蚜虫内共生菌Buchnera+aphidicola对黄瓜花叶病毒（CMV）传播的影响

《蚜虫内共生菌Buchnera+aphidicola对黄瓜花叶病毒（CMV）传播的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

硕士学位论文蚜虫内共生菌Buchneraaphidicola对黄瓜花叶病毒（CMV）传播的影响研究生姓名严硕指导教师张德咏研究员学科专业微生物学研究方向植物病毒与昆虫互作二0一七年六月 分类号密级UDC单位代码10537.….湖南农业大学硕士学位论文蚜虫内共生菌Buchneraaphidicola对黄瓜花叶病毒（CMV）传播的影响TheeffectofaphidendosymbiontBuchneraaphidicolaonthetransmissionofCucumbermosaicvirus研究生姓名严硕指导教师张德咏研究员戴良英教授学科专业微生物学研究方向植物病毒与昆虫互作论文答辩日期答辩委员会主席论文评阅人二0一七年六月 I 摘要昆虫介体在传播植物病毒的过程中与植物病毒相互作用，昆虫介体的细菌共生体是否参与了病毒的传播过程在这一领域仍缺乏研究。蚜虫是黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）的传播介体，有研究表明，蚜虫内共生菌Buchnera，在蚜虫取食和在植物上定殖过程中影响蚜虫与植物的互作，这种影响可能有利于病毒的传播。本实验针对这一科学问题，研究了桃蚜内共生菌Buchnera对桃蚜生长发育的影响、CMV侵染对桃蚜体内Buchnera的影响、Buchnera对植物挥发物的影响，并进一步研究了植物挥发物对病毒传播的影响，主要结果如下：1、用200μg/mL利福平处理后的桃蚜，其BuchneradnaK的表达量显著降低。2、比较了健康桃蚜和利福平处理后的桃蚜在三种蔬菜上的生长发育和繁殖情况。结果表明，用200μg/mL利福平处理后的桃蚜产蚜量、寿命和体重都显著低于健康桃蚜。3、桃蚜携带CMV后，其内共生菌BuchneradnaK的含量显著降低。4、带毒桃蚜与利福平处理后的桃蚜取食的植物挥发物成分发生改变，趋避性挥发物含量升高，吸引性挥发物含量降低。5、带毒桃蚜及200μg/mL利福平处理后的桃蚜都趋向于健康植物，促进了病毒的传播。根据以上结果可以推测，感染CMV的桃蚜内共生菌含量降低，改变了植物挥发物的组分，导致趋避性挥发物含量升高，吸引性挥发物含量降低，从而改变了桃蚜的选择性，使其趋向于健康植物，促进了植物病毒的传播。关键字：桃蚜；黄瓜花叶病毒；Buchnera；挥发物III AbstractPlantvirusinteractswithinsectvectorsduringtheprocessofplantvirustransmisson.Anareaofdeficientinthefieldiswhetherbacterialsymbiontsofinsectvectorsareinvolvedinthevirustransmissonprocess.AphidisthetransmissonvectorofCucumbermosaicvirus(CMV).Previousresearchshowedthat,Myzuspersicae(Sulzer)endosymbiont,Buchneraahpidicolacanaffecttheinteractionofaphidsandplantsintheprocessoffeedingandcolonizing,andthiseffectmayfacilitatevirustransmission.Ourresearchaimedonthisscientificquestion,andsurveyedtheeffectofBuchneraonaphidperformance,andeffectofCMVinfectiononBuchneraofaphids,andeffectofBuchneraonplantvolatilesandfurtherinvestigatedtheroleofplantvolatileinvirustransmission.Themainresultsareasfollows:1.TheexpressionofBuchneradnaKinahphidstreatedwith200μg/mLrifampicinwassignificantlydecreased.2.WecomparedthegrowthandreproductionofMyzuspersicaeuntreatedandtreatedwithrifampicinonthreekindsofvegetables.Theresultsshowedthataftertreatedwith200μg/mLrifampicin,thereproduction,lifespanandbodyweightofaphidsweresignificantlylowerthanthatofthehealthyaphids.3.TheexpressionofBuchneradnaKinahphidsfeedingofaphidsonCMV-infectedplantswassignificantlydecreased.4.TheaphidsacquiredCMVortreatedbyrifampinalteredthecomponentoftheplantvolatilesafterfeedingonplants,therelativecontentofrepellentvolatileswereincreasedandtherelativecontentofattractivevolatilesweredecreased.5.TheaphidsacquiredCMVandtreatedby200μg/mLrifampinwerepreferredtohealthyplants,andvirustransmissionwaspromoted.AccordingtotheresultswecanspeculatethatthereductionofBuchneradensityalteredthecomponentofplantvolatiles,leadingtotheincreasedcontentofrepellentvolatileandthedecreasedcontentofattractivevolatile,therebyaphidschangedtheirpreferencetohealthyIV plants,andpromoteCMVspreaded.Keywords:Myzuspersicae；Cucumbermosaicvirus(CMV)；Buchnera；volatileV 目录摘要......................................................................................................................................IIIAbstract..................................................................................................................................IV目录....................................................................................................................................VI第一章文献综述....................................................................................................................11.1黄瓜花叶病毒的分类地位...............................................................................................11.2黄瓜花叶病毒的危害.......................................................................................................11.3黄瓜花叶病毒的传播方式................................................................................................11.4影响黄瓜花叶病毒的传播效率的因素............................................................................11.4.1蚜虫的生活史对病毒传播效率的影响.........................................................................21.4.2蚜虫的取食习性对病毒传播效率的影响....................................................................21.4.3寄主植物对病毒传播效率的影响................................................................................21.4.4环境条件对病毒传播效率的影响.................................................................................31.4.5昆虫内共生菌对传毒效率的影响.................................................................................31.5蚜虫与黄瓜花叶病毒的互作关系...................................................................................41.5.1蚜虫的介体种群.............................................................................................................41.5.2蚜虫传播病毒的类型....................................................................................................41.6黄瓜花叶病毒对寄主植物及蚜虫的影响.......................................................................61.6.1CMV对寄主植物的影响...............................................................................................71.6.2植物病毒对介体昆虫的影响........................................................................................71.7蚜虫内共生菌Buchnera..................................................................................................81.7.1Buchnera对植物病毒传播的影响................................................................................82研究目的及内容.................................................................................................................11第二章内共生菌对桃蚜生长发育的影响..........................................................................122.1试验材料.........................................................................................................................122.1.1植物和昆虫材料..........................................................................................................12VI 2.1.2主要试剂......................................................................................................................122.1.3其他各种抗生素、试剂、溶液和培养基的配制方法见附录。..............................122.1.4主要仪器设备..............................................................................................................122.2试验方法.........................................................................................................................122.2.1无毒桃蚜的繁殖..........................................................................................................122.2.2桃蚜内共生菌Buchnera的鉴定................................................................................132.2.3抗生素处理对桃蚜内共生菌的影响..........................................................................172.2.4内共生菌含量降低对桃蚜生长发育的影响..............................................................202.3内共生菌对桃蚜生长发育的影响.................................................................................212.3.1Buchnera的鉴定结果..................................................................................................212.3.2抗生素处理对桃蚜内共生菌的影响..........................................................................212.3.3内共生菌含量降低对桃蚜生长发育的影响..............................................................222.4讨论.................................................................................................................................24第三章黄瓜花叶病毒对桃蚜内共生菌的影响..................................................................263.1试验材料.........................................................................................................................263.1.1植物材料......................................................................................................................263.1.2主要试剂.......................................................................................................................263.1.3主要仪器设备...............................................................................................................263.2试验方法.........................................................................................................................263.2.1黄瓜花叶病毒对植物防御的影响...............................................................................263.2.2黄瓜花叶病毒对桃蚜生长发育的影响......................................................................293.2.3黄瓜花叶病毒对桃蚜内共生菌的影响.......................................................................303.3黄瓜花叶病毒对桃蚜内共生菌的影响.........................................................................313.3.1CMV接种症状表现.....................................................................................................313.3.2病毒量的测定..............................................................................................................313.3.3JA和SA相关基因表达水平的测定..........................................................................323.3.4PI和GUS活性测定....................................................................................................323.3.5黄瓜花叶病毒对桃蚜生长发育的影响.......................................................................33VII 