猪流行性腹泻病毒部分s1基因克隆

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1、《江西畜牧兽医杂志》2014年第6期·实验研究·文章编号：1004-2342（2014）06-0011-03中图分类号+：S852.659.6文献标识码：B猪流行性腹泻病毒部分S1基因克隆*王蓓，陈如圣，孙明，张祥华，潘美慧，熊加明，邬向东，何后军，陈瑞光（江西农业大学动科院，江西南昌330045）摘要：为研究江西省PEDV流行株可能的变异情况，作者采用RT-PCR成功扩增了PEDV的部分S1基因，并将其克隆至T载体，经测序同源性分析，与PEDV标准毒株同源性在95%以上，说明成功的克隆了PEDV病毒部分S1基因，为将来进一步研究打下基础。关键词：猪流行性腹泻；分子流行

2、病学调查；同源性猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrhea毒性腹泻仔猪的小肠组织及粪便样品。Virus,PEDV）是引发猪流行性腹泻（PorcineEpi－1.1.2主要设备。K960型梯度PCR扩增仪，5415RdemicDiarrhea,PED）的原因。其属于冠状病毒科，型eppendorf高速台式冷冻离心机，JY300C型电泳[1]冠状病毒亚科甲型冠状病毒属b亚群。PED对于仪、JY02S型紫外分析系统，SPX-150B-Z型上海博不同年龄段及不同品种的猪都容易感染，是猪的一迅生化培养箱，DW-FL262型-40℃中科美菱超低温种拥有高度接触

3、性的传染病，以哺乳仔猪最为严冷冻储存箱等。重，死亡率可达100%，该病在我国及世界各养猪国1.1.3主要试剂。氨苄青霉素、LB培养基、SDS、Tris家普遍分布。其主要的临床症状以食欲不振、水样碱等（Solarbio公司产品）；EcoRⅠ、SalⅠ、PCRmix、腹泻、呕吐、脱水，最后酸中毒为基本特征。以往该M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等（普洛麦病虽给养猪业造成了极其严重的影响，但病毒感染格公司）；TrizolKit、DNA凝胶回收纯化Kit与[2]往往在一周后即基本恢复，病程较短。但最近几PMD18-TVector（大连宝生公司）。年，该病在我国发生率

4、明显升高，而且病程拖长，给1.2方法[3]养猪场造成极其严重的损失。本研究根据NCBI发1.2.1PEDV部分S1基因的RT-PCR扩增方法建立表的PEDV标准毒株序列设计引物，通过RT-PCR1.2.1.1引物设计。根据GenBank上已发表PEDV-S方法，扩增出预期大小基因片段，经克隆测序，证实基因序列设计引物，预期大小为1139bp，由上海生本研究成功克隆到PEDV-S1基因，为进一步研究工生物工程公司合成。引物序列：其变异性提供了理论基础。P1：5'-------TTCACTGGTCATGGCACTGAC1材料与方法--------3'1.1材料P2：5'--

5、-----CTAACAGGCGTGTTGTAAAGC1.1.1病料来源。采集江西省南昌市某县猪场疑似病TG----3'1.2.1.2病毒RNA的提取。取约50mg病料，加入有基金项目：2012年江西省大学生创新训练项目（DC201313）；1mL生理盐水的匀浆器中充分研磨后，12000×g离南昌市科技支撑项目（201-KJZC-NY-002）心3min，取上清用于总RNA提取。作者简介：王蓓，女，江西农业大学动医专业学生，E-1.2.1.3PEDV反转录反应体系。无菌2H2O4.5μL、mail：1106269656@qq.comdNTP4μL、5×buffer4μL、

6、P21μL、RNA酶抑制0.5*通讯作者：邬向东，副教授，E-mail：dxywxd2006@126.com。μL、M-MLV1μL、RNA模板5μL。反应条件：42℃·11·《江西畜牧兽医杂志》2014年第6期·实验研究·50min，72℃15min，获得cDNA置-40℃冰箱保存备用。培养12~16h。再将新鲜生长的转化菌落转接至LA[4]1.2.1.4RT-PCR退火温度确定。反应条件：94℃预变液体培养基，参照分子克隆实验指南碱裂解法提性5min；94℃45s，56.3℃、57.1℃、57.9℃、59.0℃、60.0℃、取转化质粒。EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定

7、重组质粒，61.1℃、62.2℃、63.3℃、64.2℃9个梯度45s，72℃90s，酶切体系如下。共35个循环；最后72℃延伸10min。反应体系：无10×buffer1.0μL菌2H2O8.5μL、cDNA2μL、PCRmix12.5μL、P11EcoRⅠ1.0μLSalⅠ1.0μLμL、P21μL产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察。质粒DNA4.0μL1.2.1.5RT-PCR反应敏感性检测。将cDNA模板做ddH2O3.0μL610倍递度稀释，采用10~10倍稀释样品进行扩增，Total10.0μL以无菌2H2O做空白对照，用优化后的R