR技术获得携带相同酶切位点的PCV2的ORF2-V5片段和不含ORF2的pMD19-T-PCV1片段，将二者进行双酶切后进行连接转化至TOP10感受态细胞并克隆，即获得了pMD19-T-PCV1-2m-V5质粒，再将PCV1-2m-V5序列连至pcDNA3.1载体即获得了pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒。图3-1pcDNA3.1-PCV1-2m-V5质粒的构建流程图Fig.3-1ConstructionofrecombinantplasmidpcDNA3.1-PCV1-2m-V543 2.3pMD19-T-PCV2m-V5质粒的构建及鉴定2.3.1pMD19-T-PCV2m-V5质粒的构建根据序列分析结果，以实验室之前构建的PCV2b型pCDNA3.1-PCV2GZ-RH1质粒为模板，用F1/R1引物进行PCR扩增，通过PCR反应将V5标签引入至PCV2-ORF2末端，其反应体系如下：10×LATaqBuffer5.0µLF1/R1各2µLdNTPMixture8.0µLpCDNA3.1-PCV2质粒5.0µLLATaq聚合酶0.5µLddH2O29.5µL总体积50.0µL反应条件如下：94℃5min；94℃1min，56℃40s，72℃2min，共35个循环；72℃10min。将PCR产物进行电泳并根据胶回收试剂盒说明书将PCR产物进行收纯化，将纯化回收的DNA连至pMD19-TSimpleVector载体，其连接体系和条件如下：SolutionⅠ5μL，pMD19-TSimpleVector0.5μL，DNA4.5μL，将连接混合液置于16℃过夜。将连接产物转化至Top10大肠杆菌中，步骤如下：（1）将保存于-80℃冰箱的Top10大肠杆菌取出，并立即将其于冰水混合物中放置10min。（2）取10μL连接产物加入有100μLTop10大肠杆菌菌液的1.5离心管中中，并于冰水混合物中放置30min。（3）将离心管于42℃水浴锅中放置2min，37℃放置5min，冰水混合物中放置2min。（4）往离心管中加入890μL预热的LB营养液，并于37℃恒温摇床中孵育50min。将转化后的Top10大肠杆菌菌液均匀地涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，并将平板于37℃温箱中过夜培养。次日，于平板上挑取阳性菌落，并于装有含氨苄的LB营养液中37℃过夜进行增菌培养。次日，待菌液浑浊后根据小剂44 量质粒提取试剂盒说明书提取质粒。2.3.2pMD19-T-PCV2m-V5质粒的鉴定用F1/R1引物对质粒进行质粒PCR鉴定，条件同2.1.1，体系减半为25μL，将PCR产物进行电泳检测。用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶对构建的质粒进行双酶切鉴定，条件和体系如下：10×KBuffer2.5µLpMD19-T-PCV2m-V5质粒10µLHindⅢ0.5µLBamHⅠ0.5µLddH2O11.5µL总体积25.0µL于37℃酶切作用4h，酶切产物进行电泳检测。将质粒PCR和双酶切鉴定为阳性的质粒送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。2.4pMD19-T-PCV1-2m-V5克隆质粒的构建及鉴定2.4.1PCV2-ORF2-V5的扩增以构建的pMD19-T-PCV2m-V5克隆质粒为模板，用F2/R2引物进行扩增反应，以获得PCV2-ORF2-V5，条件体系如下：10×LATaqBuffer5.0µLF4/R4各2µLdNTPMixture8.0µLpMD19-T-PCV2m-V5质粒5.0µLLATaq聚合酶1µLddH2O27µL总体积50.0µL反应条件如下：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃10min。将PCR产物进行电泳并进行回收纯化，并将纯化的目的DNA保存于-20℃备用。