3.3.6黄瓜花叶病毒对桃蚜Buchnera含量的的影响.........................................................353.4讨论.................................................................................................................................35第四章桃蚜内共生菌对植物挥发物及桃蚜选择性的影响..............................................384.1试验材料..........................................................................................................................384.1.1主要试剂.......................................................................................................................384.1.2主要仪器设备...............................................................................................................384.2试验方法..........................................................................................................................384.2.1内共生菌含量降低对蚜虫选择性的影响...................................................................384.2.2内共生菌含量不同的蚜虫取食辣椒对植株挥发物的影响......................................394.2.3带毒蚜虫取食辣椒对植株挥发物的影响...................................................................404.3内共生菌对植物挥发物及桃蚜选择性影响.................................................................404.3.1内共生菌含量降低对桃蚜选择性的影响..................................................................404.3.2被不同处理的蚜虫取食后的寄主植物挥发物差异..................................................404.3.3差异挥发物对蚜虫选择性的影响..............................................................................414.4讨论.................................................................................................................................42第五章全文主要结论及创新点..........................................................................................44参考文献................................................................................................................................45附录1本实验涉及的重要缩略词及中文对照...................................................................55附录2本实验所用溶液及培养基的配方...........................................................................56附录3常用生化试剂及仪器...............................................................................................57作者简介................................................................................................................................61VIII 第一章文献综述1.1黄瓜花叶病毒的分类地位黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型种。CMV的寄主范围非常广泛，能侵染85科以上的1000多种植物，是很多农作物和观赏植物的重要毁灭性病原之一[1]。CMV表现出高度多样性，大量的分离物在生物和分子特性上都存在差异，使其成为研究植物-病毒相互作用的重要模型[2]。1.2黄瓜花叶病毒的危害植物病毒因其对作物的损伤性大、难以防治，有植物癌症之称，是重要的病原物之一。近年来，越来越多的经济作物受到植物病毒病的危害，造成严重的经济损失。大量的数据表明，黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）是危害最为广泛的两种病毒。黄瓜花叶病毒可以通过70多种蚜虫传播，且寄主范围的分布和种类都非常广泛，同时还能种传，因此随着蚜虫的迁飞和种子的流转，CMV被带到世界各地。CMV能够侵染葫芦科、十字花科、芭蕉科等11个属的植物。CMV在不同的寄主植物上表现出不同的症状，最典型的症状有花叶、卷叶、整体矮化等等。通常植株都是从心叶开始发病，叶片反卷并条纹状的绿色，不会完全变绿，当整株植物发病时，下部的叶片也逐步褪绿，叶子变小、镶嵌黄绿花叶、卷曲皱缩、畸形。葫芦科植物的发病症状则是长出大量的小叶，短缩叶枝间节果实表面不光滑，出现深浅不同的斑块，无花无果直至全株最后死亡。在植物发病初期，心叶出现花叶，成条状，叶表绒毛减少，叶脉明显。1.3黄瓜花叶病毒的传播方式CMV可以通过机械摩擦、寄主植物种子和昆虫传播，在自然条件下，主要由蚜虫以非持久性方式传播。1 1.4影响黄瓜花叶病毒的传播效率的因素CMV主要通过蚜虫的迁飞来传播，其传播效率受多种因素的影响。1.4.1蚜虫的生活史对病毒传播效率的影响蚜虫有复杂多样的生活史，具有周期性的孤雌生殖，卵生或卵胎生。在温和的环境中，蚜虫在第一寄主和第二寄主之间频繁转主活动。它们可以产生多种不同的形态类型，其生命周期因蚜虫种类和气候不同而异。有些蚜虫可能以孤雌生殖胎生的形式越冬。有些可能在一个属的一种或几种寄主上完成生活史。桃蚜Myzuspersicae（Sulzer）是一种重要的介体蚜虫，它以李属植物为第一寄主，以50余科其他植物为第二寄主转主活动。蚜虫不同的无性繁殖系、不同的存在形式和龄期都能影响蚜虫的传毒能力。1.4.2蚜虫的取食习性对病毒传播效率的影响蚜虫是刺吸式昆虫，最初发现寄主的行为是靠短暂的刺探，尝试表皮细胞的汁液，这种试探性的刺吸非常适于获毒。获毒时间很短，通常只需几秒钟。在这个过程中，蚜虫口针通常不穿透表皮细胞，若穿透表皮进入叶肉和维管组织时，则传毒效率迅速降低。取食初期蚜虫先分泌一些凝胶状唾液，然后以试探性取食的方式快速将口针穿透表皮，在穿刺过程中凝胶状唾液将形成一个保护鞘，确保口针能顺利穿刺到达深层组织，口针在细胞间隙间移动直到韧皮部筛管，只有下颚口针能到达筛管[3]。蚜虫如果不在韧皮部分泌唾液，那么局限于韧皮部的病毒就不能通过带毒蚜虫进入该组织。1.4.3寄主植物对病毒传播效率的影响寄主植物的理化特性对蚜虫的取食行为有很大影响。例如，某些甘蓝对甘蓝蚜Bbevicorynebrassicae（L.）的抗性取决于其叶片表面的蜡质层的物理状态[4]，大豆叶片表面毛状体的密度影响蚜虫的穿刺行为。大豆花叶病毒（Soybeanmosaicvirus，SMV）在田间的传播与大豆短绒毛的密度呈负相关[5]。化学特性也可能吸引或趋避某些特定的蚜虫的取食。例如，黑芥子苷在十字花科植物上发现的一种芥子油糖苷可以刺激通常在十字花科上取食的蚜虫，但是会抑制一般不在该科植物上取食的其他种类的蚜虫的取食[7]。有数据表明，被病毒侵染的植株更适合昆虫介体的生长和繁殖。豆卫矛蚜Aphisfabae在被甜菜花叶病毒（Beetmosaicvirus，BtMV）侵染的植物上产生的幼蚜比在健康植物上的多[6]。在病毒侵染的植物上蚜虫拥挤出现得越早，蚜虫迁移得就越快。植物被内共生菌侵染后改变了植物挥发物的组分，被侵染的植物最初会吸引昆虫随后又趋避它[7]。两种以大麦黄矮病毒（Barleyyellowdwarfvirus，BYDV）侵染的植物为食的蚜虫分析的蜜露比以健康植物为食的蚜虫分泌的少[8]。蚜虫形成成熟的有翅蚜的比例在被BYDV侵染的燕麦上为85%，而在健康植物上为35%[9]。另外，在BYDV侵染的植2 物上饲养的蚜虫生活周期变短[10]。在传播试验中，植物可以作为病毒侵染的材料、蚜虫的饲料以及作为健康植物来检验蚜虫的传毒能力。通常将无毒蚜虫饲养在对所研究的病毒而言的非病毒寄主植物上。然而，将蚜虫饲养在病毒侵染的植物上时，植物种类的变化有可能影响蚜虫的取食行为。改变被用作毒源植物或供试植物的种甚至品种都有可能影响蚜虫的传毒效率。1.4.4环境条件对病毒传播效率的影响环境条件对蚜虫的取食和运动具有很大的影响。尤其是湿度、温度和风力等因素。当温度为25℃时CMV多表现为隐症，CMV的最适发病温度是20℃。20-22℃时蚜虫获得和传播温州蜜柑矮缩病毒（Satsumadwarfvirus，SDV）的效率要高于10-11℃或29℃[11]。高湿度更利于马铃薯卷叶病毒（Potatoleaffrollvirus，PLRV）和马铃薯Y病毒（Potaovirus,PVY）的传播[12]。光质会影响植物对桃蚜所传播病毒的防御和黄症病毒（Luteoviruses）在番茄上的迁移[13]。环境因素可能也通过影响植物的感病性和毒源植物内的病毒浓度来影响病毒的传播。1.4.5昆虫内共生菌对传毒效率的影响昆虫体内含有与之互利共生、协同进化的内共生菌，分为垂直传播的初生内共生菌（PrimaryEndosymbiont）和水平传播的次生内共生菌（SecondaryEndosymbiont）。大量的研究表明昆虫内共生菌对其生长发育、繁殖、抗性包括抵御天敌昆虫都有着重要作用。介体昆虫带毒、持毒和传毒，内共生菌存在于昆虫特化的含菌细胞内，因此内共生菌可能和病毒共享某些相同的位置，共生菌能够影响病毒的传播[14]。吴云峰等研究表明去除内共生菌后蚜虫不能传播循回持久性病毒,因为进入血淋巴中的病毒只有与内共生菌Buchnera合成的分子伴侣GroEL蛋白结合才能免于被血淋巴中的蛋白酶类降解[15]。GroEL同源蛋白质能在目前研究的几种内共生菌中大量合成，GroEL在蚜虫菌胞初生内共生菌-Buchnear中为组成型高量表达,约占Buchnear所合成蛋白质的10%，并且能够分泌到菌胞外，帮助病毒经过昆虫血腔并在专一性植物间进行传播[16]。烟粉虱（Bemisiatabaci）中含有初生内共生菌Portieraaleyrodidarum，此外还有一些次生内共生菌也有报道，比如Arsenophonus、Hamiltonella、Wolbachia、Rickettsi、Cardinium、FritscheaandOrientia。其中研究得较多的是Hamiltonella、Wolbachia。这些次生内共生菌在粉虱中起着不同的作用，比如抗杀虫剂、抗高温以及抵御天敌等等。Morin等发现以色列的一个烟粉虱种群中的B型含有Hamiltonella而Q型没有，B型3 烟粉虱是番茄黄化曲叶病毒的传毒介体（Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV），B型烟粉虱次生内共生体Hamiltonella产生的GroEL蛋白能够与病毒粒子的CP结合并保护其进入唾液腺[17]。由此可见，无论是初生内共生菌还是次生内共生菌，在介体昆虫传播植物病毒的过程中都发挥着重要作用。1.5蚜虫与黄瓜花叶病毒的互作关系在昆虫中，尤其是在温带植物种群中，蚜虫进化为取食高等植物最为成功的代表，因此他们发展成为最重要的一群病毒介体。1.5.1蚜虫的介体种群半翅目（Hemiptera）昆虫传播55%的已知植物病毒，根据不同的分类方式，已经记述的蚜虫约有4700种[18]。其中蚜亚科（Aphidinae）含有超过一半的蚜虫种是重要的病毒介体，在大约600种以无脊椎动物为介体的病毒中，50%是由蚜虫传播的，蚜虫传播植物病毒的能力在病毒介体中居于首位。仅侵染茄科（Solanaceae）植物的病毒中就有22种是蚜虫传播的[19]。在关于病毒-介体研究中，通常选用分布广泛、在很多植物上容易饲养的桃蚜Myzuspersicae（Sulzer）、棉蚜Aphisgossypii（Glover）、大豆蚜Aphisglycines（Matssumura）等作为研究对象。1.5.2蚜虫传播病毒的类型根据蚜虫获毒后保持传毒能力时间的长短将病毒与介体之间的相互作用分为持久性和非持久性。表1-1列出的是植物病毒与其传播介体的关系，它们可区分外传型和内传型之间以及两种传播类型各自内部的相互作用。这些区别是基于与介体发生相互作用的部位，同时还考虑到了参与相互作用的病毒基因产物。1.5.2.1非持久性传播的病毒非持久性病毒，也称为口针带毒型病毒，病毒仅存在口器内。蚜虫获毒后不需要潜伏期就可传毒。获得病毒和传播病毒只需要几分钟甚至几秒钟就可完成。已知的大约209种蚜传病毒中绝大部分是非持久性的。以下病毒属有确定成员是以非持久性方式传播的：花椰菜花叶病毒属（Caulimovirus）蚕豆病毒属（Fabacirus）苜蓿花叶病毒属（Alfamovirus）以及黄瓜花叶病毒属的确定成员黄瓜花叶病毒等。对于非持久性病毒而言，蚜虫在获毒饲喂后很快就失去传染力，通常只有几分钟。无论这种植物是否易感染这种病毒，失去传染性的速率是相同的。4 表1-1植物病毒与其传播介体的关系Table1-1Therelationshipbetweenplantvirusandtheirvectors病毒传播类型传播的特征ThetypeofvirustransmissionTraitsofvirustransmission病毒在介体内是否存在于介体与介体互作的病毒产获毒时间（最大是否跨龄期传是否在介体内位点传播类型释毒时间是否跨代传播潜育期血淋巴中物剂量）播增殖LocationofWaysofvirusReleaseTransmitacrossLatentPresenceinTheproductsofvirusAcquisitionTransmitacrossPropagateinvirusinthetransmissionVirionperiodgenerationperiodvector’sinteractwithvectoraccessperiodinstarvectorvectorhemolymph非持久性口针传播外壳数秒钟至数分钟数分钟否否无否否外传非持久性前肠传播辅助因子几分钟至数小时数小时否否无否否几小时至持久循环型外壳几小时至数天几天至数周是否否是内传数天持久增殖型辅助因子几小时至数天几周至数月是通常数周是是5 1.5.2.2非持久性病毒的传毒机制在病毒非持久性传播的过程中，病毒与介体的相互作用分为两个阶段，即病毒在特异性位点的保持和病毒的释放[20]。所有非持久性传播的病毒都有一个结构简单的核酸，被一种或多种外壳蛋白包裹形成二十面体或杆状粒体。介体昆虫的传毒机制涉及到多种受体蛋白，这些蛋白主要包括外壳蛋白（coatProtein，CP）、次要外壳蛋白（minorcoatprotein，CPm）、辅助成分蛋白（helpercomponentpro-tease，HC-Pro）、热激蛋白、非结构蛋白、GroEL蛋白（由蚜虫内共生菌Buchnera产生）等。因而，外壳蛋白被用于相互作用。已经确定了保持阶段的两种互作方式：一种是病毒的衣壳和蚜虫的持毒位点直接相互作用；另一种涉及病毒编码的非结构蛋白的参与。这种非结构蛋白已经被命名为辅助组分，是帮助蚜虫传播病毒的辅助因子[21]。CMV的传播涉及衣壳和蚜虫介体中病毒结合位点的直接连接。外壳蛋白和辅助成分与蚜虫口针的结合方式见图[22]1-1。图1-1非持久性病毒的蛋白与桃蚜口针的结合方式（引自James.C.K.Ng）Fig.1-1Aschematicrepresentationofthemodelsfornonpersistentvirustransmission口针穿透毒源植株的叶片表皮，口针带毒型的非持久性病毒-马铃薯Y病毒和CMV都能被结合到口针当中，马铃薯Y病毒与口针结合位点受辅助因子HC-Pro调控，与病毒粒子的CP蛋白和一个蚜虫口针位点相结合。CMV与蚜虫口针的结合直接受病毒粒子衣壳蛋白CP内的氨基酸调控。Penetratingtheepidermisofaninfectedsource,virionsofnonpersistentstylet-bornevirusesPVYandCMVcanbeboundtositeswithinthestylet.Bindingofapotyvirusismediatedbythehelpercomponentproteinase(HC-Pro),whichinteractswithacoatprotein(CP)ofthevirioncapsidandwithabindingsiteoftheinsectstylet.BindingofCMVtotheinsectstyletismediateddirectlybyaminoaciddeterminantswithintheCPofthevirioncapsid.1.6黄瓜花叶病毒对寄主植物及蚜虫的影响植物病毒-介体昆虫-寄主植物之间存在着复杂的互作关系，它们相互影响，协同6 进化。植物病毒能显著地改变寄主植物的表型从而改变蚜虫的行为模式，有利于病毒的传播。病毒可能通过改变寄主植物一系列的特性从而对寄主与介体间的互作产生影响，这些特性包括：吸引介体昆虫侵染的植物的视觉和嗅觉线索；植物诱导防御草食昆虫介体的要素；昆虫取食后的营养状况等等。反过来说，这些改变了的性状也可能影响介体的行为模式，包括介体选择停留受侵染植株、邻近植株到健康植株上的频率，介体是否要开始取食和在寄主植物上取食或停留时间的长短，生长繁殖和扩散的速度等。