新疆尉犁县哨兵动物感染蓝舌病及其病原的分离与鉴定

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cheng称 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研巧成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研巧成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：弓长不时间：年月＞０曰关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，良Ｐ：新疆农业大学有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电＾子文档，１＾采用彰印可、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被誉阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部１）分内容编入有关数据库进仔检索，可＾公布（包括刊登论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名时间八年６＾月円导师签名：时间：年６月日 公益性行业（农业）科研专项“重要牛羊虫媒病毒病防控关键技术研究与应用”的部分研究成果（项目编号：201303035）课题主持人：钟旗（新疆畜牧科学学院兽医研究所 新疆尉犁县哨兵动物诱发感染蓝舌病及其病原的分离与鉴定摘要蓝舌病（Bluetongue，BT）是由蓝舌病病毒（Bluetonguevirus，BTV）引起的非接触性的经媒介昆虫库蠓（Culicoides）传播感染绵羊、山羊和牛等多种家养和野生反刍动物的疾病。该病毒属于呼肠孤病毒科环状病毒属，目前已有27个血清型。该病的感染与传播受到库蠓活动的影响。BT以发热、口腔黏膜及舌头充血、糜烂，严重时舌头发绀为特征性临床症状，并能引起妊娠母畜流产、死胎等，对养殖业造成重大损失。本实验根据新疆蓝舌病流行病学调查的历史资料及近几年的BTV血清学调查结果和媒介昆虫库蠓的生活习性，选择新疆尉犁县作为监控点，并放置哨兵动物绵羊5只、山羊5只和牛10头。从2014年5月25日，每周定期采取血样，共采样21次，采集血清和肝素钠抗凝血各420份。采用BTV竞争性ELISA方法检测哨兵动物血清，对BT感染情况进行血清学检测；采集蓝舌病抗体由阴转阳的哨兵动物血液样品接种BHK-21进行BTV病毒分离；对分离时出现细胞病变（CPE）的样品，采用BTV抗原捕获ELISA、BTV群特异性片段VP7的RT-PCR扩增及透射电镜形态学观察，对CPE样品进行BTV血清群的鉴定。再采用BTV型特异性片段VP2的RT-PCR扩增、1~24型的血清及病毒中和实验，鉴定BTV分离毒株的血清型。结果显示：BTV竞争性ELISA方法共检出8只哨兵动物血清转阳，其中绵羊转阳率15%（3/20），转阳时间为6月~7月；山羊转阳率25%（5/20），转阳时间为9月~10月，牛未发生转阳。根据转阳时间可看出绵羊的易感早于山羊。转阳哨兵动物抗凝血接种BHK-21细胞，有7份血样出现CPE，主要表现为细胞皱缩、变圆、团聚现象，随后开始脱落，间隙加大，形成空斑。分离株经BTV抗原捕获ELISA检测均为阳性；阳性分离毒株电镜下观察呈现典型BTV形态特征：中心的病毒颗粒与核衣壳分界明显，并被病毒表面的绒毛层包围，大小约70~80nm；分离毒株TCID50在10-3.33/0.1mL~10-5/0.1mL之间；BTV群特异性片段VP7基因扩增、测序比对、遗传进化分析与BTV序列的同源性最高为80%~82%。经以上鉴定7株分离毒株均为蓝舌病病毒。病毒中和试验结果表明本次分离毒株及相应血清与现有BTV1~24型均无中和保护能力，每孔均发生CPE；型特异性片段VP2测序结果NCBI比对显示与现有的BTV血清型毒株同源性从64%到70%不等，与其他病毒无同源性。由此可得7株分离毒株属于BTV血清群，但不属于现有的BTV血清型。结果表明：本试验首次从新疆分离到了非BTV1~24型的BTV新毒株，暂定名为XJ/1/2014~XJ/7/2014。初步判定其为BTV的变异株，具体血清型鉴定尚需进一步研究确定。关键词：蓝舌病；病毒；分离；鉴定I TheIsolationandIdentificationofBluetongueVirusInducedbytheSentinelAnimalsinYuliCountyofXinjiangAbstractBluetonguedisease(BT)isanon-contagious,insect-borne,viraldiseaseofruminants,mainlysheepandlessfrequentlycattle,goats,buffalo,deer,andwildanimals.Itiscausedbythebluetonguevirus(BTV)whichistransmittedbythemidgeCulicoidesimicola,Culicoidesvariipennis,andotherculicoids.BTVisprototypemembersoftheOrbivirusgenusinReoviridaefamily,inwhich27distinctserotypesbluetonguevirus(BTV)havebeenrecognized.Themajorsignsarehighfever,excessivesalivation,swellingofthefaceandtongueandcyanosisofthetongue,aswellasoralinflammationedema,anddentalulceraccompanied.OftenlyBTcausespregnantruminantanimalswithabortions,stillbirth,especially,insheepBTVcausesanacutediseasewithhighmorbidityandmortality,henceresultinginthebiglossesinanimalproduction.ThisexperimentaccordingtotheXinjiangbluetongueepidemiologicalinvestigationofhistoricaldataandthelifeofinsectvectorslibrarymidge,Yulicountywerechoosenasmonitorypoint,andfivesheep,fivegoatsandtencowswereplacedasthesentinelanimals.Bloodsamplesweretakenregularlyeveryweek.FromMay25,2014,therewere21timesintotal,420partsserumandheparinanticoagulantwerecollected.UsingtheBTVcompetetiveELISAtodetecttheserumofsentinelanimals,testingtheBTinfectionserological.TheserumofsentianelanimalswithnegativeturnpositivebluetongueantibodywereinoculatedBHK-21andconductedbluetonguevirusisolation.Thesampleswithcellpathologyweredetectedbyantigen-captureELISA,RT-PCRamplification,performedelectronmicroscopymorphology,samplesoftheCPEwereidentifiedbyBTVserogroup.ThenusingBTVVP2fragmentRT-PCRamplification,1~24typeofserumneutralizationtestandvirusneutralizationtesttoidentifytheserumtypeoftheBTVisolatedstrains.Resultsshowedthat8sentianelanimalsserumweredetectedtopositivebythemethodofcompetitiveELISA,amongthemtheturnedpositiverateofsheepwere15%(3/20),goatwere25%(5/20),theturnedpositivetimeofsheepwerefromJunetoJuly,thegoatwerefromSeptembertoOctober,thecowsdidnotoccur.Accordingtothetimeoftheturnedpositivecouldbeseenthatthesusceptibilityofsheepwereearlierthanthegoat.TheanticoagulantofturnedpositiveinculatedBHK-21cells,7bloodsamplesappearedcytopathiceffect(CPE).Thecytopathiceffectmainlymanifestiedcellshrinkage,cellturntoroundandcellagglomeration,afterthepathologicalchanges,thecellwouldbegantofallandthegapincreased,eventuallyformplaques.TheisolatedstrainswerepositivebyantigencaptureELISAtest.ThemorphologicalcharacteristicsoftypicalBTVobservedbyelectronmicroscopevirus:therewereclearboundariesbetweenparticlescentervirusandthenucleocapsid,thestrainsweresurroundedbyflufflayersurfaceofthevirus,thesizewere70~80nm;7strainsofbluetonguevirusisolatedstrainTCD-3.33-550between10/0.1mL~10/0.1mL;ThehighesthomologyofspecificfragmentVP7comparedwithbluetonguevirussequenceswere80%~82%bygeneamplification,sequencingalignmentgeneticevolutionanalysis.Bytheaboveidentificationthe7isolatedstrainswerebelongtobluetonguevirus.VirusneutralizationtestresultsshowedthatexistingBTV1~24typet,theisolatedstrainsandcorrespondingserumhadnoneutralizationprotectability,everyholeoccurredcellpathology;sequecingresultsoftypespecificfragmentVP2showedthatthehomologybetweentheexistingBTVandtheisolatedstrainswerenotII highfrom64%~70%.Thus,the7isolatedstrainswerebelongtoBTVserumgroup,butnotbelongtothepresentBTVserumtype.Results:ThisexperimentfirstisolatednonBTV1~24typeofnewBTVstrainsfromXinjiang,provisionalnamedXJ/1/2014~XJ/7/2014strains.PreliminarydeterminedasnewBTVserotype,butthespecificserotypeidentificationrequiresfurtherstudytodetermine.Keywords：Bluetongue;Virus;Isolation;IdentificationIII 目录第1章绪论.......................................................................................................11.1蓝舌病流行情况概述.............................................................................................11.1.3BTV的传播.................................................................................................31.2病原学......................................................................................................................51.3病毒的结构..............................................................................................................51.3.1病毒结构蛋白..............................................................................................61.3.2非结构蛋白NS1、NS2、NS3、NS3A和NS4......................................81.4BTV的致病机理与临床症状...............................................................................81.4.1BTV致病机理.............................................................................................81.4.2临床症状....................................................................................................101.5BTV的检测方法..................................................................................................111.5.1琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）........................................................111.5.2竞争性ELISA............................................................................................111.5.3抗原捕获ELISA.......................................................................................121.5.4微量血清中和实验...................................................................................121.5.5反