2.4.2pMD19-T-PCV1△ORF2的扩增45 以本实验室构建的pMD19-T-PCV1质粒为模板，用F3/R3引物对其进行扩增，以获得pMD19-T-PCV1△ORF2，条件体系如下：10×LATaqBuffer5.0µLF3/R3各2µLdNTPMixture8.0µLpMD19-T-PCV1质粒5.0µLLATaq聚合酶1µLddH2O27µL总体积50.0µL反应条件如下：94℃5min；94℃1min，56℃2min，72℃4min，共35个循环；72℃10min，将PCR产物进行电泳并进行回收纯化，并将纯化的目的DNA保存于-20℃备用。2.4.3pMD19-T-PCV1-2m-V5克隆质粒的构建及鉴定分别将回收纯化的PCV2-ORF2-V5和pMD19-T-PCV1△ORF2进行SpeⅠ和SphⅠ双酶切，酶切体系和条件如下：10×KBuffer5µLPCV2-ORF2-V5/20µLpMD19-T-PCV1△ORF2SpeⅠ1µLSphⅠ1µLddH2O23µL总体积50µL于37℃酶切作用4h，分别将酶切产物进行电泳并纯化回收，将两种回收产物进行连接，条件体系如下：PCV2-ORF2-V54.5µLSolutionⅠ5.0µLpMD19-T-PCV1△ORF20.5µL总体积10.0µL于16℃过夜，将连接产物转化至Top10大肠杆菌，挑取阳性菌落进行增菌46 培养，提取质粒，用F2/R2引物对其进行质粒PCR鉴定，用SpeⅠ和SphⅠ限制性内切酶对其进行双酶切鉴定。其中质粒PCR鉴定条件同2.3.1和体系减半，用25μL；双酶切鉴定条件同上，体系减半，用25μL体系。将酶切产物和质粒PCR产物进行电泳检测。将经质粒PCR和双酶切鉴定为阳性的质粒送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。2.5pcDNA3.1(+)-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒的构建将经测序鉴定构建成功的pMD19-T-PCV1-2m-V5质粒和pcDNA3.1(+)载体DNA分别进行SpeⅠ和SphⅠ双酶切，体系和条件同2.3.3，将酶切产物进行电泳，分别对PCV1-2m-V5和pcDNA3.1进行纯化回收，再将目的片段PCV1-2m-V5连至pcDNA3.1(+)载体上，16℃过夜连接，体系如下：10×T4DNALigaseBuffer1.0µL目的片段PCV1-2m-V55.0µLpcDNA3.1(+)载体1.0µLT4DNALigase0.5µLddH2O2.5µL总体积10.0µL将连接产物转化至Top10大肠杆菌，挑取阳性菌落扩大培养后，提取质粒，以其为模板，用Fa/Ra引物对其进行质粒PCR鉴定，用HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶对其进行双酶切鉴定。其中质粒PCR体系和条件如下：10×LATaqBuffer2.5µLFa/Ra各1µLdNTPMixture4.0µLpMD19-T-PCV1质粒2.5µLLATaq聚合酶0.5µLddH2O23.5µL总体积25µL94℃5min；94℃1min，55℃40s，72℃2min，共35个循环；72℃10min。HindⅢ和BamHⅠ双酶切体系同2.2.2，将质粒PCR和双酶切产物进行电泳检测，将鉴定为阳性的质粒送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。47 2.6PCV1-2m-V5病毒株的拯救将18只6周龄昆明雌性小鼠，随机分成3组，每组6只，进行标记病毒拯救试验。实验Ⅰ组肌肉注射100µgPCV2iDNA候选标记疫苗（pcDNA3.1(+)-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒）；实验Ⅱ组肌注100µg之前构建的pcDNA3.1(+)-PCV2GZ-RH1质粒作为阳性对照；实验Ⅲ组肌肉注射100µgpcDNA3.1(+)空质粒作为阴性对照组。分别于接种后7、14、21、28、35、42d断尾采集小鼠血液，分离血清，并根据MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0试剂盒说明书提取血液的混合核酸。以混合核酸为模板，用Fa/Ra引物检测实验Ⅰ组和对照组血清中病毒核酸，条件体系同2.2.2，用F4/R4引物检测实验Ⅱ血清中病毒核酸，以此分析其病毒血症产生情况。将实验Ⅰ组检测出的阳性病毒核酸进行克隆测序，将测序结果同鉴定pcDNA3.1(+)-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒时的测序结果进行对比分析，将鉴定为阳性的小鼠血清经虑菌器过滤后于-80℃保存备用。2.7拯救毒株PCV1-2m-V5的鉴定2.7.1PCV1-2m-V5的细胞接种及病原检测试验Ⅰ组取200μL鉴定为PCV1-2m-V5阳性的小鼠血清同步接种1瓶PK15细胞；试验Ⅱ取200μL的PCV2GZ-RH1病毒液接种1瓶PK15细胞；阴性对照组取200μL细胞营养液接种1瓶PK15细胞。将3瓶PK15细胞盲传5代，分别取其第5代细胞培养物，提取其核酸并同时用F2/R2引物（条件体系同2.2.2）和F4/R4引物对其进行病原核酸检测。2.7.2PCV1-2m-V5的IFA检测将长势良好的PK15细胞转移至6块六孔板中，将每2块六孔板分为板1和板2，其中板1用V5标签单克隆抗体作为一抗；板2用PCV2阳性血清作为一抗。每块六孔板分为3组（每2孔1组），试验Ⅰ组每孔同步接种50μL的PCV2GZ-RH1病毒液；试验Ⅱ组每孔同步接种50μL鉴定为PCV1-2m-V5阳性的小鼠血液；试验Ⅲ组每孔接种50μL细胞营养液作为阴性对照。待六孔板中细胞培养24h、48h、72h时，分别取2块六孔板进行IFA检测，试验步骤如下：（1）将六孔板取出，用PH=7.4的灭菌PBS清洗3次，每次5min，清洗完毕后将六孔板置于室温下，待其自然干燥后每孔加入2mL于-20℃预冷的70%的48 丙酮，室温放置15min。（2）固定完毕后，用PBS清洗，方法同上，清洗完毕后每孔加入2mL现配的含5%脱脂奶的PBS，于37℃恒温箱中封闭2h。（3）封闭结束后，用上述方法充分清洗，板1中每孔加入1mL按1:40稀释的V5标签单克隆抗体作为一抗（用PBS进行稀释）；板2中每孔加入按1:40稀释的PCV2阳性血清作为一抗，于37℃恒温箱中放置1h。（4）一抗作用完毕后，取出六孔板并用上述方法充分清洗，于避光处每孔加入1mL酶标二抗，于37℃恒温箱中避光孵育1h。（5）二抗作用完毕后，取出六孔板并用上述方法避光清洗，并立即置于荧光显微镜下观察结果。2.7.3WesternBlot分析分别将50μL的PCV1-2m-V5、GZ-RH1PCV2、细胞营养液接种于长势较好的PK15细胞上，各盲传5代后收集细胞培养物，以V5标签单克隆抗体为一抗进行WesternBlot检测，步骤如下：（1）蛋白提取：取约1mLPK15细胞培养物，按试剂盒说明书提取蛋白；（2）浓度测定：BCA蛋白定量，BCA液每孔200uL与硫酸铜液4uL混合，配制成为BCA蛋白定量工作液使用。37度温箱孵育30min。酶标仪读数；（3）制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶5%，分离胶10%；（4）制样：上样量40μg/孔；（5）电泳：浓缩胶80V，30min；分离胶120V，通过预染蛋白Marker来确定电泳停止时间；（6）转膜：湿转，300mA；转膜时间为60min；（7）封闭：将膜完全浸没5%脱脂牛奶中37℃轻摇60min；（8）孵育一抗：用5%脱脂牛奶稀释一抗（V5标签单克隆抗体），室温孵育15min，放4℃过夜；（9）洗涤：TBST洗膜4次，10min/次；（10）孵育二抗：用5%脱脂牛奶稀释二抗，加入识别对应一抗的HRP标记二抗，1:8000稀释，室温轻摇60min；（11）洗涤：TBST洗膜4次，10min/次；49 （12）ECL曝光显示，观察结果。2.7.4免疫沉淀试验和PCV1-2m-V5病毒粒子的观察对接种PCV1-2m-V5的第5代PK15细胞进行免疫沉淀，将该试验分为2组，试验Ⅰ组以PCV2阳性血清为一抗；试验Ⅱ组以V5标签单克隆抗体为一抗，试验步骤如下：（1）将接种PCV1-2m-V5的第5代PK15细胞培养物反复冻融3次，12000rpm4℃离心30min；（2）取上清，试验Ⅰ组加入终浓度为5%的PCV2阳性血清；试验Ⅱ组加入终浓度为5%的V5标签单克隆抗体，4℃过夜，12000rpm4℃离心30min；（3）弃上清，沉淀用PBS溶解，12000rpm4℃离心30min；（4）重复步骤（3）两次；（5）沉淀用PBS溶解，将样品送至扬州大学进行后续处理后于电镜下观察病毒粒子。