1.6.1CMV对寄主植物的影响大量的研究表明，病原物可以显著地改变寄主植物的表型，植物病毒可以改变整株植物叶片的形态、代谢产物的分布、植物对生物和非生物胁迫的应答等。Mauck等研究发现蚜传导致的CMV侵染使西葫芦（Cucurbitapepo）叶片韧皮部组织的糖类和氨基酸水平紊乱，从而导致植株品质下降，并引起了水杨酸的上调，改变了虫害诱导的茉莉酸的生物合成，改变了对茉莉酸下游基因防御的敏感性，增加了乙烯和游离脂肪酸挥发物前体的释放。此外，CMV还引起了植物挥发物的改变，Mauck发现桃蚜和棉蚜都会先被感染CMV的西葫芦吸引，CMV显著降低了寄主植物的品质，对蚜虫而言，影响了适口性，蚜虫在寄主植物上只短暂停留之后迅速散开，这非常有利于非持久性病毒的传播。蚜虫在试探取食的过程中只需几秒便能获毒，并且持毒时间也短。CMV引起了植物挥发物含量的升高，首先吸引蚜虫，因此CMV通过释放出欺诈性的化学信号吸引蚜虫取食带毒植株，但随后立即散开的原因尚不明确[23,24]。Eigenbrode的研究也发现PLRV侵染植株释放的挥发物吸引蚜虫，优先选择降落在PLRV的植株上[25]。综上所述，CMV通过改变植物挥发物的释放，蚜虫随后响应嗅觉觅食线索被其吸引，从而有益于CMV的传播。病毒也可以影响植物的化学防御，包括诱导植物激素的表达从而调节对草食动物和病原物侵染的防御应答。1.6.2植物病毒对介体昆虫的影响蚜虫的行为习性很大程度上受有效养分和营养吸收所调控，同时也受到寄主植物抗草食动物的防御机制调控，因此，当植物受到病毒侵染，引起了植株一系列生理生化的改变，打破了原有的营养均衡，同时也对介体昆虫造成影响。Amalendu等发现与健康植株相比，蚜虫更多地定殖在豆蔻矮缩病毒（Cardamombushydwarfvirus,CBDV）上。并且龄期缩短，寿命增长，繁殖力增强[26]。与其结果不同的是Cassone等研究发现饲喂在持久性传播的病毒豆荚斑驳病毒（Beanpodmottle7 virus,BPMV）侵染的植株上的豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)比饲喂在非持久型病毒SMV侵染的植物上的豌豆蚜，其存活率和繁殖力都显著降低，同时，豌豆蚜相关的常规细胞活性的基因持续下调表达，但BPMV没有在豌豆蚜中复制。这可能是由于BPMV侵染后引起了豆蚜将更多的能源用来供给生存而非繁殖和其他细胞活性进程[27]。由于蚜虫与其初生内共生菌Buchnera专性互利共生，Buchnera为蚜虫提供必需氨基酸且直接影响若虫的生长繁殖，因此可以推测蚜虫存活率和繁殖力的降低可能是由于病毒对蚜虫微生物群产生了不利影响。1.7蚜虫内共生菌Buchnera垂直传播的细菌共生体在节肢动物中普遍存在，目前在植物介体生物学领域研究得最多最经典的样本就是蚜虫的初生内共生体细菌Buchneraaphidicola，Buchnera隶属于γ-proteobacterium变形菌纲，存在于特化的类菌体细胞当中。蚜虫以韧皮部汁液为食，韧皮部汁液是一种不平衡的营养源，含有丰富的糖类但缺少必需氨基酸，蚜虫之所以能利用这种不平衡的营养源存活很大程度上是由于其与内共生菌建立起了保守的专性共生关系。Buchnera通过合成韧皮部汁液中缺乏的必需氨基酸而有益于蚜虫，蚜虫提供给Buchnera韧皮部汁液中丰富的含氮底物，包括共生体生产必需氨基酸时所需的非必需氨基酸[28]。这种寄主与共生体之间的相互依赖通过Buchnera基因组大小被反应出来，Buchnera不仅已经丢失了很多独立生存的细菌中对于生存来说关键的代谢基因，而且丢失了很多调控因子，导致必需氨基酸的持续产出[29]。上一节我们论述到病毒在侵染寄主植物后引起了植物一系列生理生化的改变，Tu等还发现病毒改变了韧皮部汁液的组分，比如含氮底物、毒素和miRNAs[30]。Rubinstein等的研究发现以病毒侵染的植株为食可以显著改变刺吸韧皮部害虫的适应性[31-34]。Buchnera在蚜虫的营养合成中起着不可或缺的作用，那么病毒引起的寄主植物韧皮部汁液组分的改变也可能对蚜虫内共生菌造成影响。1.7.1Buchnera对植物病毒传播的影响从20世纪90年代初期，提出了一个蚜虫传播的循回型病毒的调节机制的核心假说即Buchnera共生体蛋白GroEL，GroEL是含量最多的Buchnera蛋白并且是蚜虫蛋白质组当中含量最丰富的蛋白质之一，它保护病毒粒子在蚜虫血淋巴或血液当中传送的过程中免遭降解[35,36]。Buchnera是一种EscherichiacoliGroEL蛋白的同源蛋白，与8 E.coli的同源物序列一致性超过了80%。蚜虫在摄取韧皮部汁液的同时，也摄取到病毒粒子和韧皮部汁液当中的蛋白，RNAs和其他代谢物。病毒从肠道进入血腔或者体腔。对于不同的循环型病毒有不同的趋性，这取决于病毒衣壳的拓扑结构[37-41]。病毒从血淋巴转移到唾液腺组织，在取食过程中，它们进入细胞是通过胞吞作用然后接种到新的寄主植物。病毒在转移至昆虫血淋巴时，GroEL保护病毒粒子顺利地通过血腔。这个假设提出，GroEL保护的病毒粒子通过成对的唾液腺得以转运。粉虱传播的双生病毒Geminiviridae和蚜虫传播的矮缩病毒Nanoviridae都能转运通过唾液腺组织[42]。用抗生素处理蚜虫可以减少70%由蚜虫传播的病毒[43]。BuchneraGroEL蛋白在体外与马铃薯卷叶病毒PLRV以及两种BYDV结合[44,45,46]。用免疫染色和一个多克隆抗体-抗GroEL抗体证实发现GroEL也存在于蚜虫的血淋巴和唾液中，尽管这并没有证实这种蛋白在唾液中是否与病毒结合。近来，用蛋白质组学方法也在蚜虫唾液中检测到了BuchneraGroEL[47]。GroEL良好的生化特性都与其在病毒传播中假定的作用相关。它是与蛋白质稳定性相关的分子伴侣家族中的一员[48]。此外，这个蛋白是具有免疫原性的，只需要很少量的来源于不同种类细菌的GroEL就能与多克隆抗体发生交叉反应，提高了对其他细菌GroEL的抗性[49]。GroEL的病毒结合位点是一个通读区（RTD），一个病毒粒子包含一个结构蛋白。RTD的区域都暴露在病毒粒子表面并与GroEL建立起互作关系[50]。这个通读区与GroEL的互作被认为是用来保护蚜虫血淋巴中病毒粒子的稳定性[51]。黄症病毒Luteoviridae与共生蛋白之间的互作由次要衣壳蛋白的通读区决定。将缺失甜菜西方黄化病毒（Beetwesternyellowsvirus,BWYV）通读区的突变体注射进蚜虫的血淋巴后发现，突变体病毒在血淋巴中的持续时间比非突变的粒体短。此外，用影响Buchnera并降低血淋巴中共生蛋白水平的抗生素处理桃蚜可以抑制病毒传播，并可是血淋巴中的CP完整性丧失[52]。总之，这些发现都表明病毒-共生蛋白之间的互作对病毒在血淋巴中的保持是必需的。近来，对于GroEL是否参与了病毒传播引起了质疑。有研究表明一个豌豆耳突花叶病毒（Peaenationmosaicvirus,PEMV）的自然发生突变体的稳定性与蚜虫血淋巴中的野生型病毒一样缺少RTD[51]。同时也有研究支持GroEL参与病毒的传播，针对BuchneraGroEL蛋白用一个抗GroEL单克隆抗体表明GroEL被限制在类菌体细胞当中。GroEL在9 血淋巴、肠道和脂肪体细胞当中都没有检测到，这就使得病毒与GroEL蛋白在体内发生互作的可能性很小[46]。这可能与实验当中的解剖方式以及病毒的含量有关，Bouvaine的研究表明在豌豆蚜中如果腿截肢了用作血淋巴收集，GRoEL在血淋巴中就检测不到，但是用腹管截断术则有可能在血淋巴中检测到。最近的研究提出了一个有趣的想法，即蚜虫微生物群落，包括Buchnera，在蚜虫取食和在植物上的定殖影响蚜虫与植物的互作。这种影响可能有利于病毒的传播和植物的侵染。蚜虫内的微生物群对植物病毒传播的作用可能不是与昆虫介体内的蛋白互作，而是通过调控植物防御间接影响植物病毒的传播。Chaudhary分析了土豆蚜唾液当中的105种蛋白，其中一些就来源于Buchnera，包括GRoEL，发现在拟南芥叶片上浸润GroEL蛋白诱导了活性氧的爆发和病原相关分子模式激发的免疫反应（PTI）相关基因的表达。此外，在转基因拟南芥中，可诱导GroEL的表达从而激活PTI相关基因的表达。在拟南芥中表达GroEL表现出绿色桃蚜繁殖力的减弱，这表明提高了对蚜虫的抗性。通过荧光假单胞菌将GroEL转入番茄或拟南芥中，设计表达TypeIII分泌系统，也能分别降低土豆蚜和绿色桃蚜的繁殖力。综上所述，蚜虫内共生菌Buchnera分泌的GroEL是一种触发PTI的分子模式[53]。此外，Tomas等研究表明刺吸式昆虫马铃薯木虱（Bactericeracockerelli）对植物的选择性和繁殖力受到植物一种内共生菌的侵染调控。与未被木虱取食的对照相比，被木虱取食和被含有内共生菌的木虱取食的植物挥发物组分均不相同。木虱最开始会降落在含共生菌木虱取食的植株上，但随后就会投向不含共生菌木虱取食的植株上，并在上面产卵。这与前文中Mauck的发现高度一致[54]。近来，有研究提出介体操纵假说以解释昆虫介体与植物病毒传播的关系[55,56]。这个假说预测一种植物病毒可能通过影响昆虫介体对植物寄主的选择行为从而促进其在植物间扩散并且增加了有翅个体的繁殖[57,58,59]。比起健康植物或者由其他方式传播的病毒侵染的植株，蚜虫更容易被受到以其为介体传播的病毒侵染的植物所吸引。这表明病毒-介体的关系模式形成了病毒可以操控其介体的程度[60,61]。在增殖型病毒中，昆虫介体也是病毒的一个寄主，病毒复制可以对昆虫寄主产生有害影响。介体的致病性会影响到病毒侵染的植株对昆虫介体的吸引力，因此也会影响病毒的适应性。比如说，针对依靠其介体传播的持久性传播的病毒对介体的行为产生积极或中性影响[62,63,64]。另一方面，报道的对昆虫产生负面或一些中性影响的主要是植物被病毒侵染或被一些其他不能被传播或尚未被研究过的昆虫种类专性传播的病原[65-70]。报道的对受到能在昆10 虫介体中复制的病毒侵染的植株的负面影响，可能是增值型病毒对其介体昆虫产生了有害影响[71-74]。一些持久型的病毒可能与其昆虫介体的共生体互利共生。依靠病毒-介体-共生体细菌的特异性水平和病毒介体共进化，病毒和昆虫介体可能合作对抗植物的免疫应答[75,76,77]。假定植物病毒、昆虫介体和植物寄主之间的关系涉及到第四方：昆虫介体的内共生菌，初生共生体主要有助于昆虫的营养需求，提供昆虫不能合成或者不能从饮食中获得的必需氨基酸，这种关系给昆虫带来了优势，避免与其它昆虫种类竞争，使得半翅目的昆虫能够在一个独有的生态位中生存。韧皮部汁液-含有丰富的碳水化合物而缺少其它营养素。如果没有初生共生体，昆虫生长不良并且基本上无法繁殖[78]。对于细菌而言，共生也是专性的，它既不能在自然界中独立存在，这种细菌也不能体外培养[79]。细菌共生体是怎样通过植物病毒参与调控介体应答的（包括行为、生化、代谢等等）还不清楚。然而目前有越来越多的研究支撑这个假说：昆虫介体的微生物群参与了病毒的传播，共生体细菌在介体传播病毒的过程中发挥了作用。1.7.2研究目的及内容桃蚜传播的黄瓜花叶病毒是植物病毒中寄主范围最广、危害最为严重、造成经济损失巨大的植物病毒。防控CMV最主要的方式就是控制蚜虫的爆发和流行。我们从蚜虫内共生菌入手，寻找CMV与蚜虫行为方式和生长发育之间的线索，探究介体昆虫-植物-病原物之间的关系，以期为桃蚜和CMV的防控提供新的思路。主要内容如下：1、明确抗生素处理对内共生菌含量的影响2、明确内共生菌含量降低对桃蚜生长发育的影响3、研究黄瓜花叶病毒对内共生菌含量的影响4、探究内共生菌含量逐渐降低的蚜虫取食对辣椒挥发物的影响5、明确内共生菌含量变化引起的差异挥发物对桃蚜选择性的影响11 第二章内共生菌对桃蚜生长发育的影响2.1试验材料2.1.1植物和昆虫材料以十字花科萝卜、茄科辣椒、葫芦科黄瓜3种蔬菜为试材，萝卜品种（RaphanussativusLinn.）中蔬红樱桃、辣椒品种（CapsicumannuumL.）中椒5号和黄瓜品种（CucumissativusL.）中农8号均购自中蔬种业科技（北京）有限公司。供试虫源为湖南农业科学院植物保护研究所在室内烟草上饲养的桃蚜种群，试验前分别在3种蔬菜上饲养了60d，进行适应性锻炼，并建立了3种蔬菜上的桃蚜种群。2.1.2主要试剂实验中所需要的主要试剂有：TRIzol、蛋白酶K、树脂、三氯甲烷、异丙醇、反转录试剂盒TransScriptAll-in-oneFirstStrandcDNASynthesisSuperMixForqPCR（One-stepgDNARemoval）、Trans2KTMPlusIIDNAMarker、dNTPs、TaqDNA聚合酶、TaKaRaMiniBESTDNAFragmentPurificationKit、利福平、蔗糖、pEASY-T1ExpressionKit、琼脂均购自上海生工生物有限公司，AceQqPCRSYBRGreenMasterMix购自南京诺唯赞生物科技有限公司，其他化学试剂选自国产分析纯。2.1.3其他各种抗生素、试剂、溶液和培养基的配制方法见附录。2.1.4主要仪器设备实验中涉及的主要仪器设备有：Parafilm封口膜、光照培养箱、超声波清洗机，玻璃匀浆器、不锈钢立式压力蒸汽灭菌器、全恒温震荡器、AppliedBiosystems2720PCR仪、Eppendorf5424离心机、DK-8D型电热水槽、BioRadCFX96梯度荧光定量PCR仪、BioDOC-It220UVP凝胶成像系统、超低温冰箱、水浴锅、电子天平、漩涡仪、玻璃管、昆虫隔离培养箱、恒温培养箱等。2.2试验方法2.2.1无毒桃蚜的繁殖从实验室饲养的绿色桃蚜种群中挑取刚出生且未取食的若蚜，将其转移到隔离培养的无毒萝卜幼苗上，在防虫箱中单克隆繁殖3代，经PCR检测无毒以后大量繁殖，12 获得无毒蚜，供后续试验所需。通常一周左右能获得大量的若蚜，当发育至4龄无翅胎生若蚜时即可供试验所用。2.2.2桃蚜内共生菌Buchnera的鉴定为了明确实验室饲养的桃蚜种群是否携带Buchnera，我们用16SrDNA对其进行了鉴定。2.2.2.1桃蚜总DNA的提取采用树脂法提取桃蚜的总DNA（1）用细毛笔从健康的萝卜苗上挑取10头4龄若蚜，挑取的过程中先用毛笔尖轻触蚜虫尾部，待其拔出口针，停止取食后再行挑取；（2）取3μL蛋白酶K，将一头蚜虫放入蛋白酶K中充分研磨；（3）将研磨液转入PCR管中；加入20μL树脂溶液（1g/10μL）；（4）将PCR管固定在漂浮板上，置于37℃水浴锅中，孵育1h，每隔15min混匀一次；（5）置于PCR中96℃加热10min，得到的DNA置于-80℃保存，备用。2.2.2.2桃蚜内共生菌Buchnera16SrDNA扩增利用16SrDNA序列测序能够对细菌进行种属鉴定。引物的选择：正向引物（F）：5'-CATGGCTCAGATTCAACGCTGGCG-3'反向引物（R）：5'-CCCCTCGGTTACCTTCTTACGAC-3'。该对引物能从广泛的真细菌中扩增出16SrDNA。引物委托北京华大公司合成。常规PCR反应：以蚜虫DNA为模板进行PCR扩增反应。（1）PCR反应体系：在200μL的PCR管中依次加入以下各种成分：10×Buffer2μLdNTPs，（10mmoL/L）1.6μL引物F，（10μmoL/L）1.0μL引物R，（10μmoL/L）1.0μLDNA模板，（160ng/μL）1.0μLDNA聚合酶，（5U/μL）0.3μL加灭菌H2O至20μL13 （2）常规PCR反应程序的设置：94℃预变性3min94℃变性45s55℃退火45s72℃延伸1min30s步骤2~4循环38次72℃延伸7min4℃保存PCR产物凝胶电泳检测：（1）称取0.5g琼脂糖粉，加入1×TAE电泳缓冲液50mL，充分混匀；（2）微波炉加热琼脂糖粉至完全熔解，待琼脂糖溶液稍冷后倒入模具并插上对应的梳子，（3）等琼脂糖溶液完全冷却凝固后，拔下梳子，制成1.0%浓度凝胶；（4）将已制备好的琼脂糖凝胶连同模具一同放入装有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，液面视没过凝胶孔为准；（5）取loadingbuffer2μL、PCR产物5μL和SYBRGreen染料2μL，充分吸打反复混匀，点入凝胶孔中；（6）打开电泳仪，电压设置为120V，约等待25min；（7）使用Alpha凝胶成像系统观察结果并拍照记录，保存。2.2.2.3DNA的纯化回收PCR产物纯化试剂盒使用宝生物工程（大连）有限公司的DNA片段纯化试剂盒TaKaRaMiniBESTDNAFragmentPurificationKit，按厂家提供的说明方法操作。操作方法：（1）向PCR反应液中加入3倍量的BufferDC，均匀混合；（2）将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上；（3）将上述操作（1）当中的溶液转移至SpinColumn中，室温12000rpm，1min，弃滤出液；（4）将700μL的BufferWB加入SpinColumn中，室温12000rpm，30s，弃滤出液；（5）重复步骤（4）；（6）再一次室温离心12000rpm，1min；14 （7）将SpinColumn置于新的1.5mL的离心管上，在离心柱中央加入30μLElutionBuffer，室温静置1min；（8）12000rpm，1min，洗脱DNA。2.2.2.4感受态细胞的制备（1）菌种的活化，在LB固体培养基平板上，采用平板划线法培养实验室已保存的NW522大肠杆菌(-80℃保存)，37℃过夜培养；（2）从LB培养基平板上挑取单菌落，接种于15mL的LB液体培养基中，37℃恒温，200rpm震荡培养12h；（3）取1mL菌液转入100mL的液体培养基中，加入经高温灭菌的2mol/LMgCL21mL；（4）37℃恒温，200rpm震荡培养约2~3h，培养至OD550=0.5；（5）将菌液转入50mL的大离心管中，放置于冰上10min；（6）2500rpm，4℃离心10min，除去上清；（7）加入TFBI溶液15mL，充分混匀悬浮；（8）放置于冰上10min；（9）4000rpm，4℃10min，除去上清；（10）加入预冷的TFBII溶液2mL，轻轻混匀使细胞悬浮，分装成200μL/管；（11）液氮速冻，装袋，做好标记，于-80℃保存备用。2.2.2.5连接取1.2.2.3中回收后的DNA，使用北京全式金生物技术有限公司提供的pEASY-T1克隆载体进行连接。pEASY-T5ZeroCloningVeCtor连接体系：DNA片段，（160ug/μL）4μLpEASY-T51μL将体系混匀，用PCR仪控温，25℃，10min，待反应结束后，将PCR管立即置于冰上保存。2.2.2.6DNA产物的转化（1）从-80℃超低温冰箱中将1.2.2.4中制备的感受态细胞取出，立即放置冰上至完全溶解，分装成100μL一管，将1.2.2.5中的连接产物加到感受态细胞中，轻弹混匀。（2）放置于冰上反应30min；（3）将离心管固定在漂浮板中，置于水浴锅，42℃热激30s（准确控制时间），15 反应后立即转置于冰上2min，操作过程中轻拿轻放，切忌晃动；（4）加入37℃水浴预热的LB500uL；固定在漂浮板上，置于摇床中200rpm，37℃孵育1h；（5）制备平板，向溶解完全的LB固体培养基加入氨苄霉素（培养基氨苄终浓度为0.1mg/mL），每个平板倒置约15mL培养基。（6）为了得到较多的克隆，将孵育后的菌液4000rpm，离心30s，弃去部分上清，混匀。（7）取150μL菌液，用L型涂布棒将菌液均匀的涂布到LB固体培养基平板上。（8）正置于37℃恒温培养箱中，孵育40min，待培养基充分吸收菌液，倒置培养过夜。(培养时间不宜过久，待菌落大小均匀、边界清晰即可挑取，以免长出卫星菌落，影响实验操作)。