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）...................................................121.6疫苗的研究............................................................................................................131.6.1弱毒疫苗................................................................................................131.6.2灭活疫苗....................................................................................................141.6.3病毒样颗粒（VLPs）..............................................................................141.6.4重组疫苗....................................................................................................151.6.5反向遗传改造蓝舌病疫苗.......................................................................151.7防控措施................................................................................................................161.8小结........................................................................................................................16第2章新疆尉犁县监哨兵动物血清学检测..............................................172.1监控群的建立.......................................................................................................172.2血清学检测............................................................................................................172.2.1实验材料....................................................................................................172.2.2检测血清的准备........................................................................................182.2.3实验方法....................................................................................................182.3结果........................................................................................................................192.4讨论........................................................................................................................20第3章新疆尉犁县哨兵动物BT病毒的分离.............................................223.1实验材料................................................................................................................223.1.1细胞.............................................................................................................223.1.2实验试剂....................................................................................................223.1.3主要的仪器及耗材...................................................................................223.2实验方法................................................................................................................233.2.1接种样品的准备........................................................................................233.2.2BHK-21细胞培养.....................................................................................23IV 3.2.3细胞接毒....................................................................................................253.2.4分离物的保存............................................................................................253.3结果........................................................................................................................253.4讨论........................................................................................................................27第4章新疆尉犁县哨兵动物BT分离毒株的鉴定..................................284.1实验材料................................................................................................................284.1.1主要试剂....................................................................................................284.1.2仪器及耗材................................................................................................