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学校代码10459学号或申请号201412283224密级硕士学位论文野菊花保肝胶囊抗乙肝病毒及肝保护作用研究作者姓名：孟小倩导师姓名：王振基副教授毕跃峰教授学科门类：医学专业名称：药理学培养院系：药学院完成时间：2017年05月 AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterEffectsofYejuhuabaogancapsuleonHBVandhepatoprotectiveactivityinmiceByXiaoqianMengSupervisor:Assoc.Prof.ZhenjiWangProf.YuefengBiPharmacologySchoolofPharmaceuticalSciencesMay,2017 原创性声明＊独立进行研本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下宄所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其它个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研宄作出重要贡献的个人和集体。本声明的法律责任由本人承担。，均己在文中以明确方式标明？曰期：年６月曰学位论文作者＿学位论文使用授权声明。本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被査阅和借阅；本人授权郑州、大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印缩印或者其它复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学一署名单位仍然为郑位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第州大学。。保密论文在解密后应遵守此规定学位论文作者：孟小墙曰期：年（月＾ 摘要基于本课题组前期对野菊花(FlosChrysanthemiindici)大量的研究工作，本课题对从中提取并自行制备的野菊花保肝胶囊（以下简称为CBC）进行了进一步的研究。课题通过CBC体外抗HBV的药效学研究，筛选出了既具有抗HBV作用又无毒性的药物浓度；并通过最大给药量法检测急性毒性，进一步评价CBC的安全性；在此基础上，采用酒精致KM小鼠肝损伤以及刀豆蛋白A致KM小鼠肝损伤模型，进一步评价了CBC的预防性肝保护作用。抗HBV实验中，应用典型的体外筛选抗HBV药物细胞——HepG2.2.15细胞。采用CCK-8比色法检测CBC对HepG2.2.15细胞的抑制作用，筛选出半数致死量（TC50）和最大无毒浓度（TC0），在此基础上，应用酶联免疫吸附法测定CBC对第6d、第9dHepG2.2.15细胞培养基中HBsAg和HBeAg的含量，探讨其对HBV的作用。结果显示，CBC对HepG2.2.15细胞有抑制作用，且抑制作用随CBC浓度的减小而减弱，其中TC50为5.014μg/ml。CBC对HepG2.2.15细胞培养基中HBsAg和HBeAg均有抑制作用，且对后者的抑制作用强于前者；时间效应方面，对第6d的抑制作用强于第9d。结合毒性实验和抗原抑制实验结果，表明CBC具有体外抗HBV作用。急性毒性实验中，参照《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》，采用最大给药量法，最大给药浓度（0.6089g/ml），最大体积（40ml/kg）给药，1次/天，连续14天密切观察CBC作用于KM小鼠后各项指标变化，进一步评价CBC的药物安全性。结果显示，给药组和正常组小鼠，各项指标均正常，无死亡现象。此给药剂量约为临床拟用剂量（0.1g/kg）的243倍，表明CBC用药安全。肝保护实验中，选用KM小鼠建立两种肝损伤模型，即酒精所致化学性肝损伤模型和Con-A所致免疫性肝损伤模型。应用赖氏法测定血清中ALT及AST的酶活力，硫代巴比妥酸法测定肝匀浆中MDA的含量，WST-1法测定肝匀浆中SOD的酶活力，ELISA法测定血清中TNF-α的含量，并观察肝组织病理学变化，来综合评判CBC的保肝作用机制和疗效。结果显示，CBC能使肝损伤小鼠两种血清转氨酶的酶活力降低，肝匀浆中MDA含量降低、SOD酶活力升高，并使Con-A肝损伤小鼠血清TNF-α的含量降低，CBC各给药组肝组织病I 理损伤程度均比模型组有不同程度减轻，表明CBC对两种肝损伤有预防性的保护作用。综上所述，本论文首次对野菊花保肝胶囊进行抗乙肝病毒及肝保护的药效学探索，并系统研究了CBC对小鼠肝保护作用机制以及肝组织病理切片的分析，明确了CBC肝保护效应的量效关系，为中药在抗乙肝病毒和肝保护方面的作用研究提供了一定的科学参考价值，为CBC保健药品的研究和开发奠定了基础。关键词：野菊花保肝胶囊抗乙肝病毒急性毒性酒精性肝损伤Con-A肝损伤II AbstractBasedonourpreviousresearchonFloschrysanthemumindicium,thissubjectcarriedoutmoreresearchonYejuhuabaogancapsule（CBC）,whichwasextractedandpreparedfromFloschrysanthemumindiciumbyourselves.Wehavebeenproceededofpharmacodynamicsinvestigationandscreenedoutthedrugconcentrationofanti-HBVandnon-toxic;AcutetoxicitytestwasperformedinKMmicebythemaximumdosagetoevaluatethesafetyofCBC.Meanwhile,TheCBCwastestedforliverprotectiveeffectagainstmiceliverinjuryinducedbybothalcoholandCon-A.HepG2.2.15cellswaschoosedtoestimatetheanti-HBVeffect,themethodwastypicalcellmodelofscreeninganti-HBVinvitro.TheCCK-8assaywasusedtoexamineHepG2.2.15cells’viabilityandhencefindouttheTC50andTC0.Onthisbasis,ELISAanalysismethodwasusedtodetectthesecretionofHBsAgandHBeAgbyHepG2.2.15cellsonthesixthandninthdayaftertreatmentwithCBC,respectively.TheresultsshowedthatCBChadinhibitoryeffecttotheHepG2.2.15cellsproliferation,andtheinhibitoryeffectdecreasedwiththedecreasedoftheCBCconcentration.TheTC50was5.014μg/ml.Moreover,thesecretionofHBsAgandHBeAgbyHepG2.2.15cellswereinhibitedbyCBC,andtheinhibitoryeffectofHBeAgwasmorepowerfulthanHBsAgandthesixthdaywasmorepowerfulthantheninthday.TheresultsshowedthatCBChastheeffectofanti-HBV.Inacutetoxicitystudy,weusedthemethodofthemaximumdosage(0.6089g/ml,40ml/kg)toevaluatethesafetyofCBC,withcontinuousobservationfor14days.Nodeathorabnormalclinicalsignswerefound.Themaximumdosagewas243timeshigherthanthatofman'snormaldose(0.1g/kg).Inordertostudytheliverprotectioneffect,liverinjurymodelswerepreparedwithalcoholandCon-A.Theformerwaschemicalhepaticinjury,andthelatterwasimmuneliverinjury.UsingReitman-Frankelassay,TBAassay,WST-1assayandELISAassay,wedetectedthechangeofALT,ASTinserum,MDA,SODinliverandTNF-αinserum.Inaddition,livertissuepathologywereobservedafterIII dissection.TheprotectiveeffectofCBCagainstliverinjuryandthemechanismwereoverallevaluate.TheresultsshowedthatCBCcouldreducetheALT,AST,TNF-αinserum,thecontentofMDAinliverandincreasedtheactivityofSODinliverofmiceliverinjuryinducedbyalcoholandCon-A.Meanwhile,comparedwiththemodelgroup,CBCcouldimprovethepathologicalchangeofliver,indicatedthatCBCcouldimprovetheacuteliverinjuryinducedbyalcoholandCon-A.Tosumup,itwasthefirsttimethattheeffectsofCBCagainstHBVandprotectliverinjuryandthemechanisminduceddyalcoholandCon-Awereconfirmed,furthermore,somestatisticalanalysiswerefinshedontherelationshipbetweenthedoseofCBCandtheliverprotectiveeffect.Ihopethispapercanprovidesomescientificreferencevalueforanti-HBVandliverprotectionduralroleoftraditionalChinesemedicineandlaythefoundationfortheresearchanddevelopmentofhealthcaremedicine.Keywords:Yejuhuabaogancapsuleanti-HBVacutetoxicityalcoholicliverinjuryCon-AliverinjuryIV 目录摘要.............................................................................................................IAbstract......................................................................................................III英文缩写词对照表....................................................................................1第一章中药抗乙肝病毒和肝保护研究进展..........................................31中药抗乙肝病毒研究进展....................................................................................31.1单味中药...........................................................................................................................31.2中药复方...........................................................................................................................42中药肝保护研究进展............................................................................................62.1单味中药...........................................................................................................................62.2中药复方...........................................................................................................................72.3中药活性成分...................................................................................................................83中药抗乙肝病毒和肝保护双重作用研究进展...................................................103.1单味中药.........................................................................................................................103.2中药复方.........................................................................................................................114本课题的目的和意义...........................................