2.2.2.7阳性重组子的筛选（1）取PCR管，每管加入灭菌水H2O20μL。（2）过夜培养的平板拿出，用灭菌牙签从每个平板上挑取单个菌落（每个板挑取8~10个单菌落），混合均匀。（3）菌落PCR。菌落PCR体系（20μL）：10×buffer2μLdNTPs1.6μL菌液1μLM13F（10μmol/L）1μLM13R（10μmol/L）1μLTaq酶，（5u/μL）0.3μLddH2O13.1μL菌落PCR反应程序：94℃预变性3min94℃变性45s55℃退火45s72℃延伸1min30s步骤2~4循环38次72℃延伸7min4℃保存16 （4）菌落PCR产物凝胶电泳检测；（5）根据检测结果挑取阳性克隆单菌落，转移至20mL含氨苄青霉素抗性的LB液态培养基中（氨苄终浓度为0.1mg/mL），置于200rpm摇床，37℃振荡培养过夜；（6）取2mL过夜培养后的菌液送测序公司测序。（7）取过夜培养后的菌液1mL与灭菌甘油（60%）按1:1的比例均匀混合，加入到2mL灭菌离心管中，均匀混合。（8）做好标记，-80℃冻存。2.2.3抗生素处理对桃蚜内共生菌的影响利福平为利福霉素类半合成广谱抗菌药，对多种病原微生物均有抗菌活性，本试验用利福平处理桃蚜来达到抑制桃蚜内共生菌的效果。2.2.3.1不同浓度利福平处理桃蚜（1）桃蚜人工饲料的制备：称取3g蔗糖溶解于1mL的灭菌水中，制备成30%（M/V）的蔗糖溶液；（2）用蔗糖溶液将利福平（Rifampicin，优级纯GR，Sigma公司）配置成10、50、100、200μg/mL4个浓度，对照使用相同浓度的蔗糖溶液；（3）取直径3cm，高7cm的玻璃管，在玻璃管上端以Parafilm膜覆盖；（4）在Parafilm膜上均匀地涂布200μL利福平蔗糖溶液，对照使用无利福平的蔗糖溶液，再覆盖另一层Parafilm膜，注意操作过程中轻柔缓慢，以双层膜中没有气泡，溶液均匀分布于整个管壁范围内为宜；（5）每个玻璃管内放入50头经过饥饿处理6h、发育一致的成蚜；（6）玻璃管另一端以单层Parafilm膜覆盖；（7）将玻璃管四周及底部用锡箔纸包裹（由于蚜虫有趋避银色的特性，锡箔纸包裹能促使蚜虫集中在人工饲料处取食）；（8）放入光照培养箱中，培养24h，控制条件为温度25±1℃，光周期14L∶10D，RH=60%；（9）将存活的蚜虫取出。每个处理进行8次生物学重复，每个生物学重复包含4次技术重复。2.2.3.2桃蚜总RNA的提取取2.2.3.1中存活的桃蚜为样品，使用TRIzol法提取总RNA。试验中所使用的离17 心管、枪头均为爱思进生物有限公司（Axygen）提供的RNase-free耗材，研磨虫体所使用的玻璃匀浆器都经过高温灭菌。（1）将2.2.3.1中存活的桃蚜每个处理挑取20头，置于1.5mLRNase-free的离心管当中，液氮速冻；（2）将液氮速冻后的蚜虫置于玻璃匀浆器中，加入TotalRNAExtractor1mL，快速研磨，直至虫体完全裂解；（3）将研磨液转至2mL离心管中，至于冰上10min，室温再静置5min，使核蛋白与核酸能彻底分离开来；（4）将室温静置过的研磨液冷冻离心12000rpm，10min；（5）取800μL上清液，加入320μL三氯甲烷，（6）在涡旋振荡仪上剧烈震荡15s，震荡完全后在室温静置5min。12000rpm，冷冻离心15min；（7）离心完成后，将离心管小心取出，期间避免晃动。小心吸取上层水相转移至干净的2mL离心管中（避免吸到下层），随后加入等体积的异丙醇，轻柔地混匀，室温静置15min，使RNA充分沉淀；（8）12000rpm，冷冻离心10min，弃去上清液；（9）12000rpm，冷冻离心1min，弃去残留的上清液；（10）向沉淀中加入1mL75%（DEPC水配制）洗涤，12000rpm，冷冻离心3min，弃上清。打开离心管盖，室温干燥10~15min，待管中酒精完全挥发；（11）加入50μL无菌水（DEPC处理），使RNA充分溶解。将得到的RNA溶液做好标记，置于-80℃冰箱保存。2.2.3.3cDNA的合成以2.2.3.2当中提取的RNA为模板，使用北京TransGenBiotech提供的TransScriptAll-in-oneFirst-StrandcDNASynthesisSuperMixforqPCR（one-stepgDNARemoval）合成cDNA。总RNA，（400ng/μL）10μL5xTransScript®All-in-oneSuperMixforqPCR4μLgDNARemoval1μLRNase-freeWater5μLcDNA合成体系：18 轻轻混匀，使用PCR仪控制温度，42℃孵育15min；85℃加热5s失活TransScriptRT。合成的cDNA做好标记，置于-80℃保存，用于后续实验。2.2.3.4qPCR检测桃蚜BuchneradnaK的含量以2.2.3.3中合成的cDNA为模板进行qPCR扩增。由于Buchnera无法成功地进行体外培养，因此我们用qPCR染料法来测定经抗生素处理后的桃蚜体内Buchnera的含量。引物的选择：我们选择Buchnera的dnaK基因用以qPCR扩增，由于dnaK基因在Buchnera中以单拷贝形式存在，并且在Douglas、Jiang和Cassone等的研究中也用到该基因作为Buchnera含量的检测[80,81,82]。内参基因之一Betaactin为蚜虫的肌动蛋白，另一个内参基因AWRT002为蚜虫的伸长因子1α，在Buchnera中同样为单拷贝。使用南京诺唯赞生物科技有限公司的qPCR试剂盒ChamQTMSYBR®ColorqPCRMasterMix(HighBOXPremixed)进行qPCR扩增。试验中用的PCR八联管和管盖都为Axygen的RNase-free耗材。实验中每个样品进行4次生物学重复，每个生物学重复进行4次技术重复。表2-1实验中使用的引物序列Table2-1ThesequenceofPCRprimers位置退火温度/℃编引物名称引物序列（5’-3’）LocationintheAnnealing号PrimernamePrimersequence（5’-3’）Completesequencetemperature1dnaK(F)TTGACCATAGGCATTCTTG160565-16054656℃2dnaK(R)AACCGCTTAAAGTGGCGTTA160624-16064356℃3Betaactin(F)CTAGAAGGACAGCTACGTAG136-15356℃4Betaactin(R)GATCCATATCATCCCAGTTG233-24356℃5AWRT002(F)CTGATTGTGCTGTGCTTATTG8-2856℃6AWRT002(R)CAAGGTGAAAGCCAATAGAGC136-15356℃qPCR体系如下：RNase-freeWater10μLSYBRMix12.5μLcDNA模板1μLForwardprimer0.5μL（dnaK、Betaactin、AWRT002）Reverseprimer0.5μL（dnaK、Betaactin、AWRT002）QPCR反应参数设置：95℃预变性5min19 95℃变性10s56℃退火20s72℃延伸32s步骤2~4循环40次溶解温度65℃-95℃（以0.5℃递增）4℃保存数据处理：采用MicrosoftExcel2010软件记录和处理试验结果，采用IBMSPSSStatistics19软件进行数据分析，Ct值用Bio-RadCFX96qPCR监测系统记录和校正，用2-ΔΔCt方法计算dnaK的相对表达量，内参基因作为协同变量，采用单因素方差分析（P<0.05），用Tukey检验方法进行差异比较。2.2.4内共生菌含量降低对桃蚜生长发育的影响利福平作用于桃蚜体内的Buchnera，导致Buchnera数量发生改变，必需氨基酸合成能力下降，进一步导致蛋白质合成受阻，无法为蚜虫的正常生长发育及代谢提供必需营养元素。因此我们对利福平处理后的桃蚜在三种蔬菜上的生长发育进行了观察和记录。2.2.4.1桃蚜生长发育观察（1）取同期播种的萝卜、辣椒和黄瓜苗，分别单株置于洁净的养虫笼内；（2）将刚完成蜕皮的健康成蚜和200μg/mL利福平处理后的成蚜分别接种到植物上，每株植物上放一头成蚜；（3）在植物的主茎秆上涂1圈凡士林防止蚜虫逃逸；（4）每天观察蚜虫的存活情况和产蚜量，用毛笔轻轻除去若蚜，直至所有蚜虫死亡，没种植物进行10次技术重复；（5）将健康初生若蚜和200μg/mL利福平处理后的若蚜每10头1组，分别放在不同无虫笼里的3种植物上，每隔8h调查若蚜数量和蜕皮数，直至成蚜，记录发育历期，并计算平均值。每种植物10次重复。（6）每株植物上分别放置50头健康的和200μg/mL利福平处理后的发育时间相同的成蚜，随机选取20头进行称重；（7）每株植物上的蚜虫称重后重新放回原植物上进行饲养，5d后，重新在每株植物上随机选取健康的和200μg/mL利福平处理后的成蚜20头称重，每种植物10次重20 复；（8）采用独立样本t检验比较健康蚜虫和抗生素处理的蚜虫的生长发育情况。2.3内共生菌对桃蚜生长发育的影响结果与分析2.3.1Buchnera的鉴定结果对实验室饲养的绿色桃蚜进行16SrDNA扩增，从桃蚜总DNA中扩增出一条约1500bp的目的条带，经DNA纯化回收，连接目的片段至T-5载体转化感受态细胞后筛选出多个阳性克隆，阳性克隆送公司测序，测序结果通过GeneBank比对，证实为桃蚜Buchnera全序列当中的16SrRNA。登录号为：CP002703，长度为1845bp，位于Buchnera全序列的275749-276779位点。常规PCR及菌落PCR检测结果见图2-1和图2-2。2.3.2抗生素处理对桃蚜内共生菌的影响结果与分析通过用10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的利福平处理桃蚜24h后，提取桃蚜的总RNA，反转录合成cDNA后，用qPCR扩增Buchnera的dnaK基因。结果表明与空白对照相比，各处理的蚜虫Buchnera的dnaK表达量均显著下调，其中200μg/mL利福平处理后dnaK表达量降到最低，效果最为理想。各处理与空白对照相比Buchnera的dnaK表达量见图2-3。M12345672000bp1000bp图2-1常规PCR检测桃蚜16SrDNA电泳图M:Trans2KPlusIIMarker;1-7:Aphid16SrDNAPCR产物电泳；Fig.2-1Theaphid16SrDNAelectropHoresisofConventionalPCRdetectionM:Trans2KPlusIIMarker;1-8:ThePCRproductselectropHoresisofaphid16SrDNA21 M12345672000bp1000bp图2-2桃蚜16SrDNA菌落PCR筛选M:Trans2KPlusMarker;1-7:Aphid16SrDNART-PCR菌落筛选Fig.2-2TheAphid16SrDNART-PCRelectropHoresisofConventionalPCRdetectionM:Trans2KPlusMarker;1-7:TheRT-PCRproductselectropHoresisofAphid16SrDNART-PCRA相对表达量BCCDBuchneradnaK利福平浓度μg/mL图2-3不同浓度利福平处理的桃蚜BuchneradnaK的表达量Fig.2-3TherelativeabundanceofdnaKinBuchneraofaphidsthattreatedbydifferentconcentrationofrifampicin2.3.3内共生菌含量降低对桃蚜生长发育的影响结果与分析用200μg/mL的利福平处理桃蚜之后，将其饲喂在健康的萝卜、辣椒和黄瓜上，结果表明利福平处理后的桃蚜产蚜量、寿命和体重都显著低于健康桃蚜，平均发育历期与健康蚜虫相比无显著差异。桃蚜的产蚜量、寿命和体重变化情况见图2-4；2-5；2-6；2-7。由图2-4可以看出，萝卜、辣椒和黄瓜上蚜虫的平均产蚜量依次为48、35、23头/株。用200μg/mL利福平处理后，3种蔬菜上蚜虫的产蚜量均显著降低，萝卜、辣椒和黄瓜上蚜虫的平均产蚜量依次为39、26、16头/株。由图2-5可以看出，萝卜、辣椒和黄瓜上健康蚜虫的平均寿命依次为15、13、10d。200μg/mL利福平处理显著降低了蚜虫的平均寿命，3种蔬菜上蚜虫的平均寿命分别为22 10、8、5d。由图2-6可以看出，萝卜、辣椒和黄瓜上蚜虫的平均体重依次为0.14、0.12、0.11g。200μg/mL利福平处理显著降低了蚜虫的体重，萝卜、辣椒和黄瓜上蚜虫的平均体重依次为0.10、0.07、0.06g。由图2-7可以看出，蚜虫在黄瓜、辣椒和萝卜上的平均发育历期依次为8、7、6d。用200μg/mL利福平处理后，3种蔬菜上蚜虫的平均发育历期与健康蚜虫相比没有显著差异。图2-4利福平处理后的桃蚜在萝卜、辣椒和黄瓜上的产蚜量Fig.2-4ThefecundityofaphidswhattreatedbyrifampicinfeededonRaphanussativus；Capsicumannuum；Cucumissativus图2-5利福平处理后的桃蚜在萝卜、辣椒和黄瓜上的寿命Fig.2-5ThelongevityofaphidswhattreatedbyrifampicinfeededonRaphanussativus；Capsicumannuum；Cucumissativus23 图2-6利福平处理后的桃蚜在萝卜、辣椒和黄瓜上的体重Fig.2-6ThebodyweightofaphidswhattreatedbyrifampicinfeededonRaphanussativus；Capsicumannuum；Cucumissativus图2-7利福平处理后的桃蚜在萝卜、辣椒和黄瓜上的发育历期Fig.2-7ThegrowthperiodofaphidswhattreatedbyrifampicinfeededonRaphanussativus；Capsicumannuum；Cucumissativus2.4讨论内共生菌与昆虫在长期的进化过程中形成了非常密切的共生关系，在昆虫的生长、发育以及进化等方面都有着非常重要的意义。研究二者之间的互作关系不仅可以揭示不同物种的进化方式及机制，而且为今后的害虫防治提供参考[83,84,85]。研究表明，利福平处理可以去除蚜虫体内的共生菌[86,87]。本试验发现，不同浓度的利福平处理蚜虫后，其内共生菌Buchnera的dnaK基因表达量极显著低于健康蚜虫，然而在浓度达到200μg/mL时仍未将Buchnera全部去除。可能是由于Buchnera属于初生内共生菌，与蚜虫一起共同进化，且能够为蚜虫提供营养物质，因而蚜虫对其有一定的保护作用。本试验发现利福平处理后的蚜虫在3种蔬菜上的生物学特性均显著降低，具体表24 现为产蚜量下降，寿命缩短，体重降低，说明蚜虫的内共生菌Buchnera在其生长发育过程中起着非常重要的作用。目前蚜虫的防治主要靠化学防治，大量使用农药引起了蚜虫抗药性的产生以及环境污染等一系列问题[88,80]。未来可以尝试通过“抑菌防虫”的手段来控制蚜虫，即通过外源物质抑制蚜虫的内共生菌来达到防治目的。随着现代微生物和生物技术的不断发展和应用，“抑菌防虫”将在蚜虫及其他害虫防治中发挥重要的作用。25 第三章黄瓜花叶病毒对桃蚜内共生菌的影响病毒、昆虫、寄主植物之间存在着复杂的互作关系，影响昆虫介体传毒的因素很多，当寄主植物受到昆虫或病原物的侵染时，将激活植物体内各种防御反应，其中主要的防御信号物质有水杨酸（SalicylicAcid，SA）、茉莉酸（JasmonicAcid，JA）、乙烯(Ethylene)和脱落酸(AbscisicAcid,ABA)等。目前大多数的研究认为SA能够诱导植物对病原菌产生抗性[90]，而当植物受到草食动物和坏死营养的病原体攻击时，JA是激活植物伤害反应的重要信号分子[91]。本研究旨在探究黄瓜花叶病毒引起的植物防御反应的差异，从植物防御的角度探索寄主植物对介体昆虫传毒的影响。病毒调控着受侵染的寄主植物的一系列分子、细胞和生理上的改变，包括改变韧皮部汁液的组分，比如含氮底物、毒素和miRNAs。取食病毒侵染的植物可以显著改变刺吸韧皮部害虫的适应性。考虑到一些共生体在其昆虫寄主的营养合成中扮演着不可或缺的角色，包括Buchnera对于蚜虫，Buchnera为正常蚜虫繁殖所必需，因此我们为探究黄瓜花叶病毒对桃蚜生长发育的影响以及对桃蚜Buchnera的影响展开如下实验。3.1试验材料3.1.1植物材料模式植物：本氏烟（Nicotianabenthamiana）、三生烟（Nicotianatobacumcv.SamsunNN），CMV分离物AN均有湖南省植物保护研究所提供。实验中所用到的辣椒品种（CapsicumannuumL.）中椒5号购自中蔬种业科技（北京）有限公司。3.1.2主要试剂磷酸缓冲液、DAS-ELISA试剂盒、石英砂等（见附录2）。3.1.3主要仪器设备BioRadCFX96荧光定量PCR仪、光照培养箱等。3.2试验方法3.2.1黄瓜花叶病毒对植物防御的影响3.2.1.1摩擦接种黄瓜花叶病毒（1）将实验室保存的黄瓜花叶病毒AN株系感病叶片取出0.2g，置入经高温灭26 菌后的研钵中，为了避免病毒讲解，研钵在使用前务必置于冰上预冷；（2）在研钵内加入300μL接种缓冲液，接种缓冲液pH7.2，浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液（配置方法见附录2），置于冰上充分研磨；（3）选择大小为5至6片真叶，健康的三生烟为寄主，从心叶开始选择3片叶片均匀地撒上石英砂；（4）洗净双手，沾取研钵中少量的研磨液，从叶柄向叶尖方向摩擦撒有石英砂的叶片2~3次，操作过程中，力度要适中，过重则会引起植物的防御反应，造成局部坏死，过轻将无法有效给植物造成微伤口，导致接种失败；（5）将叶片上的石英砂用无菌水冲洗干净，做好标记，注明样品名称和接种时间，将植物置于防虫笼中培养；（6）定期观察、记录。3.2.1.2病毒量的测定在接种CMV后的第3，6，9，12和15天，取叶片进行病毒量的测定。病毒量的测定采用检测CMV的DAS-ELISA试剂盒（ADGEN，UK）。根据产家提供的说明书操作。操作方法如下：（1）从冰箱中取出试剂盒，置于室温平衡15-25min，根据需要配好相关试剂；（2）样品处理：样品与GEB按照1g:10mL的比例称取置于研钵中，充分研磨，然后10000rpm，离心1min；（3）编号：将样品与微孔板设置一一对应的编号，做好标记，包括阳性、阴性和空白对照孔（空白对照孔内不加样品和酶标试剂，其余均与样品孔相同）；（4）加样：在阳性对照孔中加入试剂盒中提供的阳性标样50μL，阴性对照孔加入阴性标样，在加样孔中加入40μL样品稀释液，加样过程中避免触碰加样孔边缘，应直接加到酶标版底部，轻晃摇匀（如酶标版不能一次用完，剩余的可装回试剂盒中）；（5）温育：将试剂盒中提供的封口膜剪下所需的孔数封住酶标版，置于恒温培养箱中37℃温育25min（封口膜为一次性使用，以免交叉污染）；（6）制备洗涤液：将30倍浓缩洗涤液稀释20倍，加蒸馏水定容至600mL后待用（根据实际所需用量情况配置）；（7）洗涤：取出温育后的酶标版，揭去封口膜，弃净孔中液体，在每孔当中加入洗涤液200μL，置于室温30s后拍干，重复此操作5次；（8）加酶：向每孔加入酶标剂50μL，空白对照孔除外；27 （9）温育：操作同（5）；（10）再次洗涤：操作同（7）；（11）显色：向每孔中分别加入50μLA液和B液，轻晃摇匀，与37℃恒温培养箱中避光显色20min；（12）终止：向每孔中加入50μL终止液，当反应结束时，液体颜色为黄色则为阳性样品；（13）测定：设置波长为450nm进行OD值测定，以空白对照调零，应在加样后的20min之内完成测定。