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《血浆miR-146a在糖尿病性视网膜病变不同分期的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，，除了论文中特别加｜＾＾示注和致谢的地方外论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。．顶亦日作者签名：任．南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读（博±学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得Ｗ其它单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可ｉｕ公布学位论文的全部或部分内容，可Ｗ采用复印、缩印或其它手段保留学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部口规定送交学位论文。同意学校将论文加入《中国优秀博硕±学位论文全文数据库》，并按《中国优秀博硕±学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到《中国学位文论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论，解密后适用该授权。八作者签名：許满年ｃｉ月：ＫＴ日导师签名年ｒ月乂巧 目录一、中英文缩略词表................................................Ⅰ二、中文摘要......................................................Ⅲ三、英文摘要......................................................Ⅴ四、前言...........................................................1五、材料和方法.....................................................51.实验材料.......................................................52.实验方法.......................................................8六、实验结果......................................................111.电泳结果分析.................................................112．溶解曲线和扩增曲线及扩增效率结果分析.........................123．不同分期血浆miR-146a表达量比较..............................14七、讨论..........................................................151．糖尿病性视网膜病变的现状、症状、发病机制.....................152.miR-146a的表达及在DR慢性炎症反应过程中的作用...............163.实验结果分析..................................................17八、结论..........................................................19问题与展望....................................................20九、附录..........................................................21十、参考文献......................................................23十一、综述........................................................27十二、硕士期间学术成果............................................37 中英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称miRNAmicroRNA微小核糖核酸PloyAPloyA多聚腺苷酸RISCRNA-inducedsilencingcomplexRNA诱导沉默复合体PRI-miRNAprimarymiRNAmiRNA前体TNFtumornecrosisfactors肿瘤坏死因子TRAF6tumornecrosisfactor肿瘤坏死因子受体receptor-associatedfactor6相关蛋白6ILinterleukin白细胞介素IRAK1interleukin1receptor白细胞介素-1受体associatedkinase1相关激酶1NFAT5nuclearfactorof活化细胞的核因子5activatedT-cells5TAMstumor-associatedmacrophages肿瘤相关巨噬细胞ITGAVIntegrinalpha-V整合素阿尔法蛋白ROCK1Rho-associatedcoiled-coil曲螺旋蛋白激酶1containingproteinkinase1CHBchronichepatitisB慢性乙型肝炎CNVscopynumbervariations拷贝数变异DRdiabeticretinopathy糖尿病性视网膜病变NPDRnonproliferative糖尿病性视网膜病变diabeticretinopathy非增生期PDRproliferative糖尿病性视网膜病变diabeticretinopathy增生期CMEcystoidmacularedema黄斑囊样水肿PKCproteinkinaseC蛋白激酶CIX VEGFvascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子DRGdorsalrootganglion背根神经节PCRpolymerasechainfeaction聚合酶链式反应X 血浆miR-146a在糖尿病性视网膜病变不同分期的表达摘要：微小RNA（microRNA）是一类长度大约22个碱基，在进化中高度保守的非蛋白质编码的內源性小分子RNA。它是一种具有强大调节作用的新型基因分子。microRNA可以在所有细胞类型中表达，在细胞的生长、分化、凋亡中均参与其中。作为一个重要的微小RNA，miR-146家族在各种生理及病理过程中参与重要的转录后调节已经被广泛报道。miR-146a在糖尿病性视网膜病变的过程中的表达变化也有相关的报道。根据文献报道不能确定miR-146a在糖尿病性视网膜病变的表达变化情况。目的：本研究通过对糖尿病性视网膜病变的不同分期miR-146a表达进行对比，初步研究糖尿病性视网膜病变的分期同miR-146a表达变化的关系，探讨miR-146a能否成为糖尿病性视网膜病变的诊断工具。方法：1.对已确诊的2型糖尿病患者根据眼底病变的情况进行分类，从0期至Ⅳ分为5组，共33例，排除眼底病变不同各组患者无差异。同时选取健康人对照组。对目的组及对照组进行静脉采血。2.分离静脉血，利用试剂盒提取标本血浆中的microRNA。对取得microRNA利用PloyA进行加尾，并对加尾的产物进行反转录。采用实时荧光定量PCR法检测样本miR-146a的相对表达含量。3.对实时荧光定量PCR的产物进行电泳检测，验证所得到的产物是否为目的产物。4.统计学整理数据，应用统计学软件SPSS19.0处理数据，采用单因素方差分析实验结果。结果：1.根据电泳结果分析，荧光定量PCR的产物在目的条带范围，符合实验要求。证明引物具有特异性。2.溶解曲线和扩增曲线结果也证明引物的特异性好，符合实验要求。引物XI 的扩增效率同样在可信区间范围内。3.统计学分析miR-146a的相对表达含量，将糖尿病性视网膜病变的0期与健康对照组相比，血浆miR-146a的表达水平有升高趋势，但无统计学差异（P＞0.05）。