................................................12第二章野菊花保肝胶囊抗乙肝病毒作用研究.....................................141实验材料...............................................................................................................141.1主要仪器.........................................................................................................................141.2试剂与药品.....................................................................................................................151.3实验细胞.........................................................................................................................151.4药品及试剂配制.............................................................................................................151.4.1药品溶液的配制.............................................................................................................151.4.2PBS（0.0lmol/L，pH7.4）的配制................................................................................16V 1.4.3细胞冻存液的配制..........................................................................................................162实验方法...............................................................................................................162.1HepG2.2.15细胞的培养、传代和冻存.........................................................................162.2CCK-8法检测CBC对HepG2.2.15细胞的毒性作用..................................................172.3ELISA法检测CBC对HepG2.2.15细胞上清液分泌HBsAg和HBeAg的影响......172.4药效评价.........................................................................................................................192.5数据处理.........................................................................................................................193实验结果...............................................................................................................193.1CCK-8法检测CBC对HepG2.2.15细胞的毒性作用结果.............................................193.2ELISA法检测CBC对HepG2.2.15细胞上清液分泌HBsAg和HBeAg的影响结果.204小结.......................................................................................................................215讨论.......................................................................................................................21第三章CBC对小鼠的急性毒性研究....................................................241实验材料...............................................................................................................241.1主要仪器.........................................................................................................................241.2试剂与药品.....................................................................................................................251.3实验动物.........................................................................................................................251.4药品及试剂配制.............................................................................................................251.4.1CBC灌胃供试液的配制.................................................................................................251.4.20.5%CMC-Na溶液的配制.............................................................................................252实验方法...............................................................................................................252.1CBC对小鼠急性毒性预实验..........................................................................................252.2CBC对小鼠急性毒性正式实验......................................................................................262.3急性毒性实验观察指标.................................................................................................262.3.1一般观察指标.................................................................................................................262.3.2体重变化.........................................................................................................................262.3.3尸体解剖.........................................................................................................................262.4数据处理.........................................................................................................................26VI 3实验结果...............................................................................................................273.1CBC对小鼠急性毒性预实验结果.....................................................................................273.2CBC对小鼠急性毒性正式实验结果.................................................................................274小结.......................................................................................................................285讨论.......................................................................................................................28第四章CBC对小鼠的肝保护作用研究................................................301实验材料................................................................................................................301.1主要仪器.........................................................................................................................301.2药品.................................................................................................................................311.3主要试剂..........................................................................................................................311.4实验动物.........................................................................................................................321.5药品及试剂配制.............................................................................................................321.5.1药品溶液的配制.............................................................................................................321.5.20.5%CMC-Na的配制.....................................................................................................321.5.3灌胃酒精的配制..............................................................................................................321.5.4Con-A注射液的配制......................................................................................................321.5.510%福尔马林的配制.......................................................................................................332实验方法...............................................................................................................332.1动物分组与造模.............................................................................................................332.1.1CBC抗酒精性肝损伤动物分组与造模..........................................................................332.1.2CBC抗Con-A肝损伤动物分组与造模.........................................................................332.2检测指标.........................................................................................................................342.2.1体重及脏器指数.............................................................................................................342.2.2血清生化指标的测定......................................................................................................342.2.3肝组织生化指标的测定.................................................................................................342.2.4肝组织病理学检查.........................................................................................................352.3数据处理..........................................................................................................................353实验结果...............................................................................................................35VII 