DB13∕T 2593-2017 禽腺病毒4型PCR检测方法(河北省)

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1、尬2017-11-22发布2017-12一22实施河北省质量技术监督局发布悖。11ρ'Jμ、!升飞飞飞卜寸、DB13/T2593--2017禽腺病毒4型PCR检测方法1范围本标准规定了禽腺州毒4型PCR检测方法的技术要求。本标准适用于检测家禽咽喉拭子、月工拭子，发呐禽组织和这些采集样品培养物中的禽腺病毒4型。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件O2.1DNA脱氧核糖核酸Cdeoxyribonucleicacid)2.2EB澳化乙链Cethidiumbromide)2.3PCR聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)2.4dNTP脱氧核科二酸二磷酸(~f';

2、)xy-ribonucleosidetriphosphate)3试剂或材料包括各种市售情毒核酸提取试剂盒，l.ú曾在ι节糖ìJ?，U变，50XTAE绥忡液，澳化乙提(EB，10ug/μL)或核酸染料，焦碳酸气乙醋(DEPC)处理的灭曲的双去Fl二，DNA分子量标准C100bp)，2xTaqMasterMix或商品化的一步法PCR反应试剂。警示:电泳中用到的EB在操作中应戴手套和口罩。试验中被EB污染的物品要进行无需化处理;DEPC在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾3'IJ皮肤应.即冲洗。3.1恼毒核酸提取试剂盒。3.2l.0%琼脂糖凝胶，配制方法见附录A中A.

3、1o3.350XTAE绥川液，配制方法见附录A中A.203.4泱化乙皖(EB，10ug/~L)g~核酸染料，配制方法见附录A中A.303.5焦碳酸一乙醋(DEPC)处理的灭曲的现蒸水，配制方法见附录A中A.4oDB13/T2593--20173.6DNA分子量标准(100bp)包含100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp,2000bp儿种分子量标准。3.72XTaqMasterMixo3.8商品化的步法PCR反应试剂:含有PCR缓冲液、酶混合物、dNTP混合物、无RNA酶的水寺。3.9引物:上游引物与下游引物见附录B中的表B.1。引物浓度为10IJmol/L4仪器

4、设备4.1PCR仪:温度范围4.O'C~99.9'C;样品基座配青主少包括单个O.2日lL孔。4.2凝胶成像系统:检测灵敏皮DNA注0.1日g;有效像数1360X1024、10bit、USB2.0。4.3台式低温高速禹心机:最高转速16000r/min;容量1.5mLX12。4.4电泳仪:电压50V~120V，电流10mA~800时，走时Omin~999mi口。4.5电泳槽:耐高温、耐腐蚀、不漏液:缓冲液容量充足。4.6冰箱:具有冷藏功能。4.7微量移液器:单道可调:量程包括0.5~10IJL、2~20IJL、10~100IJL、100~1000IJL4.8水浴锅:温度范围为室温~1

5、00'C05样品5.1阴阳性对照以j(活的禽腺病毒4到鸡胚尿囊液作为IS日性别照，以正常鸡胚尿囊液或者是正常家禽组织作为阴性别照。对肝、均应在20l"保存。5.2样品的采集与处理5.2.1采集工具下列的采集工具应经121'C::!:::2'C，20min高压灭的iJ(烘干:a)楠拭子:b)剪刀:c)慑了丁d)1.5mL离心管;巳)研钵。5.2.2棉挝子采集将棉拭了?禾入咽喉或月工、]转一圈:将采集后的柏拭子放入盛有1.0mLPBS(配制力法见附录A中A.5)的1.5mL的离心管，加盖，编号。5.2.3组织采集2DB13/T2593--2017剖检家禽，用剪刀采集心肝脾肺肾法氏囊等组织

6、，装入一次性灭菌容器，编号O5.2.4样品储运样品采集后放入塑料袋内密封(个采集点的样品放个塑料袋内儿子保温箱巾加冰，密封24h与送至实验室O5.2.5样品的处理5.2.5.1棉挝子处理方法将装有棉拭子的离心轩在混合器上充分混合后，用高压灭菌的慑子将拭子巾的液体挤出，4'C条件下3000r/min离心15min，取上;青液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。5.2.5.2组织的处理方法将所采集的细织置于洁净、灭菌并炉、丁的搪瓷盘中，称职细织按照质量体积比(1:5)加入样品保存液进行充分研磨，4'C条件下3000r/min离心15mino取上;青转入无菌的1.5mL的离心管备用，编

7、号。6操作步骤6.1DNA的提取用病毒核酸提取试剂命，按照如下步骤提取待检样品、阳性对照及阴性对照样品的DNAo6.1.1加入20IJL蛋白酶K于1.5mL离心管巾，在离心管巾加入200IJL样品，加入200IJL885,涡旋混合15s,56'C孵育15mino6.1.2加入250IJL无水乙醉，涡旋泪合15s，室泪放置5mi口。6.1.3将溶液和沉淀一起加入离心柱巾，12000r/min离心1min，弃掉流出液。6.1.4加入500IJL~R~.~200