糖尿病性视网膜病变Ⅰ~Ⅳ期分别与健康对照组相比，miR-146a的表达水平有下降趋势，但无统计学差异（P＞0.05）。糖尿病性视网膜病变各分期之间差异无统计学差异（P＞0.05）。结论：1.本实验检测miR-146a表达在糖尿病视网膜病变各组之间，目的组与对照组之间，未能得出统计学差异，尚不能确认miR-146a在糖尿病视网膜病变的表达情况。2.不同糖尿病患者及健康人之间miR-146a表达的个体差异较大。3.在本研究所检测的样本中未能体现miR-146a的表达与糖尿病视网膜病变的发展程度有相关性。miR-146a在糖尿病视网膜病变的表达情况有待于进一步研究。关键词：miR-146a；糖尿病性视网膜病变；分期；慢性炎症XII TheexpressionsofcirculatingmiRNA-146aatdifferentstagesinthepatientswithdiabeticretinopathyHanJing（Ophthalmology）DirectedbyWuZhengqingAbstract:MicroRNAs(miRNAs)areshort(about22nucleotideslong)andhighlyconservedsequencesofendogenousRNAthatdonotencodeforanyprotein,andrepresentanewpowerfulclassofgenemodulators.Theyareexpressedinallhumancell-typesandareinvolvedinthemainbiologicalprocessesincludingcellgrowth,differentiation,andapoptosis.AsanimportantmicroRNA,miR-146familyofimportantpost-transcriptionalregulatorsofgeneexpressionandtheirinvolvementinthephysiologicalandpathologicalprocessesofvariousdiseaseshasalreadybeenwidelyreported.Also,theexpressionchangesofmiR-146aintheprocessofdiabeticretinopathyhavebeenreportedrelevantly.AccordingtothereportscannotdeterminethechangesofexpressionofmiR-146aindiabeticretinopathy.Objective:Thisstudyonthedifferentstagesofdiabeticretinopathypatients,comparingtheexpressionchangesofmiR-146a.ThisisapreliminarystudyofanalyzingtherelationshipbetweenmiR-146aexpressionlevelanddifferentstagesofdiabeticretinopathy.InordertodiscusswhetherthemiR-146acanbecomeadiagnostictoolfortheXIII diabeticretinopathy.Method:1Weseparatethediagnosedpatientswithtype2diabetesto5groupsfrom0toⅣaccordingtotheperformanceofocularfundusdiseases,atotalof33cases,expectingocularfundusdiseasesindifferentgroupsofpatientswithnodifference.Healthypeoplewereselectedascontrolgroup.Venousbloodsampleswerecollectedfromthetargetgroupandthecontrolgroup.2WeseparatebloodsamplesandusemicroRNAkittobeextractedmicroRNAinplasma.ThemicroRNAswereaddedtailofPloyAPolymerase,andtheproductsofthetailwerereversedtranscription.TherelativeexpressionofmiR-146awasdetectedbyreal-timefluorescencequantitativePCRmethod.3Theproductsofreal-timefluorescentquantitativePCRweredetectedbyelectrophoresis,andwevalidateiftheproductswerethetargetones.4ThedatawereprocessedbystatisticalsoftwareSPSS19.0,andtheresultsofsinglefactoranalysisofvariancewereused.Result:1Accordingtotheresultsofelectrophoresisanalysis,theproductofthefluorescencequantitativePCRwasintheband,whichwasinaccordancewiththerequirementsoftheexperiment.Itcanprovetheprimerswerespecific.XIV 2Theresultsofthesolubilitycurveandamplificationcurvealsoprovedthattheprimerswerespecific,andtheresultswereingoodagreementwiththeexperimentalresults.Theamplificationefficiencyofprimersalsoconformstotherequirementsoftheexperiments.3.StatisticalanalysisofmiR-146arelativeexpressivecontent,indiabeticretinopathy0andhealthcontrolgroupcompared.PlasmamiR-146aexpressionlevelshaveincreased,butnosignificantdifferenceinstatistics(P>0.05).DiabeticretinopathyI~IVwerecomparedwithhealthycontrols,theexpressionlevelofmiR-146adecreased,butnosignificantdifferenceinstatistics(P>0.05).Therewasnosignificantdifferenceinstatisticsbetweenthevariousstagesofdiabeticretinopathydifferences(P>0.05).Conclusion:1Inthisstudy,miR-146aexpressionwasdetectedindiabeticretinopathygroup,betweenthetargetgroupandthecontrolgroup,therewasnostatisticaldifference,andtheexpressionofmiR-146aindiabeticretinopathycouldnotbeconfirmed.2TheindividualdifferenceofexpressionlevelofmiR-146abetweendiabeticpatientsandhealthyislarge.3InthesampleinthisstudydidnotreflectthedetectionoftheexpressionlevelofmiR-146aandthedevelopmentofdiabeticretinopathycorrelated.TheexpressionofmiR-146aindiabeticretinopathyneedsfurtherstudy.XV Keywords:miR-146a;diabeticretinopathy;staging;chronicinflammationXVI 第１章前言微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度大约22个碱基，在进化中高[1]度保守的非蛋白质编码的內源性小分子RNA。