284.2实验方法................................................................................................................294.2.1BTV抗原捕获ELISA检测....................................................................294.2.2BTVVP7片段RT-PCR扩增...................................................................304.2.3BTVVP2片段RT-PCR扩增...................................................................324.2.4病毒形态学观察........................................................................................354.2.5病毒TCID50测定......................................................................................354.2.6血清中和实验............................................................................................364.2.7病毒中和实验............................................................................................384.3结果........................................................................................................................394.3.1BTV抗原捕获ELISA实验结果...........................................................394.3.2TotalRNA提取结果.................................................................................404.3.3BTVVP7片段扩增结果..........................................................................404.3.4BTVVP2片段RT-PCR扩增...................................................................424.3.5病毒形态学观察结果...............................................................................474.3.6病毒TCID50测定结果..............................................................................474.3.7血清中和实验结果...................................................................................484.3.8病毒中和实验结果...................................................................................494.4讨论........................................................................................................................50第5章结论.....................................................................................................52参考文献..............................................................................................................53致谢......................................................................................................................60作者简历..............................................................................................................61V 英文缩略词表缩写英文名称中文名称BTVBluetonguevirus蓝舌病病毒BTBluetongue蓝舌病C.sppCulicoides.spp库蠓OIEWorldOrgnizationforAnimalHealth世界动物卫生组织XJXinjiang新疆EHDVEpizootichaemorrhagicdiseasevirusofdeer鹿流行性出血热病毒AHSVAfricanhorsesicknessvirus非洲马瘟病毒BHK21Babyhamsterkidney21幼仓鼠肾细胞dNTPDeoxynucleosidetriphosphate三磷酸脱氧核苷PCRPolymerasechainreaction多聚酶链式反应RT-PCRReversetranscriptionpolymerasechain反转录聚合酶链式反应MEMModifiedEagleMedium基础培养基dsRNADouble-strandedRNA双链核苷酸ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附实验PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸缓冲盐溶液CPECytopathiceffect细胞病变效应ODOpticaldensity吸光度TMB3，3'，5，5'-Tetramethylbenzidine3，3'，5，5'-四甲基联苯胺DMSODimethylsulpoxide二甲基亚砜r/minRotationperminewute每分钟转数FBSFetalbovineserum胎牛血清TCID5050%Tissuecultureinfectivedose半数组织培养感染量DEPCDiethypyrocarbonate焦炭酸二乙酯VI 新疆农业大学硕士学位论文第1章绪论蓝舌病（Bluetongue，BT）是由呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus）的蓝舌病病毒（Bluetonguevirus，BTV）引起的经媒介昆虫如库蠓、伊蚊等传播的非接触性病毒性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将BT规为多种动物共患疾病，为上报疾病[1]。该病主要侵害绵羊，并可以感染牛及其他多种反刍动物且呈现隐性经过感染。该病的临床表现以面部充血和出血、发炎和水肿为主要特征的发热反应，同时伴有粘膜溃疡。妊娠动物感染后可以经过胎盘垂直传染至胎儿，引起流产、死胎等。BT通过库蠓等吸血昆虫叮咬带病毒血症的动物血液感染病毒并在易感动物之间传播BTV，感染病毒的库蠓终身带毒。库蠓作为该病的传播媒介影响BT的流行，因此BT在许多地区呈季节性流行。随着全球气候变暖的加速和国际旅游贸易交流的增加，BT分布范围也在逐渐扩大。