人骨髓间充质干细胞的冷冻干燥实验

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1、第九届全国冷冻干燥学术交流会中国上海2008年12月卵日人骨髓间充质干细胞的冷冻干燥实验范菊莉张绍志陈光明浙江大学制冷与低温研究所，杭州，310027擒耍问充质干细胞是具有自我增殖、免疫调节和多项分化潜能的成体干细胞，而人骨髓间充质干细胞(hBM_MSCs)因其比较容易获取而成为组织工程和再生医学理想的种子细胞，在干细胞治疗的临床应用中有广阔的前景．骨髓间充质干细胞的长期保存是重要难题。实验尝试用冻千的方法来保存骨髓间充质干细胞．以海藻糖为保护剂，应用差示扫描量热仪(DSC)测量其玻璃化转变温度，从而为冻干工艺的设计提供了基础，从样品容器等方面对

2、人骨髓间充质干细胞的冻干进行了实验研究，并采用含20％胎牛血清的LG—DMEM培养基对冻干后l埘SCs进行复苏，获得了初步的成功。关键词人骨髓间充质干细胞；冷冻干燥；保存；DSCl引言干细胞研究以及利用千细胞来治疗疾病的干细胞生物工程已经成为继人类基因大规模测序完成后生命科学中最活跃的研究领域之一。间充质干细胞是具有自我增殖和多项分化潜能的成体干细胞，且具有免疫调节活性。它被英国(Nature)杂志评为。成体干细胞工程领域的先导”。人骨髓间充质干细胞(h酬—MSCs)因其比较容易获取而成为组织工程和再生医学理想的种子细胞，在干细胞治疗的临床应用中

3、有广阔的前景。但是，随着骨髓问充质干细胞的临床应用研究和产业化开发应用的不断深入，如何对骨髓间充质干细胞进行长期保存及便捷运输已成为了重要难题之一川。目前国内外间充质干细胞库的主要保存方法是液氮低温保存E2]。其中又包括程序性降温冻存法和非程序性降温冻存法，在降温程序中典型的是两步降温法和玻璃化法，两步法是第一步将含有细胞的低温保护剂一盐水溶液慢速冷却至某一中间温度，第二步将其直接置入液氮，冷却速率较高。两步降温法避免了胞内冰晶的形成，最后细胞内形成的是玻璃态。浙江大学医学院已建立了以5％二甲基亚砜(D惦O)为冻存保护剂的程控冻存方案，复苏后细胞

4、回收率为87．67±2．52％，且复苏后的h蛐SCs的生物学特性均较好，优于二步法。但是低温保存方法需要液氮容器和大量液氮，占地大，成本高，且不利于远距离运输，因而限制了m瑚scs进一步应用于临床．一种新的保存工艺——冷冻干燥保存逐渐受到学者们的重视。冷冻干燥保存细胞能够实现室温或4℃冰箱内长期稳定保存，不需要昂贵的低温储存设备；干燥产品质量轻，有利于储存和运输：且在移植前，不需要进行冻干保护液洗涤。随着冷冻干燥技术在血小板、红细胞等细胞保存领域的研究。近年来国内外的一些学者对有核细胞的冻干保存进行了一些尝试协’。2004年Xiao删等川以40％

5、PvP+20％蔗糖+10％胎牛血清(FBS)对脐带血中的有核细胞冻干复苏后，存活率达98．57±0．6蹦，CD34‘细胞的复苏率达68．4％。2005年杨鹏飞等嚆1对11^lSCs的冻干保存作了探索性研究，他们用海藻糖、甘露醇、羟乙基淀粉(HES)、PVP、和FBS作为冻干保护剂对hMSCs实施冻干，证实冻干的MSCs仍保持活性，且以30％PVP+20％海藻糖作为冻干保护液的细胞活性最高，但该研究没有进一步研究IISCs复苏后的存活率和生物学性质的改变。在此基础上，本实验尝试用冻干的方法来保存骨髓间充质干细胞，以海藻糖为保护剂，应用差示扫描量热仪

6、(DSC)测量5第九届全国冷冻干燥学术交流会中国上海2008年12月6-7日其玻璃化转变温度，从而为冻干：[艺的设计提供基础，从样品容器等方面对人骨髓间充质干细胞的冻干进行了实验研究。2材料与方法。2．1海藻糖孵育㈣’用含100mmol／L的海藻糖的保护液在37℃孵育11MSCs细胞24h，得到细胞内海藻糖浓度约为7．5pg／mL。2．2冻干保存液憎130％PVP、20％海藻糖和细胞悬液(悬于PH=7．2’7．4的PBS缓冲液)以2：1：2的比例混匀待用。2．3样品玻璃化转变温度研究程控冷冻干燥程序的关键参数包括冻干样本的结晶温度(Te)和玻璃化

7、转变温度(Tg)。为了减少冻干过程中的损伤并最大限度地节省资源，一般希望将样品冷却到Tg之下，并在此温度下进行干燥¨⋯。因此，冻干实验前，对样品的玻璃化转变温度(Tg)进行了测定。以冻于保存液(海藻糖+PVP+细胞溶液)为样本，使用美国TA仪器公司的Q100型差示扫描量热仪(DSC)，仪器配有液氮冷却系统，用环己胺(结晶转变-87．1℃)和汞(熔融温度-38．6℃)进行温度校正。取约15p1样本溶液放入标准液体铝皿，用液固通用压机压制密封，在参比侧放置与样品皿相同的空皿。实验中的冷却速率和加热速率均为10℃／min。液体样品冷却至一120℃保证温

8、度稳定和样品平衡后升温至25℃。根据ASTM标准方法E1361-91，玻璃化转变温度用玻璃化转变引起的比热变化(ACp)的中点所对应的温