它是一种具有强大调节作用的新型基因分子。microRNA可以在所有细胞类型中表达，在细胞的生长，分化，凋亡中均参与其中。据研究数据显示，人类基因组编码的microRNA估计有1100[2]多种，它们可调节哺乳动物约60%的蛋白质编码。microRNA的转录及合成是一个发生在胞核及胞质的涉及多种酶的复杂生物过程。微小RNA的基因编码可能定位于内含子的编码及非编码区域，也可能定位于外显子，或基因间区域。大多数microRNA定位于内含子并且同宿主基因共同转录。通常情况下，这些由宿主基因编码的miRNA与宿主蛋白质通过相同的生物学途径的进行调节。另一方面，由外显子编码的miRNA通常具有自身的启[3]动子，因此经常是自主转录。作为信使RNA，miRNA的主要转录发生在细胞核内，通过RNA聚合酶Ⅱ进行介导，形成具有发夹结构的PRI-miRNA。然后被RanGTP依赖蛋白Exportin-5识别转运到细胞质中，由RNA聚合酶Ⅲ（(Dicer酶）进一步剪切。经剪切形成的双链结构分离，其中一条形成成熟的miRNA分子。经过这个过程后，成熟的miRNA被装入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，[4]选择性地结合靶基因mRNA，抑制其转录，发挥生物学效应。关于microRNA的各种研究已成为近年来的新热点。随着对microRNA检测技术的不断进步，microRNA的表达研究日益深入。而关于细胞外microRNA的表达对于疾病意义受到近年来的广泛关注。早在1948年，Mandel等人就在血浆[5]中检测出了核酸的存在。而Mitchell等人在血浆总RNA中分离出了18-24个碱基的RNA片段，对其进行反转录。并利用实时定量PCR技术对其表达量进行检测。同时建立了RNA分子文库进行分析，在得到的125个DNA序列中，确认了37个miRNA分子。并且设立患病组及健康人对照组进行比较，研究得出患[6]病组及健康人血浆中的miRNA表达量不同。在同年，Chen等人的研究，分析了人类和其他动物如小鼠、大鼠、胎牛、犊牛和马的血浆，证明miRNA的表达具有可重复性，证明血清中miRNA的水平是稳定的，并且同一物种的个体之间具有一致性。而且他们检验了100位左右中国健康人受试者，证明血清中miRNA的表达与性别无关。同时研究了肺癌、结直肠癌、糖尿病血清miRNA的特异表1 达模式，证明血清miRNA在疾病和健康人的表达有差异性，血清miRNA可反应人的生理状态，和疾病的发生及病程有关。总之，血清miRNA可作为包括癌症在内的各种疾病的潜在生物学检测标志物。本研究选取血浆miR-146a为研究目标。作为一种重要的微小RNA，miR-146家族包括miR-146a及miR-146b。miR-146a定位于人类基因染色体5q34，而miR-146b定位于10q24，两种基因序列仅相差两个核苷酸。目前，关于miR-146a的调节机制研究比较深入，有明确的阐述。而miR-146b有关机制还处于研究之中，对其尚未有明确的结论。通过国内外的报道证明，miR-146a是一个典型的多靶基因调节器，对多种信号通路起调节作用。早在2006年，Konstantin等人[7]通过启动子分析，发现miR-146a是一个NF-κB依赖性基因。脂多糖，TNF-α和IL-1β可通过NF-κB通路上调miR-146a。同时证明TNF受体相关因子6（TRAF6）和IL-1受体相关激酶1（IRAK1）是miR-146a的潜在靶基因。miR-146a可通过对TRAF6及IRAK1的下调，减少下游炎症因子IL-6，IL-8，[8]IL-1β,和TNF-α的表达，进一步减轻炎症反应，形成负反馈过程。总之，[9]miR-146a可通NF-κB通路负调节炎症反应。在最新的研究中还表明，miR-146a还与Notch信号通路相关，Notch1是它的直接靶基因之一。这使miR-146a作用研究又向前迈进了一大步。这些证明miR-146参与多种炎症反应信号通路，是一个重要的转录后调节因子。[10]在心血管系统疾病中，Gao等人在研究脓毒症引起的心功能障碍时，通过对慢病毒转染的miR-146a高表达组及其对照组进行心功能的比较，表明提高miR-146a的表达水平可以减弱由败血症引起的心功能不全。因为miR-146a可以降低脓毒血症诱导的NF-κB活性，并抑制心肌IRAK和TRAF6表达，减少血浆及腹膜液中细胞因子的产生量。同时，可以减低嗜中性粒细胞和巨噬细胞诱导的脓毒症浸润到心肌。在神经系统的研究当中，miR-146过表达促进了鼠神经干细胞自发分化成神[9]经细胞。实验证明miR-146可借助先天调节机制通过直接控制Notch1的表达形成一种天然保护机制，以限制胶质瘤干细胞样细胞和神经胶质瘤生长形成。这使它有可能成为神经胶质瘤治疗的一个新靶点。这项研究还发现了miR-146a可在多发性硬化活动期病变和实验性自身免疫性脑脊髓炎的小鼠脊髓微血管中上2 [11]调。同时，作为NF-κB抑制剂，miR-146a可以减少神经炎症的白细胞粘附。这个实验还发现了它的两个新型的靶点RhoA和活化细胞的核因子5（NFAT5）。这对于神经炎症机制的研究具有重要的作用。在免疫性疾病中，miR-146a被观察到可以影响多种免疫细胞的功能。在B细胞，它可降低的B抗R97-116抗体产生和抑制细胞的类别转换，降低浆细胞、记忆B细胞和B-1的细胞的数目，并减弱B细胞活性。实验证明可以通过沉默[12]miR-146a影响B细胞的功能，从而改善实验性自身免疫性重症肌无力。在T细胞中，有关于慢性乙型肝炎的研究发现，miR-146a的表达在慢性乙型肝炎（CHB）显著上调，并且它的水平与血清丙氨酸水平相关。这证明了炎性细胞因子和病毒因素导致了T细胞中miR-146a的上调。同时确定了STAT1是参与抗病毒细胞因子的miR-146a的一个靶基因，它具有CD4（+）和CD8（+）T细胞的细胞毒性。在慢性乙型肝炎关于T细胞的研究证明，miR-146a大大提高了病毒特异性T细胞活性，从而造成细胞外堵塞。因此，慢性乙型肝炎中miR-146a的上调可能导致T细胞的功能受损，这可能在慢性病毒感染过程中造成肝细胞免[13]疫缺陷和免疫学损伤。关于肿瘤的相关报道中，最新的研究表明miR-146a的表达上调在恶性黑色[14]素瘤具有双重作用。在黑色素瘤的进展模型中，miR-146a被确定是一个关键性的调节器。它能够增强黑色素瘤生长而抑制传播。据测定miR-146a可通过NOTCH/PTEN/Akt等通路直接促进黑色素瘤细胞的生长和增殖，而通过ITGAV和ROCK1的表达下降，抑制肿瘤的转移作用。最重要的是，miR-146a的表达和黑色素瘤的复发密切相关，在由患者取得的黑色素瘤及其皮肤转移病灶的标本中显示miR-146a的表达大幅度增高，并且其直接靶基因被严重抑制。而miR-146a在循环肿瘤细胞中的表达水平是下降的。这表明了对miR-146a表达检测的必要[15]性。它可以反应肿瘤在生长和转移进展中的波动。而Li等人研究了乳癌中肿瘤相关巨噬细胞与miR-146a表达的相关性。该研究证实了miR-146a是M1型巨噬细胞调控相关的重要基因。miR-146a的表达可抑制M1型肿瘤相关巨噬细胞的生长。进一步研究发现miR-146a同时部分抑制肿瘤相关细胞M2型的生长，但没有找到其在M2型巨噬细胞相关信号通路的靶基因。这个结果表明miR-146a可能是肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的极化负调节因子。研究人员认为miR-146a3 靠Toll样受体（TLRs）和NF-κB信号通路起负反馈作用。类似于炎症的制动，它在肿瘤相关巨噬细胞起刹车的作用。[16]在炎症相关眼病中也有miR-146a的相关研究。