3.2.1.3qPCR测定JA和SA在接种CMV后的第3,9和15天，取0.2g接种的叶片提取RNA，反转录成cDNA，方法参照上一章内容，用qPCR的方法检测叶片中的JA和SA相关基因的表达量。根据文献报道，我们选择了JA的上游基因OPR3和下游基因COI1andPDF1.2，以及SA的上游基因ICS1和下游基因NPR1andPR1，选用了Actin作为内参基因[92]。各基因序列见表3-1。表3-1实验中使用的引物序列Table3-1ThesequenceofPCRprimers编引物名称引物序列（5’-3’）GeneBank登录号退火温度/℃号PrimernamePrimersequence（5’-3’）GeneBankaccessionAnnealingnotemperature1OPR3(F)5′-AGGCACTATGATTTCTC-3′EF46733160℃2OPR3(R)5′-GTTGATCCCATCTTTC-3′EF46733160℃3COI1(F)5′-CACTTGATAATGGTGT-3′AY54749360℃4COI1(R)5′-AGGCCTTCATCGGATTCC-3′AY54749360℃5PDF1.2(F)5′-AACTTGTGAGTCCCAGAG-3′X9940360℃6PDF1.2(R)5′-GGATACCTTTCTACCACC-3′X9940360℃7ICS1(F)5′-TTAAACTCATCATCTTCAG-3′DQ14991860℃8ICS1(R)5′-GGCTTCGCCGGCATTCATT-3′DQ14991860℃9NPR1(F)5′-GCTGTGGCATTCCTGGTT-3′AF48048860℃10NPR1(R)5′-GTGAGCCTCTTGGCGATT-3′AF48048860℃11PR1(F)5′-TGCCTTCATTTCTTCTTG-3′JN24744860℃12NPR1(R)5′-TTAGTATGGACTTTCGCCTCT-3′JN24744860℃13Actin(F)5′-AACTGATGAAGATACTCACA-3′AY17960560℃14Actin(R)5′-CAGGATACGGGGAGCTAAT-3′AY17960560℃28 qPCR反应体系：RNase-freeWater10.5μLSYBR®GreenPCR12.5μLcDNA模板1μL0.5μL（OPR3、COI1、PDF1.2、ForwardprimerICS1、NPR1、PR1、Actin）0.5μL（OPR3、COI1、PDF1.2、ReverseprimerICS1、NPR1、PR1、Actin）qPCR反应参数设置：95℃预变性5min95℃变性10s60℃退火20s72℃延伸32s步骤2~4循环40次溶解温度65℃-95℃（以0.5℃递增）4℃保存数据处理方法参照上一章内容。3.2.2.3PI和GUS的活力测定在接种CMV后的第3,9和15天，我们同时测定了叶片的蛋白酶抑制剂（proteinaseinhibitor，PI）活性和β-1,3-葡聚醣酶（β-1,3-glucanases，GUS）活性。GUS的活性单位表示为nMMU/min/毫克蛋白。两种酶活性分析均采用了3个技术重复和3个生物学重复。方法如下：（1）酶液的提取：称取1g叶片，按m:v=1:10的比例加入0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.8)，内含0.1%Tween20，冰浴匀浆,匀浆液在4℃，15000rpm离心15min，上清液作为粗酶液。（2）胰蛋白酶抑制剂含量测定：取0.2mL酶液和0.5mL的0.1μg/μL的胰蛋白酶溶液在室温下振荡混合10min，加入100μL的25mg/mL偶氮酪蛋白37℃培育30min，立即加入300μL20％的TCA(三氯乙酸)终止反应，12000rpm离心10min，取100μL的上清液和100μL的0.5mol/L的NaOH，在酶标仪上于450nm下检测吸光度值。以2.5，5，10，20，40μg/的胰蛋白酶抑制剂绘制标准曲线。结果以μg/mg蛋白表示。总蛋白含量用Bradford(1976)方法测定。3.2.2黄瓜花叶病毒对桃蚜生长发育的影响为明确病毒对桃蚜生长发育的影响，我们观察比较了取食CMV侵染的植株后，桃29 蚜的有翅和无翅个体的数量、寿命的变化。首先将蚜虫饥饿处理4h，随后将出生时期一致、发育状态一致的无翅桃蚜分别放到健康三生和感染CMV的三生烟上，每棵烟草上放20头桃蚜，在烟草的茎部涂抹一圈凡士林防止桃蚜的逃逸。健康烟草和感染CMV的烟草分别放在不同的笼子（40×20×40cm）中。在第3，6，9，12和15天，分别观察并记录健康烟草和感染CMV烟草上的无翅蚜和有翅蚜的数量，为了防止遗漏有翅蚜，笼子中除了烟草上之外，其他地方也仔细进行了检查。每次数完之后，所有的有翅蚜都用吸虫管吸走，以免影响下一次的观察。每个试验重复8次，即共观察了8株健康烟草和8株感染CMV烟草上蚜虫的翅型变化情况。此外，我们对桃蚜在健康烟草和感染CMV烟草上的寿命也进行了观察。每株植物上放20头出生时间一致的无翅蚜，每天观察桃蚜的生长发育情况，并随时用毛笔移走桃蚜产出的若蚜，直到桃蚜死亡，记录桃蚜的存活时间。数据分析单因素方差分析（one-wayANOVA）用来比较CMV侵染的植株上有翅蚜的数量。重复测量的方差分析（repeated-measuresANOVAs）用来比较在不同时间内，健康烟草和感染CMV烟草上无翅蚜的数量。t检验（t-test）用来比较健康烟草和感染CMV烟草上桃蚜的寿命。3.2.3黄瓜花叶病毒对桃蚜内共生菌的影响桃蚜取食了CMV侵染的植株以后，其繁殖力、产卵量、寿命以及发育历期都受到不同程度的不利影响，而Buchnera是蚜虫正常生长发育所必需，因此为了明确CMV是否对Buchnera产生影响，我们做了如下研究。3.2.3.1桃蚜获毒（1）准备好摩擦接种后表现出明显病毒病症状的辣椒，挑取10头经过饥饿处理3h、发育一致的成蚜置于辣椒的发病心叶上，挑取过程务必轻柔，以免伤及蚜虫口针，无法使其获毒；（2）准备好一小杯液氮，将1.5mLRNase-free的离心管固定在漂浮版上，放入液氮中预冷；（3）待蚜虫取食约15s之后迅速轻柔地将蚜虫挑取至预冷的离心管中，随后继续置于液氮中冷冻，由于蚜虫获毒的时间只有十几秒至几分钟，此操作务必在不伤及蚜虫口针的前提下越快越好，确保每头蚜虫都能获毒。同时选用无毒健康苗饲喂对照组蚜虫。处理组和对照组均进行四次技术重复。3.2.3.2检测桃蚜体内黄瓜花叶病毒的含量以及Buchnera的含量30 引物的选择：黄瓜花叶病毒荧光定量PCR所使用的引物根据CMVCP基因设计，来源于（孙洁，2014）的研究[93]。基因序列在GeneBank上的登录号为：AY965892。正向引物MF1（F）：5'-CGATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3'，反向引物CMV-R（R）：5'-CGGCGTACTTTCTCATGTCAC-3'。（1）用Trizol法提取1.2.2.1中桃蚜的总RNA，操作步骤同上一章；（2）将提取的总RNA进行cDNA合成，操作步骤同上一章；（3）qPCR体系：RNase-freeWater10μLSYBRMix12.5μLcDNA模板1μLForwardprimer3.75μL（MF1、Betaactin、AWRT002）Reverseprimer3.75μL（CMV-R、Betaactin、AWRT002）（4）qPCR反应参数设置：95℃预变性5min95℃变性10s60℃退火20s72℃延伸32s步骤2~4循环40次溶解温度65℃-95℃（以0.5℃递增）4℃保存（5）数据处理，方法同上一章。3.3黄瓜花叶病毒对桃蚜内共生菌的影响3.3.1CMV接种症状表现3.3.1.1CMV摩擦接种情况在寄主本氏烟及辣椒上出现系统侵染症状，叶片表现出花叶，皱缩等症状；在见图3-1。3.3.2病毒量的测定用DAT-ELISA方法分别测定接种CMV3天、6天、9天、12天和15天的三生烟叶片中的病毒量变化，检测其OD值，结果表明随着时间的推移，病毒含量逐步升高，到12天左右趋于平稳，OD值变化情况见图3-2。31 图3-1黄瓜花叶病毒在本氏烟及辣椒上的症状Fig.3-1CMVsymptomsontobaccoandpepperleaves图3-2CMV的OD值病毒为黄瓜花叶病毒；波长为450nm；在接种3、6、9、12、15天后的三生烟叶片中测OD值。OD值表示为均值±标准误差。不同字母表示差异显著(P<0.05)Fig.3-2ODvalueofCMVTheviruswasCucumbermosaicvirus(CMV)；Thewavelengthwas450nm;ODvaluewasdeterminedafter3,6,9,12and15daysofCMV-inoculation.Valuesaremeans±SE.Differentlettersindicatesignificantdifferences(P<0.05)3.3.3JA和SA相关基因表达水平的测定接种黄瓜花叶病毒到三生烟上后，我们用qPCR检测了寄主植物JA的上游基因OPR3和下游基因COI1、PDF1.2，以及SA的上游基因ICS1和下游基因NPR1、PR1的相对表达量。结果发现JA的上游基因OPR3无明显差异，JA的下游基因COI1和PDF1.2均下调表达，SA的上游基因ICS及下游基因NPR1和PR1均上调表达。各基因相对表达量的变化情况见图3-3。3.3.4PI和GUS活性测定蛋白酶抑制剂（PI）在植物防御害虫的过程中发挥着重要作用，且与JA途径有紧密的联系。β-1,3-葡聚糖酶（GUS）在植物SA防御途径中发挥着重要作用，因此我们测定了CMV侵染的植株内PI和GUS的活性。32 图3-3接种黄瓜花叶病毒3、9、15天后植株的JA和SA相关基因表达量A：为JA上游基因OPR3和下游基因COI1、PDF1.2，B：为SA的上游基因ICS1和下游基因NPR1、PR1Fig.3-3JAandSAinmolecularandbiochemicallevel.GeneexpressionlevelsweredeterminedonCMV-inoculatedplantsafter3,9and15days.A:GeneexpressionlevelsofJAupstreamgeneOPR3anddownstreamgenesCOI1andPDF1.2.B:GeneexpressionlevelsofSAupstreamgeneICSanddownstreamgenesNPR1andPR1.图3-4PI和GUS活性测定Figure3-4PIandGUSactivitydeterminationA:PI活性测定；B:GUS活性测定A:Proteinaseinhibitor(PI)activitydeterminationB:β-1,3-glucanases(GUS)activitydeterminationPI活性在第3天最高，最后逐渐降低，且在第9天时PI活性的数值最低，然而第9天和第15天在统计上没有显著差异(one-wayANOVA:F2,24=15.023,P=0.005,图3-4)。GUS活性在第3天时最低，随后逐渐升高。在第9天时GUS活性的数值最高，然而第9天和第15天在统计上没有显著差异(one-wayANOVA:F2,24=15.902,P=0.004,Fig.2d)。3.3.5黄瓜花叶病毒对桃蚜生长发育的影响黄瓜花叶病毒对桃蚜数量的影响：在第3天，桃蚜数量在对照植物和感染CMV植33 物上没有显著差异。从第6天到第15天，桃蚜在对照植物和感染CMV植物上的数量有显著的变化(repeated-measurementANOVA:F=2739.310,P<0.001)。在第6天和第9天，感染CMV植物上蚜虫的数量高于对照植物，而在第12天和第15天，在感染CMV植物上蚜虫的数量低于对照植物。在对照植物上，桃蚜的种群增长速率较为稳定，然而在感染CMV植物上，桃蚜的种群增长速率逐渐降低。（图3-5）黄瓜花叶病毒对桃蚜寿命的影响：在感染CMV植物上桃蚜的寿命显著低于对照植物上桃蚜的寿命(F=0.293,P=0.005)。（图3-6）黄瓜花叶病毒对有翅蚜数量的影响：在对照植物上，无有翅蚜产生。在感染CMV植物上，前6天无有翅蚜产生，从第9天开始出现有翅蚜，且有翅蚜的数量逐渐增高。（图3-7）图3-5蚜虫饲喂在CMV侵染的植株上3、6、9、12、15天的数量变化Fig.3-5AphidnumberonCMV-inoculatedplantsafter3、6、9、12and15days.CMV:CMV-inoculatedplants.Mock:mock-inoculatedplants.Valuesaremeans±SE.Asterisksindicatesignificantdifferences(P<0.05,a).Differentlettersindicatesignificantdifferences(P<0.05,bandc)图3-6饲喂在CMV侵染的植株上的蚜虫的寿命变化Fig.3-6LongivityofaphidsfeedingonCMV-infectedplants.34 图3-7蚜虫饲喂在CMV侵染的植株上3、6、9、12、15天的有翅蚜数量变化Fig.3-7AphidnumberonCMV-inoculatedplantsafter3、6、9、12and15days.3.3.6黄瓜花叶病毒对桃蚜Buchnera含量的的影响桃蚜获毒以后，通过qPCR检测体内CMV-CP基因和BuchneradnaK基因的表达量，结果表明与未带毒的蚜虫相比，CMV-CP基因表达量显著上调而BuchneradnaK基因显著地下调表达。（见图3-8）3-8获毒桃蚜CMV-CP基因和BuchneradnaK基因表达量A：CP基因表达量B：dnaK基因表达量Fig.3-8GeneexpressionlevelsofCMV-CPandBuchneradnaKincarriedCMVaphidsA：TherelativeabundanceofCP；B：TherelativeabundanceofdnaK3.4讨论我们的研究发现，在蚜虫数量，植物的病毒量和植物防御之间有着非常明显的联系。在感染病毒的植物上，蚜虫的数量在刚开始有显著的升高，然而随着病毒量增长，当病毒量达到一定水平时，蚜虫的数量开始下降。此外，感染CMV植物上的桃蚜寿命35 显著低于对照植物。我们的结果表明在CMV侵染的初期阶段，感病植物促进了桃蚜的生长发育，而在病毒量达到平衡后，蚜虫的生长发育逐渐降低。前期研究表明在病毒侵染的前14天，桃蚜在感染CMV植物上的存活率显著低于对照植物。此外，也有研究表明在前15天内感染CMV植物上的桃蚜数量显著降低。结合我们的结果可以看出，蚜虫的生长发育在CMV侵染的植物上是有时效性的。我们的结果也表明植物防御随着病毒量的变化而变化。在CMV侵染的过程中，JA相关基因表达量下调，而SA相关基因表达量上调。在第9天，植物体内的病毒量是最高的，同时SA相关基因ICS、NPR1和PR1的表达量在数值上都是最高的，而JA下游基因COI1和PDF1.2的表达量在数值是最低的。NPR1是已报道的在调节SA和JA互作过程中发挥关键作用的基因[95]。例如，坏死性真菌Botrytiscinerea侵染过程中，通过NPR1激活了SA信号，从而开启了JA和SA信号之间的拮抗作用[96]。CMV的2b蛋白也通过NPR1来调节JA和SA信号间的对抗[94,97,98]。前期研究表明TYLCV的侵染诱导了SA下游基因NPR1的表达，并且抑制了JA下游基因的表达[99,100]。本研究发现，CMV侵染诱导了SA下游基因NPR1和PR1的表达，而这两个基因在JA和SA信号交互过程中发挥着重要作用。同时我们发现，CMV侵染诱导了SA相关基因并抑制了JA相关基因的表达，这与之前的研究是一致的。蛋白酶抑制剂在植物防御害虫的过程中发挥着重要作用，且与JA途径有紧密的联系[101]。β-1,3-葡聚糖酶在植物SA防御途径中发挥着重要作用[102]。我们的研究发现，PI活性显著降低，而GUS活性显著升高，这与JA信号被抑制，相关基因表达量降低而SA信号被诱导，相关基因表达量升高的结论是一致的。根据我们的结果可以发现，与对照植物相比，在病毒侵染初期，植物防御能力较低，可能的原因是病毒的侵染抑制了部分植物防御，此时桃蚜的数量增长较快。然而，随着病毒量逐渐趋于稳定，植物防御尤其是SA相关基因的表达量上升到一个较高的水平，而SA对桃蚜的生长发育有着不利的影响[103]，因此造成了桃蚜的数量下降。Avila等（2012）研究表明FAD7基因通过SA途径和NPR1基因提高了植物防御[104]。SA信号是已经报道的对蚜虫有不利作用的化学防御物质[105]。我们的研究中随着病毒量的增加，SA信号被诱导，因此降低了桃蚜的生长发育。桃蚜生长发育降低的另外一个可能的原因是CMV的侵染对植物营养状况造成了不利影响。之前的研究表明CMV侵染降低了植物的适口性和质量，并且植物韧皮部汁液的质量也降低了。结合我们的研究，可以看出，随着植物病毒量的升高，植物生理学和形态学特征下降，因此降低了桃蚜的生长发育。36 有趣的是，我们发现有翅蚜的数量在感染CMV的植物上逐渐增加。蚜虫翅型的变化与许多因素有关，例如环境条件、桃蚜虫口密度、寄主植物品质等。例如，植物品质的下降可以激活某些桃蚜品系产生有翅蚜[106]。本研究发现，在接种病毒9天后，感染病毒植物上的有翅蚜数量多于对照植物，而此时感病植物上桃蚜的总数少于对照植物。因此可推测，本研究中造成有翅蚜产生的原因不是虫口密度，很可能的原因是CMV侵染趋于稳定后诱导了植物防御，同时降低了植物质量，使植物变得不适合桃蚜生长发育，导致了桃蚜的离开。之前的报道发现CMV侵染后植物质量下降，促进了桃蚜的迁移，这与我们的发现是一致的。不同的是，我们还发现CMV侵染后促进了无翅蚜向有翅蚜的转变，这种转变促进了有翅蚜在迁移过程中对CMV的传播。总之，我们研究了CMV流行的生态学机制，即CMV侵染不同阶段，不同程度影响了植物防御，进而影响了桃蚜的生长发育和种群数量，造成了病毒的传播。CMV在初侵染过程中，植物防御较低，桃蚜生长发育较好，种群增长较快。随着病毒的侵染，病毒量逐渐趋于稳定，此时植物防御逐渐增强，尤其是SA防御增强，因此降低了桃蚜的生长发育，并造成了有翅蚜的产生。CMV便随着有翅蚜的迁移进行了传播。根据以上结论，我们应该在桃蚜发生早期及时进行防治，以减少桃蚜对病毒的传播。37 第四章桃蚜内共生菌对植物挥发物及桃蚜选择性的影响桃蚜的嗅觉对其寄主的选择性和降落在寄主植物上后小范围的定位具有重要作用[107]。寄主植物释放的挥发物当中既有吸引植食性昆虫的种类（如各种饱和及不饱和脂肪醇、酮类、酯类、醛类混合物等），又有对植食性昆虫产生趋避作用的种类[108]。本实验主要探究当内共生菌含量降低时是否影响桃蚜的选择性，不同含量内共生菌的蚜虫以及带毒蚜虫取食后的寄主植物挥发物与健康植株相比是否存在差异，差异挥发物对蚜虫选择性的影响。通过对这一系列问题的探索，以期找到内共生菌对蚜虫传播黄瓜花叶病毒的间接影响。桃蚜取食了CMV侵染的植株以后，引起了内共生菌含量的降低，内共生菌含量的降低对桃蚜的生长发育造成不利影响，是否同时影响桃蚜的选择性，是本实验要探究的问题。4.1试验材料4.1.1主要试剂正己烷、SuperQ吸附剂和挥发物标样等。（详见附录2）4.1.2主要仪器设备流量计，昆虫行为观察箱，Y型管，玻璃棉、密封收集罐、无油空气压缩机等。