3.1CBC抗酒精性肝损伤实验结果......................................................................................353.1.1CBC对酒精性肝损伤小鼠体重及脏器指数的影响......................................................363.1.2CBC对酒精性肝损伤小鼠血清ALT及AST的影响...................................................363.1.3CBC对酒精性肝损伤小鼠肝匀浆MDA及SOD的影响.............................................373.1.4CBC对酒精性肝损伤小鼠肝组织病理学的影响..........................................................373.2CBC抗Con-A肝损伤实验结果.....................................................................................413.2.1CBC对Con-A肝损伤小鼠体重及脏器指数的影响.....................................................413.2.2CBC对Con-A肝损伤小鼠血清ALT及AST的影响..................................................423.2.3CBC对Con-A肝损伤小鼠肝组织匀浆MDA及SOD的影响....................................433.2.4CBC对Con-A肝损伤小鼠血清TNF-α的影响............................................................433.2.5CBC对Con-A肝损伤小鼠肝组织病理学的影响.........................................................444小结.......................................................................................................................445讨论.......................................................................................................................48参考文献...................................................................................................49个人简历...................................................................................................56致谢...........................................................................................................57VIII 英文缩写词对照表Abbreviation英文缩写英文全称中文对照CBCYejuhuabaogancapsule野菊花保肝胶囊ELISAenzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定CCK-8CellCountingKit-8细胞活性检测试剂盒HBVHepatitisBvirus乙型肝炎病毒HBsAgHepatitisBsurfaceantigen乙型肝炎表面抗原HBeAgHepatitisBeantigen乙型肝炎e抗原Con-AConcanavalin-A刀豆蛋白-APBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液CMC-NaSodiumcarboxymethylcellulose羧甲基纤维素钠HEHematoxylineosin苏木素-伊红染色TBAThiobarbituricAcid硫代巴比妥酸BPBiphenyldicarboxylatepills联苯双酯3TCLamivudine拉米夫定ALTAlanineaminotransferase丙氨酸氨基转移酶ASTAspartateaminotransferase门冬氨酸氨基转移酶GSHGlutathione谷胱甘肽TGTriglyeride甘油三酯AKPAlkalinePhosphatase碱性磷酸酶ILInterleukin白细胞介素ADHAlcoholDehydrogenase乙醇脱氢酶BCGBacillusCalmette-Guerin卡介苗CCl4CarbonTetrachloride四氯化碳D-GalND-galactosamineD-半乳糖胺LPOLipidPeroxides脂质过氧化物1 P450CytochromeP450细胞色素P450MDAMalondialdehyde丙二醛SODSuperoxideDismutase超氧化物歧化酶TNF-αTumorNecrosisFactor-α肿瘤坏死因子-α2 第一章中药抗HBV和肝保护作用研究进展1中药抗HBV研究进展乙型病毒性肝炎（ViralHepatitisB）是由乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，[1]HBV）引起的，以肝损伤为主的传染性疾病。乙肝的发病呈全球性分布，从[2]WHO公布的最新数据显示，全球约有二十亿人感染HBV。中国是乙肝高发病区，乙肝病毒携带者占全世界总数的30%。乙肝具有恶变性，据统计资料表[3]明：乙肝病毒携带者若不尽早治疗，将有1/3-3/5转化成慢性肝炎；约1/5-1/2的慢性肝炎患者将恶化成肝硬化、肝腹水；约1/5-1/2的肝硬化会发生癌变，直接威胁人类生命。因此，乙肝需及早防治，目前认为抗HBV是治疗的关键。[4]目前抗HBV的药物主要有两类：核苷类和干扰素类，其中前者就占用药市场的80%。但是西药治疗乙肝效果不甚理想，核苷类药物易产生耐药性，干[5]扰素易引起包括肝损伤在内的多种严重不良反应，且这些抗HBV药物价格普遍较高，平均费用约550元/月，通常情况下，患者需要至少连续服药2年才能较好的控制病情，抗HBV连续用药依从性本就不高，加之高额的医药费，限制了乙肝的治疗。因此，研发疗效好、不良反应少、价格低廉的抗HBV新药迫在眉睫。我国传统中药以其多途径、价格便宜、不良反应少的特点，逐渐成为抗[6]HBV的研究热点。1.1单味中药[7]蒋美娟等利用固相放射免疫测定试剂检测野菊花、商陆、积雪草等20味不同浓度的中药单方乙醇提取液对HepG2.2.15细胞培养基中HBsAg和HBeAg含量的影响。结果表明，不同的中药单方乙醇提取液分别作用HepG2.2.15细胞4d，其中17味中药能降低HBsAg的含量，以商陆抑制率最高，可达85.2%；6味中药能降低HBeAg的含量，以秦艽效果最好，抑制率大于70%。[8]Wang等利用不同浓度的六月青作用于Wistar大鼠，连续7d灌胃给药，制备六月青含药血清。检测上述药物对HepG2.2.15细胞的毒性作用和培养基中HBsAg和HBeAg的含量变化并进行药效评价。结果表明，药物作用72h后，六月青的TC50和TC0分别为11.56g/kg/d和1.65g/kg/d，在给药剂量0.213~1.7g/kg/d时，对HBsAg的抑制率大于50%，半数有效剂量IC50为0.178g/kg/d，3 对应的治疗指数TI=64.94（高效低毒）；表明该药具有体外抗HBV的作用，且毒性较低。[9]彭立生等选用HepG2.2.15细胞以及自行构建的HepG2X、HepG2-pcDNA3.0-CAT细胞和HepG2X–HIV-1-LTR-luciferase细胞系，用多个浓度的叶下珠水提物作用于上述细胞以确定其TC0和IC50。应用RT-PCR和抑制luciferase的方法测定HBV-DNA和HBX的含量变化。结果表明，该药TC0为15mg/ml，对HepG2.2.15细胞HBV-DNA和HepG2-X细胞HBX半数有效量均为3.75mg/ml。当药物浓度为15mg/ml时，药物作用3d与1d相比，抑制率大大提升。可见叶下珠提取物具有抗HBV作用，可能与抑制基因表达有关。[10]侯迎迎等对艾叶乙酯部位进行了体内外的抗HBV实验，体外抗HBV实验通过测定该部位对第三天、第六天、第九天HepG2.2.15细胞培养基中HBsAg和HBeAg的含量变化，并用荧光定量PCR法测定第九天HepG2.2.15细胞培养基中HBV-DNA拷贝数的变化；体内抗HBV实验选用樱桃谷鸭构建DHBV动物模型，荧光定量PCR法测定给药前后血清和肝脏中DHBV-DNA的影响。结果表明，该部位对HepG2.2.15细胞的TC50大于100μg/ml，毒性较低，对HBsAg和HBeAg的IC50分别为1.26μg/ml和8.06μg/ml，对HBV-DNA拷贝数有抑制作用，IC50为38.97μg/ml，且第九天治疗指数TI均大于3。另外，该部位可使鸭血清和肝脏DHBV-DNA拷贝数均降低。表明其具有较强的抗HBV作用。1.2中药复方[11]钟正贤等研究肝必康胶囊体外抗HBV作用。肝必康胶囊是由甜茶藤、溪黄草等10多种中药制成纯中药制剂。应用MTT比色法测定其对HepG2.2.15细胞的毒性作用，ELISA法检测肝必康胶囊对HepG2.2.15细胞72h、144h的HBsAg和HBeAg含量，定量PCR检测HBV-DNA拷贝数的影响。研究结果表明，肝必康胶囊TC50为4.677mg/ml，TC0为0.118mg/ml。各给药组均能减低72h、144hHepG2.2.15细胞培养基中HBsAg和HBeAg的含量，其中浓度为0.1mg/ml时效果最好。另外，各给药组均能够降低72h、144h细胞培养基中HBV-DNA拷贝数，其中当药物浓度为0.1mg/ml时效果最好，与HBsAg和HBeAg下降结果一致。结果显示该药具有明显的抗HBV作用，治疗指数均大于3，呈现高效低毒的特点。4 [12]徐海波等对三黄乙肝胶囊进行体外抗HBV的血清药理学研究，该药由黄芩、黄芪、大黄等多种中药制备而成，选用阿昔洛韦和速消净为阳性对照药，采用给新西兰兔连续灌胃7d的方式，制备不同浓度的含药血清。将上述含药血清与HBsAg阳性血清接触4h后，用酶联免疫诊断试剂盒测定各组作用后表面抗原和e抗原的P/N值；特异性免疫沉淀法测定各组作用后HBV-DNAP的CPM值；斑点杂交法检测各组作用后HBV-DNA的影响。研究结果表明，含药兔血清对表面抗原和e抗原有较强的抑制作用，且作用随着剂量的增加、反应时间的延长而增强，随表面抗原和e抗原浓度的升高而减弱。另外，含药兔血清对HBV-DNAP和HBV-DNA有较强的抑制作用，且作用随剂量的增加而增强。该药粗制剂与含药血清体外直接抗HBV作用相比效果更好，显示该药具有体外抗HBV作用。[13]张士军等对复方六月雪进行了体内外抗乙肝病毒的研究，复方六月雪是由六月雪、白花蛇舌草等多种中草药制备而成。体内抗乙肝病毒实验采用广西麻鸭感染DHBV，连续14d灌胃不同浓度的待测药物，应用FQ-PCR法分别于给药前、给药第7d，给药第14d和停药后3d检测鸭血清DHBV-DNA的含量变化，ELISA法检测鸭血清HBsAg和HBeAg的滴度；体外抗HBV实验应用MTT法检测复方六月雪对HepG2.2.15细胞的TC50；采用直接加药法和血清药理学法观察不同浓度药物作用于HepG2.2.15细胞后72h、144h细胞上清液HBsAg和HBeAg的滴度，以及HBV-DNA的含量。研究结果表明，该药对鸭血清HBsAg、HBeAg和病毒滴度有显著的抑制作用，且停药3d后病毒滴度回升不明显。该药对HepG2.2.15细胞的TC50为3.07mg/ml，在无毒浓度下可有效抑制细胞表面抗原和e抗原的分泌和HBV-DNA的合成，并且抑制作用具有明显的量效和时效关系。[14]Hui-Ying等对肝康颗粒进行体外抗乙肝病毒作用研究。肝康颗粒由薏苡仁、香茶菜等13味中药制备而成。应用MTT比色法测定该药作用于HepG2.2.15细胞第3d、第6d、第9d的毒性作用，ELISA法检测肝康颗粒作用HepG2.2.15细胞第3d、第6d、第9d上清液中HBsAg和HBeAg的含量。