血清乙二醛酶Ⅰ在2型糖尿病视网膜病变中的临床意义

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分类号：R587.1学校代码：10392学科专业代码：105101学号：1210307032福建医科大学硕士研究生毕业论文血清乙二醛酶І在2型糖尿病视网膜病变中的临床意义TheSignificanceOfGlyoxalaseILevelInSerumInType2DiabeticRetinopathy学位类型：临床医学硕士所在学院：协和临床医学院研究生：刘佩君学科、专业：内科学（内分泌与代谢病）导师：刘礼斌教授研究起止日期：2012年8月至2014年11月答辩日期：2014年5月27日二○一四年五月 目录英文缩略词释义表…………………………………………………………………………3中文摘要……………………………………………………………………………………4英文摘要……………………………………………………………………………………7正文…………………………………………………………………………………………11前言………………………………………………………………………………………11材料与方法………………………………………………………………………………12结果………………………………………………………………………………………21讨论………………………………………………………………………………………27结论………………………………………………………………………………………30致谢…………………………………………………………………………………………31参考文献……………………………………………………………………………………32综述…………………………………………………………………………………………341 英文缩略表缩略词英文名称中文名称GLOІglyoxalaseІ乙二醛酶ІAGEsadvancedglycationendproducts晚期糖基化终末产物RAGEreceptorforAGE晚期糖基化终末产物受体sRAGEsolubleRAGE可溶性晚期糖基化终末产物受体DMdiabetesmellitus糖尿病DRdiabeticretinopathy糖尿病视网膜病变NPDRnonproliferativediabeticretinopathy非增殖期糖尿病视网膜病变PDRproliferativediabeticretinopathy增殖期糖尿病视网膜病变BMIbodymassindex体重指数CHOLcholesterin胆固醇HDL-Chighdensitylipoproteincholesterol高密度脂蛋白胆固醇LDL-Clowdensitylipoproteincholesterol低密度脂蛋白胆固醇TGtriglyceride甘油三酯HbA1cglycosylatedhemoglobin糖基化血红蛋白FBGfastingblood-glucose空腹血糖2 血清乙二醛酶I在2型糖尿病视网膜病变中的临床意义中文摘要[目的]观察乙二醛酶I（GlyoxalaseІ，GLOІ）在2型糖尿病视网膜病变患者血清中的变化及与糖基化终末产物的相关性，探讨其在2型糖尿病视网膜病变中的潜在临床意义。[方法]入选2012年10月至2014年4月就诊福建医科大学附属协和医院内分泌科的2型糖尿病病人53例，于体检中心行健康体检的正常人28例，分为三组：健康对照组（N组）28例，平均年龄（55.93±6.21）岁，男性16例，女性12例；2型糖尿病无视网膜病变组（DM组）30例，平均年龄（59.37±6.93）岁，男性21例，女性9例；2型糖尿病伴视网膜病变组（DR组）23例，平均年龄（59.39±7.41）岁，男性12例，女性11例。收集一般资料：身高、体重、血压、病程、既往病史、糖尿病其他并发症情况、用药史，计算体重指数（BodyMassIndex，BMI，BMI=体重（kg）/身高2（m2））；检测空腹血糖（Fastingblood-glucose，FBG）、糖基化血红蛋白(Glycosylatedhemoglobin，HbA1c)、甘油三酯（triglyceride，TG）、胆固醇(cholesterin，CHOL)、高密度脂蛋白胆固醇(highdensitylipoproteincholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇（lowdensitylipoproteincholesterol，LDL-C）；同步使用酶联免疫分析法（ELISA）测定GLOІ、晚期糖基化终末产物（Advancedglycationendproducts，AGEs）、可溶性晚期糖基化终末产物受体（SolubleReceptorforadvancedglycationendproducts，sRAGE）含量；对确诊为2型糖尿病患者于眼科行详细的眼部检查最佳矫正视力、双眼非接触眼压、裂隙灯下外眼、角膜、瞳孔、晶状体检查，散瞳后裂隙灯显微镜下VOLK前置镜检查眼底、眼底照相。采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，计量资料采用完全随机设计的单因素方差分析(ANOVA)；计数资料采用χ2检验；各指标间的差异及相关性则采用直线相关分析及多元线性回归分析，以双侧P<0.05为有统计学意义。[结果]1.一般临床资料及生化指标的单因素方差分析：各组间年龄（N组：55.93±6.21岁，DM组：59.37±6.93岁，DR组：59.39±7.41岁）、甘油三酯（N组：2.63±1.68mmol/l，DM组：2.24±2.18mmol/l，DR组：1.51±1.45mmol/l）、低密度脂蛋白胆固醇（N组：2.80±0.46mmol/，DM组：3.09±0.83mmol/l，DR组：3.23±1.33mmol/l）、3 糖基化血红蛋白（DM组：9.04±2.70%，DR组：9.48±1.92%）差异无明显统计学意义（P>0.05），DM组的病程明显短于DR组（DM组：7.59±6.18年，DR组：11.65±8.46年；P<0.01）；N组的BMI、收缩压均显著低于DM组和DN组（BMI：N组：22.40±2.16kg/m2，DM组：25.00±2.88kg/m2，DR组：24.87±3.19kg/m2；收缩压：N组：119.18±15.37mmHg，DM组：135.03±19.83mmHg、DR组：144.04±23.69mmHg；两者P<0.01）；N组舒张压显著低于DM组（N组：73.68±10.05mmHg，DM组：81.10±7.06mmHg，DR组：81.39±13.13mmHg；P<0.05）；N组的胆固醇、空腹血糖均明显低于DM组和DR组（胆固醇：N组：2.88±1.71mmol/l，DM组：4.81±0.97mmol/l，DR组：9.24±3.47mmol/l；空腹血糖：（N组：5.11±0.39mmol/l，DM组：8.61±3.85mmol/l，DR组：9.24±3.47mmol/l；两者P<0.01），N组的高密度脂蛋白胆固醇明显高于DM组（N组：1.43±0.24mmol/l，DM组：1.12±0.27mmol/l，DR组：1.28±0.32mmol/l；P<0.01）。2.DM组、DR组中的其他糖尿病并发症情况、用药史、吸烟史等构成比行用χ2检验表明：糖尿病大血管病变、糖尿病周围神经病变、糖尿病肾病以及口服降糖药、高血压等在DM组和DN组间差异无明显统计学意义（P>0.05）。3.3组间GLOI、AGEs、LN（sRAGE）进行单因素方差分析表明：GLOI（N组：283.63±62.60ng/ml，DM组：247.59±46.19ng/ml，DR：205.81±43.71ng/ml）、AGE（N组：1119.77±427.65ng/ml，DM组：1741.00±354.20ng/ml，DR组：2066±599.70ng/ml）、LN（sRAGE）（N组：7.12±0.69ng/l，DM组：6.36±0.37ng/l，DR组：6.13±0.27ng/l）在N组、DM组、DR组间差异存在统计学意义（P<0.01），且GLOI、LN（sRAGE）在N组、DM组、DR组间呈逐渐递减趋势，AGEs在三组间则呈逐渐递增趋势。4.AGEs、GLOІ、LN（sRAGE）与一般资料及生化指标之间的相关性采用Pearson相关分析显示：GLOI与BMI、收缩压、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖、AGEs呈负相关，与LN（sRAGE）呈正相关；AGEs与年龄、BMI、舒张压、空腹血糖呈正相关，与GLOI、LN（sRAGE）呈负相关；LN(sRAGE)与BMI、收缩压、舒张压、胆固醇、空腹血糖、AGEs呈负相关，与甘油三酯、GLOI呈正相关。