4.2试验方法4.2.1内共生菌含量降低对蚜虫选择性的影响用200μg利福平处理蚜虫，方法参照第一章内容。将健康蚜虫饲喂在CMV侵染的植株上。桃蚜的选择反应试验：（1）Y型嗅觉仪的Y型管的规格为上端两臂长18cm，底臂长15cm，内径3cm，两臂夹角75度。（2）挑取利福平处理后的桃蚜100头或取食了CMV侵染植株的蚜虫置于Y型管低臂的球状处，底部用锡纸封好；（3）将健康辣椒和CMV侵染的辣椒分别放入不同的两个密封收集罐中，为确保实验的准确性，植株的盆和土均用锡箔纸包裹；38 （4）用胶管一端连接空气压缩机，一端连接密封收集罐底部，用另一根胶管连接密封罐顶部，一端连接Y型管其中一臂；另一臂按照同样的方法连接；（5）开启空气压缩机，将流速调至1L/min；（6）将Y型管平置于昆虫行为观察箱中，每个处理观察20min，重复10次。选择性判断标准：当蚜虫爬过底臂的10cm，并稳定地持续5min以上，则判定其对该臂对应的植物做出了选择。如蚜虫在20min内未做出选择则视为无效，随即用95%的乙醇仔细擦拭Y型管内外壁，烘干待用。4.2.2内共生菌含量不同的蚜虫取食辣椒对植株挥发物的影响4.2.2.1辣椒挥发物的收集将200μg利福平处理后的蚜虫饲喂在健康的辣椒苗上（辣椒需在隔离的防虫笼中单独培养，由于辣椒虫害很多，尤其在受到红蜘蛛攻击时，蚜虫不会在上面定殖），24h之后，去掉蚜虫，收集辣椒挥发物。采用顶空收集法收集辣椒挥发物，方法如下：（1）吸附管的准备：准备好洗净烘干的玻璃吸附管（直径为3mm），取少量玻璃棉塞入吸附管三分之一处，称取0.1gSuperQ吸附剂，倒入吸附管一端，再塞入少量玻璃棉（注意吸附剂与玻璃棉之间要留有少许空隙）；（2）将利福平处理后的蚜虫取食后的辣椒放入密封收集罐中；（3）用胶管一端连接空气压缩机，一端连接密封收集罐底部；（4）用另一根胶管一端连接密封收集罐顶部，一端连接吸附管；（5）打开空气压缩机，调整流量至1L/min，连续收集6h；（6）6h后拔出吸附管，然后立刻用1600μL正己烷淋洗；（7）将淋洗液用Millipore0.22μM的滤膜过滤，将滤出液收集于1.5mL的样品瓶中，待测。处理和对照分别都进行4次技术重复和3次生物学重复。4.2.2.2挥发物定性分析将1.2.2.1当中收集的挥发物用安捷伦气质联用仪Agilent5975C（5975CGC-MS）进行定性分析。气相色谱条件：进样口温度为250℃，采用程序升温，初始柱温为40℃，保持17min；以10℃/min升至250℃；250℃，维持2min；以30℃/min升至280℃，280℃，维持5min。质谱条件：离子源为电子轰击EI源，激发电压为70eV，离子源温250℃，四级39 杆温度150℃，扫描速度0.5scans/s，扫描范围为50m/z到650m/z。通过质谱图和与NIST数据库的比对结果来定性分析各辣椒挥发物成分。利用峰面积归一化法对化合物的保留时间进行鉴定。4.2.3带毒蚜虫取食辣椒对植株挥发物的影响将健康蚜虫饲喂在CMV侵染的辣椒苗上，24h后，将蚜虫转移至健康辣椒苗上取食24h，空白对照用健康蚜虫取食后的健康辣椒苗。随后收集辣椒苗的挥发物并用GC-MS对挥发物进行定性测定与分析，方法参照4.2.2操作。4.2.4差异挥发物对蚜虫选择性的影响用Y型管检测桃蚜对差异挥发物的选择性，操方法参照4.2.1进行。我们选择了与蚜虫选择性相关的10种差异挥发物进行桃蚜选择性分析，并委托公司合成标样，它们分别是：2-辛醇、1-丁醇、苯甲醇、正己醛、邻伞花烃、3-己烯-1-醇、邻二甲苯、α-蒎烯、β-蒎烯、γ-萜品烯。4.3内共生菌对植物挥发物及桃蚜选择性影响的结果分析4.3.1内共生菌含量降低对桃蚜选择性的影响用利福平处理桃蚜内共生菌后，Buchnera含量降低，利用Y型管验证处理后的桃蚜和携带CMV的桃蚜对健康植株和带毒植株的选择性，结果表明两者都趋向于健康植株。（见图4-1）图4-1利福平处理后的桃蚜和携带CMV的桃蚜对CMV侵染植株与健康植株的选择性Fig.4-1TheselectivityofaphidsthattreatedbyrifampicinandcarriedCMVagainstCMVinfectedplantsandhealthyplants4.3.2被不同处理的蚜虫取食后的寄主植物挥发物差异测定了Buchnera含量不同的蚜虫取食辣椒后，辣椒的挥发物种类，并与健康辣椒、CMV侵染的辣椒以及未被处理的健康蚜虫取食后的辣椒挥发物相比较。通过与NIST40 数据库进行检索比对后，每一个处理都得到了超过300种化合物反馈结果，根据文献报道，我们选取了与蚜虫行为相关的10种化合物进行分析，并购买这10种化合物的标准品做下一步的选择性试验。我们发现10种化合物在各处理间的含量都存在差异，其中邻二甲苯含量的差异最大，利福平处理后的蚜虫取食的的辣椒显著高于其他处理，尤其以200μg/mL利福平处理组邻二甲苯含量最高。各处理总离子流量中的封面积见图4-1。表4-1各处理间辣椒挥发物的峰面积百分比比较分析Table4-1AnalysisofpeakareaofvolatilefordifferenttreatedchiliCompoundABCDEFα-蒎烯0.030.060.100.090.090.09β-蒎烯0.050.090.150.090.070.09γ-萜品烯0.070.090.160.060.050.06邻伞花烃0.140.250.350.120.900.132-辛醇0.260.330.49n.d.n.d.0.02苯甲醇0.450.360.280.020.010.01邻二甲苯1.061.097.531.010.010.033-己烯-1-醇0.090.080.080.03n.d.0.011-丁醇0.040.050.050.00n.d.n.d.正己醛0.050.030.06n.d.n.d.n.d.A：健康辣椒B：50μg/mL利福平处理后的蚜虫取食的辣椒C：100μg/mL利福平处理后的蚜虫取食的辣椒D：200μg/mL利福平处理后的蚜虫取食的辣椒E：感染CMV的蚜虫取食的辣椒F：未处理的蚜虫取食的辣椒n.d.：表示没有检测到A:HealthychiliB:Thechilifeededbyaphidwhichwastreatedby50μg/mLrifampinC:Thechilifeededbyaphidwhichwastreatedby100μg/mLrifampinD:Thechilifeededbyaphidwhichwastreatedby200μg/mLrifampinE:ThechilifeededbyaphidinfectedwithCMVF:Chilifeededbyaphidwhichwasuntreadedn.d.:notdetected4.3.3差异挥发物对蚜虫选择性的影响用选定的差异挥发物标样，进行Y型管选择实验，验证健康桃蚜对这10种挥发物的选择性，结果显示其中2-辛醇、邻伞花烃、α-蒎烯、β-蒎烯、γ-萜品烯吸引桃蚜（见图4-2）；苯甲醇、邻二甲苯趋避桃蚜（见图4-3）；桃蚜对1-丁醇、正己醛、3-己烯-1-醇没有明显选择性（见图4-4）。41 4.4讨论本研究发现，利福平处理后的桃蚜和携带CMV桃蚜都趋向于健康植株。根据前面两章的结果可以发现，利福平处理后桃蚜的内共生菌含量随着浓度的升高而降低，而CMV侵染后桃蚜的内共生菌含量也有显著降低，因此我们推测内共生菌含量的降低影响了桃蚜对植物的选择性。图4-2桃蚜对2-辛醇、邻伞花烃、α-蒎烯、β-蒎烯、γ-萜品烯的选择性Fig.4-2Theselectivityofaphidsfor2-octanol、o-cymene、α-pinene、β-pinene、γ-terpinene图4-3桃蚜对苯甲醇、邻二甲苯的选择性Fig.4-3Theselectivityofaphidsforbenzylalcohol、o-xylene图4-4桃蚜对1-丁醇、正己醛、3-己烯-1-醇的选择性Fig.4-4Theselectivityofaphidsfor1-butanol、3-hexen-1-ol、1-hexanal已有研究表明，植物挥发物在媒介昆虫选择过程中发挥着重要作用[109]。我们比较了不同浓度利福平处理后的桃蚜以及感染CMV的桃蚜取食植物后发现，感染CMV的42 桃蚜取食辣椒引起的挥发物与200μg/mL利福平处理后的桃蚜取食的辣椒引起的挥发物最为接近。比较10种特异挥发物的作用发现，2-辛醇、邻伞花烃、α-蒎烯、β-蒎烯和γ-萜品烯这几种挥发物对桃蚜有排斥作用，而苯甲醇和邻二甲苯对桃蚜有吸引作用，1-丁醇、正己醛和3-己烯-1-醇对桃蚜没有明显作用。结合挥发物结果可以看出，排斥性挥发物的含量随着内共生菌含量的降低而升高，而吸引性挥发物的含量随着内共生菌的含量降低而降低。说明内共生菌在诱导植物挥发物过程中发挥了重要作用。有研究表明，内共生菌含量的降低影响了挥发物释放，从而影响了昆虫的选择性和生长发育[110]，这与我们的结论是一致的。我们用外源抗生素处理桃蚜，导致了桃蚜内共生菌含量的降低，而内共生菌含量的降低导致了趋避性挥发物的增加和吸引性挥发物的降低。我们同时发现，感染CMV的桃蚜取食植物释放的挥发物与200μg/mL利福平处理后的桃蚜取食植物释放的挥发物最为接近，结合前面的结果可以看出，这两个处理下，桃蚜体内的内共生菌含量均较低，说明感染CMV桃蚜降低了内共生菌的含量，从而导致了趋避性挥发物的升高和吸引性挥发物的降低，这便导致了桃蚜的迁移，造成了病毒的传播。我们从内共生菌的角度研究了CMV流行爆发的原因，发现CMV侵染蚜虫后能够导致蚜虫内共生菌含量降低，并通过直接和间接的方式改变携带CMV蚜虫的选择性。内共生菌的降低可直接改变带毒桃蚜的选择性，使桃蚜趋向于健康植物而趋避感染CMV植物，直接造成病毒的传播。此外，在蚜虫取食过程中内共生菌含量的降低会导致趋避性挥发物的增多以及吸引性挥发物的减少，使蚜虫在短时间内离开所取食的植物，从而将病毒传播到其他植株上去。我们从直接和间接的角度研究了内共生菌及其介导的挥发物对桃蚜选择性的影响，发现了桃蚜内共生菌在桃蚜选择性过程中发挥的重要作用，从而解释了内共生菌在CMV传播过程中的重要作用。43 第五章全文主要结论及创新点1、本试验发现不同浓度的利福平处理桃蚜后，其内共生菌Buchnera的dnaK基因表达量极显著低于健康桃蚜，当浓度达到200μg/mL时仍未将Buchnera全部去除。这可能是由于Buchnera属于初生内共生菌，与蚜虫一起协同进化，且能够为蚜虫提供某些必需氨基酸，因此蚜虫对其有一定的保护作用。2、本试验发现用利福平处理后的桃蚜在辣椒、萝卜和黄瓜这三种蔬菜上的生物学特性均显著降低，具体表现为寿命缩短、繁殖力下降、体重降低，说明内共生菌Buchnera在桃蚜的生长发育中起着重要作用，内共生菌Buchnera含量的降低对蚜虫生长发育有不利作用。3、研究发现，植物病毒的含量和植物防御之间有着密切关系。当CMV侵染植物，随着病毒量的增加，诱导了SA下游基因NPR1和PR1的表达并抑制了JA上游基因OPR3的表达。同时我们还发现与JA信号通路相关的蛋白酶抑制剂（PI）活性降低而与SA相关的β-1,3-葡聚糖酶（GUS）活性升高。JA和SA是与植物防御相关的重要信号通路，这说明植物病毒的含量与植物防御有着非常重要的联系。4、实验表明随着病毒量的增加，蚜虫的数量先多后少、寿命缩短、有翅蚜增多，这表明植物病毒对蚜虫的生长发育起着不利影响。此外，当蚜虫获毒后其体内内共生菌BuchneradnaK的表达量显著降低，这表明植物病毒与内共生的含量有着直接关系。5、带毒桃蚜取食植物释放的挥发物与200μg/mL利福平处理后的桃蚜取食植物释放的挥发物最为接近，与对照组相比趋避性挥发物升高而吸引性挥发物降低，结合前面的结果，这两个处理与对照组相比都降低了内共生菌含量，这说明内共生菌的降低可改以改变带毒桃蚜的选择性，使桃蚜趋向于健康植物而趋避感染CMV的植物，直接造成病毒的传播。6、发现感染CMV可降低桃蚜内共生菌含量，利用抗生素处理发现内共生菌含量降低的桃蚜取食植物可增加植物趋避性挥发物的含量，造成桃蚜向健康植物的迁移。创新点：研究了内共生菌对植物挥发物的影响，进而对植物病毒传播的影响，从内共生菌的角度解释了造成CMV传播流行的原因。44 参考文献[1]EdwardsonJR,ChristieRG.Cucumoviruses,P.CRCHandbookofvirusesinfectinglegumes.CRCPress,BocaRaton,Fla.1991,293-319[2]JacquemondM,ela1.Cucumbermosaicvirus[J].Advancesinvirusresearch,2012,(84):439-504[3]BackusEA.History,development,andapplicationsoftheACelectronicmonitoringsystemforinsectfeeding[J].EntomologicalSocietyofAmerica,Lanham,MD,1994:1-51[4]GunasingheUB,IrwinME,KampmeierGE.Soybeanleafpubescenceaffectsaphidvectortransmissionandfieldspreadofsoybeanmosaicvirus[J].Annalsofappliedbiology,1988,112(2):259-272[5]NaultLR,StyerWE.Effectsofsinigrinonhostsecectionbyaphids[J].Entomologiaexperimentalisetapplicata,1972,15(4):423-437[6]KennedyJS.Benefitstoaphidsfromfeedingongalledandvirus-infectedleaves[J].Nature(lond),1995(168):825-826[7]DavisTS,HortonDR,MunyanezaJE,etal.Experimentalinfectionofplantswithanherbivore-associatedbacterialendosymbiontinfluencesherbivorehostselectionbehavior[J].PLoSOne,2012,7(11):e49330[8]AjayiBYO,DewarAM.Theeffectofbarleyyellowdwarfvirusonfieldpopulationsofthecerealaphids,SitobionavenaeandMetopolophiumdirhodum[J].AnnalsofAppliedBiology,1983,103(1):1-11[9]GildowFE.Influenceofbarleyyellowdwarfvirus-infectedoatsandbarleyonmorphologyofaphidvectors[J].Phytopathology,1983,73(8):1196-1199[10]ArayaJE,FosterJE.LaboratorystudyontheeffectsofbarleyyellowdwarfvirusonthelifeCycleofRhopalosiphumpadi[J].PlantDiseasesandProtection,1987:578-583[11]DamsteegtVD,HewingsAD.RelationshipsbetweenAulacorthumsolaniandsoybeandwarfvirus:Effectoftemperatureontransmission[J].hytopathology,1987,77(3):515-51845 [12]SinghMN,KhuranaSMP,NagaichBB,etal.EnvironmentalfactorsinfluencingaphidtransmissionofpotatovirusYandpotatoleafrollvirus[J].Potatoresearch,1988,31(3):501-509[13]ThomasPE,HassanS,MinkGI.InfluenceoflightqualityontranslocationofTomatoyellowtopvirusandPotatoleafrollvirusinLycopersiconperuvianumandsomeofitstomatohybrids[J].Phytopathology,1988(78):1160-1164[14]HedgesLM,etal.Wolbachiaandvirusprotectionininsects.[J].Science,2008,322(5902):702[15]吴云锋,林林,崔晓峰.麦二叉蚜体内病毒结合蛋白基因的克隆和原核表达[J].病毒学报,2002,18(3):275-278[16]谭周进,谢丙炎，肖启明.病毒虫传相关蛋白[J].氨基酸和生物资源2004,(26)2:56-61[17]MorinS,GhanimM,ZeidanM,etal.AGroELhomologuefromendosymbioticbacteriaofthewhiteflyBemisiatabaciisimplicatedinthecirculativetransmissionoftomatoyellowleafcurlvirus[J].Virology,1999,256(1):75-84[18]VonDohlenCD,RoweCA,HeieOE.AtestofmorphologicalhypothesesfortribalandsubtribalrelationshipsofAphidinae(Insecta:Hemiptera:Aphididae)usingDNAequences[J].Molecularphylogeneticsandevolution,2006,38(2):316-329[19]EastopVF.Worldwideimportanceofaphidsasvirusvectors[J].Aphidsasvirusvectors,1977:3-62[20]WangRY,PironeTP.MineraloilinterfereswithretentionoftobaccoetchpotyvirusinthestyletsofMyzuspersicae[J].Phytopathology,1996,86(8):820-823[21]PironeTP,BlancS.Helper-dependentvectortransmissionofplantviruses[J].Annualreviewofphytopathology,1996,34(1):227-247[22]FereresA,MorenoA,ThreshJM,etal.Behaviouralaspectsinfluencingplantvirustransmissionbyhomopteraninsects.[J].VirusResearch,2009,141(2):158[23]MauckKE,DeMoraesCM,MescherMC.BiochemicalandphysiologicalmechanismsunderlyingeffectsofCucumbermosaicvirusonhost-planttraitsthatmediatetransmissionbyaphidvectors.