研究结果表明，该药对HepG2.2.15细胞第3d、第6d、第9d的半数毒性浓度分别为7.131、1.756和1.809mg/mL；对HepG2.2.15细胞第3d、第6d、第9d上清液中HBsAg的治疗指数分别为8.519、5.730、7.066；对HepG2.2.15细胞第3d、第6d、第9d上清液中HBeAg的治疗指数分别为1.723、12.839、47.650，在第6d和第95 d对e抗原的抑制率均高达90%，显示肝康颗粒具有较强的体外抗HBV作用，且毒性较低。总之，大量的实验研究表明，具有清热解毒、疏肝健脾、利湿退黄等功效的部分中药在抗乙肝病毒的防治方面具有不可忽视的作用，这些中药多是通过清热解毒、抑制HBV-DNA复制、改善肝功能及微循环等途径达到抗HBV的效果。为中药新药的研究和开发提供了科学依据。2中药肝保护研究进展肝脏是人体代谢系统中一个特殊的脏器，在各种内源性及外源性有害物质的转化和消除过程中发挥至关重要的作用。由于人们生活节奏的日益加快、饮食结构的不断改变、与有害物质的接触机会逐渐增加等因素，肝病的发病率逐年升高。肝损伤主要是脂质过氧化反应引起的细胞破坏，严重者可发展为肝炎、[15]肝硬化、肝衰竭甚至肝癌。[16]根据肝损伤的发病原理，大致可分为化学性和免疫性两大类，化学性肝损伤主要是通过细胞色素P450以及结合反应产生的中间代谢产物对肝脏造成[17]损伤，例如生物膜的完整性发生变化、酶的活性丧失、自由基产生过多等。免疫性肝损伤主要是通过细胞因子、NO、补体介导的免疫反应以及病理性细胞[18]凋亡等因素造成。根据肝损伤的发病机制，目前已研究开发出多种保肝药物，如抗脂质过氧[19]化剂、膜保护剂、抗免疫反应剂等，但是效果却差强人意，且因其潜在的不[20]良反应大大限制了其市场应用，因此，研制开发新的高效低毒的保肝药物具有重要的应用价值。我国传统中药具有多靶点、多途径综合作用的特点，在防治肝损伤方面具有自身的优势。2.1单味中药[21]Huang等研究辛夷对酒精性肝损伤小鼠的保护作用，采用56°白酒灌胃法构建酒精性肝损伤模型，通过检测小鼠血清ALT、AST活性，肝组织MDA含量、GSH-Px活性，荧光定量PCR法测定肝细胞色素P450氧化酶mRNA表达水平和肝组织病理变化以评估辛夷的肝保护作用。结果表明，辛夷的高、中6 剂量组小鼠两种血清转氨酶活性、肝组织MDA含量、CYP2E1mRNA的表达水平显著下降，血清GSH-Px活性明显升高，同时肝细胞病变程度明显改善。[22]熊文静等研究姜黄浸膏散对CCl4肝损伤小鼠的保护作用，首先给予不同剂量的姜黄浸膏散，连续7d，再用0.12%CCl4腹腔注射，建立CCl4肝损伤模型。通过测定小鼠血清ALT、AST活性，肝组织MDA含量、GSH-Px、SOD、CAT活性，以及肝组织病理学变化，评价该药对CCl4肝损伤小鼠的保护作用。研究结果表明，该药各剂量组均能降低CCl4肝损伤小鼠血清转氨酶活性、肝匀浆MDA含量，升高肝匀浆中GSH-Px、SOD、CAT活性，同时明显改善肝病理损伤，表明该药对CCl4肝损伤小鼠具有肝保护作用。[23]汤新慧等通过在体实验和离体实验研究榄仁叶对D-半乳糖胺所致肝损伤小鼠的保护作用。在体实验，首先给予不同剂量的榄仁叶提取物，连续7d，再用53mg/mlD-GaIN一次性腹腔注射，建立D-GaIN肝损伤模型。通过测定小鼠血清两种转氨酶活性，肝线粒体肿胀程度以及肝脏病理学变化，评价榄仁叶对D-半乳糖胺肝损伤小鼠的保护作用。体外实验，构建原代小鼠肝细胞D-GaIN损伤模型，采用MTT法检测榄仁叶对细胞增殖的影响，并检测对细胞上清AST和SOD活性的影响。研究结果表明，该药能明显抑制D-GaIN引起的小鼠血清转氨酶活性升高，抑制线粒体肿胀，同时改善肝组织病变程度。不同浓度的榄仁叶可抑制D-GaIN所致MTT下降，降低D-GaIN引起的原代肝细胞培养基AST活力同时升高SOD活性，并呈现一定的量效关系。2.2中药复方[24]杨丽娜等研究四逆散对CCl4诱导肝损伤大鼠血清代谢组学，四逆散由柴胡、白芍、枳实、甘草四味中药等份制成。以上述药物作用于CCl4所致肝损伤大鼠，研究血清中内源性代谢物的变化，寻找其肝保护潜在的生物学标志物。研究结果表明，有包括磷脂酰胆碱类在内的九种物质与肝损伤相关的潜在生物学标志物，发生肝损伤是上述物质代谢异常。四逆散具有预防性肝保护作用，且可能是通过调节代谢途径的方式来发挥作用。[25]黄丹青等对清肝解毒方进行抗肝损伤临床及实验研究。清肝解毒方由板蓝根、甘草、连翘、郁金等13味中药制备而成。研究结果表明，清肝解毒方可明显改善肝病患者的肝功能、肝脏B超以及血流变指标，总有效率达71.7%；另外，该药可使CCl4诱导肝损伤大鼠两种血清转氨酶、TBI1、CH、TG及血液7 粘度水平均趋于正常，肝组织及血清过氧化脂质明显下降，同时肝脏病理损伤明显改善。[26]孙鸿昌等研究将军汤对卡介苗（BCG）+脂多糖（LPS）所致免疫性肝损伤小鼠的保护作用。该药由灵芝、茵陈、黄芪等9味中药制备而成。采用BCG+LPS尾静脉注射法构建慢性肝损伤模型，评价将军汤对预处理小鼠的肝保护作用。研究结果表明，该药可使BCG+LPS所致肝损伤小鼠的脾脏指数和T细胞增殖率明显下降，并可改善肝组织病变程度。[27]刘钰华等研究复方肝宁颗粒对小鼠急性肝损伤的保护作用，复方肝宁颗粒由绞股蓝、丹参、当归等11味中药制备而成。结果表明，复方肝宁颗粒可使CCl4诱导化学性肝损伤小鼠血清两种转氨酶活性和肝匀浆MDA含量均明显的下降，对肝匀浆SOD活性有显著的促进作用，同时肝脏病变程度也得到了显著地改善。2.3中药活性成分大量实验证明直接从中药材中获得的活性成分进行肝保护的应用研究，也能达到良好的保肝作用。此外，中药活性成分含量高且大多毒副作用很低，使其保肝作用更为突出。[28]Zhao等将从葛根中获得的黄酮类成分作用于酒精性肝损伤小鼠，结果证实，黄酮类成分能够使肝匀浆中脂质过氧化物的含量大幅度下降，抗氧化酶活[29]性大幅度升高，同时肝损伤程度减轻。Wei等从何首乌中获得的黄酮类成分作用于化学性肝损伤小鼠，结果证实，黄酮类成分能够使肝脏指数，血清转氨酶活性、脂质过氧化物含量大幅度下降，升高肝组织SOD活性，降低血清TNF[30][31]-α、IL-4、IL-6含量。张玲和李国栋等从野菊花中获得的黄酮类成分分别作用于化学性和免疫性肝损伤小鼠，结果证实，黄酮类成分能够使化学性和免疫性肝损伤小鼠血清转氨酶活性和细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6含量大幅度下降，使肝匀浆中脂质过氧化物的含量大幅度下降，抗氧化酶活性大幅度升高，同时明显改善肝组织病变程度。[32][33]Du和Chen等分别从龙牙楤木和芍药中提取了皂苷和芍药苷作用于化学性和免疫性肝损伤小鼠，结果证实，苷类成分能够使血清转氨酶活性和脂质4+8+过氧化物含量明显下降，同时使抗氧化酶活性明显升高，并减少CD、CD、NKT细胞的浸润，降低炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-6水平，改善肝细胞坏8 死程度。其可能是通过提高机体抗氧化能力及抑制炎症因子释放起到肝保护作[34]用。Lei等从松果菊中获得的苷类成分作用于免疫性肝损伤小鼠，结果证实，苷类成分能够使血清ALT、AST活性和炎症因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平降低，可能是通过稳定生物膜和抑制炎症因子的合成和释放起[35]到肝保护作用。刘渊等从肉苁蓉中获得的苷类成分作用于化学性肝损伤小鼠，表明苷类成分可降低肝脏指数和肝功能指标，并减少肝组织中TC、TG、MDA、LPO含量，升高肝组织中SOD、GSH-Px和CAT活性，同时减轻肝脏组织炎性浸润和脂肪空泡的产生。可能是通过减少自由基的合成，增强对自由基及其代谢产物的消除能力，抑制脂质过氧化程度和稳定生物膜达到肝保护作用。[36]钟萍等从香菇中获得的多糖类成分作用于化学性肝损伤小鼠，表明多糖类成分能够使两种血清转氨酶活性及其比值大幅度下降，并降低MDA含量，升高SOD、GSH-Px、CAT活性。肝保护功效可能与其提高抗氧化水平以及加[37]速消除自由基有关。Guo等从白首乌中获得的多糖类成分作用于化学性肝损伤小鼠也表明，多糖类成分能够使肝匀浆MDA含量大幅度下降，使肝组织GSH[38]-Px、SOD、CAT活性大幅度上升，并能改善肝脏病变。刘曦等从六月青中获得的多糖类成分作用于免疫性肝损伤小鼠，证实多糖类成分能够使两种血清转氨酶、AKP活性、TNF-α水平和肝匀浆脂质过氧化物含量明显下降，升高抗氧化酶活性并降低Fas和FasL抗原的表达，同时减轻肝脏病变程度。肝保护[39]功效可能是通过下调炎症因子浓度并抑制脂质过氧化程度。陈晓光等从鹿茸中获得的多糖类成分作用于CCl4、AAP、TAA、ANIT肝损伤小鼠，表明多糖类成分可低沉血清TBIL含量和SGPT活性，升高肝匀浆糖原、甘油三酯含量，并降低MDA含量，升高SOD、GSH-Px、CAT活性。肝保护功效可能与其增强抗氧化酶的活力及维持物质正常代谢等因素有关。除上述黄酮、苷类、多糖中药活性成分，还有许多中药活性成分对肝损伤[40]具有保护作用。例如，Shi等研究发现穿心莲内酯对Con-A肝损伤小鼠具有[41]肝保护作用。Wang等研究发现芦丁提取物—槲皮素能够抗Con-A肝损伤。[42][43]Yang和Zhang等研究发现鞣酸和叶黄素对化学性肝损伤小鼠有预防性的肝保护作用。总之，大量的实验及临床研究表明，中药在肝保护方面具有自身的优势，这些中药发挥肝保护作用的机制大多是通过提高机体抗氧化能力，加快消除自9 由基，抑制过氧化程度，维持核酸、蛋白质、糖类三大物质正常代谢，诱导肝[44]药酶，增强肝脏解毒能力。3中药抗乙肝病毒和肝保护双重作用研究进展现在临床常用的抗HBV药物和保肝药物虽然各自具有很好的功效，但是也存在着自身不能克服的缺点，例如，抗乙肝病毒药物虽然能控制乙肝病毒的复[45]制却有引起肝损伤不良反应的后果，且长期使用易产生耐受性；保肝药虽然[46]对肝脏具有一定的保护作用，却不能很好的抑制HBV-DNA的复制，所以临床常常需要两种药物联合使用以期达到最佳的治疗效果。而我国传统中药具有多途径、多靶点的特点，目前在抗乙肝病毒和肝保护双重作用方面已取得一定进展，现做简单综述，以供参考。3.1单味中药[47]Shen等实施了红背叶根抗HBV以及肝保护双重作用研究，抗HBV应用体外HepG2.2.15细胞模型和体内感染DHBV的鸭动物模型，保肝实验使用Con-A致小鼠肝损伤模型，对上述药物正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、水共四种提取物进行抗HBV和肝保护实验研究。实验结果表明，在无毒浓度下该药正丁醇提取物的结果最佳，对HepG2.2.15细胞培养基中表面抗原和e抗原的抑制率分别高达60%和90%以上，并且能显著减低HepG2.2.15细胞培养基中HBV-DNA的病毒滴度。另外该药石油醚提取物对鸭体内乙肝病毒滴度有明显抑制作用。该药四种提取物均能够抑制血清转氨酶活力，降低脂质过氧化物含量，抑制炎性细胞因子IL-6、IL-4、TNF-α、IFN-γ水平，提高脾巨噬细胞上TLR4和Tim-4的表达百分率。以上结果提示红背叶根抗乙肝病毒和肝保护作用可能涉及抑制脂质过氧化、抑制炎性细胞因子、降低转氨酶、升高TLR4和Tim-4的表达百分率、改善肝组织形态等。[48]张天文等进行了鸦葱抗乙肝病毒及保肝作用研究。抗HBV研究选用HepG2.2.15细胞模型，检测鸦葱对该细胞培养基中HBsAg和HBeAg含量的影响；保肝实验研究选用CCl4、卡介苗+脂多糖、原位胶原酶消化法提取分离大鼠肝细胞并以CCl4诱导肝细胞损伤模型，分别检测血清和培养基上清中两种转氨酶、LDH、NO、SOD和肝细胞MDA含量。结果表明，鸦葱对HepG2.2.1510 细胞HBsAg、HBeAg和HBV-DNA均有抑制作用，对CCl4、卡介苗+脂多糖、及体外诱导肝细胞损伤模型ALT、AST、LDH、NO均有降低作用，对SOD活性具有升高作用，同时改善肝细胞病变。[49]周兰芳等进行了赤芍总苷抗乙肝病毒及肝保护作用研究，选用HepG2.2.15细胞模型和鸭乙肝病毒模型，分别从体内和体外两种方法，全面地考察赤芍总苷的抗HBV作用。采用D-GalN和Con-A所致肝损伤的动物模型研究该药的预防性肝保护作用。结果表明，该药对HepG2.2.15细胞培养基中表面抗原和e抗原的治疗指数介于1和3之间，抑制强度分别为低效有毒和有效低毒，而总苷在给药第9d时DHBV-DNA含量有显著性降低，但停药后有反跳现象。总苷能够明显降低D-GalN和Con-A所致肝损伤小鼠两种血清转氨酶的活性，提高肝匀浆超氧化物歧化酶活性，降低MDA、TNF-α含量，并明显改善肝脏损伤程度。[50]林兴等研究山芝麻抗鸭体内乙肝病毒和肝保护作用，直接选用DHBV-DNA阳性的麻鸭进行抗乙肝病毒及肝保护双重作用研究，检测血清中DHBV-DNA滴度、DHBsAg、ALT、AST、TBIL含量。实验表明，山芝麻可以降低鸭血清DHBV-DNA拷贝数、DHBsAg、ALT、AST含量，但是对TBIL含量无影响，且停药七天后无反跳现象，表明山芝麻具有良好的抗HBV和肝保护双重作用。该研究也为在一个实验模型上同时进行抗HBV和肝保护实验提供了一个新思路。3.2中药复方[51]郝志等进行了参杞苡甘颗粒抗乙肝病毒和肝保护作用研究，参杞苡甘颗粒是由人参、枸杞、薏苡仁、甘草等12味中药制备而成。应用一种反相血凝实验法进行抗人体血清HBV作用研究，同时进行CCl4肝损伤的肝保护实验研究。结果表明，参杞苡甘颗粒可低沉人血清ALT、AST活性，纠正A/G比值。参杞苡甘颗粒可低沉肝损伤小鼠血清ALT、GPT、TG含量。推测其保肝机制也许是调节机体免疫，减轻脂肪变性，改善肝脏微循环，加快胶原纤维的降解，预防发生肝纤维化。[52]刘丽丽等进行了清肝排毒饮抗乙肝病毒和肝保护作用研究，清肝排毒饮是由大青叶、柴胡、甘草等7味中药制备而成。利用HepG2.2.15细胞模型和鸭DHBV模型，从体外和体内综合评价其抗HBV作用。利用Con-A和醋氨酚11 肝损伤模型，评价其肝保护作用。实验表明，清肝排毒饮体外抑制表面抗原和e抗原的TI值分别为1.45和0.74（均小于3），即体外无明显抗HBV功效，但是体内实验可明显降低DHBV-DNA滴度，即具有体内抗HBV作用。该研究结果说明在体外无效的药物也许在体内能发挥好的疗效。清肝排毒饮对Con-A所致免疫性和醋氨酚所致化学性肝损伤均有肝保护功效，其机制可能为抑制T淋巴细胞的活化和炎症因子的释放，提高机体抗氧化能力等。[53]郑阿乾等进行了叶下珠复方抗乙肝病毒和肝保护作用研究，叶下珠复方是由叶下珠、黄芪、甘草等数十种中药制备而成。利用HepG2.2.15细胞模型和鸭DHBV模型，从体外和体内综合评价其抗HBV功效。利用卡介苗+脂多糖肝损伤模型和CCl4肝损伤模型，并选择临床慢性肝炎患者60例，综合评价其肝保护作用。研究结果表明，叶下珠复方体外抑制表面抗原和e抗原的TI值分别为3.8和8.4，即具有高效低毒抑制作用。体内抗乙肝病毒实验同样表明其良好的抗乙肝病毒作用，并且与西药相比，无停药反跳现象。该药对免疫性和化学性肝损伤均有良好的保肝功效，对临床慢性肝炎患者ALT、AST、A/G复常率分别为73.3%、80.0%、83.3%。