1.1蓝舌病流行情况概述BT是经媒介昆虫叮咬传播的非接触性虫媒病毒病，该病主要侵害绵羊，其他反刍动物如牛感染后多呈隐性经过。主要的临床以面部充血和出血、发炎和水肿为主要特征的发热反应，同时伴有粘膜溃疡，母羊流产、畸形、短毛等。库蠓作为该病的传播媒介影响BT的流行，因此BT在许多地区呈季节性流行。1.1.1国外流行情况蓝舌病第一次发现是在19世纪的南非[2]。20世纪初，随着国际进出口贸易的快速发展，BT在非洲地区广泛传播。随后又在美洲、澳洲、亚洲等地区内传播[3]。在20世纪90年代以前，BT仅短暂的在欧洲的南部地区（希腊和塞浦路斯、葡萄牙、西班牙）发生。而在此以后，在欧洲地区至少有6种不同的BTV血清型（BTV-1、2、4、8、9、16）毒株爆发，其中囊括多数北欧的国家[4-5]。进入21世纪后随着全球气候的改变，扩大了蓝舌病的分布范围。目前27种蓝舌病血清型在首发地南非就有22种被发现[6]。在2006年8月，BT在荷兰爆发，随后在德国、法国和比利时等1 新疆尉犁县哨兵动物诱发感染蓝舌病及其病原的分离与鉴定地也出现蓝舌病病例。经检测证明该蓝舌病为BTV-8型，与欧洲南部的BT所出现的血清型不同，并证明该血清型从非洲传入[7]。2007年后BTV-8型爆发面积继续在欧洲扩张。截止2009年欧洲北部的12个国家累计爆发蓝舌病93531次，其中法国爆发次数最多53747次[7]。2011年至2012年期间又在摩洛哥和希腊出现了蓝舌病病例（见图1-1）。虽然大多数BTV主要感染的是绵羊，而其他的反刍动物也会发生感染但却不出现较为明显的临床症状，但根据报道感染BTV-8型的动物除绵羊，感染的牛也产生了一些较明显的临床症状及较低死亡率，该型蓝舌病也被广泛关注[8]。注：汇总从1964年至2014年11月的蓝舌病病例（黄色点），阴影代表BTV发生早期带。图1-1疫情在全球的分布（截止至2014年）[95]Fig.1-1Distributionofbluetongueinglobe(until2014)1.1.2国内流行情况我国自1979年在云南省的师宗县首次检测出BT后[9]，1994~1997年相继在湖北、安徽、四川、山西等29个省均检出BTV血清阳性畜。到1997年，已经有8个血清型（BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16）在我国被发现并分离出毒株[10-12]。其中BTV-1和BTV-16在国内是主要的致病血清型。在2012年至2014年期间，又在云南省（师宗、德宏）检测并分离到BTV-5和BTV-24；在广东（汕头）检测并分离到BTV-7[96]。自欧洲爆发BTV-8型后，其现2 新疆农业大学硕士学位论文在也成为我国重点检测的外来疫病。在2015年，首次报道广西应用血清中和实验发现了其境内有BTV-5、BTV-19和BTV-20的感染[13]（见图1-2）。新疆牛羊BT血清阳性畜首先于1988年8月由自治区兽医检疫总站在克孜勒苏州从辽宁盖县调出的绒山羊中查出，同年农九师（塔城地区）调往湖北襄樊的绵羊中查出血清学阳性羊。1988~1989年首次对BT进行普查，在普查中采用琼脂扩散法对全疆的84个县（市）的160671头（只）的绵羊、山羊、牛和鹿等进行了血清学检测，平均阳性率为2.52%。普查的结果揭示了BT血清阳性畜在新疆广泛存在。1990年，新疆兽医检疫总站在山羊中分离获得一株蓝舌病病毒，并由自治区科委主持通过专家鉴定，从而确诊我区存在BT[81]。新疆畜牧科学院兽医研究所于2012年再次对疆内的8个地州的8个县市进行蓝舌病调查，羊的阳性率最高为3.33%[82]。BTV-17BTV-1BTV-1BTV-16BTV-1、16BTV-1、2、3、4、5、9、12、15、16、24BTV-2、4、5、7、12、16注：红点为已报道成功分离病原，但血清型未定图1-2蓝舌病血清型在国内的分布情况Fig.1-2DistributionofbluetongueserumtypeinChina1.1.3BTV的传播3 新疆尉犁县哨兵动物诱发感染蓝舌病及其病原的分离与鉴定蓝舌病是由经媒介昆虫吸食病毒血毒症的动物血液后携带病毒，再在易感动物（如：羊、牛及骆驼等反刍动物）中进行叮咬传播BTV。感染的库蠓终身带毒。该病在热带和亚热带地区属于地方性疾病，主要分布的区域从北纬40°到南纬35°之间，在北美和中国的某些地区，已研究证明在北纬50°也检测到BTV[14]。而它的分布传播与媒介昆虫的活动区域有很大关系，其媒介昆虫主要为库蠓（Culicoidesspp.）。非洲马瘟病毒（Africanhorsesicknessvirus，AHSV）、鹿流行性出血热病毒（EHDV）和蓝舌病病毒（BTV）是由库蠓为媒介传播的三种环状病毒[15]。现知库蠓的种类有1247种，其中有17种可传播动物虫媒病病毒。我国有库蠓305种，可传播动物虫媒病毒病的有9种[16]。我国对Culicoidesspp.的调查发现我国境内的C.actoni是BT公认的BTV传播媒介[83]，疆内的调查显示，在BT疫病区采集捕获的C.pesudosalinarius和C.Reduncutheca所出现的高峰期与易感动物BT阴转阳性的高峰重合[84]。近来BTV有持续向北扩张的趋势，雨量大、高湿高温都对库蠓的孳生有利，这种情况的出现可能是因为全球气候变暖的原因所致[17]。同时，随着人们逐渐加深对该病的研究，SimonCarpenter、AnthonyWilson等发现在11.4℃~13.3℃时仍能从媒介昆虫库蠓的体内分离到蓝舌病，并且在10月底仍能获得雌性库蠓活动的信息[18-19]。图1-3BTV媒介昆虫库蠓Fig.1-3Blood-feedingGulicodiesmidges4 新疆农业大学硕士学位论文1.2病原学BTV是呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus）蓝舌病病毒亚群（Bluetonguevirussub-group）的成员，现共有27个血清型，其中BTV-25（2008年，瑞士）和BTV-26（2011年，科威特）是从山羊的体内检测分离到的新血清型[20-21]。BTV-27（2014年，法国）VP2基因序列分析与BTV-25（73%nucleotides[nt]，75%aminoacids[aa]）和BTV-26（65%nt，60%aa）有紧密联系[22]。BTV对热敏感，60℃持续加热30min后就可将其灭活，而在75℃~95℃时即可将其快速灭活。同时BTV的酸性抵抗力较弱，pH3时就能将其灭活。对乙醚和氯仿等有一定的抵抗能力，对胰酶敏感。BTV可在4℃和-70℃长期保存，-20℃中长期放置毒价下降较快[23]。在干燥的血液及血清和腐败的肉内BTV可长久存活并保持感染力。BTV也可在10~11日龄的鸡胚的肝脏、Vero细胞、BHK细胞中生长繁殖，其中鸡胚传代毒价会下降，但免疫原性不变。1.3病毒的结构完整的BTV病毒粒子呈二十面体对称，基因组由10个dsRNA构成（见表1-1），可看到典型的3-3-3-1聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）带形，编码7种结构蛋白（VP1~VP7）和4种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3/3A和NS4）。BTV是双层衣壳，最外层是由两个结构蛋白所构成，分别为VP2蛋白三聚体和VP5蛋白三聚体。核心由VP7组成的中间层衣壳和VP3组成的亚核心颗粒与VP1（RNA依赖性RNA聚合酶）、VP4（RNA加帽酶）、VP6（双链RNA解旋酶）三种次要结构蛋白构成。有研究表明编码VP6的S9片段上含有一个小的ORF编码NS4[24]。S10含2个开放阅读框（ORF），可编码NS3/NS3A。BTV的27个血清型的抗原能力取决于VP2。VP7是在分离BTV时能保存完整的基因序列，它是最丰富的结构蛋白，还是能产生免疫应答的主要蛋白[25]。