5.GLOI、AGEs、LN（sRAGE）的多元线性回归分析分析示：以课题分组、BMI、收缩压、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖为自变量，GLOI为因变量进行多元线性回归表明：课题分组对GLOI（P<0.01）有显著影响，即按着N组、DM组、DR组的分组顺序GLOI水平逐级降低31.15ng/ml；以课题分组、年龄、BMI、收缩压、舒4 张压、胆固醇、空腹血糖为自变量，AGEs为因变量进行多元线性回归表明：课题分组对AGEs（P<0.001）有显著影响，即按着N组、DM组、DR组的分组顺序AGEs水平逐级增高417.94ng/ml；以课题分组、BMI、收缩压、舒张压、甘油三酯、胆固醇、空腹血糖为自变量，LN（sRAGE）为因变量进行多元线性回归表明：课题分组对LN（sRAGE）（P<0.01）有显著影响，即按着N组、DM组、DR组的分组顺序LN（sRAGE）水平逐级降低0.296ng/l。[结论]1.GLOI、LN（sRAGE）在2型糖尿病视网膜病变患者血清中显著降低，且与血清中AGEs呈负相关，提示GLOI、sRAGE在延缓2型糖尿病视网膜病变的发生、发展中起着重要作用。5 [关键词]2型糖尿病视网膜病变，乙二醛酶I，晚期糖基化终末产物，可溶性晚期糖基化终末产物受体；6 TheSignificanceOfGlyoxalaseILevelInSerumInType2DiabeticRetinopathyABSTRACT[Objective]ObservedthechangesofserumGLOIintype2diabetesretinopathy,anddiscussitsrelatedtoAGEs、sRAGE,explorethepotentialclinicalsignificanceofGLOІintype2diabeticretinopathy.[Methods]53casesoftype2diabeticpatientswhohospitalizedintheDepartmentofEndocrinologywardofFujianMedicalUniversityUnionHospitaland28casesofcontrolpeoplewhowenttophysicalexaminationcenterforhealthexaminationin2012Octoberto2014Aprilwereenrolled.Dividedintothreegroups:normalcontrolgroup(Ngroup)28cases,meanage(55.93±6.21)years,16males,12females;type2diabeticpatientswithoutretinopathygroup(DMgroup)30cases,averageagewas(59.37±6.93)yearsold,male21cases,female9cases;type2diabetesmellituswithretinopathygroup(DRgroup)23cases,meanage(59.39±7.41)yearsold,male12cases,female11cases.Collectingdataofeachresearchobject:weight,height,bloodpressure,durationofdisease,pastmedicalhistory,diabetesothercomplications,medicationhistory,bodymassindex(BMI,BMI=bodyweight(kg)/height2(M2));fastingbloodglucose(FBG),glycosylatedhemoglobin(HbA1c),triglyceride(TG),cholesterol(CHOL),highdensitylipoproteincholesterol(HDL-C),lowdensitylipoproteincholesterol(LDL-C);synchronizationusingenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)fordeterminationofGLOI,AGEs,sRAGEcontent.Patientswhohaddiagnosedtype2diabetesmustdodetailedeyeexaminationssuchasbestcorrectedvisualacuity,binocularnoncontacttonometry,slitlampeye,cornea,pupil,lensaftermydriasis,slitlampmicroscopeVOLKfrontmirrorfundusexamination,fundusphotographyintheDepartmentofophthalmology.StatisticalanalysiswasperformedusingSPSS19.0statisticalsoftware,Singlefactorvarianceanalysiswasusedforcontinuousvariables;χ2testforcategoricalvariables;differencesandcorrelationamongtheindexeswereusinglinearcorrelationanalysisandmultiplelinearregressionanalysis.Two-sidedP-values<0.05wasconsideredstatisticallysignificant.7 [Results]1.Analysisofclinicaldataandbiochemicalindexesbysinglefactorvarianceanalysis:ageofeachgroup(groupN:55.93±6.21years,groupDM:59.37±6.93years,groupDR:59.39±7.41years),triglyceride(groupN:2.63±1.68mmol/l,groupDM:2.24±2.18mmol/l,groupDR:1.51±1.45mmol/l),lowdensitylipoproteincholesterol(groupN:2.80±0.46mmol/,groupDM:3.09±0.83mmol/l,groupDR:3.23±1.33mmol/l),glycosylatedhemoglobin(groupDM:9.04±2.70%,groupDR:9.48±1.92%)differencewasnotstatisticallysignificant(P>0.05),thedurationofgroupDMwassignificantlyshorterthangroupDR(groupDM:7.59±6.18years,groupDR:11.65±8.46years;P<0.01);BMIandsystolicbloodpressureingroupNweresignificantlylowerthangroupDMandgroupDN(BMI:group:N:22.40±2.16kg/m2,groupDM:25±2.88kg/m2,groupDR:24.87±3.19kg/m2;systolicbloodpressure:groupN:119.18±15.37mmHg,groupDM:135.03±19.83mmHg,groupDR:144.04±23.69mmHg;bothP<0.01);diastolicbloodpressureingroupNwaslowerthanthatingroupDM(groupN:73.68±10.05mmHg,groupDM:81.10±7.06mmHg,groupDR:81.39±13.13mmHg;P<0.05);cholesterol,fastingbloodglucoseingroupNweresignificantlylowerthanthatofgroupDMandgroupDR(cholesterol:Ngroup:2.88±1.71mmol/l,groupDM:4.81±0.97mmol/l,groupDR:9.24±