哈巴苷对急性脑缺血小鼠神经细胞及caspase非依赖性凋亡通路的影响

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1、哈巴苷对急性脑缺血小鼠神经细胞及caspase非依赖性凋亡通路的影响SfiX龍浙江中医药大学药学院R的研宄哈巴苷对急性脑缺血小鼠海马神经细胞、线粒体功能及caspase非依赖性细胞凋亡通路的影响。方法采用大脑中动脉阻塞法(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)复制小鼠急性脑缺血模型。造模后，各组分别立即尾静脉注射哈巴苷(4、8、12mg•kg1)、依达拉奉(3.2mg•kg1),模型组及假手术组同法给予等量生理盐水(10niL*kg[)。造模6h后，采用流式细胞术检测MCAO小鼠海马神

2、经细胞凋亡率及线粒体膜电位;透射电镜观察MCAO小鼠海马神经细胞线粒体内外膜的清晰度、线粒体嵴的完整性、线粒体基质电子密度的高低变化及线粒体肿胀情况;采用Westernblot法检测MCAO小鼠脑组织线粒体中AIF及EndoG的蛋白表达;采用qPCR法检测MCAO小鼠海马组织中AIF及EndoGniRNA的表达。结果造模6h后，与假手术组相比，模型组小鼠脑组织海马神经细胞凋亡率明显增加(P〈0.01);海马神经细胞线粒体膜电位明显降低(P<0.01);神经细胞线粒体超微结构受损严重，线粒体结构松散，可见明显肿胀;脑组

3、织线粒体中A1F及EndoG蛋白表达明显降低，线粒体A1F及EndoG蛋白释放增加(P<0.01);海马组织AIF及EndoGmRNA表达明显增加(P<0.01);与模型组相比，哈巴苷各剂量组小鼠脑组织海马神经细胞凋亡率明显降低(P<0.05,P〈0.01);海马神经细胞线粒体膜电位明显升高(P〈0.01):神经细胞线粒体超微结构明显改善;哈巴苷8、12mg•kg1组小鼠脑组织线粒体中AIF及EndoG蛋白表达明显增加，线粒体A1F及EndoG蛋白释放减少(P<0.05，P<0.01)，哈巴苷4mg•kg1组小鼠脑组

4、织线粒体中EndoG蛋白表达明显增加，线粒体EndoG蛋白释放明显减少(P〈0.05):哈巴苷8、12mg•kglfl.小鼠海马组织AIF及EndoGmRXA表达明显降低(P<0.05，P<0.01)。结论哈巴苻对急性脑缺血有保护作用，其机制可能与保护大脑神经细胞及线粒体生理活性，抑制caspase非依赖性细胞凋亡通路相关。关键词：哈巴;MCA0;神经细胞凋亡;线粒体膜电位;线粒体超微结构;caspase非依赖性凋亡通路；线粒体作为调控真核细胞生命活动的中心，其不仅是细胞的供能场所，且是调控细胞凋亡的重要细胞器，在细

5、胞凋亡过程中发挥重要的作用m。因此，保证线粒体生理功能的完整性对急性脑缺血的治疗具有重要意义。细胞凋亡主要有内源性的线粒体、内质网途径以及外源性的死亡受体途径3种。内源性的线粒体途径又包括caspase依赖性及caspase非依赖性细胞凋亡途径两种位1。线粒体介导的非caspase依赖凋亡通路主耍为当细胞受到内部凋亡刺激因子作用后，细胞凋亡诱导因子(apoptosisinducingfactor,ATF)与核酸内切酶G(endonucleaseG,EndoG)可由线粒体释放到胞质，并最终进入细胞核，引起DNA的破坏，

6、直接导致细胞凋亡U1。课题组前期研究发现，哈巴苷对急性脑缺血具有保护作用，且其作用可能与caspase依赖性细胞凋亡通路相关［5-6］。本研宄采用多指标研宄哈巴苷抗急性脑缺血的作用机制，为哈巴苷应用于临床治疗脑缺血疾病提供实验基础和理论依据。1材料1.1实验动物1CR小鼠，SPF级，6，体质量23~25g，由浙江中医药大学实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK（沪）：2013-2016。饲养环境温度22_25°C，相对湿度45%^70%,昼夜周期12h/12h,喂以普通饲料，自由饮水。1.2药物与试剂哈巴苷（批号：

7、15030621，上海同田生物技术股份有限公司）；依达拉奉（批号:86-141106，南京先声东元制药有限公司）；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒（批号:6033840，美国BD公同）；JC-1探针粉末（批号:MKBZ3766V,美国Sigma公司）：线粒体蛋白提取试剂盒（批号:20151228,凯基生物技术股份有限公司）；BCA蛋白定量检测试剂盒（批号：10121，北京康为生物科技有限公司）；5X蛋白上样缓冲液（批号:LMYG15502，杭州诺森徳生物技术有限公司）；预染蛋白Marker（批号:0

8、0135995,美国赛默飞世尔科技有限公司）；AIF兔抗人单克隆抗体（批号:ab32516）、EndoG兔抗人单克隆抗体（批号:ab76122）、P-actin单克隆抗体（批号:3700S_10），均购自美国Abeam公司；山羊抗兔焚光二抗、山羊抗鼠荧光二抗（批号:C50113-05、C50331-05,美国LI-C0R公司）;MiniBEST