趋化因子生物活性的测定

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1、化因子生物活性的测定趋化因子生物活性的测定1.基本原理：趋化因子的趋化作用没有种属特异性，趋化因子的靶细胞主要有中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞和成纤维细胞等。（以IL-8为例）158是典型的CXC家族趋化因子，对嗜中性粒细胞和T淋巴细胞有趋化作用。由于它的趋化作用没有种属特异性，因此，可以用豚鼠嗜中性粒细胞代替人嗜中性粒细胞对其进行活性检测。趋化因子诱导的细胞移动方式有两类：化学增活现象，指增强细胞的随机运动，琼脂糖小滴化学动力实验是检测这种活性的比较简易，快速，重复性好的方法。趋化性，指诱导细胞向趋化因子化学浓度高的方向移动。琼脂糖中的趋

2、化实验和微孔小室中的趋化实验则是常用的测定细胞因子趋化活性的方法。微孔小室中的趋化实验：微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞，中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设计的。滤膜将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，染色并计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。趋化材料和趋化时间的选择：趋化滤膜的材料和孔径需根据靶细胞的大小选择；中性粒细胞用3Um孔径的PVPF聚碳酸膜（Polycarbonatemembranes）,趋化时间为30分钟；单核细胞用8Um孔

3、径的PVPF聚碳酸膜，趋化时间为90分钟；粘附力弱的淋巴细胞则用下表面复以明胶或纤粘素的511m或8HmpVPF聚碳酸膜，以免淋巴细胞穿过膜后落入下室，趋化时间为180分钟。趋化因子浓度的确定:由F趋化因子的特异活性非常高，某些趋化因子在较高浓度时促进细胞趋化的作用反而降低，所以待测样品常需连续稀释(5倍或10倍系列稀释)以获得最适剂量的趋化结果。每次实验都需设好对照，因为不同来源或不同活力靶细胞的趋化能力差异很大。趋化因子活性的表达方式有三种，其中最常用的是用趋化指数表示，趋化指数(chemotacticindex,CI)是指细胞迁移到待测样品液的数目和迁移到对照液的数目的比值

4、。1.试剂和材料：纯化的IL-8注射器，离心管，移液器，Tip头0.17%D(+)-糖原/生理盐水解剖器械(剪刀，锦子，止血钳)17%D(+)-Glycogen趋化小室，趋化滤膜，细胞刮子计数板，显微镜，玻璃片红细胞裂解液：0.17MTrisO.16MNH4CL将10ml0.17MTris加至90ml0.16MNH4C1中，调至PH7.2甲醇，Gimsa染色液Hanks使用液RPMI1640豚鼠中性粒细胞3.实验程序：一.豚鼠嗜中性粒细胞的制备：1)取成年豚鼠1只，腹腔注射含0.17%糖原的生理盐水，13小时后，用PBS缓冲液冲洗腹腔，收集腹腔液，1500rpm/minlOmin

5、,弃上清。2)轻轻弹起沉淀，用3-5mlPH7.2的37预温的(Tris-NH4CL)红细胞溶解液，充分吹散，作用3-5分钟,立即加入serum-freeRPMU640,吹打均匀,1500rpm/min5min,弃上清，再加入serum-freeRPMI1640,离洗两次。得到豚鼠嗜中性粒细胞，纯度可达97%以上。3)将纯化后的嗜中性粒细胞溶在serum-freeRPMI1640中，细胞计数，调整细胞浓度为5X105/ml,备用。二.样品的准备：1）将纯化的IL-8用PBS分别稀释为1000ng/ml,100ng/ml,10ng/ml,lng/ml,0.lng/mlo同时用稀释I

6、L-8的PBS作阴性对照。（样品加入小室前最好放入室温平衡或37oC培养箱中预温，以免加样时出气泡）。一.准备底层小室，加样：1）将趋化小室底层板放水平台上，NP标记位于右下方。2）将稀释好后预温的样品加入孔中,使液面微微隆起,每孔27U1（,国产板每孔25U1）,每个样品3个复孔。为防止样品过度蒸发，整个加样过程应不超过5分钟。3）将适当孔径的滤膜取出，在滤膜的一角剪去1mm的小角，缺角对着NP标记，分别用镜子夹住滤膜两端，水平下降，中间部位最先接触小室液面，将膜平放在加完样的底层板上。4）铺上硅胶垫，装上上层板，硅胶垫的缺角及上层板的NP标记位于右下方。装上螺丝，拧紧装置。二

7、.加入细胞：1）将己稀释好的细胞悬液加入上层小孔中，每孔50H1,加样时微量加样器Tip贴着小孔壁，Tip末端恰好位于滤膜稍上方垂直快速加样，避免孔底滞留气泡，（注意这一步加样过程中一定不要有气泡形成）。2）检查上层液体中是否有气泡，一个比较简便的方法是观察小孔凸的反射光，如果小孔上方有一个异常大的凸液面，通常表明有滞留气泡。解决的办法是用Tip将孔中的液体吸干净，重新加样。三.再育：O将趋化小室放入37c5%C02孵箱中，孵育30分钟。六.取出滤膜，清洗，染色:1）取出滤膜，拧