Sheng等通过实施定量PCR检测miR-146a在小柳原田综合征（VKH）及白塞氏病（BD）的表达，对比miR-146a拷贝数变异（CNVs）与VKH及BD病变的相关性，表明miR-146a的拷贝数变异与小柳原田综合征存在相似关联，而在白塞氏病没有发现相同的结果存在。证明了miR-146a的基因多态性和拷贝系数变异与葡萄膜炎的发展有关。以上研究均证明了miR-146a在炎症反应过程中发挥重要的作用，而关于[17]miR-146a在糖尿病的表达尚未有定论。2011年，Karolina等人通过基因芯片比较糖尿病小鼠血清中与肝脏、胰腺、脂肪组织和骨骼肌等组织的miR-146a表达含量，证明其在糖尿病过程中表达下降。同时在胰岛素抵抗中也呈现下降。而在[18]Kong等的临床试验中，糖尿病2型患者在疾病的早期miR-146a在血浆的表达上调。究竟miR-146a在已发生糖尿病性视网膜病变的患者中表达情况如何？它的表达情况与糖尿病性视网膜病变的分期有没有相关联系？miR-146a能否成为检测糖尿病性视网膜病变的相关指标，它与糖尿病性视网膜病变的预后及发展是否有联系？这些在国内外的相关研究较少，本研究针对2型糖尿病患者，对不同糖尿病性视网膜病变的血浆miR-146a表达量进行检测，初步探讨miR-146a在不同分期表达情况的变化，检验miR-146a可否成为检测糖尿病性视网膜病变诊断的相关指标。4 第2章材料和方法1实验材料1.1研究对象选取2015年6月至2015年9月就诊于郴州市第一人民医院眼科的已确诊2型糖尿病的患者33例，其中女性19例，男性14例，年龄分布30岁-69岁。根据我国糖尿病视网膜病变临床诊疗指南(2014年)的标准同国际糖尿病性视网膜病变重度分类，将糖尿病患者分为5组，分别为：A组，视网膜病变0期，即无视网膜病变期，5例。B组，Ⅰ期，即轻度非增生性视网膜病变期，8例。C组，Ⅱ期，即中度非增生性视网膜病变期，7例。D组，Ⅲ期，即重度非增生性视网膜病变期，7例。E组，Ⅳ期，即增生性视网膜病变期，6例。另外选取于我院体检者6例作为对照组（NC组），其中女性2例，男性4例。排除全身各大系统疾病，无糖尿病家族史，无其他眼部疾病。纳入标准：30-69岁原发性2型糖尿病男、女性患者。排除标准：有免疫系统疾病，恶性肿瘤，慢性骨关节炎症，肝肾功能急性损伤，长期服用糖皮质激素，精神类药物等影响血糖的药物。取静脉血3-5ml，1800rpm离心10min，分离新鲜血浆，-80℃保存，备用。本实验通过郴州市第一人民医院临床伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。1.2患者基本资料的采集采集患者的基本信息、糖尿病相关信息、眼病相关的各项指标，详细见附表：糖尿病患者基本信息采集表。5 1.3实验试剂主要试剂来源氯仿国药集团化学有限公司100%乙醇天津北联精细化学品开发有限公司异丙醇天津北联精细化学品开发有限公司miRNA提取试剂盒北京康为世纪生物科技有限公司Quanto-miRcDNA合成试剂盒北京旷博生物技术有限公司SYBRGreenMaster上海罗氏制药有限公司50bpDNAladder天根生化科技有限公司引物上海生工生物工程有限公司6×Loadingbuffer大连宝生生物有限公司琼脂糖上海生工生物工程有限公司1.4实验仪器主要仪器及耗材厂家-20℃、-70℃冰箱中科美菱4℃医用冰箱青岛海尔低温高速离心机美国Thermo公司梯度PCR仪德国Eppendorf公司快速混匀仪德国Eppendorf公司超净工作台美国Thermo公司电子天平美国OHAUS公司LightCycler®480实时荧光定量PCR仪瑞士Roche公司雪花制冰机宁波新芝生物公司电泳仪Bio-Rad实验室（上海）吸头、EP管、PCR管等美国Axygen公司八连管瑞士Roche公司高温消毒器美国Zealway公司6 2.实验方法2.1引物的设计2.1.1目的序列及引物通过微小RNA数据库（http://www.mirbase.org）查询，本实验的目标RNA序列为hsa-miR-146a-5p：5′－UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU－3′本实验利用加尾法反转录miRNA，实际上就是在反转录前设计一个步骤为RNA样品加上PolyA尾，然后进行正常的反转录。这样就可以通过mRNA的多聚A尾，对大量的mRNA通过序列末的一个不同碱基进行分类。所以本方法的反转录引物中包括：一段通用序列、一段多聚T和一个单碱基锚定。反转录RNA通用引物：5′－GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG（T）24N（A，G，C）－3′miR-146a-5pPCR上游引物：5′－TGAGAACTGAATTCCATGGGTT－3′miR-146a-5pPCR下游引物：5′－GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG－3′2.1.2内参序列及引物本实验采用miR-16作为内参基因。内参序列：hsa-miR-16-1-3p：5′－CCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA－3′内参引物：miR-16-3pPCR上游引物：5′－TAGCAGCACGTAAATATTGGCG－3′反转录引物及PCR下游引物与目的基因引物相同。2.2提取血浆微小RNA①取血浆200μl，加入BufferRLM1ml。震荡混匀30s，加入BufferRLT后反复吹打，使其充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。4℃12000rpm离心5分钟。②取上清，转入新的离心管以1:1的比例加入氯仿。盖好管盖，剧烈震荡15秒，室温放置5分钟。4℃12000rpm离心15分钟，样品分为三层：红色有机相，中7 间层，无色水相。③取上层水相移到一个新的离心管中，加入1/3体积无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入收集管的吸附柱RM(SpinColumnRM)中。一次不能转入可分多次转入，室温12000rpm离心30s。④离心后弃掉吸附柱RM，保留流出液。向流出液中加入2/3体积无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入收集管的吸附柱RS(SpinColumnRS)中。一次不能转入可分多次转入。室温12000rpm离心30s。⑤倒掉废液，将吸附柱RS重新放回收集管中，向吸附柱中加入700μlBufferRWT，室温12000rpm离心30秒。⑥倒掉收集管中的废液，将吸附柱RS重新放回收集管中。向吸附柱RS中加入500μlBufferRW2，室温12000rpm离心30秒。⑦重复步骤6。⑧室温12000rpm离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱RS置于室温中数分钟，以彻底晾干。⑨将吸附柱置于一个新的无酶管中，加入20~30μlRNase-freeWater，室温放置1min，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，保存在-70℃，防止降解。2.3逆转录微小RNA第一步：在microRNA的3’尾部添加PolyA使用E.coliploy(A）Polymerase在成熟的microRNA序列的3’端添加PolyA尾。采用20µL的反应体系，在离心管中加入总体系如下：表2.3.1逆转录加尾反应体系试剂体积10*buffer2µL10mMATP2µLE.coliploy(A）Polymerase1µLRNaseInhibitor0.5µLRNase-FreeWater12.5µLmRNA2µL8 离心15s，将离心管置于PCR仪中37℃孵育1小时。第二步：cDNA链的合成加尾反应结束后，将反应管从PCR仪中取出，往每个反应管中加入1µL反转录引物（0.25µg/µL），70℃孵育5分钟，然后将反应管迅速置于冰上至少5分钟。在40µL的反应体系中加入以下反转录试剂。表2.3.2逆转录反应体系试剂体积5*Buffer8µLM-MLVReverseTranscriptase1µL10mMdNTP2µLRNaseInhibitor1µLRNase-FreeWater8µL加尾后产物20µL在PCR仪中50℃孵育50分钟，反应后70℃保温15分钟。