该研究还显示中西药联合使用效果更好，为中西医结合治疗乙肝和肝损伤提供了新思路。如上所述，中草药在抗HBV和肝保护作用方面已具有广泛的研究和应用基础。这些中药多具有疏肝理气、活血化瘀、补肾健脾、益气养血、去热解毒、利湿退黄等功效，可通过调节整体水平发挥作用，体现了中药君臣佐使、整体调节、标本兼治这些独特的优势。其抗HBV和肝保护功效涉及到的机制包括：提高机体抗氧化能力、加速清除自由基、抑制脂质过氧化、抑制炎症因子的合[54]成或分泌，维持机体正常代谢，提高机体免疫力等。因此中药在抗HBV和肝保护双重作用方面具有很大的开发前空间。4本课题的目的和意义野菊花(FlosChrysanthemiindici)来源于菊科植物野菊的干燥头状花序，性微寒，味苦辛，归心肝二经，具备疏散风热、解毒消肿、抗感染、抗病毒的[55-56]疗效。本课题组经过前期对野菊花深入系统的研究，得到一个具有抗乙肝病毒、肝保护的活性部位（主要成分包括黄酮类和倍半萜类），并研制成野菊花保肝胶囊。本课题旨在从细胞水平检测野菊花保肝胶囊对HBV的抑制作用；从12 急性毒性实验进一步评价野菊花保肝胶囊的药物安全性信息；采用酒精和Con-A肝损伤模型来评价野菊花保肝胶囊的预防性肝保护作用。为中药在抗乙肝病毒和肝保护作用研究方面提供一定的参考价值。13 第二章野菊花保肝胶囊抗乙肝病毒作用研究课题组前期通过对野菊花提取工艺优化、化学成分和剂型研究等一系列研究工作，利用固体分散体技术制备了野菊花保肝胶囊（CBC），且前期研究证实，野菊花拥有抗乙肝病毒的功效，本章主要在前期研究工作的基础之上考察CBC体外抗HBV的药效学研究。新药研究第一步需要找到合适的筛选药物模型，本课题选用HepG2.2.15细胞进行抗HBV药物筛选，因为HepG2.2.15细胞是由人肝癌细胞（HepG2）转染入HBV-DNA的全套基因组获得，是目前最典型的抗HBV药物筛选模型[57]。首先利用灵敏度高且重现性好的CCK-8比色法测定CBC对该细胞增殖的影响，筛选出该细胞的最大无毒浓度后，应用ELISA法测定CBC对HepG2.2.15细胞第六天、第九天上清液中HBsAg和HBeAg的影响，结合细胞毒性实验探讨其抗HBV的作用。1实验材料1.1主要仪器SW-CJ-2D型超净工作台苏州名牌之星仪器有限公司DZKW-D-1型电热恒温水浴锅北京市永光明医疗仪器有限公司BP211D分析天平德国sartorius公司Mili-Q超纯水制备器法国Milipore公司36-100L高压蒸汽灭菌锅致微仪器有限公司pH计奥豪斯仪器有限公司倒置显微镜上海光学仪器五厂微量可调移液枪德国eppendorfCO2培养箱ThermoFisherH1650-W离心机长沙湘仪仪器有限公司酶标仪BioTek液氮生物容器新乡市新亚有限公司冰箱Ronshen96孔板NestBiotechnology14 225cm细胞培养瓶Corning冻存管Corning细胞计数板QIUJING1.2试剂与药品CBC本实验室自行制备拉米夫定片GSK有限公司RPMI1640培养基HyClone公司胎牛血清（FBS）HyClone公司G418InvitrogenDMSO北京索莱宝生物科技有限公司0.25%胰蛋白酶碧云天生物技术研究所乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒上海科华生物有限公司乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒上海科华生物有限公司CCK-8试剂盒郑州德雅有限公司1.3实验细胞HepG2.2.15细胞，由郑州大学药学院王亚峰老师惠赠，实验室用G418严格定期筛选并传代培养。1.4药品及试剂配制1.4.1药品溶液的配制拉米夫定母液的配制：取1片（0.1g）3TC片剂，研磨成粉末，溶于1mlDMSO中，配成100mg/ml的3TC母液，并在超净台中用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。实验时用培养基稀释成100μg/ml的溶液。CBC母液的配制：用分析天平精确称取适量CBC囊材（1g含FCI-B75mg），溶于一定量的DMSO中，配成1mg/ml的CBC母液，并在超净台中用0.22μm微孔滤膜过滤。再用培养基稀释成所需浓度。15 1.4.2PBS（0.0lmol/L，pH7.4）的配制称取NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.56g，KH2PO40.2g，溶于0.9L超纯水中，用稀HCl调节pH至7.4，再用超纯水定容至1L，高压蒸汽灭菌（121℃条件下，30min）。在超净工作台内分装于已消毒的250ml玻璃瓶中，用封口膜封口，置4℃冰箱中保存备用。1.4.3细胞冻存液的配制细胞悬液：胎牛血清：DMSO=5:4:11.4.4含G418培养基的配制称取20mg的G418粉末，溶于200μlPBS中，配成浓度为100mg/ml的母液，实验时每100ml培养基（含10%FBS）中混入200μlG418母液。2实验方法2.1HepG2.2.15细胞的培养、传代和冻存从液氮生物容器中取出冻存的HepG2.2.15细胞，立刻置于37℃恒温水浴锅中，待细胞完全解冻后立即转移到5ml的离心管中，再加入1ml培养基，以1000r/min离心5min。倒掉上清液，加入2ml含有10%FBS的RPMI1640完2全培养基，吹打使其混合均匀后，将其吸入25cm细胞瓶中，再加入2ml培养基和400μl胎牛血清（为使其更容易复苏，所以最好第一次使用约含有18%FBS的培养基）混匀。在37℃，5%CO2培养箱中，饱和湿度条件下，约每3天换一次培养基（在超净台中倒掉3/4的上清液，剩余1/4旧的培养基中再加入3ml含10%FBS的新鲜培养基。因为旧的上清液中含有的某些细胞因子可以刺激细[58]胞的生长）。等到细胞生长到近融合状态，弃去上清液，吸取3ml无菌PBS洗三遍，清除掉部分死细胞和细胞碎片。再加入1ml0.25%的胰蛋白酶于37℃消化细胞约3min，可在显微镜下密切留意其形态变化。待其收缩变圆时，迅速加入2ml培养基终止胰酶作用，并吹打成单细胞悬液。（由于HepG2.2.15细胞极易抱团16 生长，根据经验需吹打60下左右才无大的细胞团块），收集悬液至5ml离心管中，1000r/min离心5min。弃去上清液，用2ml培养基混匀后留取约1/4的量即可，继续培养3~4天后传代备用。如果需要冻存，选取对数生长期的HepG2.2.15细胞弃去旧的上清培养基，用3ml无菌PBS洗3遍，加入1ml0.25%胰蛋白酶于37℃消化细胞约3min，可在显微镜下密切留意其形态变化。待其收缩变圆时，迅速加入2ml培养基终止胰酶作用，并吹打成单细胞悬液。收集悬液至5ml离心管中，以1000r/min离心5分钟。弃上清后加入1ml培养基混匀，吸取750μl悬液加入2ml的冻存管中，补加600ul胎牛血清和150μl的DMSO轻轻吹打混匀，拧紧管盖。切记在冻存管上标记细胞的名称、实验时间及实验人员。梯度降温4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，于次日投于液氮容器中保存。2.2CCK-8法检测CBC对HepG2.2.15细胞的毒性作用当细胞生长至近融合状态时，用0.25％胰酶消化制成单细胞悬液，计数并43调节其浓度为6×10个/ml，接种到96孔细胞培养板中，每孔100µl，即6×10个/孔，将其置于37℃，5%CO2培养箱中生长24h。待细胞贴壁后，甩出上清液，换成不同浓度的含药培养基（浓度分别为：80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/ml），共8个梯度，每孔100ul，同时设空白对照组，每个浓度设5个复孔。继续生长72h，于实验结束前4h，每孔避光加入5μlCCK-8试剂，再放入37℃培养箱中，继续生长4h，立即使用全波长酶标仪在450nm处测定其吸光度，取平均值为其活力OD值，并计算细胞增殖抑制率和半数毒性浓度(TC50)。细胞增殖抑制率公式：细胞增殖抑制率（%）=（1-给药组OD值/空白对照组OD值）×100%2.3ELISA法检测CBC对HepG2.2.15细胞上清液分泌HBsAg和HBeAg的影响将对数期的HepG2.2.15细胞用0.25％胰酶消化后制成混悬液，计数并调43节其浓度为6×10个/ml，接种到96孔培养板中，每孔100µl，即6×10个/17 孔。将其置于培养箱中24h。待细胞贴壁后，甩出上清液，换成不同浓度的含药培养基（1、0.5、0.25、0.125μg/ml），每孔100μl。同时设拉米夫定阳性对照组（3TC，100μg/ml）和空白对照组，每个浓度设5个复孔。于加药后的第3d换液，甩出旧的上清液，换成重新配置的新鲜含药培养基，继续培养至加药后的第6d，每孔吸取50µl旧培养基于0.5mlEP管中，同时用无菌PBS做5倍稀释（即补加200µlPBS)，96孔板中剩余培养基弃除干净，加入重新配置的含药培养基，继续生长到加药后的第9d，每孔吸取50µl旧上清液于0.5mlEP管中，同时用无菌PBS做5倍稀释（即补加200µlPBS)，各样品标记清楚，于4℃冰箱保存待检（7天内检测完）。依照ELISA分析方法，采用HBsAg和HBeAg诊断试剂盒，测定HepG2.2.15细胞第6d和第9d上清液中HBsAg和HBeAg的含量变化。计算CBC的抗原抑制率及半数抑制浓度（IC50），方法如下：（1）预先从4℃冰箱里取出HBsAg诊断试剂盒、HBeAg诊断试剂盒，及待测样品放在室温平衡30min。（2）根据实验设计，选择一定量的反应板条。（3）每孔加入50µl待检样本、阳标、阴标，其中阳标和阴标各设2孔，并预留空白孔1孔。（4）封板后37℃避光孵育60min。（5）各孔加入50µl酶结合物。（6）手动悬空轻轻震荡10s。（7）封板后37℃避光孵育30min。（8）配制工作浓度的洗涤液（取48ml纯化水，加入2ml洗涤液，充分混匀后，配成50ml工作浓度的洗涤液，现配现用）。（9）甩出各孔红色液体，将上述配置好的工作浓度洗涤液加满各孔，放置30-60s，甩干，重复5次后，在干净的吸水纸上拍干。拍板的过程可用封板膜的光面一侧垫在板底上，以减少对96孔板底的摩擦影响吸光度。（10）立即加显色剂A+B各50µl混匀。（11）手动悬空轻轻震荡10s。（12）封板后37℃避光孵育30min。（13）在各孔内加入50µl终止液。（14）手动悬空轻轻震荡5s混匀。18 （15）10min内450nm处读取各孔OD值。（16）计算抗原抑制率公式：抗原抑制率（%）=(1-药物组OD值/阴性对照组OD值)×100%[59]结果有效性：参考值=阴性标准品平均OD值×2.1阴性标准品OD值<0.05按0.05算。当阴性标准品OD值<0.1时，结果有[60]效；反之无效。2.4药效评价结合细胞毒性实验和抗原抑制实验分别得出TC50和IC50后，得出治疗指数（TI），TI=TC50÷IC50当TI≥3时，表明受试物高效低毒；当13，CBC属于高效低毒，有进一步开发的意义。5讨论乙肝是由于感染乙型肝炎病毒而导致的传染性疾病，具有传染性强、难康[62]复、易恶变等特性。我国是感染乙肝病毒人数最多的国家，而目前并没有特效疗法，这也使其成为一项研究热点。人们一直不懈努力的寻找治疗乙肝的新方法，新靶点。而我国传统中草药以其多靶点、价格便宜、不良反应少的特点[63]，逐渐成为抗乙肝病毒的研究热点。野菊花具有抗感染、抗病毒等功效，本章就以此为切入点研究CBC的体外抗乙肝病毒作用。本章选用目前体外筛选抗HBV药物常用的细胞模型——HepG2.2.15细胞，该模型是带有HBV-DNA全套基因的重组质粒，转染入人肝癌细胞株HepG2[64]所获得，能够稳定的合成并释放抗原以及完整的丹氏颗粒，并向培养基中释放病毒复制中间体——HBsAg和HBeAg，此特性可间接反映乙肝病毒的复制情[65]况。为了防止有部分HepG2细胞未能成功的转染入HBV-DNA全基因而影响最终的实验结果，我们在HepG2.2.15细胞的传代、培养、冻存时所使用的RPMI1640培养基中加入了浓度为200μg/ml的遗传霉素(G418)，该物质为一种[66]氨基糖苷类抗生素，是最常用的确保稳定转染的筛选试剂。该试剂能够特异21 性的抑制HepG2细胞的生长，而对HepG2.2.15细胞的生长无影响，推测其原因可能是，通过抑制某些基因的表达进而阻断某种蛋白质的合成，或者能够刺激细胞产生某些毒素，当细胞转染某种基因后，刺激转录和翻译，从而使抗性[67]产物得以高效表达。本章首先利用CCK-8比色法对CBC进行细胞增殖抑制实验，找出TC50以及TC0，为后续的抗乙肝病毒实验的剂量设计提供参考依据。这也是各种新药筛选的第一步。目前检测细胞毒性的方法主要有CCK-8法、MTT法、SRB法[68][69]等，本文采用CCK-8法，其作用原理是：CCK-8试剂能够将活细胞线粒体中的脱氢酶还原成具有高度水溶性的黄色甲瓒物，该有色物质的多少与活细胞的量成正比，通过酶标仪在450nm波长处测定其OD值，便可检测细胞的活性。CCK-8法与另外两种方法相比大同小异，但优点是其准确度和重现性大大提升、操作简便，缺点是价格较另外两种方法昂贵，这也是限制其大规模应用的一个重要因素。本章选用ELISA法测定细胞培养基中HBsAg和HBeAg的含量。ELISA法[70]检测的基础是：以HBsAg为例，采用抗-HBs包被反应板，加入待测样品，经避光孵育后，加入抗-HBs-HRP，当样本中存在HBsAg时，该HBsAg与包被抗-HBs结合并与抗-HBs-HRP结合形成抗-HBs-HBsAg-抗-HBs-HRP三联复合物，加入TMB底物发生显色反应，反之则无显色反应。该法能够进行定性或定量分析且灵敏度很高。在细胞毒性实验中，我们得出CBC对HepG2.2.15细胞的TC50为5.014μg/ml，抗原抑制实验中得出CBC对HBeAg第6d和第9d的IC50分别为：0.66μg/ml和0.35μg/ml，其对应的TI值分别为7.60和14.32两者均大于3，表明CBC属于高效低毒药物，而CBC对第6d和第9dHBsAg的抑制率均不足50%，因此无法求出对应的IC50和TI。CBC对HBsAg和HBeAg抑制作用大小不同，考虑其可能的原因是：HBsAg是HBV转录合成外膜蛋白上的S基因编码的主蛋白，属于一种结构蛋白，可以刺激机体产生保护性的免疫应答反应。而HBeAg是C基因编码的核蛋白，属于一种功能蛋白。目前HBeAg在HBV感染中的明[71]确功能尚不清楚，推测可能与调节免疫反应有关。在作用时间强度方面，第6d的抗原抑制作用要稍强于第9d的抗原抑制作用，推测其可能的因素是：HepG2.2.15细胞在第6d处于对数生长期，其细胞活力要稍强于第9d，倒置显微镜3下观察，当使用96孔板铺细胞时，细胞浓度选择6×10个/孔，细胞连续生长至22 第9d时，细胞融合度几乎达到100%，所以本实验也为抗乙肝病毒实验的铺板浓度提供了一定的参考价值。