5 新疆尉犁县哨兵动物诱发感染蓝舌病及其病原的分离与鉴定表1-1BTV节段及其编码的蛋白Table1-1BTVdsRNAsegmentsandthefuctionofencodingproteinsGenomeNo.ofbpProteinNO.ofaaPredictedsizeFunctionsegmentL13945VP11302149588RNA聚合酶/转录酶L22926VP2956111112粘附结构L32772VP3901103344结构M42011VP465476433RNA加帽酶M51639VP552659163血凝素作用M61770NS155264445病毒体运输S71156VP734938548结构S81123NS235740999mRNA绑定VP632835750S92046RNA解旋酶NS47712000NS322925572S10822病毒子的释放NS3A216240201.3.1病毒结构蛋白1.3.1.1外衣壳蛋白VP2、VP5VP2是由L2基因进行编码，是BTV的型特异性抗原，主要决定BTV的血清型，能引起血凝，并能诱导感染机体产生中和抗体，同时与病毒的毒力和吸附细胞的能力有关。BTVVP2与红细胞表面的唾液酸血型糖蛋白A有很强的亲和作用，可促使BTV与血细胞相结合[26]。此外，BTV缺失VP2后不具有感染细胞的能力。VP2在感染的细胞内与波形蛋白结合，而用药物抑制剂阻断两者的结合就可抑制BTV在感染细胞内的出芽[27]，VP2蛋白上至少有2个可插入十二个氨基酸短肽的位点[28]。用BTVVP2蛋白免疫绵羊后可使接种绵羊抵抗同一种血清型的强毒攻击[29]。对比来自26个血清型的BTV毒株，发现VP2序列存在从29%（BTV-8和BTV-18）~59%（BTV-16和BTV-22）的差距[26]。而同血清型的不同地域的不同毒株的VP2蛋白序列的核苷酸差异可高达30%[30]。这说明BTV的同血清型有一定地域性。引物扩增Seg-2，可用来确定BTV的血清型、疫苗株和地域分布等[31]。VP5是除VP2外的另一个BTV型特异性抗原，由M5基因编码，是BT病毒仅6 新疆农业大学硕士学位论文有的糖基化蛋白。VP5存在于BTV的颗粒表面，形成球状结构区域，可一定程度反映病毒的地域来源[32]。相关研究表明，VP5属于镶嵌式蛋白，可介导病毒核心部分从内体小泡中释放进入受体的细胞质中[33]。同其他病毒相比，BTVVP5蛋白不需要通过蛋白的水解作用就可发挥其活性。VP5在VP2免疫中和反应中起到增强作用[34]。因此，在研制以及检测BT疫苗时，VP2和VP5蛋白的表达量都需要检测，这对于BTV疫苗效力的研究有重大意义。1.3.1.2内衣壳蛋白VP3和VP7VP3与VP7分别由L3和S7基因编码，均含有BTV的群特异性抗原决定簇。两者均是保守性蛋白，而且具有疏水性。重点是核心蛋白对哺乳动物的细胞感染率几乎为零，而对库蠓细胞的感染率较哺乳动物细胞高出100倍[35-36]。VP3与内部的VP1、VP4、VP6及dsRNA紧密相连，在病毒内层结构完整性的维持起到了重要作用。BTV毒力与VP3无关[37]。在VP2蛋白或VP5蛋白缺少时，VP7蛋白可介导病毒颗粒与媒介昆虫的细胞进行结合及渗透[35]。在BTV的蛋白中，T细胞抗原决定簇主要由VP7、NS1和VP2构成，但仅仅VP7蛋白构成T细胞CD8+的抗原决定簇，而它隐藏在BTV血清型中[38]。BTV的26种不同血清型中VP7氨基酸残基的同源性高达至98%，因此目前所用的许多商品化的BTV血清学检测方法均以VP7蛋白或是其单克隆抗体（MAb）为基础进行检测，故VP7也是成为了研究的热点[39-40]。1.3.1.3核芯蛋白VP1、VP4、VP6VP1蛋白在病毒颗粒内部的摩尔浓度较低。VP1由L1基因编码，具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，并对Mg2+具有依赖性。其作用以Oligo（A）为引物来扩增RNA链，对病毒的复制也起到重要作用。VP1蛋白在27℃~37℃时，在哺乳动物细胞和昆虫细胞内其活性较高[26]。VP4是合成mRNA时的加帽酶。因BTV早期的mRNA不具备生物活性，必需进一步修饰，才更稳定、更有效地翻译。而参加这一过程的4种酶都有VP4蛋白的参与催化，VP4蛋白主要起到了支架作用。7 新疆尉犁县哨兵动物诱发感染蓝舌病及其病原的分离与鉴定VP6蛋白由S9基因（1046bp）编码，是最小的核蛋白，具有与ATP和Mg2+结合活性，通过依赖RNAATP酶活性和解旋功能，能有效解开BTV的双链结构并对mRNA的合成起到辅助作用[41]。在VP6蛋白上可以识别到ATP酶活性、RNA和ATP结合、RNA解旋区域。VP6的高亲水性与拥有的残基，使其均可结合单链和双链RNA。1.3.2非结构蛋白NS1、NS2、NS3、NS3A和NS4NS1由M6（1156bp）基因编码，349个氨基酸组成，在感染的细胞中含量最高。病毒感染细胞时，可观察到大量由病毒特异性小管构成的多聚体NS1蛋白[26]。实验证明，NS1蛋白在合成病毒蛋白的过程中起正调节作用[42]。NS2由S8（1123bp）基因编码，357个氨基酸组成。BTV感染细胞后新合成的蛋白以包含体（VIBs）的形式脱离mRNA，称前病毒粒子。该粒子在聚集在dsRNA合成的部位进行加工后形成完整的BTV病毒粒子，随后释放到细胞外。NS2蛋白是VIBs的主要成分，它在感染后的细胞中被大量合成，并与核蛋白合成转录子。NS2与单链RNA结合后可使三磷酸核苷酸水解成单磷酸核苷酸[43]。由此可看出NS2蛋白在病毒复制的过程重要性。NS3和NS3A由S10（822bp）基因编码，分别229个氨基酸和216个氨基酸。它们在昆虫体内的表达量很高，但在哺乳动物体内几乎检测不到，再联想到BTV的传播方式可看出，这两种蛋白对BTV在昆虫细胞中的传播关系紧密。NS3/NS3A是BTV编码的唯一的膜蛋白。在BTV复制过程中，在NS3/NS3A的作用下，部分新合成的病毒颗粒从细胞中释放出来并重新感染细胞。S9基因除了编码结构蛋白VP6外，在其基因的开放阅读框中还编码一种非结构蛋白NS4[44]。在BTV早期被感染的细胞核中，NS4的主要作用是对BTV的某些血清型可起到抵抗宿主的抗毒反应[45]。1.4BTV的致病机理与临床症状1.4.1BTV致病机理8 新疆农业大学硕士学位论文蓝舌病依靠媒介昆虫叮咬易感动物进行传播。BTV经雌性库蠓叮咬易感动物后储存在其体表皮肤中。通过树突状细胞传递到局部淋巴结，并在淋巴结中进行首次复制。复制完成后随淋巴液进入到血液中，发生BTV病毒血症，病毒再随血液循环和淋巴循环，至全身组织和器官。BTV还能在淋巴细胞、血管内皮细胞以及单核巨噬细胞内复制[46]。感染后期，BTV内嵌红细胞内膜，所以即使机体此时已经产生抗体，病毒血症仍存在。BTV会引起细胞凋亡和细胞坏死，增加血管的通透性，促进机体产生白细胞介素（Interleukin，IT）和干扰素（Interferon，IFN），还能引起机体炎症从而造成机体损伤，有时也可导致机体水肿。机体所产生的干扰素，引起机体对BTV产生免疫应答，刺激机体产生抗体，这对机体二次感染BTV具有一定的抵抗作用。BTV在感染初期还能引起机体的细胞免疫，可减缓病毒的传播。BTV在细胞胞浆内复制，先通过VP2蛋白介导作用吸附靶细胞上，并在靶细胞膜上形成网格蛋白小窝（Clathrin-coatedpit）包裹病毒[47]，进入到靶细胞内。BTVVP5与内吞膜融合[48]，使病毒脱壳（Virusuncoating），核酸进入到细胞质中。BTV在细胞质中进行复制，10个dsRNA在VP1蛋白（RNA依赖性RNA聚合酶）和VP4（RNA加帽酶）蛋白的作用下，合成mRNA并移出核心粒子。以mRNA为模板翻译合成蛋白质。并在NS2作用下与细胞质中的mRNA形成早期的病毒包涵体（Earlyviralinclusionbodies）。病毒包含体中mRNA组装成亚核（Subcore）,再在VP7蛋白的作用下合成病毒核心颗粒并从包涵体释放到细胞质中。在BTVVP3蛋白的影响下，病毒核心颗粒在高尔基小泡上与BTVVP2和VP5进行病毒粒子的组装形成成熟的病毒颗粒。利用NS3蛋白使病毒以出芽的形式释放到靶细胞外[49-50]。（见图1-4）9 新疆尉犁县哨兵动物诱发感染蓝舌病及其病原的分离与鉴定图1-4BTV宿主细胞内复制过程Fig.1-4BTVreplicationwithinhostcells1.4.2临床症状BTV的临床表现以面部充血和出血、发炎和水肿为主要特征的发热反应，同时伴有粘膜溃疡。妊娠动物感染后可经胎盘垂直传染胎儿，引起母畜流产、死胎等。