2.4实时定量PCR检测利用反转录产物进行实时定量PCR检测。总反应体系20µL，具体反应试剂如下表所示。表2.4.1实时定量PCR反应体系试剂体积终浓度dH2O(灭菌蒸馏水)8.2μlSYBRGreenIMaster10μlPCRForwardPrimer(10μM)0.4μl0.2μMPCRReversePrimer(10μM)0.4μl0.2μMcDNA1μl9 启动LightCycler®480实时定量PCR仪，预热后将八连管放入仪器中，反应条件如下表，95℃至65℃绘制溶解曲线。表2.4.2实时定量PCR反应条件步骤温度（℃）时间循环次数预变性9510min1变性9515sec40退火延伸601min402.5实时定量PCR产物电泳检测2.5.1制备浓度约为3%的琼脂糖凝胶：将2.4g琼脂糖放入烧杯中，加入80mL1×TBE缓冲液，微波加热至琼脂糖完全溶解，冷却，约50℃时加入染料7.5μl，充分摇匀后倒入胶槽中。2.5.2加样：将制备好的凝胶放入电泳槽中，加1×TBE缓冲液至基本没过胶面，取10μlPCR产物及3μl6×Loadingbuffer混匀，加入凝胶孔中。2.5.3电泳：通电后设置电压约105V，电泳约45分钟后停止，将琼脂糖凝胶取出，放入成像设备中，采用紫外线摄像后分析结果。2.6统计学分析-△△CT本实验实时定量数据采用miR-16作为内参对比，应用相对定量2计算对照组及实验组miRNA表达水平差异。应用统计学软件SPSS19.0进行统计学处理。计量资料均以均数士标准((X士S)表示，多组比较采用单因素方差分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。10 第3章实验结果1电泳结果分析根据逆转录通用引物及PCR上游引物计算所获得产物的长度大约在70~80bp左右，如图所示94、102号样本长度符合这个范围。HR为空白对照逆转录产物，产生条带为非特异性，符合实验对照组要求。H为空白对照PCR产物，条带长度可以同目标条带相区分。如图1.1图1.1miR-16荧光PCR产物电泳结果miR-146a产物条带长度大约在65~70bp左右，符合PCR产物的预测长度。部分标本产生长度较大的非特异条带，如90号标本，同目的条带可以区分，不影响实验结果。部分标本，如94、95主要条带不符合目的条带范围，结果予以剔除。如图1.2图1.2部分样本miR-146a荧光PCR产物电泳结果11 2.溶解曲线和扩增曲线及扩增效率结果分析miR-146a溶解曲线结果显示曲线形成单一峰，主峰在80℃左右，表明标本中无非特异性二聚体及引物二聚体形成，引物的特异性良好。(图2.1)图2.1miR-146a实时荧光定量PCR溶解曲线实时荧光定量PCR反应结果显示，所有miR-146a扩增曲线Ct值均小于35个循环，证明数据有效可信。(图2.2)图2.2miR-146a实时荧光定量PCR扩增曲线12 扩增效率结果显示R²=0.904，结果在0.8~1.0可信区间范围内，证明引物的扩增效率符合实验要求。（图2.3及图2.4）图2.3样本5倍梯度稀释所得到的miR-146a的扩增曲线图2.4miR-146a的标准曲线13 3.不同分期血浆miR-146a表达量比较（表3.1）在糖尿病性视网膜病变的0期与健康对照组相比，血浆miR-146a的表达水平有升高趋势，但无统计学差异（P＞0.05）。糖尿病性视网膜病变Ⅰ~Ⅳ期分别与健康对照组相比，miR-146a的表达水平有下降趋势，但无统计学差异（P＞0.05）。糖尿病性视网膜病变各分期之间差异无统计学差异（P＞0.05）。表3.1各组miRNA-146a检测结果比较(x士S}组别miR-146a相对表达量NC组，健康人对照组19.82士9.733890766n=6A组，视网膜病变0期26.60士18.43898508n=5B组，视网膜病变Ⅰ期15.58士4.468430292n=8C组，视网膜病变Ⅱ期15.33士4.592450433n=7D组，视网膜病变Ⅲ期11.58士8.588392508n=7E组，视网膜病变Ⅳ期14.83士8.67818206n=6注:与健康对照组比较A、B、C、D、E组比较P＞0.05，A组与D组比较P＞0.05。图3.1miR-146a在各组间的相对表达量比较注：图中标识为各分组之间的标准误。14 第4章讨论1.糖尿病性视网膜病变的现状、症状、发病机制糖尿病已成为世界性的健康问题。根据国际糖尿病联盟（IDF）12月1日在“2015年世界糖尿病大会”上最新发布的第7版糖尿病概览（DiabetesAtlas），世界范围内共有4.15亿成年人患有糖尿病，即每11人中便有1人患有糖尿病。在中国，我国18岁及以上成人样本中，诊断的糖尿病估测患病率为11.6％，约1.139亿人，占全球发病人口的三分之一。糖尿病性视网膜病变（diabeticretinopathy，DR）是糖尿病的主要并发症之一，是发达国家工作人群失明的主要原因。随着我国人均生活水平的提高及老龄化程度的增加，糖尿病所造成的视力威胁越来越不可忽视。据统计，病程在5年内的1型糖尿病患者的DR发生率为13%，病程在10～15年则高达90%；而在2型糖尿病患者中，病程5年的DR发生率为24%～40%，病程超过10[19]年可达53%～84%。糖尿病性视网膜病变已成为我国重要的致盲因素。它的主要症状是随着血糖水平升高，视力模糊，视物有暗斑或闪烁的灯光，[20]和突然丧失视力。早期DR可无自觉症状，病变后由于累及黄斑的不同，可以有不同程度的视力减退。按病变的严重程度可以分为：为非增生期（nonproliferativediabeticretinopathy，NPDR；分为轻度、中度和重度阶段）出现微血管瘤、出血、硬性渗出、静脉异常，视网膜水肿及黄斑囊样水肿（CME）和增生期（proliferativediabeticretinopathy，PDR；进展阶段）产生新生血管，视网膜前或玻璃体底边出血，纤维血管增生，大量玻璃体出血。新生血管性青光[21]眼，牵拉性视网膜脱离也产生在这个阶段。最初，DR被认为是糖尿病微血管并发症所产生的内皮功能障碍，因为它的主要特征是毛细血管基底膜的增厚，周细胞和内皮细胞的缺失，血视网膜屏障的[22]破坏和渗漏，毛细血管的闭塞和新生血管的形成。这些是目前公认的典型DR特征，并且可以在临床诊断、细胞分析、病理诊断和视网膜的功能变化等方面得到证明。实际上，细胞凋亡的病理变化使所有类型的视网膜细胞均受到影响，包括神经节细胞。神经视网膜细胞内核层（INL）变薄，突触数量和突触蛋白减少，突触的形态发生变化，视网膜色素上皮细胞（RPE）功能障碍，这些病理变化在[22、23]DR早期即可导致视力发生障碍。因此，DR不仅是一种血管疾病，而且是15 一种神经退行性疾病。无论是血管病变还是神经病变总的来说都是一种细胞凋亡，这种细胞凋亡的过程受多种因素的影响，与多元醇代谢通路的异常、蛋白质非酶糖基化产物的堆[24]积、蛋白激酶C(PKC)的活化等作用有关。而先天性免疫炎症和无菌炎症在DR的早期即发生。近年来，慢性炎症反应对糖尿病性视网膜病变的影响日益受到研究者们的关注。研究证明，DR的多种病理过程和慢性炎症反应密切相关，包括血管通透性的增加，视网膜水肿，与炎症相关联的炎性细胞的浸润，组织的破坏，[25]新生血管的形成，和促炎细胞因子及炎症趋化因子在视网膜细胞的表达。而microRNA调节作用被证明与慢性炎症反应过程关系密切。慢性炎症反应受多种microRNA的调节影响，本研究选取miR-146a，它是参与慢性炎症反应过程中具有代表性的调节基因，并且是一个多靶基因的调节因子，对炎症反应的多种调节途径具有重要影响。2.miR-146a的表达及在DR慢性炎症反应过程中的作用[17]关于miR-146a在糖尿病视网膜病变的表达尚未有定论。2011年，Karolina等人使用基因芯片检测，构建糖尿病小鼠模型，比较其血清中与肝脏、胰腺、脂肪组织和骨骼肌等组织的miR-146a表达含量，证明其在糖尿病过程中表达下降。[18]同时在胰岛素抵抗中也呈现下降。而在Kong等的临床试验中，糖尿病2型患者在疾病的早期miR-146a在血浆的表达上调。miR-146a在糖尿病性视网膜病变炎性反应产生的多种损伤中起重要作用。