在使用HBsAg和HBeAg诊断试剂盒检测抗原时，多种因素可影响结果的准确性，根据本实验多次重复的结果，现归纳如下，正式实验开始前，均需做本次实验样品稀释倍数预实验，因为样本中HBsAg和HBeAg的含量通常较高，若直接用所收集细胞上清液进行检测，很有可能会导致反应终止时颜色过深，OD值过大超出酶标仪检测上限，所以每批样本均需提前测定样本合适的稀释倍数，本实验待检抗原以稀释5倍效果最佳；试剂盒和待测样本需从冷藏环境中取出，放至室温后才能使用，余者按照保存方法及时保存；从冷藏环境中取出的洗涤液会有部分呈现固态，需要适当加热使其完全融化后使用，洗涤液应用超纯水做1：24倍稀释后现配现用；除设置样品孔外，另需设置阳性对照、阴性对照，和空白对照孔，一方面是计算结果所需，另一方面是判断检测结果的有效性；所有试剂在使用前均需摇匀，用微量移液枪准确量取，避免使用试剂瓶直接滴加，这样会造成较大误差；实验过程中所用的封板膜不可重复利用，避免发生交叉反应的现象；若选择手动洗板，应将洗涤液加满各孔，拍板时将孔内液体全部拍干，并且在96孔板底可垫上光滑的封板膜，这样可大大减小对板底的摩擦，缩小误差；结果的判断必须在反应终止10min内读数完成。本章完成了HepG2.2.15细胞增殖抑制实验和抗原抑制实验，结果表明在无毒浓度下CBC具有抗乙肝病毒的作用，为CBC作为保健药品的进一步开发和利用提供了科学依据，也为中药在抗乙肝病毒方面的研究提供了一定的参考价值，但是本论文未对HepG2.2.15细胞中HBV-DNA的含量进行测定，不能确定其是否发生变化，所以不能肯定CBC是否影响了DNA的复制，因此，CBC抗乙肝病毒确切的作用机制有待后续研究。23 第三章CBC对小鼠的急性毒性研究急性毒性(acutetoxicity)是指人或动物24h内单次或多次大剂量接触某种药物所出现的有害反应，也指人或动物一次性大剂量接受某种药物后产生的快速[72]且剧烈的中毒反应，甚至死亡反应。其目的是初步阐明药物的毒性作用并为重复给药的剂量设计和临床起始剂量的选择提供参考价值，为新药的研发提供[73]参考信息。多数中药和天然药物的作用相对较温和，中药复方制剂通过合理的配伍使[74]用，也能够减轻毒性作用。多数中药和天然药物新药已有一定的临床应用基础，但是与传统中药相比，现代中药和天然药物不断的应用大量新技术，使其[75]物质基础和给药方式等可能已发生很大变化，甚至有发生毒性反应的危险。所以，对中药和天然药物进行急性毒性实验研究是十分必要的。在第二章中，我们通过细胞毒性和抗HBV研究表明了CBC具有体外抗HBV作用。在本章中我们需要对CBC的急性毒性做进一步的研究，以充分了解CBC的毒性作用和毒性靶器官等相关毒性信息，来综合评判药物的安全性，并为后续的预防性肝保护实验的剂量设计提供一定的参考价值。1实验材料1.1主要仪器DZKW-D-1型电热恒温水浴锅北京永光明医疗仪器有限公司BP211D分析天平德国sartorius公司Mili-Q超纯水制备器法国Milipore公司微量可调移液枪德国eppendorf冰箱Ronshen注射器河南科虹有限公司KQ5200E超声波清洗机昆山市超声仪器有限公司MS200磁力搅拌器济南光耀医疗设备有限公司24 1.2试剂与药品CBC本实验室自行制备0.5%CMC-Na安徽山河股份有限公司1.3实验动物SPF级KM小鼠50只，雌雄各半，体重(20±2)g，年龄约4-6周龄，由河南省实验动物中心提供。实验单位使用许可证编号：SYXK(豫)2012-0006；实验动物使用许可证号：SCXK(豫)2015-0004。1.4药品及试剂配制1.4.1CBC灌胃供试液的配制称取6.089gCBC粉末，溶于10ml0.5%CMC-Na溶液中，充分摇匀，配成终浓度为0.6089g/ml（该剂量是药物所能灌胃的最大浓度）的CBC灌胃供试液，4℃避光密封限7天内使用。1.4.20.5%CMC-Na溶液的配制称量2gCMC-Na粉末溶到400ml纯化水中，放在磁力搅拌器上连续搅拌4h，配成质量分数为0.5%CMC-Na溶液，4℃冰箱内存放，限7天内使用。2实验方法2.1CBC对小鼠急性毒性预实验取SPF级KM小鼠10只，雌雄各半，随机分为两组，即CBC给药组和0.5%CMC-Na溶媒对照组。实验前禁食不禁水16h，于第二天上午按照最大浓度0.6089g/ml，最大体积40ml/kg灌胃给药，0.5%CMC-Na溶媒对照组灌胃等体积的0.5%CMC-Na溶液。一次性给药后，连续观察14d。因预实验给予0.6089g/mlCBC无法测出小鼠最大耐受量及半数致死量（LD50），故正式实验扩大样本容量，仍先采用该方法进行实验以进一步考察CBC的安全性信息。25 2.2CBC对小鼠急性毒性正式实验取SPF级KM小鼠40只，雌雄各半，随机分为两组，即CBC给药组和0.5%CMC-Na溶媒对照组。实验前禁食不禁水16h，于第二天上午按照最大浓度0.6089g/ml，最大体积40ml/kg灌胃给药，0.5%CMC-Na溶媒对照组灌胃等体积的0.5%CMC-Na溶液，一次性给药后，连续观察14d。2.3急性毒性实验观察指标2.3.1一般观察指标各组小鼠灌胃给药后，恢复饮食饮水，给药后2h内，每15min观察1次；给药后2～4h内，每30min观察1次；给药后4～8h内，每1h观察1次；给药后8～24h内，每4h观察1次；第2d起，每天观察3次。连续14d，密切观察并详细记录各小鼠的进食情况、饮水情况及其他可能出现的非正常现象如：皮肤红肿、多尿、呕吐、排便异常、痛觉丧失、竖毛、心律异常、眼球突出、反射消失、惊厥、呼吸异常、运动失调等中毒反应及死亡情况，包括中毒反应[76]的症状、发生率、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆等。2.3.2体重变化实验期间应详细记录第1d、第7d、第14d及动物死亡或濒死时各小鼠的体重变化。2.3.3尸体解剖在实验过程中，对于濒死及死亡动物应立即进行解剖，用肉眼仔细观察各个器官，尤其是心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠等主要脏器有无异常及有何异常，同时与溶媒对照组进行比较，并做详细记录。剩余动物在实验结束后进行大概解剖，观察并记录上述指证。2.4数据处理所有数据均采用统计软件SPSS20.0进行分析处理。计量资料均采用⎯x±s表示，多组均数比较采用单因素方差分析（One-WayANVOA）；两两比较采用LSD-t检验；以P<0.05表示结果具有显著性差异。26 3实验结果3.1CBC对小鼠急性毒性预实验结果各组小鼠给药15min后出现怠动，安静，活动量减少，摄食饮水减少，对外界异常声响反应不敏感，2h后逐渐消失，恢复正常。给药期间各组小鼠小便均正常，大便颜色略带有绿色，以高剂量组最为明显，24h后逐渐趋于正常。截至第14天各组实验小鼠毛发浓密洁白，有光泽，且无死亡情况。实验结束后及时解剖，经肉眼仔细观察小鼠心、肝、脑、肺、肾等主要脏器，并没有明显异常。给药组小鼠与溶媒对照组相比，给药期间体重变化无显著性差异（P>0.05），初步认定CBC不会影响机体的正常代谢。结果如表3.1所示。表3.1CBC对小鼠急性毒性预实验体重变化的影响（⎯x±s，n=5）组别剂量(mg/ml)第1天（g）第7天（g）第14天（g）CBC0.60919.27±0.9527.20±1.2533.83±1.05溶剂对照组-19.30±1.3226.87±0.8032.00±1.483.2CBC对小鼠急性毒性正式实验结果CBC组小鼠从给药10min后开始，活动减少或静卧不动，进食饮水减少，对外界异常声响反应不敏感，约2h后逐渐趋于正常。给药后约4h小鼠排便呈药样，即颜色加深略带有CBC的颜色（绿色），自第2d小鼠排便渐趋恢复，截至第14天各组实验小鼠毛发洁白，有光泽，且无死亡情况。实验结束后及时解剖，肉眼仔细观察小鼠心、肝、肺、肾、脑、胃、胸腺等主要脏器，并没有明显异常。给药组小鼠与溶媒对照组相比，给药期间体重变化无显著性差异（P>0.05），表明CBC不会影响机体的正常代谢。结果如表3.2所示。表3.2CBC对小鼠急性毒性正式实验体重变化的影响（⎯x±s，n=20）组别剂量(mg/ml)第1天（g）第7天（g）第14天（g）CBC0.60920.14±1.3227.35±1.5732.31±2.29溶剂对照组-20.54±1.4727.73±1.3131.89±2.6827 4小结（1）本章研究CBC急性毒性作用：采用最大给药量法灌胃给药，最大浓度0.609mg/ml，最大体积40ml/kg，一次性给药后，连续观察14d，各组小鼠均无死亡及中毒反应。（2）急性毒性所用药物剂量相当于成人临床拟用剂量的243倍（大于100倍），可判定CBC具有良好的安全性。5讨论药品是用于预防、治疗和诊断人的疾病，有目的地调节人的生理机能并规[77]定有适应症、功能主治、用法用量的物质。药品是一种特殊商品，在上市前必须经过严格的实验设计，并与已上市的有效药物作比较，客观评价其优劣，从而决定取舍。所以，临床前的药理研究必须秉承安全、有效、质量可控的基[78][79]本原则，其中，安全性排在药品研究的第一位。药品安全性评价目的在于：确定药物的最大耐受量和药物作用的安全范围；努力去发现药物的毒性反应及[80]毒性靶器官；判断毒性反应的可恢复性；寻找毒性反应的防治措施。毒性反应（toxicreaction）是指：在用药剂量较大或用药时间过长以及机体对药物敏感性升高等情况下，引起机体组织、器官以器质性损伤为主的严重不[81]良反应。少数情况下，因个体的遗传缺陷、病理状态或合用其他药物等因素，在治疗量时也会出现毒性反应。与一般的毒性反应相比，药理学中的毒性反应着重强调多种原因引起的药[82]物蓄积所造成的不良反应。通常这种反应较为严重，但是能够预知，并且可[83]以避免。根据毒性反应出现的时间，我们可简单的将其分为两类：急性毒性和慢性毒性。由于目前还没有CBC的相关药理资料，我们无法得知其毒性大小，本文就对CBC进行了前述的HepG2.2.15细胞毒性实验，以及本章所进行的小鼠急性毒性实验。急性毒性实验也被称为单次给药毒性实验，是为了观察有害作用的发生与否，可以提供药物毒性效应的初步资料，阐明受试药物剂量、毒性、时间三者之间的关系。结合半数有效量(ED50)，评价受试药物的安全系数，为新[84]药的研发以及临床间，安全用药提供参考信息。28 [85]急性毒性实验可测定的几个反应剂量：最大给药量、最大耐受量、最大无毒剂量、致死量等。如只能测出最大给药量，可不用继续测定其他剂量。由于大多数中药、天然药物的急性毒性可能相对较低，所以中药、天然药[86]物常首先采用最大给药量（或最大耐受量法）进行急性毒性研究。本文中CBC对小鼠急性毒性预实验和正式实验均采用最大给药量法进行，一次性给药后，连续观察14d，各组小鼠均无死亡及中毒反应。根据下式求出[87]该剂量相当于临床拟用药量的倍数。以耐受人用量口服100倍以上为安全。计算公式如下：小鼠的最大耐受量倍数=每只小鼠的耐受药量/小鼠平均体重（20g）×成人平均体重（60000g）/成人每日用量（倍）实验结果表明，选用最大给药量法进行CBC急性毒性试验，小鼠各项指标均正常，且无死亡现象，CBC的最大给药量相当于成人（60kg）临床拟用剂量（规格：0.5g，一次2g，3次/天）的243倍（大于100倍）。实验观察期内未见明显异常，可判定CBC具有良好的安全性，为后续药效学实验提供了科学依据。29 第四章CBC肝保护作用研究肝损伤主要是由脂质过氧化反应引起的细胞破坏，这种损伤严重的可以发[88]展为肝炎、肝硬化甚至导致肝癌。目前对于肝损伤的防治是一个全球性的严峻课题，有很多原因都会引起肝损伤，例如药物性肝炎、病毒性肝炎和酒精性[89][90]肝炎等。临床用于治疗肝损伤的药物已有很多如：思美泰、易善复等，但是很多都具有潜在的副作用，尤其是长期服药更为明显。中草药不良反应小，并且价格低廉，现在已成为保肝新药的研究热点。新药的研究离不开合适的药理模型，本文采用酒精性肝损伤模型和Con-A肝损伤模型，研究CBC的保肝作用。酒精肝损伤可致肝纤维化，因此对它的发病机制及其防治研究迫在眉睫。酒精性肝损伤模型与人类肝损伤具有相似性，[91]使其成为筛选防治该类疾病药物的理想模型；Con-A肝损伤模型最大特点是[92]发病速度快，肝损伤显著，其发病过程与人类慢性乙肝中T细胞介导的肝细胞损伤非常类似，具有肝脏依赖性、剂量依赖性等特点，是筛选急性肝损伤和[93]肝衰竭防治药物理想的动物模型。本研究预先给予CBC药物干预，应用两种肝损伤模型以综合评判药物的预防性肝保护作用。1实验材料1.1主要仪器DZKW-D-1型电热恒温水浴锅北京永光明医疗仪器有限公司电子分析天平上海OhausMili-Q超纯水制备器法国Milipore公司pH计上海Ohaus微量可调移液枪德国eppendorf离心机上海安亭仪器厂酶标仪BioTek冰箱Ronshen96孔板NestBiotechnology液氮生物容器新乡市新亚低温容器有限公司恒温磁力搅拌器致微仪器有限公司30 KQ5200E超声波清洗机昆山市超声仪器有限公司36-100L高压蒸汽灭菌锅致微仪器有限公司SW-CJ-2D型超净台苏州名牌之星有限公司高速大容量冷冻离心机Cence内切式组织匀浆机SCIENTZ全自动生化分析仪BECKMANLeicaRM2135石蜡切片机德国Leica公司OlympusBH-2型显微镜日本Olympus公司PM-20型显微摄像系统日本Olympus公司1.2药品CBC高剂量280mg/kg，CBC中剂量140mg/kg，CBC低剂量70mg/kg，均由本实验室自行制备，批号：20160701。阳性对照药联苯双酯滴丸（BP，150mg/kg）购于万邦德制药集团有限公司，批号：A02141206。1.3主要试剂Con-ASigma进口分装ALT检测试剂盒NanJingJianChengAST检测试剂盒NanJingJianChengMDA检测试剂盒NanJingJianChengSOD检测试剂盒NanJingJianChengTNF-α检测试剂盒NanJingJianCheng95%乙醇天津市风船化学试剂有限公司CMC-Na天津市北辰方正试剂厂甲醛溶液烟台市双双化工有限公司乙酸天津光复科技有限公司NS河南科伦药业有限公司二甲苯济宁恒泰化工有限公司苏木素上海Bogoo伊红上海Bogoo31 中性树胶上海MACKLIN1.4实验动物SPF级KM小鼠120只，体重（20±2）g，雌雄各半，由河南省实验动物中心提供。实验单位使用许可证编号：SYXK(豫)2012-0006；实验动物使用许可证号：SCXK(豫)2015-0004。1.5药品及试剂配制1.5.1药品溶液的配制CBC高剂量(280mg/kg)：560mg保肝胶囊固体粉末+一定量0.5%CMC-Na，配制成40ml终浓度为280mg/kg的灌胃液。CBC中剂量(140mg/kg)：280mg保肝胶囊固体粉末+一定量0.5%CMC-Na，配制成40ml终浓度为140mg/kg的灌胃液。CBC低剂量(70mg/kg)：140mg保肝胶囊固体粉末+一定量0.5%CMC-Na，配制成40ml终浓度为70mg/kg的灌胃液。