3结果与分析3.1V5标记PCV2全基因组扩增应用F1/R1引物，以之前实验室构建的pCDNA3.1-PCV2GZ-RH1质粒为模板，扩增出一条与预期约1800bp大小相符的目的条带（图3-2）。M：DL2000DNAMarker；1：PCV2-V5PCR产物M:DL2000DNAMarker；1:PCV2-V5PCRproducts图3-2PCR扩增产物Fig.3-2PCRamplificationproducts3.2pMD19-T-PCV2m-V5质粒的PCR鉴定对构建的pMD19-T-PCV2m-V5质粒进行PCR鉴定和HindⅢ和BamHⅠ双酶50 切鉴定，结果显示其为阳性质粒（图3-3），测序结果显示与预期序列一致，表明V5标签序列被成功引入到了PCV2ORF2的末端，成功构建了pMD19-T-PCV2m-V5克隆质粒。M：DL2000DNAMarker；1：质粒PCR产物；2：HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定M:DL2000DNAMarker；1:PlasmidPCRproducts;2:HindⅢandBamHⅠenzymeidentification图3-3重组质粒pMD19-T-PCV2m-V5的鉴定Fig.3-3IdentificationofrecombinantplasmidpMD19-T-PCV2m-V53.3PCV2-ORF2-V5的扩增以构建的pMD19-T-PCV2m-V5质粒为模板，用F2/R2引物对PCV2-ORF2-V5进行扩增，扩增出一条与预期约750bp大小相符的目的条带（图3-4）M：DL2000DNAMarker；1：PCV2-ORF2-V5PCR产物M:DL2000DNAMarker；1:PCV2-ORF2-V5PCRproducts图3-4PCR扩增产物Fig.3-4PCRamplificationproducts3.4pMD19-T-PCV1△ORF2的扩增以本实验室构建的pMD19-T-PCV1质粒为模板，用F3/R3引物对其进行扩增，获得了一条与预期大小相符的3700bp左右的目的条带（3-5）51 M：λ-EcoT14Idigest；1：pMD19-T-PCV1△ORF2PCR扩增产物M:λ-EcoT14Idigest；1:pMD19-T-PCV1△ORF2PCRproducts图3-5PCR扩增产物Fig.3-5PCRamplificationproducts3.5pMD19-T-PCV1-2m-V5质粒的鉴定用F2/R2引物和限制性内切酶SpeⅠ和SphⅠ对构建的pMD19-T-PCV1-2m-V5质粒进行质粒PCR鉴定和双酶切鉴定，结果显示其为阳性质粒（图3-6），测序结果与预期序列一致，表明顺利地将PCV1的ORF2置换成了携带V5标签的PCV2ORF2，成功构建了pMD19-T-PCV1-2m-V5质粒。M：DL2000DNAMarker；1：质粒PCR鉴定；2：SpeⅠ和SphⅠ双酶切鉴定M:DL2000DNAMarker；1:IdentificationbyplasmidPCR;2:DigestionbySpeⅠandSphⅠ图3-6重组质粒pMD19-T-PCV1-2m-V5的鉴定Fig.3-6IdentificationofrecombinantplasmidpMD19-T-PCV2m-V53.6pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒的鉴定用Fa/Ra引物对构建的pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒进行质粒PCR鉴定，用HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶对其进行双酶切鉴定，结果显示其为阳性质粒，如图3-7所示。测序结果进一步表明，顺利地将PCV1-2m-V5连至了pcDNA3.1（+）真核表达载体上，成功构建了pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染52 性克隆质粒。