一方面，在微血管内皮的损伤及血管周细胞的破坏造成的血视网膜屏障的损伤中，miR-146a可通过NF-κB通路靶向作用TNF及IL-1相关受体，减轻炎症反[26]应。这在XU等关于糖尿病创口愈合的实验中得到了证明。同时，这一反应通路与多种炎性及趋化因子有关，尤其是被证明在DR患者血清中显著变化的IL-1[27][28]β、IL-6、IL-8、TNF-α相关。而Wang等人的研究表明miR-146a可作用于细胞黏附因子1（ICAM-1），该因子被认为是IRAK1的下游基因，参与单核细胞的黏附作用和白细胞的游出。另一方面，miR-146a亦同先天性免疫反[29]应密切相关。它可以在Treg细胞中高度表达。Sonkoly等认为，miR-146a可通过负反馈方式调控Toll样受体(Toll-ikereceptors,TLRs)影响天然免疫反应。这可能在糖尿病早期的先天免疫及无菌性炎症中发挥重要作用。16 在神经相关的糖尿病性视网膜神经病变中，miR-146a亦发挥不可或缺的作[9]用。Wei等人在实验性糖尿病鼠神经干细胞的分化实验中，证明miR-146a可直接作用于Notch1，通过抑制它的表达抑制神经干细胞的分化。这个实验不排除miR-146a还有其他的靶基因，它们共同作用产生抑制效应。这为miR-146a在[30]DR的视神经病变中产生作用的提供了重要依据。在Wang关于糖尿病周围神经病变的实验中表明，高血糖下调的miR-146a的表达升高白细胞介素-1受体活化激酶（IRAK1）和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）在背神经节（DRG）神经元的水平。证明了miR-146a可通过介导炎性因子的调节，在背神经节的糖尿病病变中神经细胞凋亡起重要作用。在糖尿病视网膜病变的增殖期，血管内皮生长因子（VEGF）被认为是糖尿病视网膜病变最重要的相关因子之一。VEGF可直接促进血管内皮细胞的增殖，[31]对于DR新生血管的产生具有重要的意义。研究通过对比大脑血管来源的内皮细胞和视网膜内皮细胞，相同种类的VEGF在高糖缺氧的状态下，在视网膜内皮细胞的表达要明显高于脑源性的血管内皮细胞，这证明了VEGF在视网膜内皮的敏感性要高于其他组织。这为VEGF在眼部的临床应用提供了理论基础。而VEGF抗体针对糖尿病视网膜病变黄斑水肿及新生血管的治疗在临床部分患[32]者的应用已经取得了显著的成效。而在Zhang等人在最近的研究中，采用免疫组化检测肿瘤模型中miR-146a过表达的小鼠，对比miR-146a抑制低表达的小鼠，证明miR-146a可以下调VEGF的表达。这为miR-146a对VEGF的表达的调控提供依据，而这种表达调控可能在糖尿病视网膜病变中产生重要的作用。在DR前期，可能参与视网膜血管的渗漏，而在后期新生血管生长过程中，也产生重要的调节作用。3.实验结果分析本研究中显示，miR-146a的表达在糖尿病视网膜早期，即视网膜病变0期，[33]呈上升趋势，这与Kong等的临床试验结果相符合。考虑miR-146a在胰岛β细[28]胞系MIN6中表达，促进胰岛细胞的凋亡，这可能与胰岛素抵抗的发展及糖尿病前期的加重有关。其具体机制尚未明确，有待于进一步研究。随着糖尿病过程中炎性反应的增加，NF-κB通路对miR-146a抑制作用的增强，miR-146a在糖尿病性视网膜病变的表达降低，视网膜病变的程度也随之加重，这点在本实验的B17 [17]组与A组的比较可以体现。这个结果同Karolina在糖尿病视网膜病变的研究相符。但在糖尿病性视网膜病变的后期，随着炎症反应作用的减弱，新生血管等增殖作用的增强，炎症作用减轻；同时，伴随VEGF的表达显著增强，miR-146a的拮抗作用也随之增强，造成miR-146a的表达有可能稍有回升趋势，见E组的表达情况。但统计学分析不支持此结论，具体的情况在增大样本量的条件下还有待于进一步证实。本实验证明miR-146a的表达在糖尿病性视网膜病变受胰岛细胞的凋亡作用及慢性炎症反应过程的影响。但研究条件的限制，本研究的病例样本数较少，并且炎性反应介质受影响的因素较多，实验结果未显示统计学差异。实验组及对照组各样本之间miR-146a的表达含量差异较大，考虑两个因素影响。一是样本量的数量太少，不能充分显示miR-146a在人群中的表达情况。二是miR-146a在每个人的个体差异本身存在很大差异，个体水平的分布不平均。因此，暂不能把miR-146a最为一个诊断糖尿病性视网膜病变的指标，反应糖尿病的病情。18 第5章结论1.本实验检测miR-146a表达在糖尿病视网膜病变各组之间，目的组与对照组之间，未能得出统计学差异，尚不能确认miR-146a在糖尿病视网膜病变的表达情况。2.不同糖尿病患者及健康人之间miR-146a表达的个体差异较大。3.在本研究所检测的样本中未能体现miR-146a与糖尿病视网膜病变的发展程度有相关性。miR-146a在糖尿病视网膜病变的表达情况有待于进一步研究。19 问题与展望由于研究时间和条件的限制，本研究采集的样本数量较少。实验组及对照组之间，及对照组各组之间区别未显示出统计学差异。并且个体间的差异较大，没有充分体现出人群中miR-146a的表达分布情况。总之，miR-146a在糖尿病性视网膜病变的人群中的表达仍未明确。考虑miR-146a的表达和多种影响因素相关，下一步的研究的从增加样本数量，明确表达变化后及进一步检测其靶基因的表达及其表达的变化关系，探索其机制等方面进一步入手。20 糖尿病患者基本信息采集表姓名性别基年龄职业本文化程度联系方式信息住址出生年月家族史传染病史初次发现糖尿病时间病程治疗方法药物治疗□营养疗法□运动疗法□血糖监测□用药史眼部外伤史眼部手术史视网膜激光光凝术治疗0次□1次□2次□3次□4次□规范治疗是□否□空腹：病血糖血压餐后2h：史肝功是否正常是□否□肾功是否正常是□否□生化检查血脂是否正常是□否□糖化血红蛋白糖尿病全心脑血管疾病□高血压病□糖尿病肾病□糖尿病足□神经系统并身合并症发症□全身其他心脑血管疾病□免疫系统疾病□癌症□神经退行性疾病□神经分疾病裂症□右眼（OD）左眼（OS）视力裸眼矫正裸眼矫正眼压/房角专眼球运动科角膜检查晶状体玻璃体视网膜检查21 22 参考文献[1]BartelDP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction.[J].Cell,2009,116(2):287-297.[2]FriedmanRC1,FarhKK,BurgeCB,etal.MostmammalianmRNAsareconservedtargetsofmicroRNAs[J].GenomeRes,2009,19(1):92-105.[3]Lagos-QuintanaM,RauhutR,LendeckelW,etal.IdentificationofnovelgenescodingforsmallexpressedRNAs[J].Science,2001,294(5543):853-858.[4]张卓远,付汉江,吕星等.miRNA功能研究进展[J].军事医学科学院院刊,2005,29(6):571-575[5]MitchellPS,ParkinRK,KrohEM,etal.CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection[J].ProcNatlAcadSciUSA,2008,105(30):10513-10518.[6]ChenX,BaY,MaL,etal.CharacterizationofmicroRNAsinserum:anovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases[J].CellRes,2008,18(10):997-1006.[7]TaganovKD,BoldinMP,ChangKJ,etal.NF-kappaB-dependentinductionofmicroRNAmiR-146,aninhibitortargetedtosignalingproteinsofinnateimmuneresponses[J].ProcNatlAcadSciUSA,2006,103(33):12481–12486.