[J].Plant,cell&environment,2014,37(6):1427[24]MauckKE,MoraesCMD,MescherMC.Deceptivechemicalsignalsinducedbyaplantvirusattractinsectvectorstoinferiorhosts[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2010,107(8):3600-360546 [25]EigenbrodeSD,DingH,ShielP,etal.Volatilesfrompotatoplantsinfectedwithpotatoleafrollvirusattractandarrestthevirusvector,Myzuspersicae(Homoptera:Aphididae)[J].TheRoyalSocietyProceedings.B,BiologicalSciences,2002,269(1490):455-460.[26]GhoshA,DasA,VijayanandrajS,etal.CardamomBushyDwarfVirusInfectioninLargeCardamomAltersPlantSelectionPreference,LifeStages,andFecundityofAphidVector,Micromyzuskalimpongensis[J].EnvironmentalEntomology,2016(1)[27]CassoneBJ,MichelAP,StewartLR,etal.ReductioninFecundityandShiftsinCellularProcessesbyaNativeVirusonanInvasiveInsect[J].GenomeBiology&Evolution,2014,6(4):873[28]DouglasAE.Nutritionalinteractionsininsect-microbialsymbioses:aphidsandtheirsymbioticbacteriaBuchnera[J].Annualreviewofentomology,1998,43(1):17-37[29]MoranNA,DegnanPH.FunctionalgenomicsofBuchneraandtheecologyofaphidhosts[J].MolecularEcology,2006,15(5):1251[30]TuZ,LingB,XuD,etal.Effectsofsouthernriceblack-streakeddwarfvirusonthedevelopmentandfecundityofitsvector,Sogatellafurcifera[J].Virologyjournal,2013,10(1):145[31]RubinsteinG,CzosnekH.Long-termassociationoftomatoyellowleafcurlviruswithitswhiteflyvectorBemisiatabaci:effectontheinsecttransmissioncapacity,longevityandfecundity[J].JournalofGeneralVirology,1997,78(10):2683-2689[32]GuoJY,YeGY,DongSZ,etal.Aninvasivewhiteflyfeedingonavirus-infectedplantincreaseditseggproductionandrealizedfecundity[J].PloSone,2010,5(7):e11713[33]CassoneBJ,MichelAP,StewartLR,etal.Reductioninfecundityandshiftsincellularprocessesbyanativevirusonaninvasiveinsect[J].Genomebiologyandevolution,2014,6(4):873-885[34]XuH,HeX,ZhengX,etal.Southernriceblack-streakeddwarfvirus(SRBSDV)directlyaffectsthefeedingandreproductionbehaviorofitsvector,Sogatellafurcifera(Horváth)(Hemiptera:Delphacidae)[J].Virologyjournal,2014,11(1):55[35]PoliakovA,RussellCW,PonnalaL,etal.Large-scalelabel-freequantitativeproteomicsofthepeaaphid-Buchnerasymbiosis[M].Molecular&CellularProteomics,2011,10(6):7039[36]CiliaM,FishT,YangX,etal.Acomparisonofproteinextractionmethodssuitablefor47 gel-basedproteomicstudiesofaphidproteins[J].JBiomolTech,2009,20(4):201-215[37]SotoMJ,ChenLF,SeoYS,etal.IdentificationofregionsoftheBeetmildcurlytopvirus(familyGeminiviridae)capsidproteininvolvedinsystemicinfection,virionformationandleafhoppertransmission[J].Virology,2005,341(2):257-270[38]BraultV,BergdollM,MuttererJ,etal.Effectsofpointmutationsinthemajorcapsidproteinofbeetwesternyellowsvirusoncapsidformation,virusaccumulation,andaphidtransmission[J].Journalofvirology,2003,77(5):3247-3256[39]ReinboldC,GildowFE,HerrbachE,etal.StudiesontheroleoftheminorcapsidproteinintransportofBeetwesternyellowsvirusthroughMyzuspersicae[J].JournalofGeneralVirology,2001,82(8):1995-2007[40]BraultV,MuttererJ,ScheideckerD,etal.Effectsofpointmutationsinthereadthroughdomainofthebeetwesternyellowsvirusminorcapsidproteinonvirusaccumulationinplantaandontransmissionbyaphids[J].Journalofvirology,2000,74(3):1140-1148[41]BraultV,VandenHeuvelJF,VerbeekM,etal.Aphidtransmissionofbeetwesternyellowsluteovirusrequirestheminorcapsidread-throughproteinP74[J].TheEMBOjournal,1995,14(4):650[42]WatanabeS,BressanA.Tropism,compartmentalizationandretentionofBananabunchytopvirus(Nanoviridae)intheaphidvectorPentalonianigronervosa[J].JournalofGeneralVirology,2013,94(1):209-219[43]VandenHeuvelJFJM,VerbeekM,vanderWilkF.EndosymbioticbacteriaassociatedwithcirculativetransmissionofpotatoleafrollvirusbyMyzuspersicae[J].JournalofGeneralVirology,1994,75(10):2559-2565[44]WilkinsonTL,DouglasAE.Theimpactofaposymbiosisonaminoacidmetabolismofpeaaphids[J].EntomologiaExperimentalisetApplicata,1996,80(1):279-282[45]FilichkinSA,BrumfieldS,FilichkinTP,etal.InvitrointeractionsoftheaphidendosymbioticSymLchaperoninwithbarleyyellowdwarfvirus[J].Journalofvirology,1997,71(1):569-577[46]BouvaineS,BoonhamN,DouglasAE.InteractionsbetweenaluteovirusandtheGroELchaperoninproteinofthesymbioticbacteriumBuchneraaphidicolaofaphids[J].JournalofGeneralvirology,2011,92(6):1467-1474[47]HinodeD,NakamuraR,GrenierD,etal.Cross‐reactivityofspecificantibodiesdirected48 toheatshockproteinsfromperiodontopathogenicbacteriaofhumanorigin[J].MolecularOralMicrobiology,1998,13(1):55-58[48]ChatellierJ,BuckleAM,FershtAR.GroELrecognisessequentialandnon-sequentiallinearstructuralmotifscompatiblewithextendedβ-strandsandα-helices[J].Journalofmolecularbiology,1999,292(1):163-172[49]JohansenHK,NørgaardA,AndersenLP,etal.Cross-reactiveantigenssharedbyPseudomonasaeruginosa,Helicobacterpylori,Campylobacterjejuni,andHaemophilusinfluenzaemaycausefalse-positivetitersofantibodytoH.pylori[J].Clinicalanddiagnosticlaboratoryimmunology,1995,2(2):149-155[50]VandenHeuvelJF,BruyereA,HogenhoutSA,etal.TheN-terminalregionoftheluteovirusreadthroughdomaindeterminesvirusbindingtoBuchneraGroELandisessentialforviruspersistenceintheaphid[J].JournalofVirology,1997,71(10):7258-7265[51]LiuS,SivakumarS,WangZ,etal.Thereadthroughdomainofpeaenationmosaicviruscoatproteinisnotessentialforvirusstabilityinthehemolymphofthepeaaphid[J].Archivesofvirology,2009,154(3):469-479[52]YangX,ThannhauserTW,BurrowsM,etal.Couplinggeneticsandproteomicstoidentifyaphidproteinsassociatedwithvector-specifictransmissionofpolerovirus(Luteoviridae)[J].Journalofvirology,2008,82(1):291-299[53]ChaudharyR,AtamianHS,ShenZ,etal.GroELfromtheendosymbiontBuchneraaphidicolabetraystheaphidbytriggeringplantdefense[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2014,111(24):8919-24[54]DavisTS,HortonDR,MunyanezaJE,etal.ExperimentalInfectionofPlantswithanHerbivore-AssociatedBacterialEndosymbiontInfluencesHerbivoreHostSelectionBehavior[J].PlosOne,2012,7(11):488-488[55]RoosienBK,GomulkiewiczR,IngwellLL,etal.Conditionalvectorpreferenceaidsthespreadofplantpathogens:resultsfromamodel[J].Environmentalentomology,2013,42(6):1299-1308[56]IngwellLL,EigenbrodeSD,Bosque-PérezNA.Plantvirusesalterinsectbehaviortoenhancetheirspread[J].Scientificreports,2012,2:578[57]MayerRT,InbarM,McKenzieCL,etal.Multitrophicinteractionsofthesilverleaf49 whitefly,hostplants,competingherbivores,andphytopathogens[J].Archivesofinsectbiochemistryandphysiology,2002,51(4):151-169[58]BluaMJ,PerringTM.Alataeproductionandpopulationincreaseofaphidvectorsonvirus-infectedhostplants[J].Oecologia,1992,92(1):65-70[59]GildowFE.Increasedproductionofalataebyaphidsrearedonoatsinfectedwithbarleyyellowdwarfvirus[J].AnnalsoftheEntomologicalSocietyofAmerica,1980,73(3):343-347[60]MauckKE,DeMoraesCM,MescherMC.EffectsofCucumbermosaicvirusinfectiononvectorandnon-vectorherbivoresofsquash[J].Communicative&integrativebiology,2010,3(6):579-582[61]McMenemyLS,HartleySE,MacFarlaneSA,etal.Raspberryvirusesmanipulatethebehaviouroftheirinsectvectors[J].EntomologiaExperimentalisetApplicata,2012,144(1):56-68[62]MillerJW,CoonBF.TheeffectofbarleyyellowdwarfvirusonthebiologyofitsvectortheEnglishgrainaphid,Macrosiphumgranarium[J].JournalofEconomicEntomology,1964,57(6):970-974[63]MatsuuraS,HoshinoS.EffectoftomatoyellowleafcurldiseaseonreproductionofBemisiatabaciQbiotype(Hemiptera:Aleyrodidae)ontomatoplants[J].Appliedentomologyandzoology,2009,44(1):143-148[64]MarisPC,JoostenNN,etal.TomatospottedwiltvirusinfectionimproveshostsuitabilityforitsvectorFrankliniellaoccidentalis[J].Phytopathology,2004,94(7):706-711[65]BelliureB,JanssenA,MarisPC,etal.Herbivorearthropodsbenefitfromvectoringplantviruses[J].EcologyLetters,2005,8(1):70-79[66]NanayakkaraUN,GiguèreMA,PelletierY.PopulationGrowthofMyzuspersicaeonpotatoplantsinfectedwithdifferentstrainsandvariantsofPotatovirusY[J].Americanjournalofpotatoresearch,2013,90(3):297-300[67]WosulaEN,DavisJA,ClarkCA.Populationdynamicsofthreeaphidspecies(Hemiptera:Aphididae)onfourIpomoeaspp.infectedornoninfectedwithsweetpotatopotyviruses[J].Journalofeconomicentomology,2013,106(4):1566-1573[68]EllsburyMM,PrattRG,KnightWE.Effectsofsingleandcombinedinfectionof50 