DB3301∕T 1096-2018 南美白对虾肝肠胞虫聚合酶链式反应检测方法(杭州市)

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1、ICS65.150B50DB3301浙江省杭州市地方标准DB3301/T1096-2018南美自对虾肝肠胞虫聚合酶链式反应检测方法2018-09-05发布2018-10-05实施杭州市质量技术监督局发布目IJ吕本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由杭州市农业局提出井归口。本标准起草单位:杭州市水产技术推广总站、杭州萧山农技推广中心水产站、杭州大洋庄园农业发展有限公司O本标准主要起草人:叶键、施礼科、许婷、王力、徐铃戚、陈凡、蒋静、韩饲、王国成。D83301/T1096--20

2、18南美自对虾肝肠胞虫聚合酶链式反应检测方法1范围本标准规定了南美白对虾肝肠胞虫CEnterocytozoonhepatopenaei,EHP)聚合酶链式反应CPCR)检测的材料、仪器和设备、操作步骤和结果判定。本标准适用于南美白对虾肝肠胞虫的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的寻用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3检测材料3.17.1<符合GB/T6682中一级水的要求。3

3、.2Taq酶-20"C保存，避免反复冻融。3.3dNTPs含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L,-20"C保存。3.4引物有两对引物，浓度均为25μmo1/L，其序列分别为:Fl:5'-CAGCAGGCGCGAAAATTGTCCA圄3'Rl:5'-AAGAGATATTGTATTGCGCTTGCTG-3号，扩增778bp的片段:F2:5'-CAACGCGGGAAAACTTACCA-3'R2:5'-ACCTGTTATTGCCTTCTCCCTCC-3号，扩增上述片段中的176bp片段。3.5DNA分子量标准推荐使用DNA1adder100，各片段大小依次为

4、1500bp,1000bp,900bp,700bp,600bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp。3.6无水乙醇分析纯，使用前-20"C预冷。D83301/T1096--20183.7矿物油无DNA酶和RNA酶。4仪器和设备4.1PCR扩增仪4.2电泳仪输出直流电压oV~600V。4.3水平电泳槽50mL'~500mL，带有凝胶船及样孔梳。4.4移液器量程O.5μL~10J.lL、10μL~100μL、100μL~1000μL移液器各l支及适配吸头，0.5μL~10μL移液器建议使用带滤芯吸头。4.5紫外透射仪或;疑胶成像仪可遮挡可见光干扰，在

5、230nm~300nm波长对凝胶发射紫外线，推荐带照相功能。4.6恒温培养箱4.7冰箱具冷藏箱，并带-20'C以下冷冻箱体。4.8离心机转速可达15000r/mi日以上。5操作步骤5.1采样将待检虾置于采样容器内，加lOf音体积以上的95%乙醇.没过待检样，常温保存，可保存30d。采样数量应符合SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范的要求。5.2样品处理将待检虾置于灭菌滤纸上，滤干乙醇。幼体、仔虾及小于2cm的幼虾取完整个体。大于2cm的幼虾、亚成年虾及成虾取肝膜腺组织。充分研磨混匀后取10mg~50mg的样品，置于1.5mL的离心管中，立即进行DNA抽提。5.3D

6、NA抽提加150μLCTAB溶液(见附录A.1)，研磨成糊状后再加CTAB溶液至900μL~昆匀后于25"C作用2h。加600J.lL抽提液l(见附录A.2)，充分混合30S;12000r/min离心5mi口，取上层水相:加700μL抽提2D83301/T1096--2018液2(见附录A.3)，充分混合30S;12000r/min离心5mi口，取上层水相:加入1.5倍体积-20"C预冷的无水乙醇，泪匀后于20"C放置30min以上15000r/min离心30min，弃上洁，3TC干燥5min;最后加20flL双蒸水溶解，作为PCR模板。可以采用同等抽提效果的商品化DNA

7、抽提试剂盒。5.4设立对照经序列测定确认为阳性和阴性的对虾组织，按5.3提取获得DNA，分别作为阳性对照和阴性对照:并以双蒸水作为空白对照。5.5第一步PCR扩增5.5.1在O.2mLPCR管中加入10xPCR缓冲液(见附录A.4)5mL、25mmol/L氧化接5mL、dNTP1mL、引物Fl和R1各1mL、Taq酶5U，待测样品DNA2mL，最后加双蒸水至50mL。使用不具热盖功能的PCR仪时，在反应混合物上覆加25mL矿物油。5.5.2低速离心后将PCR管置于PCR仪中，按以下程序进行扩增94"C变性3min;94"C20