阳性对照药联苯双脂滴丸（BP，150mg/kg）：取200粒联苯双酯滴丸（BP），在研钵中充分研磨，用0.5%CMC-Na配制成体积为40ml，浓度为150mg/kg的混悬液。以上灌胃液配好后4℃保存，限7d内使用，用时37℃预热并充分摇匀。1.5.20.5%CMC-Na的配制称取2gCMC-Na，溶解到400ml超纯水中，放在恒温磁力搅拌器上连续搅拌6h即可，4℃密封保存备用。1.5.3灌胃酒精的配制取国产分析纯95%乙醇22.4ml，加入17.6ml超纯水，混匀，配制成53°灌胃酒精，室温密封保存。1.5.4Con-A注射液的配制称取30mgCon-A，于超净工作台中溶于15ml无菌PBS中，配制成20mg/kg的Con-A注射液，现配现用。32 1.5.510%福尔马林的配制量取37%~40%甲醛溶液50ml，加入450ml超纯水，室温密封保存。2实验方法2.1动物分组与造模2.1.1CBC抗酒精性肝损伤动物分组、给药与处理取4~5周龄，健康合格的SPF级KM小鼠60只，在饲养环境温度：23±2℃，相对湿度：（50±5）%，适应性饲养7d。选取体重为（20±2）g的小鼠，随机分成6组，每组10只，雌雄各半。即：正常对照组、酒精模型组、阳性对照联苯双脂滴丸组（BP，150mg/kg）、CBC高剂量组（280mg/kg）、CBC中剂量组（140mg/kg）、CBC低剂量组（70mg/kg）。各组小鼠给药前称重并记录。按照0.2ml/10g的体积，给药组灌胃给予相应的受试药物，正常对照组和酒精模型组灌胃给予等体积的生理盐水。实验时间统一选为每天上午9：00，并于给药3h后，酒精模型组、BP组和给药组灌胃给予53°酒精（12ml/kg），正常对照组灌胃等体积的生理盐水，每天1次，共10d。所有小鼠均饲喂普通饲料，并且提供新鲜的日常用水以供小鼠自由饮用。末次给酒后禁食不禁水。12h后所有小鼠称重并记录，依次摘眼球取血以测定血清相关指标，并取肝脏和脾脏测定相应指标，同时观察肝组织的病理学变化。2.1.2CBC抗Con-A肝损伤动物分组、给药与处理取4~5周龄，健康合格的SPF级KM小鼠60只，在动物饲养温度：（23±2）℃，相对湿度：（50±5）%，适应性饲养7d。选取体重为（20±2）g的小鼠，随机分成6组，每组10只，雌雄各半。即：正常对照组、Con-A模型组、阳性对照联苯双脂滴丸组（BP，150mg/kg）、CBC高剂量组（280mg/kg）、CBC中剂量组（140mg/kg）、CBC低剂量组（70mg/kg）。各组小鼠给药前称重并记录。按照0.2ml/10g的体积，给药组灌胃给予相应的受试药物，正常对照组和Con-A模型组灌胃给予等体积的生理盐水。实验时间统一定为上午9:00，每天1次，共7d。所有小鼠均饲喂普通饲料，并且提供新鲜的日常用水以供小鼠自由饮用。末次给药后，禁食不禁水4h，Con-A模型组、BP组和各给药组均按33 照20mg/kg的剂量尾静脉注射Con-A（0.1ml/10g）溶液，正常对照组尾静脉注射等体积的无菌PBS。禁食不禁水12h所有小鼠称重并记录，依次摘眼球取血以测定血清相关指标，并取肝脏和脾脏测定相应指标，同时观察肝组织的病理学变化。2.2检测指标2.2.1体重及脏器指数在给药前及解剖前均详细记录各组小鼠体重变化。摘除眼球取血后立即脱颈椎处死小鼠，在4℃生理盐水水浴的环境中，迅速解剖取出肝脏和脾脏，用4℃生理盐水冲洗3遍去除表面血渍，再用滤纸拭净盐水后称重并记录。脏器指数[94]计算公式如下：肝脏指数（%）=[肝脏重量（g）/体重（g）]×100％脾脏指数=脾脏重量（mg）/体重（g）2.2.2血清生化指标的测定灌胃53°酒精或尾静脉注射Con-A禁食不禁水12h后摘眼球取血。抓取小鼠固定头部，用手术剪剪去小鼠右侧胡须，以免取血时血从胡须处流下发生溶血。轻轻按压小鼠右侧眼部皮肤，使眼球充血突出，用干净的弯头镊子按压其右眼眼睑，夹住眼球根部迅速摘除。将小鼠头部朝下，眼眶对准1.5mlEp管，收集血液，切勿将小鼠眼眶在Ep管口剐蹭。血液在4℃静置2h后，将凝固的血液在3500rpm，4℃离心10min分离取出血清，-80℃超低温冰箱保存。按各试剂盒说明书的要求测定血清中的ALT（赖氏法）、AST（赖氏法）、TNF-α（ELISA[95]法）水平。2.2.3肝组织生化指标的测定从液氮生物容器中取出保存的肝脏，在冷冻的状态下迅速切取肝右叶同一部位约200mg，剪碎，按照肝重（g）：4℃生理盐水（ml）=1:9的比例，加入适量4℃生理盐水，在冰水浴的环境中，用内切式组织匀浆机按照：转速10000[96]rpm/min，匀浆时间12s/次，间隙30s，反复4次，制备10%的肝组织匀浆（在制备不同组织匀浆时要用纯化水清洗匀浆机：转速10000rpm/min，匀浆时34 间6s/次，间隙10s，反复4次）。用台式高速大容量冷冻离心机：4000rpm，4℃离心10min，取上清，于-80℃冰箱中保存。严格按照说明书检测10%肝组织匀浆中SOD（黄嘌呤氧化酶法）、MDA（硫代巴比妥酸比色法）的含量，单位分[97]别用U/mg和nmol/mg表示。2.2.4肝组织病理学检查剪取肝左叶，用4℃生理盐水反复冲洗肝脏表面去除积血，滤纸拭净，剪取肝脏左叶相同部分约0.5g用于制备病理切片。首先置于现配的10%福尔马林溶液中浸泡至少24h，石蜡包埋，再用苏木素-伊红进行H&E染色，最后用光[98]学显微镜观察其形态学改变。[99-100]肝组织损伤病理分级标准：0级（-）：肝细胞、肝窦均正常，未发现肝细胞空泡（或水肿）、炎细胞浸润、坏死等异常改变；I级（+）：在一个肝小叶中，有30%以内肝细胞水肿，中央静脉周围的肝细胞核被染成黑色固缩，散在分布；II级（++）：在一个肝小叶中，有30%~50%以内的肝细胞水肿，明显疏松化，汇管区有少量炎性细胞浸润，中央静脉周围出现点状坏死；Ⅲ级（+++）：在一个肝小叶中，有50%以上的肝细胞水肿，甚至气球样变性，汇管区出现大量炎性细胞浸润，有明显点状坏死灶。2.3数据处理所有数据均应用统计软件SPSS20.0进行分析处理。计量资料均采用⎯x±s表示，多组均数比较采用单因素方差分析（One-WayANVOA）；两两比较采用LSD-t检验；以P<0.05表示结果具有显著性差异。3实验结果3.1CBC抗酒精性肝损伤实验结果灌胃给药后，各组小鼠活动均正常，给予53°酒精后，约20min小鼠出现不同程度的醉酒反应：小鼠运动不协调，但无痉挛，部分小鼠俯卧，不移动，腹部贴地，极个别小鼠尾部呈现紫绀；呼吸快而浅，吸气时伴有略尖锐的吸气声；上睑下垂；肌张力普遍降低；惊跳反应不明显。给予53°酒精2h后，各组小鼠上述情况基本恢复正常。35 3.1.1CBC对酒精性肝损伤小鼠体重及脏器指数的影响实验结果表明，给药前各组小鼠体重在20g~21g左右，连续给药10天后，体重达到26g~27g左右，各组小鼠之间体重无显著性差异（P>0.05），提示CBC不影响机体正常代谢。但给予53°酒精后，正常组与模型组相比：肝脏指数和脾脏指数分别由4.41±0.24%、3.82±0.50mg/g升高至5.50±0.21%、4.71±0.95mg/g，差异具有统计学意义（P<0.05）。CBC各给药组可不同程度的降低肝脏指数，且呈现良好的剂量关系；但CBC各给药组对肝损伤小鼠的脾脏指数影响不大，差异无统计学意义（P>0.05）。结果如表4.1所示。表4.1CBC对酒精性肝损伤小鼠体重及脏器指数的影响（⎯x±s，n=10）分组剂量第1天体重第11天体重肝脏指数脾脏指数（mg/kg)（g)（g)（%）（mg/g)正常组-20.03±1.7627.06±2.804.41±0.243.82±0.50####模型组-20.57±1.1726.52±3.005.50±0.214.71±0.95***阳性对照组15020.54±0.8926.44±2.234.81±0.284.21±0.69***CBC高剂量组28021.10±1.2026.81±5.084.87±0.274.19±0.63**CBC中剂量组14020.42±0.7627.23±2.884.91±0.244.34±0.79CBC低剂量组7020.84±1.0626.83±3.655.30±0.214.66±0.41######******注：与正常组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.001；与模型组组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.0013.1.2CBC对酒精性肝损伤小鼠血清ALT及AST的影响实验结果表明，给予53°酒精后，模型组小鼠血清ALT活力和AST活力由正常组小鼠的9.84±2.38U/L、17.45±2.83U/L升高至18.36±0.59U/L、30.93±8.61U/L，差异具有统计学意义（P<0.05）。CBC各剂量组与模型组相比，可不同程度的降低ALT活力和AST活力，并呈现良好的剂量关系，提示CBC对酒精性肝损伤小鼠有预防性的肝保护作用。可能是与稳定生物膜有关。结果如表4.2所示。36 表4.2CBC对酒精性肝损伤小鼠血清ALT及AST的影响（⎯x±s，n=10）分组剂量（mg/kg)ALT活力(U/L)AST活力(U/L)正常组-9.84±2.3817.45±2.83######模型组-18.36±0.6030.93±8.61******阳性对照组1509.31±2.2319.03±4.54******CBC高剂量组28010.57±2.0420.78±4.34******CBC中剂量组14013.06±0.9921.29±3.65****CBC低剂量组7015.57±2.7823.96±6.03######******注：与正常组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.001；与模型组组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.0013.1.3CBC对酒精性肝损伤小鼠肝匀浆MDA及SOD的影响实验结果表明，给予53°酒精后，模型组小鼠肝组织匀浆中MDA含量由正常组的2.26±0.74nmol/mgprot升高至3.74±0.62nmol/mgprot；模型组小鼠肝组织匀浆中SOD水平，由正常组的136.12±3.99U/mgprot降低至68.64±11.68U/mgprot，差异具有统计学意义（P<0.05）。CBC各给药组与模型组相比，可不同程度的降低肝组织MDA含量，其中高剂量组的效果最为明显；并能升高SOD的活性，以高、中剂量组的效果较明显，且呈现良好的剂量关系，提示CBC对酒精性肝损伤小鼠有预防性的肝保护作用。可能是通过提高机体抗氧化水平，抑制脂质过氧化等途径来发挥作用。结果如表4.3所示。表4.3CBC对酒精性肝损伤小鼠肝组织MDA及SOD的影响（⎯x±s，n=10）分组剂量（mg/kg)MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)正常组-2.26±0.74136.12±3.99######模型组-3.74±0.6268.64±11.68******阳性对照组1502.33±0.42129.19±5.93******CBC高剂量组2802.46±0.63118.30±8.32**CBC中剂量组1403.21±0.8080.93±5.98CBC低剂量组703.50±0.9873.36±8.80######******注：与正常组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.001；与模型组组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.0013.1.4CBC对酒精性肝损伤小鼠肝组织病理学的影响实验结果表明，显微镜下观察，正常组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，肝窦清晰，细胞结构完整，无明显病变。模型组小鼠肝小叶结构不清，肝细胞索排列紊乱，较多肝细胞发生气球样变性，多数细胞内可见大小不等的37 脂滴空泡，多分布在中央静脉周围，汇管区出现较多炎性细胞浸润，可见点状坏死灶。与模型组相比，CBC各给药组可不同程度使肝细胞肿胀程度减轻，气球样变减轻，炎细胞浸润减少，点状坏死减轻。以高、中剂量组最为明显。应[101]用Kruskal-Wallis(H)法进行检验：结果显示肝细胞水肿、炎细胞浸润、肝细胞坏死等病理学变化具有显著性差异(P<0.05)。结果如表4.4和图4.1所示。表4.4CBC对酒精性肝损伤小鼠肝组织病理分级的影响组别剂量（mg/kg)总数n0级I级II级Ⅲ级正常组-1010000###模型组-100064*阳性对照组150100352**CBC高剂量组280102440*CBC中剂量组140101522CBC低剂量组70100262######******注：与正常组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.001；与模型组组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.00138 39 40 图4.1CBC对酒精性肝损伤小鼠肝组织病理学的影响（HE染色，×200）A：正常对照组；B：模型组；C：联苯双脂滴丸组(150mg/kg)；D：CBC高剂量组（280mg/kg）；E：CBC中剂量组（140mg/kg）；F：CBC低剂量组（70mg/kg）3.2CBC抗Con-A肝损伤实验结果灌胃给药后，所有小鼠活动均正常，尾静脉注射Con-A约20min后，模型组小鼠对外界刺激不敏感，自主活动减少，精神萎靡不振，蜷缩在鼠笼内，悬吊觅食减少，但无死亡现象。2h后小鼠情况基本恢复正常。尾静脉注射Con-A10h后解剖取出肝脏，除正常组外，其余各组均出现有不同程度的肉眼可见坏死斑，且肝脏和脾脏较正常组肿大。3.2.1CBC对Con-A肝损伤小鼠体重及脏器指数的影响实验结果表明，给药前各组小鼠体重在18g~19g左右，连续给药7天后，体重达到22g~24g左右，各组小鼠之间体重无显著性差异（P>0.05），提示41 CBC不影响机体正常代谢。但尾静脉注射Con-A后，正常对照组小鼠与模型组小鼠相比肝脏指数和脾脏指数分别由4.58±0.30%、4.35±0.40mg/g升高到5.46±0.33%、5.83±0.74mg/g，差异具有统计学意义（P<0.05）。CBC各给药组可不同程度的降低肝脏指数，且呈现良好的剂量关系；但CBC各给药组对肝损伤小鼠的脾脏指数影响不大，差异无统计学意义（P>0.05）。结果如表4.5所示。