3.47mmol/l;fastingbloodglucose:groupN:5.11±0.39mmol/l,groupDM:8.61±3.85mmol/l,groupDR:9.24±3.47mmol/l;bothP<0.01),highdensitylipoproteincholesterolingroupNwashigherthanthatingroupDM(groupN:1.43±0.24mmol/l,groupDM:1.12±0.27mmol/l,groupDR:1.28±0.32mmol/l;P<0.01).2.Theconstituentratiodifferenceofotherdiabetescomplications,medicationhistorybetweengroupDMandgroupDRwereanalyzingbyχ2testshowedthat:diabeticmacrovascularcomplications,diabeticperipheralneuropathy,diabeticnephropathyandoralhypoglycemicdrugs,highbloodpressureingroupDMandgroupDNwerenotstatisticallysignificantdifference(P>0.05).3.DifferenceofGLOI,AGEs,LN(sRAGE)betweenthe3groupsanalyzingbysinglefactorvarianceanalysisshowedthat:GLOI(groupN:283.63±62.60ng/ml,groupDM:247.59±46.19ng/ml,groupDR:205.81±43.71ng/ml),AGE(groupN:1119.77±427.65ng/ml,groupDM:1741±354.20ng/ml,groupDR:2066±599.70ng/ml),LN(sRAGE)8 (groupN:7.12±0.69ng/l,groupDM:6.36±0.37ng/l,groupDR:6.13±0.27ng/l)insignificantdifferencebetweenNgroup,DMgroup,DRgroup(P<0.01),andGLOI,LN（sRAGE）inNgroup,DMgroup,DRgrouparegraduallydecreasingtrend,whileAGEsbetweenthethreegroups,graduallyincreasingtrend.4.ThecorrelationbetweenAGEs,GLOI,LN(sRAGE)andthegeneralinformationandbiochemicalparametersusingPearsoncorrelationanalysisshowed:GLOIwasnegativelyrelatedwithBMI,systolicbloodpressure,cholesterol,lowdensitylipoproteincholesterol,fastingbloodglucose,AGEs,butpositivelycorrelatedwithLN(sRAGE);AGEswasnegativelyrelatedwithGLOI,LN(sRAGE),butpositivelycorrelatedwithage,BMI,diastolicbloodpressure,fastingbloodglucose;LN(sRAGE)wasnegativelyrelatedwithBMI,systolicbloodpressure,diastolicbloodpressure,cholesterol,fastingbloodglucose,AGEs,butpositivelycorrelatedwithtriglycerideandGLOI.5.MultiplelinearregressionanalysisofGLOI,AGEs,LN（sRAGE）showed:thesubjectgroup,BMI,systolicbloodpressure,cholesterol,lowdensitylipoproteincholesterol,fastingbloodglucoseasvariables,GLOIasthedependentvariableformultiplelinearregressionshowthat:subjectgroupsofGLOI(P<0.01)haveasignificanteffect,namely,accordingtotheNgroupinDMgroup,DRgroup,thepacketsequenceGLOIleveldecreased31.15ng/ml;Thensubjectgroup,age,BMI,systolicbloodpressure,diastolicbloodpressure,cholesterol,fastingbloodglucoseasvariables,AGEsasdependentvariablesformultivariatelinearregressionshowthat:subjecttogroupAGEs(P<0.001)haveasignificanteffect,namelyaccordingtothepacketsequenceAGEslevelofNgroup,DMgroup,DRgroupgraduallyincreasedto417.94ng/ml;subjectgroup,BMI,subjects,systolicbloodpressure,diastolicbloodpressure,triglyceride,cholesterol,fastingbloodglucoseasvariables,LN(sRAGE)asthedependentvariableformultipleregressionshowedthat:subjectgrouphaveasignificanteffecttoLN(sRAGE)(P<0.01),namely.ingroupN,groupDM,groupDRpacketsequenceLN(sRAGE)leveldecreased0.296ng/l.[Conclusion]ThelevelofserumGLOІ、LN（sRAGE）indiabeticretinopathypatientswassignificantlydecreased,andnegativecorrelationwithAGEs,sRAGEinserum,indicatingthatGLOImayplayanimportantroleintheinhibitionoftype2diabeticretinopathy9 occurrenceanddevelopment.[Keywords]diabeticretinopathy,glyoxalaseI,advancedglycationendproducts,solublereceptorforadvancedglycationendproducts;10 前言随着全球经济的快速发展，生活水平的提高，糖尿病的发病率显著增长，根据2007～2008年全国糖尿病流行病学调查结果，在年龄≥20岁的中国人群中，糖尿病和糖尿病前期患病率分别达为9.7%和15.5%，以此推算目前中国约有9240万成年人患有糖尿病，这意味着中国已成为全球糖尿病患者最多的国家[1]。而糖尿病视网膜病变作为糖尿病常见微血管并发症的一种，是目前成人致盲的主要原因，且其发病率亦相当高，国内“北京眼病研究(BeijingEyeStudy，BES)”报道45岁以上362例DM患者中DR患病率达27．9％[2]。“邯郸眼病研究(HandanEyeStudy，HES)”报道30岁以上387例DM患者中DR患病率达43．1％[3]。然而目前尚缺乏治疗晚期糖尿病视网膜病变患者失明的有效手段，故早期筛查，定期随诊，并进行治疗评估对延缓视网膜病变进展致盲相当重要，也是目前亟待解决的难题之一。对于糖尿病视网膜病变的发病机制目前仍未完全阐明，近年来多项研究发现“高血糖”对糖尿病并发症的发生发展中发挥着重要角色，持续高糖状态使体内MG等a-二羰基高糖毒性物质明显增加，后者可与蛋白质交联产生大量糖基化终末产物（AGEs），导致蛋白质结构、功能发生改变，影响其正常生理功能，诱发氧化应激、炎症因子的增加，同时亦通过细胞膜上其相应的受体（RAGE），促发下游细胞因子转导，激活NF-KB、凋亡关键酶半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)等表达，诱导活性氧(ROS)、炎症因子、VEGF产生增加，最终导致视网膜周细胞凋亡、血管通透性增加、基底膜增厚等。