[8]BhaumikD,ScottGK,SchokrpurS,etal.ExpressionofmicroRNA-146suppressesNF-kappaBactivitywithreductionofmetastaticpotentialinbreastcancercells[J].Oncogene,2008,27(42):5643-5647[9]XiaoWZ,LuAQ,LiuXW,etal.RoleofmiRNA-146inproliferationanddifferentiationofmouseneuralstemcells[J].BiosciRep,2015,35(5):e00245.[10]GaoM,WangX,ZhangX,etal.AttenuationofCardiacDysfunctioninPolymicrobialSepsisbyMicroRNA-146aIsMediatedviaTargetingofIRAK1andTRAF6Expression[J].JImmunol,2015,195(2):672-682.[11]WuD,CeruttiC,Lopez-RamirezMA,etal.RoleoBrainendothelialmiR-146anegativelymodulatesT-celladhesionthroughrepressingmultipletargetstoinhibit23 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26 综述微小RNA表达在糖尿病视网膜病变中作用研究进展摘要：微小RNA是一类在转录后水平调节目的基因的表达的小分子RNA。糖尿病视网膜病变是发生在糖尿病的重要致盲性并发症。微小RNA在糖尿病视网膜病变中可参与高血糖状态与炎性反应状态的形成，同时造成：1血视网膜屏障的破坏，2视神经细胞的凋亡，3新生血管的产生及玻璃体相关变性。本文通过阐述微小RNA在其中的作用，探讨微小RNA在糖尿病视网膜病变的作用机制。关键词：微小RNA；糖尿病视网膜病变；高血糖；炎症微小RNA（microRNA）是一类进化中高度保守基因编码的內源性小分子RNA,长度小于30个碱基。它可通过与靶基因的3’端结合，或直接与靶基因结合，[1]或通过碱基互补配对，抑制mRNA，在转录后水平调控目的基因的表达。microRNA调节靶基因mRNA主要通过降解，或直接结合抑制其翻译。据数据显示，人类基因组编码的microRNA估计有1100多种，它们可调节哺乳动物约60%的蛋白质编码。自1993年microRNA被首次从线虫发现，关于它的研究日益广泛深入，被证明在细胞的生长分化，增殖凋亡，生物的发育及物质代谢等方面均发挥作用。microRNA作为一个生物学标志物，是一个可以衡量的客观指标，可以反映特定疾病状态的发生和发展，并可以被有效测量。它可以在糖尿病诱导的视网膜病变动物模型中进行有效监测，更准确地反映疾病病理状态的变化。这对于糖尿病视网膜病变的诊断及治疗，判断预后具有重要的意义。本文就其在糖尿病视网膜病变发生发展中起到的作用进行综述。1糖尿病视网膜病变的概念和病理过程随着肥胖人群的日益增长，糖尿病已成为世界性高发疾病。2013年全球共有超过3亿的糖尿病患者。在中国，我国18岁及以上成人样本中，诊断的糖尿病估测患病率为11.6％，约1.139亿人，占全球发病人口的三分之一。糖尿病视网膜病变（diabeticretinopathy，DR）是糖尿病的微血管并发症之一，其基本病理改变是视网膜的血-视网膜屏障的破坏，视网膜神经病变，新生血管形成，[2]出血，黄斑水肿，最终视网膜脱离，甚至失明。随着病程的增长，DR的患病率递增，DR已成为全球第二大的致盲原因。27 糖尿病视网膜病变（DR）的主要病理过程：长期持续慢性的高血糖状态是DR发生的核心原因，可以导致多种病理改变:早期（非增殖期）血管内皮之间的紧密连续性破坏，血管通透性增加，接着基底膜增厚，周细胞减少，毛细血管形成潜在空洞；后期（增殖期）内皮细胞过度增殖，导致各种闭塞及渗出性病变，[3]最终使玻璃体病变，视网膜脱离。总的来说，DR的发生包括两种重要的损伤因素：1长期慢性的高血糖侵害。2慢性的炎症反应过程。造成三种主要病变：①血视网膜屏障的破坏。②视神经细胞的凋亡。③新生血管的产生及玻璃体相关变性。下面就microRNA在其中发挥的作用进行探讨。2微小RNA表达在糖尿病视网膜病变中的作用2.1高血糖状态的形成microRNA参与高血糖的形成过程体现在两个方面：一是阻碍胰岛素的生成和分泌，二是通过降低胰岛素的作用，产生胰岛素抵抗，最终导致胰岛素无法发挥它的生理作用。2.1.1胰岛素生成及分泌障碍2.1.1.1胰岛素的分泌降低：胰腺特异性表达RNA可以直接调节胰岛细胞，如miR-375，它的靶基因是Mtpn，它在神经细胞和胰岛β细胞中通过胞吐机制产生作用，调节磷酸肌醇依赖蛋白激酶1(PDK1)的表达水平抑制胰岛素产生，而且可以改变由葡萄糖诱导的胰岛素分泌[4]。miR-375不仅可以调控胰岛素分泌，而且可以影响β细胞增殖。在miR-375基因敲除小鼠可观察到胰岛β细胞数减少，胰岛α细胞数增加，血糖升高[5]。而miR-9，miR-96则通过增加胰岛素负调控因子granuphilin在胰岛β细胞的胞吐作用机制下，使葡萄糖诱导胰岛素分泌降低。但miR-9的靶基因是onecut2，而miR-96则是通过下调胰岛素分泌必要因子Noc2蛋白的表达，抑制胰岛素的分泌[6]。miR-124也调节葡萄糖诱导的胰岛素的分泌，它的主要作用机制是作用于靶基因FOXa2，调节下游胰和十二肠同源蛋白PDX1，导致基础胰岛素过度释放而降低葡萄糖诱导的胰岛素的分泌[7]。2.1.1.2胰岛细胞凋亡增加：研究还发现，肥胖型小鼠体内非酯化脂肪酸可诱使胰岛β细胞内miR-34a表达水平升高，一方面，miRNA-34抑制了囊泡转运释放相关蛋白2(VAMP2)基因的表达，抑制胞吐作用，导致胰岛细胞功能紊乱而发生了坏死。另一方面，miR-34a可使抑制凋亡基因bcl-2沉默，从而促进胰岛β28 细胞的凋亡[8]。另外，miR-375也能通过抑制Mtpn蛋白的表达来增强棕榈酸诱导的脂肪细胞凋亡，从而引起胰岛β细胞中脂肪细胞凋亡[9]。2.1.1.3免疫相关调节胰岛素的分泌：在糖尿病患者调节性T细胞中miR-342以骨形态形成受体2(BMPR2)和血小板衍生生长因子(PDGF)为目的基因表达下调，造成胰岛免疫功能紊乱，具体的机制目前尚未明确[10]。miR-181a也是自身免疫调节基因之一，它通过能够降低T细胞敏感性的免疫磷酸酶的数量，从而达到选择性复制目的，其具体机制及在糖尿病的作用还有待于进一步研究[11]。2.1.2胰岛素抵抗血糖升高的另一方面原因是胰岛素在靶组织的效应减低，如肝脏、脂肪组织和骨骼肌等对胰岛素反应敏感性下降，胰岛素抵抗的具体机制还没有明确定论，但许多研究表明在胰岛素抵抗过程中出现microRNA的变化，表明它与胰岛素抵抗的发生密切相关。在肝脏细胞中，胰岛素抵抗可表现为糖原合成和储存减少，葡萄糖的输出增加。miRNA-122在肝脏过表达，它的靶基因是酪氨酸蛋白磷酸酶（PTP1B）。PTP1B蛋白能催化胰岛素受体（IR）和胰岛素受体底物(IRS)去磷酸化，抑制肝脏内胰岛素信号传导。在糖尿病病人，miRNA-122表达下降，PTP1B蛋白增加能促使胰岛素抵抗的发生[12]。Tung-YuehChuang等研究表明在胰岛素抵抗女患者的脂肪细胞中，miR-223过度表达，抑制葡萄糖转运蛋白4（GLUT4），减低脂肪胰岛素敏感性，影响体内葡萄糖耐量和葡萄糖代谢[13]。而胰岛素受体底物（IRS）蛋白是胰岛素信号转导途径的重要组成部分。研究在糖尿病大鼠模型中验证了miR-144和miR-181以IRS1和IRS2为靶基因上调，这两种蛋白在胰岛素信号转导过程中有信号协同作用，其机制有待于进一究[14]。高糖状态是DR各种损伤的根本原因，它与目前认可的糖尿病多种发病机制的密切相关。它既可以通过多元醇通路调节细胞内外渗透压，导致细胞变性，代谢功能障碍，发生凋亡；还可以通过终末糖基化产物ACEs的堆积，影响各种视网膜细胞的生理功能；同时与PKC，氧化应激反应(活性氧（ROS），多种细胞因子造成的损伤密切相关[15]。可以说，高糖状态的形成是糖尿病病变的始发点，而microRNA在其中的作用具体总结如表1。29 表1糖尿病高血糖产生相关miRNA作用及其靶基因miRNA的表达糖尿病患者变化靶基因作用机制miR-375上调Mtpn减少胰岛素的胞吐作用[4]PDK1减少葡萄糖响应性[4]?