表4.5CBC对Con-A肝损伤小鼠体重及脏器指数的影响（⎯x±s，n=10）分组剂量第1天体重第8天体重肝脏指数（%）脾脏指数（mg/kg)（g)（g)（mg/g)正常组-19.24±2.3424.07±4.334.58±0.304.35±0.40#####模型组-19.17±1.6424.47±4.365.46±0.335.83±0.74*阳性对照组15018.82±2.7123.79±4.244.94±0.354.93±0.58*CBC高剂量组28018.83±2.0922.85±3.884.96±0.555.03±0.89CBC中剂量组14019.19±1.9424.91±3.325.03±0.375.30±0.72CBC低剂量组7018.86±2.1824.81±3.985.15±0.215.85±1.59######******注：与正常组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.001；与模型组组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.0013.2.2CBC对Con-A肝损伤小鼠血清ALT及AST的影响实验结果表明，尾静脉注射Con-A后，正常对照组小鼠血清ALT、AST活力与模型组相比，分别由9.20±2.92U/L、16.96±5.19U/L升高至32.37±7.04U/L、38.06±17.36U/L，差异具有统计学意义（P<0.05）。CBC各剂量组与模型组相比，可不同程度的降低ALT活力和AST活力，并呈现良好的剂量关系，提示CBC对Con-A致肝损伤小鼠有预防性的肝保护作用。结果如表4.6所示。表4.6CBC对Con-A肝损伤小鼠血清ALT及AST的影响（⎯x±s，n=10）分组剂量（mg/kg)ALT活力(U/L)AST活力(U/L)正常组-9.20±2.9216.96±5.19#####模型组-32.37±7.0438.06±17.36*阳性对照组15019.93±6.9424.17±9.56**CBC高剂量组28020.66±9.3420.76±7.96CBC中剂量组14028.99±9.8429.24±13.75CBC低剂量组7033.58±9.9934.44±16.26######******注：与正常组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.001；与模型组组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.00142 3.2.3CBC对Con-A肝损伤小鼠肝组织匀浆MDA及SOD的影响实验结果表明，尾静脉注射Con-A后，模型组小鼠肝组织匀浆中MDA含量由正常对照组的2.55±0.81nmol/mgprot升高至4.04±0.55nmol/mgprot；模型组小鼠肝组织匀浆中SOD水平，由正常对照组的212.70±28.14U/mgprot降低到130.56±30.86U/mgprot，差异具有统计学意义（P<0.05）。CBC各给药组与模型组相比，可不同程度的降低肝组织MDA含量，其中以高、中计量最为明显；并能升高SOD活性，以高、中剂量最为明显，且呈现良好的剂量关系，提示CBC对Con-A致肝损伤小鼠有预防性的肝保护作用。可能是通过提高机[102]体抗氧化水平，抑制脂质过氧化等途径来发挥作用。结果如表4.7所示。表4.7CBC对Con-A肝损伤小鼠肝组织MDA及SOD的影响（⎯x±s，n=10）分组剂量（mg/kg)MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)正常组-2.55±0.81212.70±28.14######模型组-4.04±0.55130.56±30.86****阳性对照组1503.42±0.39187.31±21.29*****CBC高剂量组2803.06±0.60192.85±28.53****CBC中剂量组1403.17±0.47175.80±28.67CBC低剂量组703.80±0.72153.22±30.66######******注：与正常组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.001；与模型组组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.0013.2.4CBC对Con-A肝损伤小鼠血清TNF-α的影响实验结果表明，尾静脉注射Con-A后，正常组小鼠血清TNF-α水平与模型组相比由28.33±5.96ng/L升高到51.52±6.02ng/L，差异具有统计学意义（P<0.05）。CBC各剂量组与模型组相比，可不同程度的降低小鼠血清TNF-α水平，以高、中剂量最为明显，且呈现良好的剂量关系，提示CBC对Con-A致肝损伤小鼠有预防性的肝保护作用。可能与抑制炎性因子的合成或释放有关。结果如表4.8所示。表4.8CBC对Con-A肝损伤小鼠血清TNF-α的影响（⎯x±s，n=10）分组剂量（mg/kg)TNF-α（ng/L)正常组-28.33±5.96###模型组-51.52±6.02*阳性对照组15043.90±4.48***CBC高剂量组28037.27±6.7343 *CBC中剂量组14041.52±8.19CBC低剂量组7045.76±7.17######******注：与正常组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.001；与模型组组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.0013.2.5CBC对Con-A肝损伤小鼠肝组织病理学的影响实验结果表明，显微镜下观察，正常组小鼠肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，细胞结构完整，无明显病变。模型组小鼠肝小叶结构不清，肝窦内出现红细胞堆积，肝细胞索排列紊乱，较多肝细胞发生水肿样变性甚至气球样变性，多数细胞内可见大小不等的脂滴空泡，多分布在中央静脉周围，汇管区出现较多炎性细胞浸润，可见点状坏死灶。上述差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，CBC高、中剂量组均能减轻肝细胞肿胀程度，气球样变减轻，炎细胞浸润减少，点状坏死减轻。应用Kruskal-Wallis(H)法进行检验：结果显示CBC高、中剂量组肝细胞水肿、炎细胞浸润、肝细胞坏死等病理学变化较模型组具有显著性差异(P<0.05)。结果如表4.9和图4.2所示。表4.9CBC对Con-A肝损伤小鼠肝组织病理分级的影响组别总数n0级I级II级Ⅲ级正常组1010000##模型组100145阳性对照组100172**高剂量组102332*中剂量组101243低剂量组100253######******注：与正常组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.001；与模型组组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.0014小结（1）CBC能够使酒精性肝损伤小鼠的肝脏指数降低；血清ALT和AST活力降低；肝匀浆MDA含量降低；肝匀浆SOD活性升高；同时改善肝脏病变，以高剂量组最明显。提示CBC对酒精性肝损伤有预防性的保护作用。（2）CBC能够使Con-A肝损伤小鼠的肝脏指数降低；血清ALT、AST活力和TNF-α水平降低；肝匀浆MDA含量降低；肝匀浆SOD活性升高；同时改善肝脏病变，以高、中剂量组最明显。提示CBC对Con-A肝损伤有预防性的44 保护作用。（3）CBC对酒精性和Con-A肝损伤的肝保护作用机制可能为：稳定细胞膜，提高机体抗氧化能力，抑制脂质过氧化程度，加快消除自由基等途径来发挥作用。45 46 47 图4.2CBC对Con-A肝损伤小鼠肝组织病理学的影响（HE染色，×200）A：正常对照组；B：Con-A模型组；C：联苯双脂滴丸组(150mg/kg)；D：CBC高剂量组（280mg/kg）；E：CBC中剂量组（140mg/kg）；F：CBC低剂量组（70mg/kg）5讨论目前肝损伤的防治仍是一个亟待解决的热点问题，本章通过建立酒精性肝损伤和Con-A肝损伤模型，旨在研究CBC对肝损伤的预防性肝保护作用。通过研究CBC对两种肝损伤一系列生化指标的变化及病理学检查，来综合评判CBC的肝保护作用及其作用机制。近些年酒精性肝病（alcoholliverdisease）的发病率和死亡率明显升高，研[103-105]究认为该肝损伤的原理是：乙醇可通过多种途径对肝脏造成损害，其在肝内代谢会消耗大量的NAD，影响三羧酸循环的能量供应；乙醇还会破害线粒48 体功能，使呼吸链功能障碍产生大量自由基，线粒体的形态也会发生异常；乙醇氧化过程中产生的中间产物——乙醛，也是导致肝损伤的重要因素之一，由于乙醇脱氢酶活性较高，乙醛脱氢酶活性相对较低，导致乙醛来不及被清除，堆积在肝内或到达血液生成超氧化物，引起脂质过氧化进而导致肝损伤；乙醛还可以与多种蛋白质结合形成复合体作为一个新的抗原刺激物损伤肝细胞。所以消除自由基和抑制脂质过氧化已成为目前抗酒精性肝损伤的研究热点。[106]Con-A导致的肝损伤是由T淋巴细胞介导的病理模型，近些年备受关注。[107-109]研究认为Con-A引起肝损伤的原理是：Con-A是一种植物凝集素，对肝+细胞具有特异性毒性，它能够引起炎性细胞（尤其是CD4T细胞）浸润肝细胞实质，从而刺激TNF-α和白介素等炎症因子，引起炎症反应；上述炎性细胞和炎性因子随着血液进入肝脏后可激活巨噬细胞，破坏血管内皮，进而引起肝细胞凋亡，导致免疫性肝损伤。该模型最大的特点是发病速度快，具有靶向性肝[110]损伤。其病理生理过程与人类慢性乙肝的发病过程极为相似，目前被广泛的[111]应用于急性肝损伤和肝衰竭等防治药物的筛选中。在酒精性肝损伤模型和Con-A肝损伤模型的建立中，出现的问题作以下简[112-114]要分析，据多项研究资料表明，酒精性肝损伤模型建立时，可选用市售的50~56°白酒，也可用分析纯级别的无水乙醇或95%乙醇自行配置，灌胃的体积由12ml/kg-16ml/kg不等。本实验在进行预实验时，采用市售的56°红星二锅头进行灌胃，灌胃体积16ml/kg，1次/天，连续3天，结果小鼠在灌胃后约20min就出现不同程度的醉酒反应，主要为行动不稳，对光反射不明显，呼吸急促且伴有杂音，蜷缩静卧于笼内，对外界刺激不敏感甚至无反应，有严重者出现休克状态，仅能看到腹部呼吸，体温下降，肌张力下降。灌酒1h后，多数小鼠上述症状基本趋于正常，仍有6只仍处于醉酒状态。灌胃4h后，有4只小鼠出现死亡，分别是：模型组雌性1只、阳性对照组雄性1只、低剂量组雄性2只。第2d灌酒4h后，有2只小鼠死亡，分别是：高剂量组雌性1只、低剂量组雄性1只。第3d灌酒4h后，有1只小鼠出现死亡，为低剂量组雄性1只。推测其出现死亡的因素可能是：所购买红星二锅头为假酒，内含甲醛等物质超标，直接导致小鼠死亡，或者，灌胃体积过大，再者就是天气非常炎热及饲养环境的原因，导致预实验所用小鼠身上疑似寄生有螨虫，使其各方面抵抗力大大下降，导致大剂量给酒后出现死亡。所以在正式实验时，选用分析纯级的95%乙醇自行配置成53%的灌胃酒精，灌胃体积12ml/kg。49 [115]Con-A肝损伤模型的建立，选用尾静脉注射Con-A的方式，应熟练掌握尾静脉注射的技巧，确保Con-A能够一次性完全注射，为提高造模成功率，可选用温水（温度不可过高，否则会烫伤小鼠皮肤）或者用酒精擦拭小鼠尾巴的方式，使小鼠尾静脉扩张。注射完成后，可用酒精棉球按压注射点约5s，以防药物随血液流出，影响最终给药量。因为Con-A具有毒性，所以在配药及尾静脉注射时应非常注意自身及他人的安全。另外，Con-A于-20℃保存，最好是现配现用。[116]血清转氨酶可反映肝细胞受损和坏死的程度，且该指标非常灵敏。正常情况下ALT主要分布于细胞液中，AST主要分布于线粒体中，而血清中这两种酶活性较低。当肝细胞受损时，ALT、AST从细胞释放入血，血清中含量会急[117]剧升高。自由基属于生化反应正常的中间产物，但是发生肝损伤时，其产生过多，[118]机体来不及消除，动态平衡就会被打破。正常情况下细胞内存在如SOD等抗氧化酶，其能催化2分子氧自由基生成O2和H2O2，以防御自由基对肝脏的[119][120]损害。MDA是脂质过氧化的终产物，其含量越高说明肝细胞受损越严重。本实验中，肝损伤模型组因产生大量自由基，过量消耗SOD，使模型组活性明显下降，并且脂质过氧化物明显增多。TNF-α与细胞凋亡和坏死密切相关，因为TNF-α是细胞凋亡的正触发因子[121]。TNF-α可直接损伤血管内皮细胞；另外，TNF-α可促使中性粒细胞进入肝[122]脏，诱发呼吸爆发，释放大量氧自由基，导致脂质过氧化反应，造成肝损伤；TNF-α还能使肝细胞和肝血窦内皮细胞间产生很多黏附分子，并可刺激CTL细[123]胞攻击肝细胞，从而导致大量肝细胞坏死；而且当TNF-α生成过量时，可直接导致肝细胞凋亡。本实验中，模型组小鼠在尾静脉注射Con-A后，血清TNF-α含量明显上升，CBC各给药组可不同程度的降低血清TNF-α含量。综上所述，CBC对酒精所致化学性肝损伤和Con-A所致免疫性肝损伤有预防性的肝保护作用。可能是通过稳定生物膜，提高机体抗氧化能力，加速消除自由基，抑制脂质过氧化程度以及炎症因子的生成或释放来达到肝保护作用。其更深层面的作用机制有待本课题组继续深入研究。因此，CBC有望在肝保护保健药品领域得到进一步的开发和利用，造福广大患者。50 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致谢行文至此预示着我即将毕业。回首过往，这期间有太多人给予我数不胜数的帮助，我会一一铭记、珍藏，并将更多的正能量传递下去。饮其流时思其源，成吾学时念吾师。首先，我要对我的导师王振基副教授和毕跃峰教授表示由衷的感激和真诚的敬意，在研究生期间，两位导师无论从生活上还是学习上都给予了我谆谆教导。在学习上，从课题的确定、实验方案的撰写到实验的实施，最后毕业论文的撰写和修改，两位导师都对我进行了精心指导，甚至不惜牺牲自己的休息时间，不辞辛苦的手把手教学。正是两位导师丰富渊博的学识、一丝不苟的态度、豁达开朗的性格，让我领略到了大家的风范。在生活上，两位老师谦虚豁达、与世无争的处事风格深深影响着我，教会了我认真做事、踏实做人。感谢王红娟老师，在学习和生活上给予我无微不至的帮助，我将铭记于心。感谢杜立鹏同学三年来对我生活和学习上的帮助、包容和陪伴，使我顺利度过这三年时光。感谢药理专业李晓天老师、王亚峰老师、王淙老师、侯桂琴老师和刘学武老师、吴春丽老师、符玲老师，以及基础医学院任秀花老师对我的科研工作上的帮助和指导。感谢黄晓燕师姐、杨林超师兄、刘国卫师兄、高振师兄、吴震师兄对我实验的指导，感谢我的同门闫京花、王亚可、肖二卫、樊高洁、杨晓敏、李淑敏、葛素素在科研上给我的大力支持和热情帮助，感谢师妹韩芳芳、许佳慧、张珊、周佳慧、徐丽华、师弟刘文亚对我实验的莫大帮助，感谢室友陈珊珊、杨慧、詹倩娜、王铭铭、曾曼曼、王卫萍、贾冰冰陪我度过三年学习和生活，我会永远怀念与你们在一起的快乐时光。感谢郑州大学药学院这样一个平台，为我提供了良好的学习、科研和生活环境。衷心感谢我的家人，你们的支持和鼓励是我学习和生活的动力，也希望我能够成为你们的骄傲，祝愿爸爸、妈妈和弟弟健康、平安、幸福。60