M1、M2：DL2000DNAMarker；1：质粒PCR鉴定；2：HindⅢ和BamHⅠ双酶切鉴定M1、M2：DL2000DNAMarker；1:IdentificationbyplasmidPCR;2:DigestionbyHindⅢandBamHⅠ图3-7重组质粒pcDNA3.1-PCV1-2m-V5的鉴定Fig.3-7IdentificationofrecombinantplasmidpcDNA3.1-PCV1-2m-V53.7免疫小鼠PCV1-2m-V5病毒血症的检测结果分别采集接种后不同时间段的3组小鼠血液，分离血清后进行病原核酸检测，检测结果详见表3-2。PCV1-2m-V5候选标记疫苗组在第7d有2只小鼠检测到病毒血症，14d后全部检测到病毒血症，21d后有2只小鼠检测到病毒血症，28d后病毒血症完全消失；pcDNA3.1-PCV2GZ-RH1组在第7d有2只小鼠检测到病毒血症，14d后有5只小鼠检测到病毒血症，21d有3只小鼠检测到病毒血症，28d后病毒血症也完全消失；注射空质粒组未检测到病毒血症。结果表明，PCV1-2m-V5候选标记疫苗组和PCV2GZ-RH1组一样在免疫小鼠体内均能正常增殖，并维持较长时间的病毒血症。表3-2不同时间段感染PCV2小鼠病毒血症的PCR检测Table3-2ThePCRdetectionofmiceviremiainfectedwithPCV2atdifferenttimes不同时间的PCR的检测结果分组71421283542pcDNA3.1(+)-PCV22/55/53/50/50/50/5GZ-RH1pcDNA3.1(+)-PCV12/55/52/50/50/50/5-2m-V5pcDNA3.1(+)0/50/50/50/50/50/553 将PCV1-2m-V5候选标记疫苗组第14d检测出的病原核酸进行克隆测序，利用DNAStar软件的MegAlign程序，将测序结果同构建pcDNA3.1-PCV1-2m-V5质粒时的测序结果进行核苷酸序列和氨基酸序列的比对，结果显示（如图3-8、图3-9），PCV1-2m-V5拯救病毒的核苷酸序列同构建的pcDNA3.1-PCV1-2m-V5质粒相比存在5个碱基的差异，除此之外其余序列完全一致。其中位于病毒负链的第137位碱基C→A，第183位碱基A→G，第211位碱基G→A，第1603个碱基T→G，第1764个碱基G→A；这5个碱基的变异导致其相应的氨基酸也发生了变异，其中位于负链的第46位P（脯氨酸）→H（组氨酸），第71位V（缬氨酸）→T（苏氨酸），第395位T（苏氨酸）→A（丙氨酸），第535位终止密码子→E（谷氨酸），第588位W（色氨酸）→终止密码子。其中前3个变异的氨基酸位于PCV1-2m-V5拯救病毒的ORF2内部，但标签部分序列同之前一致，并未发生变异；由终止密码子突变成E（谷氨酸）的第535位氨基酸位于PCV1-2m-V5拯救病毒的ORF1内部；而由W（色氨酸）突变成终止密码子的第588位氨基酸位于ORF9内。该结果表明通过将构建的pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒接种小鼠能够获得PCV1-2m-V5拯救病毒株，小鼠体内存在PCV1-2m-V5拯救病毒，但其在拯救过程中存在部分变异。图3-8拯救病毒和构建的pcDNA3.1-PCV1-2m-V5质粒的核苷酸序列比对结果Fig.3-8TheresultofrescuedvirusandpcDNA3.1-PCV1-2m-V5plasmidconstructednucleotidesequencealignment图3-9拯救病毒和构建的pcDNA3.1-PCV1-2m-V5质粒的氨基酸序列比对结果Fig.3-9TheresultofrescuedvirusandpcDNA3.1-PCV1-2m-V5plasmidconstructedaminoacidsequencealignment3.8第5代PCV1-2m-V5细胞液PCR检测结果分别以接种PCV1-2m-V5、PCV2GZ-RH1和MEM的第5代PK15细胞液混合核酸为模板，同时用F2/R2和F4/R4引物对其进行PCR检测，结果显示用PCV254 引物对接种PCV2GZ-RH1的PK15细胞培养物检测为阳性，对接种PCV1-2m-V5的PK15细胞培养物检测为阴性，用携带标记的引物对接种PCV2GZ-RH1的PK15细胞培养物检测为阴性，对接种PCV1-2m-V5的PK15细胞培养物检测为阳性，两对引物对阴性对照组的检测结果均为阴性（如图3-10），该结果也表明可以通过F2/R2引物对PCV2和PCV1-2m-V5进行区分。