抑制胰岛β细胞的分化[5]miR-124a上调FOXa2调节葡萄糖胰岛素负反馈反应[7]miR-9上调onecut2调节胰岛素负调节因子granuphilin，减少胰岛素分泌[6]miR-96上调?通过Noc2调节granuphilin，减少胰岛素分泌[6]miR-342下调BMPR2?胰岛免疫功能紊乱[10]PDGF?胰岛免疫功能紊乱[10]miRNA-122下调PTP1B催化IR及IRS磷酸化，产生胰岛素抵抗[12]miR-223上调GLUT4减低脂肪细胞胰岛素敏感性[13]miR-144上调IRS1与胰岛素抵抗有关[14]miR-181上调IRS2与胰岛素抵抗有关[14]2.2慢性炎症反应过程及造成的损害2.2.1炎症因子造成的损害2.2.1.1血视网膜屏障的破坏：慢性炎症反应通路决定着多种炎症因子的调节过程。NF-κB信号通路是重要的炎症反应通路，它广泛存在于人类多种组织中，在免疫反应，炎症，细胞增殖，细胞凋亡等多种生理病理过程中起着转录调控的作用。NF-κB被证明在糖尿病病变视网膜的血管内皮及周细胞中表达增加。在miR-146a是参与NF-κB通路的重要基因之一，脂多糖，TNF-α和IL-1β依赖NF-κB通路使miR-146a上调，它的结合位点的位于miR-146a启动子上。miR-146a也可直接下调Toll样受体，同时可作用于TNF-α和IL-1通路的TNF受体相关因子6（TRAF6）和IL-1受体相关激酶1（IRAK1），使其下调，降低IL-6，[16]IL-8，IL-1β,和TNF-α的表达，进一步减轻炎症反应。这是一个负反馈过程，在整个通路中发挥重要作用。而在XU等关于糖尿病创口愈合的实验中，采用骨30 髓间充质干细胞（MSC）治疗后，糖尿病大鼠的miR-146a表达水平升高，创口的炎症反应减轻，愈合闭合增快。这证明它可能成为针对糖尿病炎症反应治疗[17]的一个新靶点。同样的，miR-155也可作用于NF-κB通路。Kovacs等在链脲霉素诱导大鼠的视网膜及视网膜血管内皮细胞（RECs）中检测发现，miR-155通过此信号通路上调，上调后的microRNA可直接激活miR-146a的表达，而miR-146a过表达抑制IL-1b诱导的NF-kB激活，这形成了一个反馈回路，回[18]路一旦遭到破坏将促发凋亡发生。Wang等人的研究表明，细胞黏附因子1（ICAM-1）是miR-146a的又一个靶基因，目前被认为是IRAK1的下游基因，参与单核细胞的黏附作用和白细胞的游出。这说明miR-146a是一个多目的基因[19]的靶点，可预期成为DR治疗的新突破点。最近一项研究证明了miRNA-195在糖尿病视网膜病变的重要作用，发现了他的一个新的靶基因沉默信息调节蛋白1（SIRT1）。在糖尿病大鼠模型的RECs中，miRNA-195呈高表达。同时，在玻璃体腔注射miRNA-195拮抗剂后，SIRT1的[20]表达有所改善。这些研究充分证明了微小RNA在糖尿病视网膜血视网膜破坏的重要作用。2.2.1.2视神经细胞的凋亡：在常规的DR治疗诊断中的视神经病变没有引起人们的充分重视，事实上在糖尿病早期即发生视神经细胞的凋亡。Silva等研究发现，miR-29b对视网膜神经节细胞（RGCs）和神经视网膜的核内层杆状细胞（INL）的凋亡有保护作用，它与RNA依赖蛋白激酶相关蛋白X(RAX)共同定位在这两个部位，二者之间可能存在间接调控关系。在糖尿病前期，miR-29b的上调可[21]通过凋亡RNA依赖的蛋白酶（PKR）通路对抗RGCs和INL的凋亡。而在1型糖尿病的遗传模型的另一个研究（Akita大鼠）则发现，对大鼠的视网膜Müller细胞用miR-200b增强剂诱导，与之相关的氧化应激源4-羟基壬烯醛（4-HNE）呈不同水平的增加，这揭示了miR-200b在视网膜神经细胞的氧化应[22]激机制中的抗凋亡作用。2.2.2新生血管的生成及玻璃体病变血管内皮生长因子（VEGF）和和色素上皮衍生因子（PEDF），是新生血管形成的重要参与因素。VEGF能选择性促进内皮细胞有丝分裂，特异性地刺激内皮细胞增殖。其表达增加可以抑制内皮细胞凋亡，增加血管的通透性，是新生血31 管生成的最密切因素。而PEDF则被认为是维持新生血管稳态的必要条件。VEGF[23]和PEDF失衡是导致DR发生和调节的中心环节。Wu等人的实验中发现VEGF可能是miR-199a的潜在靶点，而同时PEDF可能是miR-363的目的基因。在糖尿病过程中miR-199a上调而miR-363下调，两者变化影响VEGF与PEDF的表[24]达平衡。而有关VEGF的microRNA的研究相对较多，早在2011年Kovacs证明miR-20a不仅可以诱导VEGF，同时以VEGF为靶基因。miR-17-5p、miR-18a、miR-21、miR-31、miR-155都随着VEGF的表达而上调，而miR-200b则在同时[25]下调，这些在DR的发展中起促进。miR-126在猴视网膜内皮细胞缺氧的条[26]件下，表达下调，并可以下调VEGF和MMP-9的水平。最新的一项研究表明，miR-152在高糖诱导的hRECs通过介导肾素受体（PRR2）抑制VEGF和TGFβ1[27]的表达。Zhao等人证明了，miR-351的高表达在体内及体外高糖模型中均可[28]抑制VEGF和Ang-2的表达，它在两者之间的竞争抑制中起到平衡作用。miR-34家族在糖尿视网膜病变病大鼠发生上调，它们中的一些是DR发生的重要信号。一项研究显示的miR-34a的在参与视网膜色素上皮细胞（RPE）的增殖和迁移，这在玻璃体视网膜病变十分重要[29]。图1微小RNA调节促进糖尿病视网膜病变过程32 3小结长期慢性的炎症反应过程和高血糖的均产生参与多种细胞因子的调控。高糖状态和慢性炎症反应共同促进糖尿病病变的发展。高血糖增加多元醇，糖基化终末产物（ACGs），蛋白酶C（PKC），活性氧（ROS）等产物，通过氧化还原反应等途径破坏包括神经血管细胞在内的视网膜细胞。慢性炎症反应状态通过NF-κB通路，TNF-α和IL-1通路，促进新生血管的产生。VEGF和PEDF则在视网膜病变中起关键性的作用，不仅是血-视网膜屏障破坏的主要因素，同时与炎症反应通路相互关联，促进新生血管的产生。两种损伤导致的病变状态密不可分，共同促进疾病缓慢进展。在此过程中microRNA参与其中调节，促进DR由非增殖期向增殖期的转变，具体过程如图1。糖尿病视网膜病变的机制极其复杂，涉及多种病变因素的共同作用。microRNA作为一个重要的转录后水平的调节靶点，它的作用已经得到多方面的证实。但它在DR中的作用及具体过程还未明确。对它的研究有利于DR致病机制的进一步明确，有望发现DR早期诊断的新标志，为开辟新治疗新靶点打下重要基础。33 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硕士期间学术成果[1]韩晶，武正清.微小RNA表达在糖尿病视网膜病变中作用研究进展[J].现代医药杂志，2016(3):104-10837 38 致谢感谢武正清老师在我研究生学习期间孜孜不倦的教导及对我的各方面的培养，感谢恩师在我在读期间的关怀和殷切期望。您严谨的治学态度，精益求精的工作作风，严于律己、宽以待人的崇高风范。一直是我学习的目标，在和您的相处中我还学会了很多为人处事的道理，深刻地认识到了自身的不足。在我们课题的建立和研究中得到了门诊老师的人力、物力支持和帮助，在这里特别感谢刘茹老师在我们研究中给予的指导和支持。感谢谢丽莲老师、田涛老师、彭婧丽老师、罗乔英老师给予我们实验的支持。正在她们的支持和教导下，我们才得以完成整个实验工作。感谢郴州市第一人民医院转化研究所的老师给予我们实验的指导及帮助。感谢邝国平主任在我们临床实习期间给予的教导，和临床及理论知识的学习引导。感谢我实习期间带教彭正武、冯少颖、陈书杨老师给予的临床指导和生活上的帮助。感谢周小平老师、朱骏东老师、欧玉仑老师、秦牧老师、李征老师及住院部各位老师给予的支持和帮助。感谢何芳老师给予的视光方面的教导和学习帮助。感谢眼视光中心老师给予的支持和指导。感谢我的研究生郗晓云同学在学习上的帮助，生活中的陪伴。感谢各位研究生同学及朋友给予的各方面的帮助。感谢我辛劳的父母含辛茹苦把我养大，助我成长。给予我方方面面的关怀。我的今天的成绩是你们背后默默付出的成果，我的明天离不开你们的关心和爱护。在未来的日子里，我将更加努力，勇往直前，用我的感恩之心报答你们的支持。39