相对于绵羊尤其是经过改良的欧洲细毛羊（Europeanfinewool）和无角陶赛特羊，多数的易感动物感染BTV后一般呈隐性进过，无明显的临床症状[51]。但欧洲所爆发BTV-8时对牛和山羊有临床症状的记载。牛记录的临床症状包括眼分泌物曾多，眼结膜炎，口腔粘膜充血并向溃疡发展和嘴唇坏死性病变以及舌水肿[52]，而山羊证明在牛奶产量急性下降，嘴唇和头部水肿，流涕和皮肤和乳房出现红斑[53]。图1-5BT临床症状Fig.1-5ClinicalsymptomsofBluetongue10 新疆农业大学硕士学位论文1.5BTV的检测方法BTV的判定，除了典型的临床症状以及病理变化，还需要更加准确和科学的实验室检测方法方能确诊。可进行检测的样品包括采集的肝素钠全血血液、血清，待检动物的淋巴结、脾脏、肝脏等组织样品的研磨液。在BHK-21细胞、Vero细胞、鸡胚和绵羊上可增值分离BTV。BTV的检测包括：血清学检测如酶联免疫吸附试验（ELISA）、琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）、补体结合试验（CFT）、病毒中和实验（VN）、荧光染色试验（FAT）、血凝试验（HA）、血凝抑制试验（HI）过氧化物酶染色法（IPS）、和微量血清中和试验（MTSN）等；分子核酸检测技术如反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、核酸探针技术和生物芯片技术等。在实践生产中较常用的检测方法主要有：AGID、竞争性ELISA、抗原捕获ELISA、MTSN和PCR。1.5.1琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）AGID主要针对BTV群特异性抗体的检测。该方法操作简单，对实验室的要求不高，能快速的检测大量的血清样品。但该实验敏感性不高，无法定量，并有非特异性反应，尤其是在血清中含有其他的环状病毒（如鹿流行性出血热，Epizootichemorrhagicdisease，EHDV）的抗体时结果会出现非特异性无法进行区分[54]。1.5.2竞争性ELISA竞争性ELISA相较于AGID更加敏感，特异性更强，也是OIE指定首选的BTV血清学诊断方法。BTV竞争性ELISA主要以抗NS1蛋白和抗VP7蛋白为单克隆抗体（McAb），与待检血清中的抗体竞争性的结合抗原，从而达到检测的目的。竞争ELISA试剂盒在国外的研究较早，Afshar等在1987年建立该法并在1993年对该试剂盒进行改进[55-56]。在国内则起步较晚，有报道记载是花群义在2002年对该类试剂盒进行研究，并取得较满意的结果[57]；狄宏伟等在2012利用具有阻断效果的单抗与重组纯化的VP7蛋白建立竞争性ELISA[58]，其与国外生产的试剂盒的检测结果11 新疆尉犁县哨兵动物诱发感染蓝舌病及其病原的分离与鉴定相比符合率高达98%以上[80]。近几年，有实验室成功利用多克隆抗体方法建立BTV竞争ELISA方法，结果显示其在抗体检测结果的符合率高于进口试剂盒，并且成本更低[43]，这将对国内蓝舌病的检测效率有一个很大的提升，且已在多个地区用于蓝舌病的普查。因此开发研制可推广应用的测试剂盒，对流行地区的易感家畜及野生动物要做到及时进行检测，才能及时遏制疫病的扩散，减少经济损失。1.5.3抗原捕获ELISA抗原捕获ELISA属于BTV群特异性检测方法，主要针对BTV增值情况进行检测，例如检测BTV在库蠓和BHK-21细胞中的增值情况和验证鸡胚接种后BTV的扩增情况[59-60]。该方法建立的关键在于对抗原的纯化，同而获得高度特异性抗体，病毒颗粒密度可在蔗糖密度梯度占50%~60%，此时病毒含量纯度最好[60]。1.5.4微量血清中和实验微量血清中和实验（MTSN）在实验室检测时较为常用，但完成该实验的时间较长。本检测方法常用于鉴定BTV分离毒株的血清型及检测特异性抗体。由于BTV有27个血清型，各血清型之间存在一定的交叉性反应。影响该法的因素较多，如所用细胞的种类及状态，所接种病毒的滴度、活性和时机等都会影响实验结果。1.5.5反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）已广泛用于检测样品中的BTV并鉴定其血清型，是OIE指定为鉴定BTV病原鉴定的实验之一。目前已根据BTV的多种核苷酸序列设计合成引物，如BTV的VP7、VP2、NS1、VP3等，其中BTVVP7、NS1引物可鉴定BTV血清群，VP2可鉴定BTV血清型。易感动物在感染BTV六个月后仍能在其血液样品中通过RT-PCR的方法检测到BTV的核酸，而此时该血液样品中已不能分离到病毒[61]。另一种被普遍应用的方法为实时荧光定量PCR检测技术，具有更强的特异性，更方便快速。目前该检测技术主要包括分子信标检测技术（2006年）、SYBRGreenI荧光染料检测技术（2004年）和TaqMan探针检测技术（200612 新疆农业大学硕士学位论文年）[62-64]。1.6疫苗的研究目前，蓝舌病疫苗有弱毒疫苗、灭活疫苗、病毒样颗粒和重组疫苗。其中弱毒疫苗因在南非已经使用超过了50年，免疫效果仍然很好[65]。弱毒疫苗和灭活疫苗的机制是对血清型特异性的保护作用，这个过程在B细胞和T细胞的保护免疫过程中外层蛋白VP2起到重要作用。BTV的27个血清型之间无明显的交叉免疫，所以在该病流行区域，人们按照当地的血清型，选择相应的单价或多价疫苗进行免疫接种。同时BTV与鹿流行性出血热病毒（EHDV）有明显的免疫交叉反应。一种理想的BTV疫苗应该能够预防流行地区内所有BTV的血清型，而对于接种动物和妊娠母畜及胎儿不会产生致病作用、无毒力的回升，并且与野毒株不会出现重组，性能较稳定和价格相对低廉。以下介绍BTV疫苗。1.6.1弱毒疫苗弱毒疫苗是最早应对蓝舌病爆发的疫苗，至今在BT的防控上占据重要位置。与其他的疫苗相比弱毒疫苗注射后一年之内都有较好的效果，且成本低[36]。弱毒疫苗多由对BTV野毒株通过连续的传代弱化病毒获得。弱化后的毒株能够刺激动物机体产生强烈的应答。现南非境内BTV就分离出22种血清型，而要控制这些血清型的BTV并非易事。现广泛应用在南非的BTV疫苗由15种血清型组成并通过连续传代弱化后的病毒，其完全免疫接种3~4周后能产生保护力。但是对于一些易感种群弱毒疫苗仍存在安全问题[66]。且有研究指出，BTV减毒活疫苗出现了各种已证实或潜在的不足，包括效价的衰减，其原因有可能与羊的品种不同有关。接种弱毒疫苗后都会出现轻微的临床症状，如怀孕母畜流产，死胎，母畜产奶量和公畜精子质量的下降等。接种山羊会出现抑制淋巴细胞非特异性活化现象。接种动物一般会在接种后10d左右出现抗体。新生的羔羊可通过初乳获得抗体，这时羔羊接种疫苗，就会影响疫苗免疫的效果。研究发现，弱毒疫苗毒株能在传播媒介库蠓等昆虫的体内复制并进行传播，并与野毒株发生重组生成新的毒株，使BTV的防控更加复杂[67]。13 新疆尉犁县哨兵动物诱发感染蓝舌病及其病原的分离与鉴定疫苗的研制离不开与病毒相关的特异性结构蛋白。BTV中的VP2、VP5、VP7等病毒蛋白，由于它们各自结构和功能上的特点，在疫苗的研制中它们表达与否和表达量的多少与疫苗的成功息息相关。1.6.2灭活疫苗相对于BTV的多价弱毒疫苗可能导致的病毒基因重组和毒力的增强，灭活疫苗的安全性更高。因此，人们首选灭活疫苗[68-70]。然而，灭活疫苗的免疫效果不理想，只能诱导免疫动物产生很短暂的免疫中和效应，通常只有几个月。目前人们的做法是通过多次注射，促使被免动物产生高效、长期的免疫效应[71]。2005年以后，欧洲地区的一些国家在欧洲食品安全局的建议下已经使用了灭活疫苗[71]。但是，目前只有针对少数几个血清型的灭活疫苗可用，并且仍然无法区分免疫接种和病毒感染的动物。自2008年欧洲爆发BTV-8后灭活疫苗成为欧盟国家预防蓝舌病的首先疫苗。且欧盟及欧盟成员国对于BTV-8引起重大疫情用灭活疫苗接种防治达成共识。2008年欧洲用于控制BTV-8的两种灭活疫苗为BTVPURALSAP®8（MERIAL）和BOVILIS®BTV-8（Intervet/SP-AH），经研究表明山羊两次注射接种BTVPURALSAP8或BOVILISBTV-8临床保护显著，并能阻止山羊发生病毒血症[72]。