M：DL2000DNAMarker；1、2：F4/R4引物对接种PCV1-2m-V5、PCV2GZ-RH1细胞培养物的检测结果；3、4：F2/R2引物对接种PCV2GZ-RH1、PCV1-2m-V5细胞培养物的检测结果；5、6：两对引物对阴性对照检测结果M:DL2000DNAMarker;1、3:ThedetectionresultsofcellinoculatedPCV1-2m-V5andPCV2GZ-RH1withF4/R4primers;2、4:ThedetectionresultsofcellinoculatedPCV2GZ-RH1andPCV1-2m-V5withF2/R2primers;5、6:negativecontrol图3-10细胞培养物的检测结果Fig.3-10Thedetectionresultsofcellculture3.9IFA检测结果在细胞分别培养24、48、72h后的IFA检测结果显示（如表3-3，如图3-11），能在以PCV2阳性血清为一抗，接种PCV2GZ-RH1的板2中观察到明显的特异性荧光，表明PCV2GZ-RH1成功感染了PK15细胞，并表达了Cap蛋白，而在以V5标签单克隆抗体为一抗，接种PCV2GZ-RH1的板1中观察不到明显特异性荧光；在分别以V5标签单克隆抗体和PCV2阳性血清为一抗，接种PCV1-2m-V5的板1和板2中皆能观察到明显的特异性荧光，表明PCV1-2m-V5成功感染了PK15细胞，并能同时表达PCV2Cap蛋白和V5标签蛋白；在接种PBS的阴性对照组中均未观察到特异性荧光。其中培养24h的细胞观察到的荧光点最少，但细胞形态最好；培养48h的细胞观察到的荧光点稍多，但细胞形态稍差，已有部分细胞出现融合凋亡现象；培养72h后的细胞中观察到的荧光强度最强，但因培养时间过长，六孔板中细胞营养物质耗尽，细胞基本已经融合凋亡，观察不到完整的细胞结构。55 表3-3IFA检测结果Table3-3TheresultsofIFA分组Ⅰ组（接种PCV2Ⅱ组（接种（接种时间：24、Ⅲ组（接种MEM）GZ-RH1）PCV1-2m-V5）48、72h）板1(V5抗体)阴阳阴板2(PCV2抗体)阳阳阴A1、A2、A3：接种PCV1-2m-V524h、48h、72h后，以V5标签单克隆抗体为一抗；B1、B2、B3：接种PCV1-2m-V524h、48h、72h后，以PCV2阳性血清为一抗；C1、C2、C3：接种PBS的阴性对照孔24h、48h、72h后，以V5标签单克隆抗体为一抗；D1、D2、D3：接种GZ-RH1PCV224h、48h、72h后，以PCV2阳性血清为一抗；E1、E2、E3：接种GZ-RH1PCV224h、48h、72h后，以V5标签单克隆抗体为一抗。A1、A2、A3:CellinoculatedPCV1-2m-V5after24h、48h、72hwithV5monoclonalantibodyasprimaryantibody;B1、B2、B3:InoculatedPCV1-2m-V5after24h、48h、72hwithPCV2positiveserumasprimaryantibody;C1、C2、C3:NegativecontrolholeinoculatedPBSafter24h、48h、72hwithV5monoclonalantibodyasprimaryantibody;D1、D2、D3:CellinoculatedGZ-RH1PCV2after24h、48h、72hwithPCV2positiveserumasprimaryantibody;E1、E2、E3:CellinoculatedGZ-RH1PCV2after24h、48h、72hwithPCV2positiveserumasprimaryantibody图3-11IFA检测结果Fig3-11.TheresultsofIFA56 4.0WerternBlot试验结果结果显示（如图3-12），以V5单克隆抗体为一抗，在接种PCV1-2m-V5的第5代PK15细胞培养物中检测到了29KDa左右（Cap和V5蛋白分子量之和为29KDa左右）的目的片段，在以接种GZ-RH1PCV2的第5代PK15细胞培养物和阴性对照的样品中未检测到特异性条带，表明拯救的PCV1-2m-V5能够在PK15细胞中表达V5蛋白。