arrowleafcloverwithBeanyellowmosaicvirusandaPhytophthorasp.onreproductionandcolonizationbypeaaphids(Homoptera:Aphididae)[J].Environmentalentomology,1985,14(3):356-359[69]InoueT,SakuraiT.InfectionofTomatospottedwiltvirus(TSWV)shortensthelifespanofthelytokousThripstabaci(Thysanoptera:Thripidae)[J].Appliedentomologyandzoology,2006,41(2):239-246[70]DonaldsonJR,GrattonC.Antagonisticeffectsofsoybeanvirusesonsoybeanaphidperformance[J].EnvironmentalEntomology,2007,36(4):918-925[71]CzosnekH,GhanimM.Backtobasics:arebegomoviruseswhiteflypathogens[J].JournalofIntegrativeAgriculture,2012,11(2):225-234[72]CzosnekH,GhanimM,MorinS,etal.Whiteflies:vectors,andvictims[J],ofgeminiviruses[J].Advancesinvirusresearch,2001,57:291-322[73]KamaliM,XiaA,TuZ,etal.AnewchromosomalphylogenysupportstherepeatedoriginofvectorialcapacityinmalariamosquitoesoftheAnophelesgambiaecomplex[J].PLoSPathog,2012,8(10):2960[74]LeiW,LiuD,LiP,etal.Interactiveeffectsofsouthernriceblack-streakeddwarfvirusinfectionofhostplantandvectoronperformanceofthevector,Sogatellafurcifera(Homoptera:Delphacidae)[J].Journalofeconomicentomology,2014,107(5):1721-1727[75]JiuM,ZhouXP,TongL,etal.Vector-virusmutualismacceleratespopulationincreaseofaninvasivewhitefly[J].PLoSOne,2007,2(1):182[76]FragoE,DickeM,GodfrayHCJ.Insectsymbiontsashiddenplayersininsect–plantinteractions[J].TrendsinEcology&Evolution,2012,27(12):705-711[77]ZhangT,etal.Begomovirus–whiteflymutualismisachievedthroughrepressionofplantdefencesbyaviruspathogenicityfactor[J].MolecularEcology,2012,21(5):1294-1304[78]WilkinsonTL,DouglasAE.Theimpactofaposymbiosisonaminoacidmetabolismofpeaaphids[J].EntomologiaExperimentalisetApplicata,1996,80(1):279-282[79]DennisonNJ,JupatanakulN,DimopoulosG.Themosquitomicrobiotainfluencesvectorcompetenceforhumanpathogens[J].Currentopinionininsectscience,2014,3:6-13[80]DouglasAE,PriceDRG,MintoLB,etal.Sweetproblems:insecttraitsdefiningthelimitstodietarysugarutilisationbythepeaaphid,Acyrthosiphonpisum[J].JournalofExperimentalBiology,2006,209(8):1395-140351 [81]JiangZ,JonesDH,KhuriS,etal.ComparativeanalysisofgenomesequencesfromfourstrainsoftheBuchneraaphidicolaMpendosymbionofthegreenpeachaphid,Myzuspersicae[J].BMCgenomics,2013,14(1):917[82]CassoneBJ,RedinbaughMG,DorranceAE,etal.ShiftsinBuchneraaphidicoladensityinsoybeanaphids(Aphisglycines)feedingonvirus-infectedsoybean[J].Insectmolecularbiology,2015,24(4):422-431[83]李正西,李定旭.桃蚜自然种群初级和次级共生菌的分子鉴定[J].昆虫学报,2005,(05):810-814[84]谭周进,肖启明,谢丙炎.昆虫胞内共生菌研究概况.微生物学通报[J].2005,32(4):140-143[85]冯利,孙玉诚,戈峰,马骏.蚜虫-内共生菌的互利共生研究综述[J].江西农业学报,2008,(06):65-68[86]ProsserWA,DouglasAE.Theaposymbioticaphid:ananalysisofchlortetracycline-treatedpeaaphid,Acyrthosiphonpisum[J].JournalofInsectPhysiology,1991,37(10):713-719[87]MiaoX,DingD.InteractionbetweenaphidsanditsintracellularbacterialsymbiontsBuchnera[J].ChineseBulletinofLifeSciences,2002,15(4):242-247[88]高亮.百部·楝·烟乳油防治桃蚜及其在莴苣上的残留试验[J].中国蔬菜,2002,(04):14-16[89]刘奎,许江,林上统,关义甫,卢辉,钟义海.防治豇豆蚜虫和美洲斑潜蝇的田间药效试验[J].中国蔬菜,2010,(06):63-66[90]NishimuraMT,SteinM,HouBH,etal.Lossofacallosesynthaseresultsinsalicylicacid-dependentdiseaseresistance[J].Science,2003,301(5635):969-972[91]ZhaoY,ThilmonyR,BenderCL,etal.VirulencesystemsofPseudomonassyringaepv.tomatopromotebacterialspeckdiseaseintomatobytargetingthejasmonatesignalingpathway[J].ThePlantJournal,2003,36(4):485-499[92]ZhuF,XiDH,YuanS,etal.SalicylicacidandjasmonicacidareessentialforsystemicresistanceagainsttobaccomosaicvirusinNicotianabenthamiana.[J].Molecularplant-microbeinteractions:MPMI,2014,27(6):567[93]孙洁,王婉,周翎等.黄瓜花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立[J].华南农业大学学报,2014(2):53-5652 [94]ZiebellH,MurphyAM,GroenSC,etal.Cucumbermosaicvirusandits2bRNAsilencingsuppressormodifyplant-aphidinteractionsintobacco[J].Scientificreports,2011,1:187[95]SpoelSH,KoornneefA,ClaessensSMC,etal.NPR1modulatescross-talkbetweensalicylate-andjasmonate-dependentdefensepathwaysthroughanovelfunctioninthecytosol[J].ThePlantCell,2003,15(3):760-77[96]ElOirdiM,ElRahmanTA,RiganoL,etal.Botrytiscinereamanipulatestheantagonisticeffectsbetweenimmunepathwaystopromotediseasedevelopmentintomato[J].ThePlantCell,2011,23(6):2405-2421[97]LewseyMG,GonzálezI,KalininaNO,etal.SymptominductionandRNAsilencingsuppressionbythecucumbermosaicvirus2bprotein[J].Plantsignaling&behavior,2010,5(6):705-708[98]LoveAJ,GeriC,LairdJ,etal.CauliflowermosaicvirusproteinP6inhibitssignalingresponsestosalicylicacidandregulatesinnateimmunity[J].PLoSOne,2012,7(10):e47535[99]ShiX,PanH,ZhangH,etal.BemisiatabaciQcarryingtomatoyellowleafcurlvirusstronglysuppresseshostplantdefenses[J].Scientificreports,2014,4:5230[100]ShiX,PanH,XieW,etal.Plantvirusdifferentiallyalterstheplant'sdefenseresponsetoitscloselyrelatedvectors[J].PLoSOne,2013,8(12):e83520[101]ZhangH,XieX,XuY,etal.IsolationandfunctionalassessmentofatomatoproteinaseinhibitorIIgene[J].PlantPhysiologyandBiochemistry,2004,42(5):437-444[102]FunnellDL,LawrenceCB,PedersenJF,etal.Expressionofthetobaccoβ-1,3-glucanasegene,PR-2d,followinginductionofSARwithPeronosporatabacina[J].Physiologicalandmolecularplantpathology,2004,65(6):285-296[103]PegadarajuV,KnepperC,ReeseJ,etal.PrematureleafsenescencemodulatedbytheArabidopsisPHYTOALEXINDEFICIENT4geneisassociatedwithdefenseagainstthephloem-feedinggreenpeachaphid[J].PlantPhysiology,2005,139(4):1927-1934[104]AvilaCA,Arévalo-SolizLM,JiaL,etal.LossoffunctionofFATTYACIDDESATURASE7intomatoenhancesbasalaphidresistanceinasalicylate-dependentmanner[J].Plantphysiology,2012,158(4):2028-2041[105]DonovanMP,NabityPD,DeLuciaEH.Salicylicacid-mediatedreductionsinyieldin53 Nicotianaattenuatachallengedbyaphidherbivory[J].Arthropod-PlantInteractions,2013,7(1):45-52[106]MauckKE,DeMoraesCM,etal.BiochemicalandphysiologicalmechanismsunderlyingeffectsofCucumbermosaicvirusonhost‐planttraitsthatmediatetransmissionbyaphidvectors[J].Plant,cell&environment,2014,37(6):1427-1439[107]范佳,陈巨莲,程登发,孙京瑞.蚜虫嗅觉行为及昆虫嗅觉信号转导途径研究进展[J].植物保护,2008,(5):6-11[108]杜家纬.植物-昆虫间的化学通讯及其行为控制[J].植物生理学报,2001,(3):193-200[109]DavisTS,HortonDR,MunyanezaJE,etal.Experimentalinfectionofplantswithanherbivore-associatedbacterialendosymbiontinfluencesherbivorehostselectionbehavior.[J].PlosOne,2012,7(11):488-488[110]FereresA.Insectvectorsasdriversofplantvirusemergence[J].Currentopinioninvirology,2015,10:42-4654 附录1本实验涉及的重要缩略词及中文对照缩写英文全称中文全称CMVCucumbermosaicvirus黄瓜花叶病毒JAjasmonicacid茉莉酸SAsalicylicacid水杨酸SMVSoybeanmosaicvirus大豆花叶病毒qPCRQantitativePolymeraseChainReaction荧光定量PCRBtMVBeetmosaicvirus甜菜花叶病毒BYDVBarleyyellowdwarfvirus大麦黄矮病毒SDVSatsumadwarfvirus温州蜜柑矮缩病毒PLRVPotatoleaffrollvirus马铃薯卷叶病毒PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应dNTPsdNTPs脱氧核糖核苷三磷酸ODOpticaldensity光密度值dsRNADouble-strandedRibonucleicAcid双链RNAcDNAComplementaryDNA互补DNACPCoatprotein外壳蛋白bpBasepair碱基对AMPAmpicillin氨苄青霉素ABAAbscisicAcid脱落酸55 附录2本实验所用溶液及培养基的配方1.接种缓冲液2%（w/v）PVP-150.2%（w/v）NaSO30.1MNaH2PO40.1MNa2HPO4调PH值至7.0，高压灭菌后4℃保存。2.PBS缓冲液1.5mMKH2PO42.7mMKCl3.LB培养基10gNaCl5g酵母抽提物10g胰蛋白胨用10mol/LNaOH调PH值至7.0，加水定容至1000mL，固体LB培养基，加1.5%琼脂粉，高压灭菌，备用。4.氨苄青霉素氨苄青霉素溶于无菌水中，Millipore0.22μm滤膜过滤。5.TAE缓冲液（50×）57.1mL冰醋酸242gTris-HCl100mL0.5MEDTA(pH8.0)用去离子水定容至1000mL，用时稀释50倍。2分子生物学试剂dNTPsSangonpGEM-TeasyVectorsystemProMEGATaqDNA聚合酶Sangon蛋白酶KSangon利福平Sangon56 附录3常用生化试剂及仪器1常用化学试剂正己烷国药试剂异丙醇国药试剂琼脂糖(Agarose)BioWestSuperQ吸附剂Sangon三氯甲烷衡阳市凯信化工试剂有限公司无水乙醇国药试剂TotalRNAExtractor（TriZol）生工生物2仪器超声波清洗机宁波新芝公司光照培养箱国产台式冷冻离心机5810REppendorfDK-8D型电热水槽小型台式离心机5415CEppendorfBioRadCFX96梯度荧光定量PCR仪伯乐上海有限公司水平电泳仪国产超低温冰箱国产超净工作台苏州净化仪器设备厂恒温培养箱国产BioDOC-It220UVP凝胶成像系统AlpHa公司玻璃匀浆器国产pH计Cole-parmerAgilent5975C气质联用仪安捷伦生物技术有限公司PCR仪Eppendorf57 昆虫行为观察箱国产Y型管国产旋涡器国产无油空气压缩机国产加热干燥器国产密封收集罐国产摇床国产震荡混匀器国产其它小型仪器国产58 致谢本论文所涉及的实验均承蒙本人指导老师——湖南省农业科学院植物保护研究所所长张德咏研究员、植物保护研究所书记刘勇研究员以及湖南大学硕士生导师史晓斌老师悉心指导完成。三年前，也是如今这般时节，我第一次踏进植保所，第一次见到我的导师，一切就像昨天发生的事，当时那种略不安、惶恐又期待的心情仍能清晰回顾。张老师所展现出的温厚谦和、博学笃定和对科研审慎求真的态度给我留下深刻印象，并在随后的科研工作中给我以积极正面的影响。一直觉得非常幸运能进到这个实验室，还未离开已然不舍。这是一个很有爱很包容的实验室，这是非常欢乐的三年，在我整个人生道路上大概都会是一段很闪亮的时光，三年来，我学到很多，无论是实验技能还是科研思路，同时也成长了很多，探索科研的过程也是探索自身的过程，有过长久的迷思但始终在进步。即将离开这里，内心是充满感激的，感谢我的导师张德咏老师对我的悉心指导，您所传递出来的正直务实又温和坚毅的精神也将持续指导我今后的人生。感谢我的第二导师史晓斌老师，能遇到晓斌姐，我上辈子一定是拯救了银河系！虽然我们相处只有两年，但我感觉晓斌姐给了我全方位的爱和指导，不管是科研还是生活，始终给我鼓励和支持，在实验进展不顺在遭遇父亲忽然离世的沉痛打击下，是晓斌姐始终给我强有力的支撑感，真的非常感谢您，您达观向上的生活态度，雷厉风行的做事风格，创新又高效的科研实力都深刻地感染着我，再一次说声谢谢你，晓斌姐！感谢实验室的张松柏老师、张卓老师在科研上和生活上给我提供的指导和帮助。感谢孙书娥老师教会我一系列实验技能，让我从菜鸟走向熟练。感谢高阳老师为我提供实验所用蚜虫种群。感谢实验室方勇老师、陈岳老师、杨春晓老师、苏品老师、彭静老师、张鑫老师、郑丽敏老师、陈莎老师、唐雯老师、植物养护师解微等在这一路上给我提供的帮助和支持，谢谢！感谢实验室的师兄师姐师弟师妹们，尤其是我们这个Team的唐鑫师弟，给我实验上提供非常多帮助。感谢实验室博士在读的师兄师姐，宋志强、杜娇、张宇、王丽爽给我提供的各种帮助。感谢硕士在读的同学蒋梦婷、陈建斌、曾益波、鲁清华、王嘉琪、丁昭仪、祝腾辉给我提供的帮助。感谢相关工作人员解啸、赵倩、谢钢、满益龙、孔小婷给我提供的帮助。感谢那些已经毕业的师兄师姐，巢娟、刘健、陈玉珍、吴龙飞、郑棚骏、唐超等等给我的各种帮助。感谢大家陪我共同经历这三年的美好时光，59 纵有离别的伤感，更多的是感激，满载这些精彩或平实的片段。504和607有太多美好与欢笑。再次感谢这些共同奋斗的师兄师姐师弟师妹们，谢谢！感谢植物保护研究所环境评价中心的郭紫兰同学帮我完成挥发物定性检测的工作，非常感谢！感谢植物保护研究所所有工作人员共同努力，创造如此优越的实验环境，使得实验得以顺利开展和完成，谢谢！感谢美国塞缪尔.诺贝基金会的丁辛顺教授和美国肯塔基大学的周序国教授给我科研上的指导和鼓励。谢谢！感谢研究生院的杨海军老师为我第一年学费尽心绸缪。感谢罗建军夫妇的慷慨仁厚，在我父亲病重时为我缴纳一年学费，非常感谢！感谢父母和姐姐，无论什么时候，始终站在我身后。感谢男友唐帅，对我无限的爱与包容，让我不再战战兢兢，更勇敢地面对未来，谢谢你！感谢一路上所有给予我陪伴与鼓励的朋友和同学，谢谢！选择读硕士对我来说是一个重要的决定，这三年在我人生当中是非常有意义闪耀着光芒的三年，即将踏上新的征程，忐忑又期待，今后的人生我将承袭着这段美好更加努力前行！严硕60 作者简介作者：严硕，女，汉族，生于1988年7月，湖南省长沙市人教育经历：2009年9月—2013年6月，就读于湖南农业大学园艺园林专业；2014年9月—至今，就读于湖南农业大学微生物学专业；61 1.严硕,张战泓,刘勇,史晓斌,张德咏.内共生菌Buchnera对桃蚜生长发育的影响.中国蔬菜62