sRAGE是存在于血清中的RAGE，可与细胞膜上RAGE竞争结合AGE而不产生下游细胞信号转导，故可减少AGE-RAGE产生毒性作用，对细胞和血管起到一定的保护作用。GLOI作为乙二醛酶系统的限速酶，在有效清除MG等AGE前体中发挥着重要作用，正备受瞩目。近年来多项体外研究及动物模型研究发现GLOI可明显减少AGE的产生，可有效保护周细胞凋亡，同时也发现在糖尿病大鼠体内该酶的活性及浓度亦显著低于正常对照组。然而目前尚缺乏对人体内GLOI的相关报道，故本研究的目的在于观察GLOI在糖尿病视网膜病变患者中的变化，并探讨其与AGEs、RAGE及血清指标的相关性，旨在发现GLOI在2型糖尿病视网膜病变中的临床意义，为糖尿病视网膜病变的早期发现、早期干预治疗寻找新出路。11 材料与方法1.材料1.1主要仪器冷藏冰箱（BCD-215YDE，青岛海尔股份有限公司）超低温冰箱（MDF-382EN，日本三洋）电动离心机TGL-16（UH-NYS-DDLX-0001，上海医用分析仪器厂）可调量程移液枪（FinnpietteDigital40-500ulX04582，ShanghaiLabsystems）1.2主要试剂晚期糖基化终末产物酶联免疫吸附试剂盒96T，美国UscnLifeScience，CEB353Ge批号L140210124、L140402046）乙二醛酶І酶联免疫吸附测定试剂盒（96T，美国UscnLifeScience，SEA501Hu，批号L140219352、L140402045）晚期糖基化终末产物受体(AGER)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)（96T，美国Cloud-CloneCorp，SEA645Mu，批号L140108150、L140402047）2.方法2.1研究对象收集2012年10月至2014年4月就诊福建医科大学附属协和医院内分泌科的2型糖尿病病人53例，于体检中心行健康体检的正常人28例。2型糖尿病诊断标准：参照1999年WHO糖尿病诊断及分型标准[4]，典型糖尿病症状（口干、多饮、多尿、多食、体重下降等）加上随机血浆葡萄糖检测≥11.1mmol/L，或口服葡萄糖耐量试验2小时血糖≥11.1mmol/L，或空腹血糖大于等于7.0mmol/L。无症状者需改日重复一次确认诊断。排除1型糖尿病，其他特殊类型糖尿病、妊娠糖尿病。（空腹状态指至少8h没有进食热量）排除标准：糖尿病酮症酸中毒、糖尿病高渗性昏迷等急性并发症，急、慢性感染，三个月内发生过心肌梗死、脑梗塞、脑出血、手术史等，恶性肿瘤，严重的心肝肾功能不全，全身结缔组织病，血液病，严重的白内障以及其他疾病引起的视网膜血管病变，如高血压病、动静脉阻塞、视网膜动静脉周围炎、柯茨病等。12 糖尿病视网膜病变诊断：对确诊为2型糖尿病患者行眼底照相（佳能<中国>有限公司CR-1MarkII免散瞳眼底照相机），眼科行详细的眼部检查：采用国际标准对数视力表进行最佳矫正视力检查，双眼非接触眼压（美国徕卡显微系统公司AT-555非接触式眼压计），裂隙灯（苏州六六视觉科技股份有限公司YZ5裂隙灯显微镜）下外眼、角膜、瞳孔、晶状体检查，散瞳后裂隙灯显微镜下VOLK前置镜检查眼底。因严重白内障不能观察眼底者予排除筛查。检查结果根据根据2002年4月悉尼举行的国际眼科会议和美国眼科学会的联合会议制定的标准[5]对DR的严重程度进行分级登记（表1）表1糖尿病视网膜病变的国际临床分级标准病变严重程度散瞳眼底检查所见无明显视网膜病无异常变非增殖期仅有微动脉瘤（NPDR）轻中微动脉瘤，存在重于轻度NPDR重于重度NPDR的表现重出现下列任何一个改变，但无PDR表现：1.任一象限中有多于20处视网膜内出血2.在两个以上象限有静脉串珠样改变3.在一个以上象限有显著的视网膜内微血管异常增殖期（PDR）出现以下一种或多种改变：新生血管形成、玻璃体积血、纤维增生或视网膜前出血2.2分组（1）健康对照组（N组）：28例，平均年龄（55.93±6.21）岁，男性16例，女性12例，系2012年10月至2014年3月于福建医科大学附属协和医院体检中心接受健康体检的正常人。（2）2型糖尿病无视网膜病变组（DM组）：30例，平均年龄（59.37±6.93）岁，男性21例，女性9例，系2012年10月至2014年4月就诊福建医科大学附属协和医院内分泌科的2型糖尿病患者，符合上述2诊断标准及排除标准，眼底检查未见糖尿病视网膜病变表现13 者。（3）2型糖尿病伴视网膜病变组（DR组）：23例，平均年龄（59..37±6.93）岁，男性12例，女性11例，系2012年10月至2014年4月就诊福建医科大学附属协和医院内分泌科的2型糖尿病患者，符合上述2诊断标准及排除标准者。2.3基本情况及生化检查所有研究对象均在休息15分钟后安静状态下测量血压、身高、体重，计算体重指数（BMI，BMI=体重（kg）/身高2（m2）），记录糖尿病病程、既往眼、心肝肾脑等病史、高血压病史、吸烟酗酒史、用药史等；空腹状态（要求至少8h没有进食热量）下于清晨6－8时采集肘前静脉处静脉血，使用福建医科大学附属协和医院检验科德国罗氏公司ModularPPI全自动生化分析仪及其配套试剂测定空腹血糖、甘油三酯（TG）、胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），日本TOSOH公司全自动HbA1c分析仪HLC-723G7及配套试剂测定糖基化血红蛋白（HbA1c），同时采集适量静脉血于血清分离管，在室温放置2-4小时,然后3000转离心10分钟，留取血清于EP管中，置于-80oC冰箱冷藏保存。标本收集完全后统一测定AGEs、GLO-1、RAGE。2.3.1乙二醛酶I的测定2.3.1.1原理将GLOI抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的GLOI与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的GLOI抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的GLOI呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值)，计算样品浓度。14 2.3.1.2试剂盒内容与配置试剂盒内容：试剂名称数量试剂名称数量96孔板(预包被)196孔板覆膜4标准品2标准品稀释液1×20mL检测溶液A1×120μL检测稀释液A1×12mL检测溶液B1×120μL检测稀释液B1×12mLTMB底物1×9mL终止液1×6mL浓洗涤液(30×)1×20mL配备：450±10nm滤光片的酶标仪、单道或多道微量加液器及吸头、稀释样品的EP管、蒸馏水或去离子水、吸水纸、盛放洗液的容器2.3.1.3试剂准备（1）使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温(18-25oC)。（2）标准品(冻干品)：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为80ng/mL(贮液)。先将其稀释为20ng/mL(标准曲线最高浓度)后，再准备7个稀释标准品的EP管，每个EP管中加入500μL的标准品稀释液，依次倍比稀释成20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，标准品稀释液(0ng/mL)直接作为空白孔。（3）检测溶液A及检测溶液B：DetectionA及DetectionB在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液A或B1:100稀释，充分混匀。（4）浓洗涤液：用580mL蒸馏水或去离子水将20mL浓洗涤液稀释至600mL，进行30倍稀释。（5）底物溶液：请用灭菌的移液器吸头吸取所需体积的TMB至另一干净容器中使用。2.3.1.4操作步骤（1）加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的标准品。空白孔加100μL，余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37oC15 温育2小时。（2）弃去液体，甩干，不用洗涤。（3)每孔加检测溶液A工作液100μL(临用前配制)，酶标板加上覆膜，37oC温育1小时。