M：蛋白Marker；1:接种PCV1-2m-V5的细胞培养物；2：接种GZ-RH1PCV2的细胞培养物；3：阴性对照图3-12Westernblot检测结果Fig.3-12TheTheresultsofWesternblot4.1电子显微镜观察结果将免疫沉淀样品送至扬州大学进行电子显微镜观察显示（如图3-13），试验Ⅰ和Ⅱ组的样品中均存在直径为17nm左右呈球形的病毒粒子，形态和大小皆与PCV病毒类似。A：试验Ⅰ组样品；B：试验Ⅱ组样品；图3-13重组病毒粒子的电子显微镜观察结果Fig.3-13Electronmicroscopeobservationofrecombinantvirusparticles57 5讨论为了能区分疫苗产生的抗体和野毒产生的抗体，国外的Beach和我国的黄立平等，分别将GLU、KT3标签和V5标签插入到PCV2ORF2的末端，构建了携带分子标记的毒株，该毒株既能产生Cap蛋白又能产生标签蛋白，利用标签抗体作为检测抗体能够将标签毒株和亲本毒株区分开来（Beachetal.,2011;黄立平，2013）。根据这一思路，笔者将V5标签引入了实验室之前分离的PCV2GZ-RH1的ORF2基因的末端，与Beach和黄立平等人的研究不同的是，他们在引入标签的过程中用的是融合PCR的方法，该方法至少设计3对引物，且操作过程繁琐，耗时费力；而本研究只设计了1对引物即成功地将V5标签带入了ORF2的末端，该方法高效简便，为今后标记基因的引入提供了更好的实验操作方法。PCV有PCV1和PCV2两种基因型，其中PCV1没有致病性，二者都具有潜在的ORF2基因，其均编码PCV的主要免疫原性蛋白，衣壳蛋白，而且PCV1和PCV2的衣壳蛋白之间没有抗原交叉原性，因此构建以PCV1为骨架的PCV1-2嵌合病毒感染性克隆质粒作为PCV2的核酸疫苗候选疫苗是一种很好的思路。美国富道公司用PCV2ORF2基因置换掉PCV1的ORF2基因，构建了PCV1-2嵌合病毒，并将其研发成商品化的PCV1-2嵌合病毒灭活疫苗，研究人员对该疫苗进行相关研究测试，结果表明该疫苗能有效地保护猪群抵抗PCV2的感染，降低PMWS的发生，且猪群不表现出临床症状（蔡杰等，2016）。在针对PCV1-2嵌合病毒弱毒苗的稳定性的研究中，研究者对免疫了PCV1-2嵌合病毒弱毒苗的动物进行PPV、PRRSV和PCV2的攻毒后，发现其未发生回复突变，说明PCV1-2嵌合病毒弱毒疫苗具有良好的稳定性（OpriessnigTetal.,2011）。据此，本研究以PCV1为骨架，用携带V5标签的PCV2ORF2基因置换PCV1的ORF2构建pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒。由于PCV2在贵州猪群中普遍流行且多为隐性感染，难以找到PCV阴性猪用于本研究的试验，因此本研究采用无PCV污染的昆明小鼠作为试验鼠。小鼠试验表明，构建的重组质粒与PCV2亲本毒株的感染性克隆质粒一样，在小鼠体内都具有感染性，能够诱导小鼠产生相应的病毒血症，且维持的病毒血症时间大致相同，提示能通过该方式获得PCV1-2m-V5拯救毒株，根据其在小鼠体内具58 有感染性且可以拯救出PCV1-2m-V5的事实，推测构建的感染性克隆质粒也许能诱导小鼠产生细胞免疫，但尚待进一步证实。提取小鼠病毒血症期间血液混合核酸，用Fa/Ra引物扩增PCV1-2m-V5全基因组，并将其进行克隆测序。测序结果发现，拯救病毒株序列与构建的pcDNA3.1-PCV1-2m-V5序列存在5个氨基酸的变异，前3个变异氨基酸分别位于负链的第46位P（脯氨酸）→H（组氨酸），第71位V（缬氨酸）→T（苏氨酸），第395位T（苏氨酸）→A（丙氨酸），这3个变异氨基酸均在ORF2内，但不在V5标签部分；其余2个变异的氨基酸是位于负链的第535位终止密码子→E（谷氨酸），第588位W（色氨酸）→终止密码子，他们分别位于PCV1-2m-V5拯救病毒株的ORF1和ORF9内。ORF1编码病毒的Rep蛋白，该蛋白主要与病毒的复制有关，ORF9暂能肯定的是其与病毒的复制和致病力无关，是否具有其他功能有待进一步研究（代振江等，2016）。这些氨基酸位点的变异会否对PCV1-2m-V5产生影响尚待印证。