1.6.3病毒样颗粒（VLPs）病毒样颗粒（Virus-likeparticles，VLPs）是无病毒基因的空心颗粒，仅含有一个或多个结构的病毒蛋白，无结构蛋白，无法自主复制，与病毒有相同的感染途径，诱导机体产生免疫应答。此类BTV疫苗具DIVA性质，可区分免疫和感染动物。BTV中的外衣壳的VP2和VP5与内衣壳的VP3和VP7可以组装VLPs。有研究表明，VP2蛋白和VP5蛋白联合表达比单一表达VP2蛋白能产生更好的免疫效应。BTV的VP2、VP5、VP3和VP7结构蛋白利用杆状病毒作为载体，转染到昆虫细胞中进行表达，构成杆状病毒重组表达疫苗，类似病毒结构的VLPs。目前有实验室对BTV-8的VLPs的免疫效应进行了测试，其数据表明，BTV-8VLPs作为一个单一的抗原或作为多价疫苗的组成成免疫效果都很好，并且接种VLPs的动物注入BTV-8后没有14 新疆农业大学硕士学位论文临床表现或病毒血症。该实验进一步强调了BTV病毒样颗粒是安全有效的免疫原，对致命病毒侵入的能够提供完整的保护[73]。1.6.4重组疫苗无论是使用弱毒疫苗还是灭活疫苗，目前均没有血清学检测的方法“区分被感染的动物与疫苗接种的动物”（Distinguishinfectedfromvaccinatedanimals，DIVAassays），而重组BTV疫苗的安全性相对更高，并具有DIVA性质，基于以上原因重组载体疫苗一直都是研究重点[74]。早期有实验证明，利用痘病毒衍生载体表达VP2蛋白，在抵抗同血清型的感染有较理想的效果。将联合蛋白VP2和VP5的牛痘病毒重组疫苗注射免疫动物后，能产生足够量的中和抗体，且与直接免疫VP2蛋白所产生的抗体同量，说明两者协同作用可使免疫效应增加[75]。近年来，利用已被弱化的活病毒为载体，连接BTV的主要抗原基因，大大降低了重组后疫苗的潜在风险。这类病毒包括禽痘病毒（如金丝雀痘病毒）、牛痘病毒和羊痘病毒[76]等，特点在于其病毒的复制在细胞核外可消除外源基因在持续感染时插入到宿主细胞DNA的风险。最近有实验用马疱疹病毒1型（EHV-1）作为BTV-8中的VP2和VP5的疫苗递送系统，结果表明，EHV-1表达BTV-8的VP2和VP5能够引发保护免疫应答[77]。近几年重组疫苗成为蓝舌病疫苗的研究热点，从痘病毒到疱疹病毒，成果显著，但相对于实际应用上由于外源基因的低表达量使该类疫苗还有待发展。1.6.5反向遗传改造蓝舌病疫苗利用反向遗传操作技术理论，不需对病毒反复传代弱化，研究出BTV的DISC疫苗（非感染单循环疫苗）和重组减毒疫苗。DISC疫苗是通过使病毒缺失复制基因，不能在细胞中复制，但仍能侵入机体细胞并编码结构蛋白[78]。构建的DISCBTV1/8D1疫苗用BTV-8的VP2和VP5基因替代BTV-1DISC中的相应片段，免疫动物后，用BTV-1或BTV-8对动物攻毒，疫苗所产生的抗体会中和病毒，使免疫动物不会发生病毒血症[79]。重组减毒疫苗是用BTV-1和BTV-8的S2、S6替换BTV-6的相应片段，构建成新的重组减毒疫苗。绵羊接种该疫苗三周后，用BTV-8强毒进15 新疆尉犁县哨兵动物诱发感染蓝舌病及其病原的分离与鉴定行攻毒几乎不出现临床症状。1.7防控措施对BT的防控主要包括疫情的预防、监控、诊断和控制等方面。在疫情控制方面中还包括隔离区的划定、患病动物的扑杀以及疫情源头追溯和后期情况处理。这些防控措施中较关键的为免疫和检测[7,85]。通过放置阴性的哨兵动物，建立监控动物群对更早的发现疫情及其流行趋势都有重要意义[86]。而在疫区需尽早的确定区内所流行的BT血清型，方可用对应的型的疫苗对未感染的易感动物进行免疫防止疫情的扩张[87]。在疫区还可对区内的阳性畜和患病畜进行扑杀和无公害化处理，并限制与非疫区的动物及其畜产品的流动；同时也要针对媒介昆虫采取措施，如使用杀虫剂灭虫，中断媒介途径可防止疫病的传播。作为OIE的多种共患病及上报疾病，在BT疫情发生后，必须在立即向相关部门上报，方可对各个地区建立数据监测与统计研究提供依据[88]。1.8小结随着BT的分布范围的扩大和新疫情的不断出现，BTV的研究也在不断的加深。作为OIE的多种共患病及上报疾病，BT受到国际动物疫病研究人员及我国出入境检验部门和药品监督部门等高度重视。因受到全球气候改变的影响，蓝舌病的分布范围逐渐扩大，并且不断有新的血清型出现，目前BTV已报道存在27个血清型，且型与型之间无明显的交叉保护，加大了BT防控的难度。因此，不同地区根据BTV流行型研制不同型疫苗，若无法接种型特异性疫苗，就无法起到疫苗接种的保护作用。BTV主要侵袭牛、羊等多种反刍动物，除绵羊外，其他反刍动物多为隐性感染。近年BTV-8在欧洲的流行,感染牛出现明显的临床症状。针对BT开发研制可推广应用的测试剂盒，对流行地区的易感家畜及野生动物要做到及时检测，明确蓝舌病的流行与分布情况；鉴定流行地区BTV血清型，研制特异性疫苗，接种牛羊才能及时遏制BT的扩散。16 新疆农业大学硕士学位论文第2章新疆尉犁县监哨兵动物血清学检测蓝舌病（Bluetongue，BT）是一种经媒介昆虫如库蠓、伊蚊等传播的非接触性病毒性传染病。该病主要侵害绵羊，并可感染牛和其他多种反刍动物且呈现隐性感染。该病在热带和亚热带地区是地方性疾病，大致的分布区域在北纬40°和南纬35°之间，在北美和中国的某些地区，已研究证明在北纬50°也检测到BTV，而它的分布传播与媒介昆虫的活动区域有很大关系。2.1监控群的建立根据新疆1988~1989年及2012年的蓝舌病流行病学调查资料确定新疆存在蓝舌病并主要分布在南疆地区，再根据媒介昆虫库蠓主要生活在河流较多的低洼地区的习性，故选择巴州尉犁县作为监控点，并于2014年5月4号在和静县阿拉沟乡筛选哨兵动物绵羊5只、山羊5只和牛10头，并放置与监控点中，建立哨兵动物群。正式血样采集从2014年5月25日开始，每周定期采集一次，分别用普通采血管和肝素钠抗凝采血管采集动物血样进行BT监测。2.2血清学检测2.2.1实验材料2.2.1.1血清待检血清来自每周固定采集尉犁县监控动物群。2.2.1.2主要试剂BTV竞争ELISA试剂盒由云南省亚热带动物病毒病重点实验室提供；PBST。2.2.1.3主要仪器落地式低温高速离心机CF16RXHITACHI超净工作台SW-CJ-IF苏州安泰空气技术有限公司冰箱BCD-452WDPF青岛海尔股份有限公司17 新疆尉犁县哨兵动物诱发感染蓝舌病及其病原的分离与鉴定酶标仪iMark168-1130BIO-RAD水浴锅DK-S26型上海森信实验仪器有限公司2.2.2检测血清的准备将普通采血管的血样3500r/min，4℃离心10min，吸出上层血清于2mLEppendorf中备用。2.2.3实验方法（1）取出在4℃保存的ELISA抗原固定板（试剂盒中提供），做好标记，每孔10μL加入待检样品血清对应2孔，强阳性对照血清、弱阳性对照血清、阴性对照血清均2孔和PBST抗原对照4孔。（2）按照每孔加入10μL，分别将样品、对照、PBST（空白对照）加到相应的孔内。（3）用PBSTM（或抗体稀释液）按1:100稀释配制兔抗BTV血清竞争液。（4）用移液排枪50μL/孔加入配制好的竞争液到ELISA板中，轻微震荡。（5）放入温箱中，37℃孵育1h，有条件可进行震荡孵育。（6）1h后取出ELISA板，甩掉板内液体，此步不用洗版。（7）用PBSTM（或抗体稀释液）按1:1000配制绵羊抗兔酶标二抗，每孔加入50μL。（8）将ELISA板放入温箱中，37℃反应30min。（9）取出ELISA板，甩掉板内液体，用PBST洗板5次，拍干。（10）将TMB显色液按照每孔50μL加入到ELISA板中，室温避光显色10min。（11）每孔加入50μL的1.24N硫酸终止液终止反应，使用酶标仪在450nm处读取OD值，计算抑制率，抑制率（presentinhabitation，PI）=（样品OD450nm-抗原对照OD450nm）/抗原对照平均OD450nm。（12）结果判定：如果结果数据符合以下标准，则数据可靠；如果数据不符合，则可能会影响样品的检测准确性，建议重做；阴性对照OD450nm不小于0.6，不大18 新疆农业大学硕士学位论文于1.8最好在0.9以上；强阳性对照PI大于80％；弱阳性对照PI在50％~80％之间。（13）判定标准1）空白对照：OD450nm不小于0.9最好在1.2左右。2）阴性对照：PI<30%。3）阳性对照：PI>85%以上。4）弱阳性对照：40%