（4）弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次，重复洗板3次。最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。（5）每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100μL，加上覆膜，37oC温育30分钟。（6）弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤（4）。（7）每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37oC避光显色(反应时间控制在15-25分钟，不要超过30分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止)。（8）每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。（9）在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(O.D.值)。（10）用标准物的浓度（x）与O.D.值（y）计算出标准曲线的回归方程式，将样品的O.D.值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。2.3.2晚期糖基化终末产物（AGEs）的测定2.3.2.1原理本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定标本中待测物质水平。将AGEs单克隆抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗体的微孔中同时加入生物素标记的抗原和待测抗原(标准品或样本)，待测抗原与生物素标记抗原对特异性抗体进行竞争结合。温育后经洗涤去掉未结合物，然后加入HRP标记的亲和素，经过温育和彻底洗涤后加入底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。待测标本浓度越高，标记抗原和抗体的结合就越受到抑制，显色愈浅。显色的深浅与酶量呈正相关，而与样品中待测物质含量呈负相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（O.D.值），计算样品浓度。16 2.3.2.2试剂盒内容和配备试剂盒内容：试剂名称数量试剂名称数量96孔板(预包被)196孔板覆膜4标准品2标准品稀释液1×20mL检测溶液A1×120μL检测稀释液A1×12mL检测溶液B1×120μL检测稀释液B1×12mLTMB底物1×9mL终止液1×6mL浓洗涤液(30×)1×20mL配备：450±10nm滤光片的酶标仪、单道或多道微量加液器及吸头、稀释样品的EP管、蒸馏水或去离子水、吸水纸、盛放洗液的容器2.3.2.3试剂准备（1）使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温(18-25oC)，试剂不能直接在37oC溶解。（2）标准品(液体)：每瓶标准品加入标准品稀释液0.7mL，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为8,000ng/mL。准备5个稀释标准品的EP管，每个EP管中加入600μL的标准品稀释液，如图所示依次三倍稀释成8.000ng/mL,2666.7ng/mL,888.9ng/mL,296.3ng/mL,98.8ng/mL，标准品稀释液(0ng/mL)直接作为空白孔。（3）检测溶液A及检测溶液B：DetectionA及DetectionB在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液A或B1:100稀释，充分混匀。（4）浓洗涤液：用580mL蒸馏水或去离子水将20mL浓洗涤液稀释至600mL，进行30倍稀释。（5）底物溶液：用灭菌的移液器吸头吸取所需体积的TMB至另一干净容器中使用。2.3.2.4操作步骤（1）加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔5孔，依次加入50μL不同浓度的标准品。空白孔加50μL，余孔加待测样品50μL，然后立即每孔加检测溶液A17 工作液50μL，轻轻振动，混匀，注意不要有气泡，酶标板加上覆膜，37oC温育1小时。（2）弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次，重复洗板3次。最后一次洗涤后，把孔内的洗涤液完全甩干。（3）每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100μL，加上覆膜，37oC温育30分钟。（4）弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤（2）。（5）每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37oC避光显色(反应时间控制在15-25分钟，不超过30分钟。当标准孔的后面3孔有明显的梯度蓝色，前3孔梯度不明显时，即终止)。（6）每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。（7）在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(O.D.值)。（8）用标准物的浓度（x）与O.D.值（y）计算出标准曲线的回归方程式，将样品的O.D.值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。2.3.3可溶性晚期糖基化终末产物受体（sRAGE）的测定2.3.3.1原理将sRAGE抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的RAGE与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的sRAGE抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的sRAGE呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值)，计算样品浓度。18 2.3.3.2试剂盒内容及配备试剂盒内容：试剂名称数量试剂名称数量96孔板(预包被)196孔板覆膜4标准品2标准品稀释液1×20mL检测溶液A1×120μL检测稀释液A1×12mL检测溶液B1×120μL检测稀释液B1×12mLTMB底物1×9mL终止液1×6mL浓洗涤液(30×)1×20mL配备：450±10nm滤光片的酶标仪、单道或多道微量加液器及吸头、稀释样品的EP管、蒸馏水或去离子水、吸水纸、盛放洗液的容器2.3.3.3试剂准备（1）使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温(18-25oC)。（2）标准品(冻干品)：每瓶标准品加入标准品稀释液0.5mL，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10ng/mL。准备7个稀释标准品的EP管，每个EP管中加入250μL的标准品稀释液，依次倍比稀释成10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，0.156ng/mL，标准品稀释液(0ng/mL)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。（3）检测溶液A及检测溶液B：DetectionA及DetectionB在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液A或B1:100稀释，充分混匀。（4）浓洗涤液：用580mL蒸馏水或去离子水将20mL浓洗涤液稀释至600mL，进行30倍稀释。（5）底物溶液：请用灭菌的移液器吸头吸取所需体积的TMB至另一干净容器中使用。2.3.3.4操作步骤（1）加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的标准品。空白孔加100μL，余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37oC19 温育2小时。