对拯救毒株进行的IFA、WesternBlot试验以及电镜观察结果表明PCV1-2m-V5能在PK15细胞内包装成与PCV大小形态一致的病毒粒子，且可以表达V5标签蛋白和Cap蛋白，而PCV2不能产生V5标签蛋白，据此可以将V5标签蛋白作为检测抗原对拯救病毒产生的抗体和野毒产生的抗体加以区别。核酸疫苗既能诱导机体产生体液免疫，又具有记忆时间较长、细胞杀伤力较强的细胞免疫反应（ChristophSchoenetal.,2004;KendraMetal.,2007）。iDNA疫苗是通过将没有毒力或者毒力弱化的病毒株全基因组连至真核表达载体后接种动物，诱导动物机体产生同自然毒株同等反应应答的核酸疫苗，其无需细胞培养和传代，降低了病毒毒力返强的可能性，制备简便，成本低廉，适合大规模生产，是一种新型核酸疫苗。之前，本实验室的王伟丞等将SalⅠ酶切位点引入至PCV2基因组中，并构建了携带酶切位点标记的PCV2感染性克隆质粒，将构建的感染性克隆质粒接种昆明小鼠，发现构建的pcDNA3.1-PCV2-SalⅠ感染性克隆质粒在小鼠体内具有感染性，能诱导小鼠产生PCV2抗体，且拯救出了PCV2-SalⅠ标记毒株，这说明PCV2iDNA新型疫苗构建策略是可行的（王伟丞等，2015）。本研究中构建的PCV1-2m-V5感染性克隆质粒对小鼠具有感染性，可以使小鼠产生PCV1-2m-V5病毒血症，并维持一定时间，且拯救出的PCV1-2m-V5病毒59 能在PK15细胞中表达V5标签蛋白和PCV2衣壳蛋白，进一步验证了PCV2iDNA新型疫苗构建策略是切实可行的，此外PCV1-2m-V5的V5遗传标记，能有效的区分疫苗毒与野毒，疫苗抗体与野毒抗体，为此后PCV2的iDNA疫苗研发提供了素材和参考，是作为PCV2iDNA疫苗的良好候选疫苗。6结论（1）试验应用基因工程技术以及圆环病毒反向遗传操作技术，将V5标记序列引入到PCV2ORF2的末端进行融合表达，成功构建了PCV1-2m-V5嵌合病毒的pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒，经小鼠体内拯救获得了PCV1-2m-V5拯救病毒株。（2）与PCV2GZ-RH1株一样，PCV1-2m-V5拯救病毒株也可感染PK15细胞，并在感染细胞内实现病毒的增殖，能产生携带有V5标签的Cap蛋白，该Cap-V5蛋白既能与PCV2阳性血清，也能与V5单克隆抗体发生血清学反应。据此，可以建立相关鉴别ELISA方法，实现对PCV1-2m-V5嵌合病毒免疫抗体与PCV2自然毒株感染抗体进行区分。（3）应用F2/R2引物，通过PCR方法，能够有效地将PCV1-2m-V5嵌合病毒与PCV2自然毒株相区别。60 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致谢值此论文完成之际，首先向尊敬的导师曾智勇教授表示衷心的感谢和诚挚的敬意！三年来，曾老师不厌其烦地对我的缺点进行提醒和劝诫，不断地给我输送正确的人生观和价值观，曾老师的教诲如同春风化雨，砥砺着我前进。曾老师是一个充满正能量的人，他的务实、努力、严谨、惜时如金的工作态度为我们树立了良好的榜样。曾老师在论文选题、课题设计、实验实施、文章发表以及论文撰写等诸多方面都给我提供了巨大的帮助，在此，我再次向曾老师表示深深地感谢！同时，我也要衷心感谢汤德元教授这三年来对我的谆谆教诲和无私帮助，感谢黄涛老师、王彬老师在实验上对我的指导。学习期间，得到了周碧君教授、王开功教授、文明教授、程振涛副教授、温贵兰副教授给予的大力支持和帮助，在此向各位老师表示衷心的感谢。同时对在百忙之中抽出时间评阅本论文的专家表示诚挚的感谢。感谢室友冯文武、李达、李俊的帮助，衷心感谢我的师兄王伟丞、刘钊，师姐王洪光给予的帮助，感谢韦冠东、徐国、叶百川、龙冬梅、胡琳琳、张爱琼、咸文、何小丽等同学的帮助，使我的试验得以更好的完成，感谢女朋友陈静的陪伴，使我的生活更加充实愉快。谨以此文献给我的家人，特别感谢家人给我的无私关怀和支持！借此机会，向我的父母表示最深情的谢意，最后，再次对关心、帮助我的老师和同学表示衷心的感谢！代振江2017年6月于贵州大学74 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：日期：年6月关于学位论文使用授权的声明本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：导师签名：日期：月75