（2）弃去液体，甩干，不用洗涤。（3）每孔加检测溶液A工作液100μL(临用前配制)，酶标板加上覆膜，37oC温育1小时。（4）弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次(也可轻拍将孔内液体拍干)，重复洗板3次。最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。（5）每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100μL，加上覆膜，37oC温育30分钟。（6）弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤（4）。（7）每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37oC避光显色(反应时间控制在15-25分钟，不要超过30分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止)。（8）每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。（9）在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(O.D.值)。（10）用标准物的浓度（x）与O.D.值（y）计算出标准曲线的回归方程式，将样品的O.D.值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。2.4统计学分析所有数据资料录入计算机，采用IBMSPSS19.0统计软件进行统计学分析，计量资料结果用均数±标准差表示，组间均数比较采用完全随机设计的单因素方差分析(ANOVA)，相关分析采用Pearson相关性分析。计数资料采用χ2检验。因病程、BMI、收缩压、空腹血糖、CHOL、HDL-C等在组间有显著性差异，为排除上述因素对研究结果可能造成的影响，分别进行多元线性回归分析。以双侧P<0.05为有统计学意义。20 结果1.健康组（N组）、糖尿病无视网膜病变组（DM组）、糖尿病视网膜病变组（DR组）一般资料及血清学生化指标比较。1.1对健康组（N组）、糖尿病无视网膜病变组（DM组）、糖尿病视网膜病变组（DR组）的年龄、病程、BMI、收缩压、舒张压、血清学生化指标进行单因素方差分析表明（表2）：各组间年龄（N组：55.93±6.21岁，DM组：59.37±6.93岁，DR组：59.39±7.41岁）、甘油三酯（N组：2.63±1.68mmol/l，DM组：2.24±2.18mmol/l，DR组：1.51±1.45mmol/l）、低密度脂蛋白胆固醇（N组：2.80±0.46mmol/，DM组：3.09±0.83mmol/l，DR组：3.23±1.33mmol/l）、糖基化血红蛋白（DM组：9.04±2.70%，DR组：9.48±1.92%）差异无明显统计学意义（P>0.05），病程在DM组和DR组间的差异有统计学意义（DM组：7.59±6.18年，DR组：11.65±8.46年，P<0.01），DM组的病程明显短于DR组；BMI（N组：22.40±2.16kg/m2，DM组：25.00±2.88kg/m2，DR组：24.87±3.19kg/m2）、收缩压（N组：119.18±15.37mmHg，DM组：135.03±19.83mmHg、DR组：144.04±23.69mmHg）分析发现N组与DM组、DR组间差异有统计学意义（P<0.01），N组的BMI、收缩压均显著低于DM组和DN组，而DM组与DN组的上述指标间则无显著性差异（P>0.05）。舒张压（N组：73.68±10.05mmHg，DM组：81.10±7.06mmHg，DR组：81.39±13.13mmHg）在3组间差异存在统计学意义（P<0.01），其中N组与DM组间存在显著差异（P<0.05），余各组间差异无统计学意义（P>0.05）。胆固醇（N组：2.88±1.71mmol/l，DM组：4.81±0.97mmol/l，DR组：9.24±3.47mmol/l）、高密度脂蛋白胆固醇（N组：1.43±0.24mmol/l，DM组：1.12±0.27mmol/l，DR组：1.28±0.32mmol/l）、空腹血糖（N组：5.11±0.39mmol/l，DM组：8.61±3.85mmol/l，DR组：9.24±3.47mmol/l）在各组间的差异存在统计学差异（P<0.05），两两比较发现N组的胆固醇、空腹血糖和DM组、DR组间差异具有统计学意义（P<0.01），N组的胆固醇、空腹血糖均明显低于DM组和DR组，而DM组与DR组的胆固醇、空腹血糖差异无统计学意义（P>0.05），高密度脂蛋白胆固醇在N组与DM组间差异存在统计学意义（P<0.01）,在N组与DR组、DR组与DM组间差异则无明显统计学意义（P>0.05），N组的高密度脂蛋白胆固醇明显高于DM组。21 表2N组、DM组、DR组间一般资料及血清生化学指标的比较N组（n=28）DM组（n=30）DR组（n=23）p年龄（岁）55.93±6.2159..37±6.9359.39±7.410.104病程（年）—7.59±6.18b11.65±8.460.049BMI（kg/m2）22.40±2.16ab25.00±2.8824.87±3.190.001收缩压（mmHg）119.18±15.37ab135.03±19.83144.04±23.690.000舒张压（mmHg）73.68±10.05a81.10±7.0681.39±13.130.008TG（mmol/l）2.63±1.682.24±2.181.51±1.450.088CHOL（mmol/l）2.88±1.71ab4.81±0.975.13±1.480.000LDL（mmol/l）2.80±0.463.09±0.833.23±1.330.228HDL（mmol/l）1.43±0.24a1.12±0.271.28±0.320.001FBG（mmol/l）5.11±0.39ab8.61±3.859.24±3.470.000HBA1c（％）—9.04±2.709.48±1.920.503aP<0.05VSgroupDM；bP<0.05VSgroupDR21.2DM组、DR组中的其他糖尿病并发症、用药史等构成比用χ检验进行比较表明（表3）：糖尿病大血管病变、糖尿病周围神经病变、糖尿病肾病以及口服降糖药、高血压等在DM组和DN组间差异无明显统计学意义（P>0.05）.22 表3DM组、DR组间既往史、其他糖尿病并发症、用药史等构成比比较DM组（n=30）DR组（n=23）卡方检验P值（双侧）糖尿病大血管病变[例（%）]16（53.3%）13（56.5%）0.817糖尿病周围神经病变15（50%）11（47.8%）0.875糖尿病肾病6（20%）7（30.4%）0.382胰岛素13（43.3%）17（73.9%）0.026口服降糖药25（83.3%）16（69.6%）0.235磺脲类7（23.3%）8（34.8%）0.359格列奈类7（23.3%）2（8.7%）0.299二甲双胍18（60%）12（52.2%）0.569噻唑烷二酮4（13.3%）2（8.7%）0.928a-糖苷酶抑制剂15（50.0%）6（26.1%）0.078DPP-IV/GLP-12（6.7%）0（0.0%）0.499降压药9（30.0%）13（56.5%）0.052利尿剂1（3.3%）1（4.3%）1.000B-受体阻滞剂2（6.7%）3（13.0%）0.754CCB10（33.3%）8（34.8%）0.912ACEI1（3.3%）2（8.7%）0.812ARB8（26.7%）4（17.4%）0.424a-受体阻滞剂0（0%）0（0%）—抗血小板药9（30.0%）4（17.4%）0.290降脂药6（20.0%）2（8.7%）0.4522.健康组（N组）、糖尿病无视网膜病变组（DM组）、糖尿病视网膜病变组（DR组）间GLO-1、AGEs、RAGE的比较（表4）。对健康组（N组）、糖尿病无视网膜病变组（DM组）、糖尿病视网膜病变组（DR组）的GLOI、AGEs、LN（sRAGE）进行单因素方差分析表明：GLOI（N组：283.6323 ±62.60ng/ml，DM组：247.59±46.19ng/ml，DR：205.81±43.71ng/ml）、AGE（N组：1119.77±427.65ng/ml，DM组：1741.00±354.20ng/ml，DR组：2066±599.70ng/ml）、LN（sRAGE）（N组：7.12±0.69ng/l，DM组：6.36±0.37ng/l，DR组：6.13±0.27ng/l）在N组、DM组、DR组间差异存在统计学意义（P<0.01），两两比较示GLOI、LN（sRAGE）在N组、DM组、DR组间呈逐渐递减趋势，AGEs在三组间则呈逐渐递增趋势。表4N组、DM组、DR组间GLO-1、AGEs、LN（sRAGE）的比较N组（n=28）DM组（n=30）DR组（n=23）P值GLOI（ng/ml）283.63±62.60ab247.59±46.19b205.81±43.710.000AGEs（ng/ml）1119.77±427.65ab1741.00±354.20b2066±599.700.000LN（sRAGE）(ng/l)7.12±0.69ab6.36±0.37b6.13±0.270.000注：aP<0.05VSgroupDM；bP<0.05VSgroupDR图1N组、DM组、DR组间GLO-1、AGEs、LN（sRAGE)的比较注：aP<0.05VSgroupDM；bP<0.05VSgroupDR；GLOI、AGEs数值见左纵坐标，LN（sRAGE）数值见右纵坐标。3.GLO-1、AGEs、LN（sRAGE）与一般资料、血清学临床资料的相关性描述（表5）。1.1AGEs、GLOІ、LN（sRAGE）与一般资料及生化指标之间的相关性采用Pearson相关分析显示：GLOI与BMI、收缩压、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖、AGEs24 呈负相关，与LN（sRAGE）呈正相关；AGEs与年龄、BMI、舒张压、空腹血糖呈正相关，与GLOI、LN（sRAGE）呈负相关；LN（sRAGE）与BMI、收缩压、舒张压、胆固醇、空腹血糖、AGEs呈负相关，与甘油三酯、GLOI呈正相关。表5GLOI、AGE、LN（sRAGE）与一般资料、血清学生化指标之间的Pearson相关性分析GLOIAGEsLN（sRAGE）年龄（岁）——0.229*——病程（年）——————BMI（kg/m2）-3.00**0.225*-0.291**收缩压（mmHg）-2.38*——-0.369**舒张压（mmHg）——0.409**-0.238*TG（mmol/l）————0.332**CHOL（mmol/l）-3.28**——-0.523**LDL（mmol/l）-2.25*————HDL（mmol/l）——————FBG（mmol/l）-2.44*0.411**-0.315**HBA1c（％）——————GLOI（ng/ml）——-0.378**0.342**AGE（ng/ml）-3.78**——-0.456**LN（sRAGE）(ng/l)0.342**-0.456**——*在0.05水平（双侧）上显著相关，**在0.01水平（双侧）上显著相关1.2根据表1、4结果提示病程、BMI、收缩压、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖等在各组间存在显著差异，各组间不均衡，且GLOI、AGEs、LN（sRAGE）与多个指标存在相关性，为排除这些因素对研究结果产生的影响，于采用多元线性回归方法进行分析。以课题分组、BMI、收缩压、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖为自变量，GLOI为因变量进行多元线性回归表明：课题分组对GLOI（P<0.01）有显著影响，即按着N组、DM组、DR组的分组顺序GLOI水平逐级降低31.15ng/ml；以课题分25 组、年龄、BMI、收缩压、舒张压、胆固醇、空腹血糖为自变量，AGEs为因变量进行多元线性回归表明：课题分组对AGEs（P<0.001）有显著影响，即按着N组、DM组、DR组的分组顺序AGEs水平逐级增高417.94ng/ml；以课题分组、BMI、收缩压、舒张压、甘油三酯、胆固醇、空腹血糖为自变量，LN（sRAGE）为因变量进行多元线性回归表明：课题分组对LN（sRAGE）（P<0.01）有显著影响，即按着N组、DM组、DR组的分组顺序LN（sRAGE）水平逐级降低0.296ng/l。（表6）表6GLOI、AGE、LN（sRAGE）多元线性回归分析调整R2β（SE）95%CIPGLOI0.247-31.147（56.387）-49.776，-12.5170.001AGE0.542417.936（62.469）293.436，542.436<0.001LN（sRAGE）0.404-0.296（0.094）-0.484，-0.1080.00226 讨论糖尿病视网膜病变已成为成人致盲的主要原因之一，国外相关研究报道在糖尿病确诊后20-30年中的发生率达到90%，其中晚期病变，即增殖期糖尿病视网膜病变的发生率更是达到60%6。尽管近几十年进行了多项研究，但迄今为止未找到阻止糖尿病视网膜发生发展的方法，故对糖尿病患者进行早期发现、并正确评估和治疗对延缓糖尿病视网膜病变的发生发展至关重要，也是在能够找到治愈糖尿病之前我们所能做的。临床上往往会碰到很多困惑我们的现象：有的患者发现糖尿病后短期内便出现了糖尿病视网膜病变，然而有些患者糖尿病病史长达二三十年，仍未出现糖尿病视网膜病变；而在糖尿病视网膜病变的发展速度上个体亦存在明显差异，这促使我们更加努力去探索糖尿病视网膜病变的发病机制，寻找延缓甚至阻止病变发生发展的有效治疗方法，然而糖尿病视网膜病变的发病机制很多，目前尚未完全阐明，其中慢性高血糖是诱发糖尿病视网膜病变的最主要的因素，它可通过各种各样的机制对视网膜血管和周细胞造成损伤，如增加晚期糖基化终末产物、激活蛋白激酶C、刺激多元醇途径、增强活性氧化物质、调节血管炎症、改变生长因子和细胞因子的基因表达、血小板和巨噬细胞活化等等。糖尿病控制及并发症试验组(DCCT)临床试验以及英国糖尿病前瞻性研究(UKPDS)均证实了早期强化治疗，控制血糖，能够有效延缓糖尿病视网膜病变的发生、发展，进一步表明高血糖在糖尿病并发症的发生中占据主导地位。本文就高血糖引起的晚期糖基化终末产物AGEs增加以及对其有有效抑制作用的乙二醛酶I、可溶性糖基化终末产物受体在糖尿病视网膜病变中的意义做进一步阐述。糖尿病视网膜病变的早期组织学特征表现为周细胞的凋亡，随后出现视网膜微血管内皮细胞功能减退，血管的通透性增加导致了大量血清、蛋白质等的渗出，血管硬化、基底膜增厚、内皮细胞功能障碍均能加剧管腔狭窄，视网膜即出现了无灌注区，而后者是诱发内皮生长因子（VEGF）等细胞生长因子生成的因素之一。新生血管的大量生成加之内皮功能不全加剧血管通透性，且增殖的血管较脆弱易破裂出血出现视网膜前、玻璃体出血等。多种因素包裹晚期糖基化终末产物毒性作用、炎症因子瀑布、氧化应激增强、表观遗传修饰的改变等等参与了糖尿病视网膜病变发病过程，其中晚期糖基化终末产物对视网膜周细胞、微血管的损伤正备受瞩目。本次研究发现2型糖尿病患者体内糖基化终末产物含量显著高于健康对照组，且存在糖尿病视网膜病变患者其含量亦显著高于糖尿病无视网膜病变者，与BenteKilhovd[7]27 等在2型糖尿病患者的发现相一致，Padival[8]等在链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病大鼠动物试验中亦有同样的发现。在持续的高糖环境下，细胞内外高糖负荷增加，葡萄糖可通过自动氧化形成乙二醛、糖酵解生成丙酮醛、与蛋白质等物质的氨基进行缩合重排形成Amadori产物后分解生成3-脱氧葡萄糖醛酮等等产生大量的具有高糖毒性的二羰基[9]，后者是能够与蛋白质、脂质、核酸等发生一系列复杂的非酶促反应形成稳定的晚期糖基化终末产物[10]，即是本次研究的实验对象之一。该物质可在视网膜血管、神经元、神经胶质等处大量积累，且与视网膜病变的严重程度及临床进展密切相关[11,12,13,14]。首先晚期糖基化终末产物可直接作用于细胞内外间的蛋白质，使其正常生理作用丧失，诱使周细胞凋亡，血管通透性改变，诱发细胞生长因子如血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子（IGF）等生成增加，导致新生血管形成、基底膜增厚等，其次还可通过细胞膜上对应的受体即晚期糖基化终末产物受体（sRAGE）激活下游细胞信号转导，如激活ras基因产物p21，细胞外信号相关激酶1和2、NF-kB等表达，诱导活性氧(ROS)及炎症因子产生，降低B细胞淋巴瘤／白血病-2／Bax(bcl-2／Bax)比例，激活凋亡关键酶半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)，诱发周细胞凋亡，上调VEGF，从而促进视网膜血管增厚并增加视网膜屏障的通透性[15]。可见晚期糖基化终末产物对视网膜细胞、血管的损害以及糖尿病视网膜发展中发挥重要作用，若能在糖尿病发病早期有效控制高血糖，采取有效措施降低晚期糖基化终末产物的堆积，如有效控制血糖，解除慢性高糖状态，将能有效延缓糖尿病视网膜病变的发生、发展。在晚期糖基化终末产物的形成过程中，乙二醛酶I作为体内乙二醛系统中的限速酶，能够有效降解清除AGEs前体，从而减少晚期糖基化终末产物的形成。乙二醛酶系统的生理过程需要谷胱甘肽催化，首先，α-羰基醛和谷胱甘肽可自发形成硫代半缩醛，乙二醛酶Ⅰ催化其异构化，生成S-2-乳酰谷胱甘肽的衍生物，接着经乙二醛酶Ⅱ催化生成α-羟基酸和谷胱甘肽。乙二醛酶Ⅰ是乙二醛酶系统的限速酶，作为体内α-羰基醛主要的解毒酶，能有效抑制由α-羰基醛衍生的晚期糖基化终末产物的生成[16]。Padival[8]等研究亦发现链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠晶体中的乙二醛酶Ⅰ含量及活性明显降低，本次研究结果亦表明随着糖尿病的发生以及糖尿病视网膜病变的出现，患者体内乙二醛酶I的浓度逐渐下降。同时Ranganathan[17]在研究分析GLO1基因启动子时发现，在糖尿病状态下，与GIOI表达相关的胰岛素应答元件出现功能障碍致使GLOI表达减少、活性下降。在AGEs前体大量形成的状态下又缺乏足够的乙二醛酶I去降解这些28 毒性物质，AGEs前提和晚期糖基化终末产物进一步堆积，形成恶性循环。Miller[18]等研究发现在高糖下孵育的人视网膜周细胞中加入乙二醛酶I抑制剂后，则观察周细胞大量凋亡，与未加入抑制剂前未观察到凋亡形成鲜明对比，而过表达乙二醛酶I又可防止这一现象的发生，这表明乙二醛酶I可减少高糖环境下人视网膜周细胞的凋亡，对周细胞的存活至关重要，乙二醛酶I活性的降低可能促进早期糖尿病视网膜病变的发展。故提高体内乙二醛酶I的浓度和活性将有望减少体内晚期糖基化终末产物的堆积，从而保护周细胞、血管功能正常，减少视网膜并发症的发生和发展。为减少晚期糖基化终末产物对视网膜造成的损伤，不仅可通过有效控制血糖减少晚期糖基化终末产物前提的形成、增加乙二醛酶I浓度和活性加速活性二羰基降解，从而减少晚期糖基化终末产物的形成，我们还可通过阻断其作用的途径来寻找新的治疗方法。总所周知晚期糖基化终末产物可通过其受体结合后启动若干信号转导，激活氧化应激、炎症因子瀑布、NF-kB等等对细胞及血管造成损伤，很多研究表明，RAGE不仅参与糖尿病慢性并发症的发生、发展，还与炎症反应、肿瘤的侵袭和转移、神经再生、Alzheimer病有关[19,20,21]。可溶性晚期糖基化终末产物受体（sRAGE）存在于血清中，它缺乏缺乏羰基末端，即缺乏跨膜结构域而无法锚定在细胞膜上，与细胞膜上的RAGE不同，血清中的RAGE虽仍能与AGE结合，但可与细胞膜上的RAGE竞争，从而阻断了AGE-RAGE产生的细胞反应[22]，HalaO[23]的研究结果显示血清sRAGE的水平在NPDR和PDR患者明显低于没有糖尿病视网膜病变的健康者，与本次研究结果相一致，表明sRAGE是组织糖尿病视网膜病变加速发展的一个内源性保护因子。通过有效增加血清sRAGE的含量，可在一定程度上抑制AGEs-RAGE交联，从而阻断下游细胞信号的转导。29 结论GLOI、LN（sRAGE）在2型糖尿病视网膜病变患者血清中显著降低，且与血清中AGEs呈负相关，提示GLOI、sRAGE在延缓2型糖尿病视网膜病变的发生、发展中起着重要作用。30 致谢值此论文完成之际，谨向我的导师刘礼斌教授对我的悉心培养、关怀和指导表示由衷的感谢。本论文的最终完成，离不开老师的细心指导与支持，他渊博的学识、用于创新的科研思维以及严谨的工作作风，是我学习的楷模，使我受益终生。感谢福建医科大学附属协和医院眼科陈平主任、卢岚主任、福建省内分泌研究所各位同学在收集标本和实验过程中提供的无私帮助和支持以及在实验技术方面给予的指导，使我可以顺利完成论文。感谢福建医科大学附属协和医院内分泌科邱晓萍主任、王燕萍师姐在临床工作中的指导和鼓励，感谢各个临床科室的带教老师在研究生轮转期间给予我的帮助与指导，他们的耐心教导使我三年间学到了许多专业知识和临床技能。同时，感谢一直关心、帮助我的家人和朋友，他们的支持令我有信心和力量最终完成学业。31 参考文献1YangW,LuJ,WengJ,etal.PrevalenceofdiabetesamongmenandwomeninChina[J].NEnglJMed,2010,362(12):1090-1101.2XieXW，XuL．WangYX．eta1．Prevalenceandassociatedfactorsofdiabeticretinopathy．TheBeijingEyeStudy2006．EurJOphthalmel．2009．19：91-993WangFH，LiangYB，zhangF，eta1．Prevalenceofdiabeticretinopathyinruralchina：theHandanEyeStudy．OphthaJmolagy，2009。116：461-467．4Reportoftheexpertcommitteeonthediagnosisandclassificationofdiabetesmellitus.DiabetesCare1997;20:1183-1197.5WilkinsonCP,FcrrisFLIII,KlcinRE,LccPP,AgardhCD,DavisM.Proposedinternationalclinicaldiabeticretiopathyanddiabeticmacularedemadiseaseseverityscales.Ophthalomligy,2003:110(9):1677-1682.6Fong,DonaldS.;Aiello,Lloyd;Gardner,DiabeticRetinopathy，DiabetesCare，2003，26,226−229.7BenteK.Kilhovd，ToreJulsrudBerg，KoreI.Birkeland，PerThorsby，KristianF.Hanssen，SerumLevelsofAdvancedGlycationEndProductsAreIncreasedinPatientsWithType2DiabetesandCoronaryHeartDisease，DIABETESCARE,1999（22）：1543-488PadicalS,NagarajRH.Pyridoxamineinhibitsmaillardreactionsindiabeticratlenses[J].OphthalmicRes,2006,38(5):294-302.9MoritsuguShinohara,P.J.Thornalley,IdaGiardino,Overexpressionofglyoxalase-Iinbovineendothelialcellsinhibitsintracellularadvancedglycationendproductformationandpreventshyperglycemia-inducedincreasesinmacromolecularendocytosis,JournalofClinicalInvestigation,1998,101:1142-1147.10郭晓敏，晚期非酶糖基化终末产物(AGEs)及其临床意义，<国外医学>秘尿系统分册，1998,18（3）：121-124.11StittAW,LiYM,GardinerTA,BucalaR,ArcherDB,etal.Advancedglycationendproducts(AGEs)co-locarizewithAGEreceptorsintheretinalvasculatureofdiabeticandAGE-infusedrats.AmJPathol1997;150:523-31.12BucalaR,VlassaraH.Advancedglycosylationendproductsindiabeticrenalandvasculardisease.AmJKidneyDis.1995;26:875–88.13MakitaZ,BucalaR,RayfieldEJ,etal.Reactiveglycosylationendproductsindiabeticuraemiaandtreatmentofrenalfailure.Lancet.1994;343:1519–22.32 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