扇贝多肽经smacxiap通路抑制uvb诱导hacat细胞凋亡的作用

扇贝多肽经smacxiap通路抑制uvb诱导hacat细胞凋亡的作用

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时间:2018-05-07

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1、扇贝多肽经SmacXIAP通路抑制UVB诱导HaCaT细胞凋亡的作用:张兰兰苏爱刘颖孙谧王春波杜卫【摘要】目的探讨扇贝多肽(PCF)经半胱天冬酶激活物(Smac)和X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)通路对抑制中波紫外线(UVB)诱导HaCaT细胞凋亡的分子机制。方法实验分为如下6组:正常对照组(A组)、UVB模型组(B组)、UVB+1.42mmol/LPCF组(C组)、UVB+2.84mmol/LPCF组(D组)、UVB+5.68mmol/LPCF组(E组)和UVB+5.68mmol/L维生素C阳性对照组(F组),分别进行相应处理。分别采用琼脂糖凝胶电泳和H

2、ochst33258染色法测定各组细胞凋亡率,蛋白印迹法(EM(Gibco公司)、体积分数为0.10的标准胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)、100kU/L青霉素和100kU/L链霉素组成;PCF由中国水产科学研究院黄海水产研究所分离纯化,纯度>96%,蒸馏水配制成227.5mmol/L的储存液,过滤除菌,4℃保存备用;DNALadder抽提试剂盒、Hoechst33258染色试剂盒均购自碧云天生物技术研究所;RNAisoReagent、逆转录试剂盒和PCR扩增试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品;Smac抗体购自eBioscience;XIA

3、P抗体购自CellSignalingTechnologyTM(Beverly,MA,USA);caspase3和9抗体购自北京博奥森公司。XIAP和GAPDH引物由北京三博远志生物技术有限公司合成;预染蛋白质相对分子质量标准、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所;βactin抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。  1.1.2仪器紫外线辐照仪(北京师范大学光电仪器厂制造),LeicaDBI4000B荧光显微镜(Leica公司),PCR仪(美国CLP公司),PROTEANⅡ型垂直电泳仪(美国BIORAD公司生产),DYYⅢ8型电泳仪(北京六一仪

4、器厂)。  1.2方法  1.2.1细胞培养与实验分组HaCaT细胞(韩国延世大学丁擘晓博士惠赠)加入完全培养基,置于37℃,体积分数0.50CO2中常规培养。实验分为6组:正常对照组(A组)、UVB模型组(B组)、UVB+1.42mmol/LPCF组(C组)、UVB+2.84mmol/LPCF组(D组)、UVB+5.68mmol/LPCF组(E组)和UVB+5.68mmol/L维生素C阳性对照组(F组)。将细胞种入置有盖玻片的6孔培养板内培养,细胞融合至50%~80%时,按实验分组进行处理。C、D、E组细胞在含有不同剂量PCF的培养液中预孵育2h后,UVB照射

5、(剂量20mJ/cm2);F组细胞在VitC浓度为5.68mmol/L的培养液中预孵育2h后,UVB照射(剂量20mJ/cm2),照射结束后继续常规培养。  1.2.2Hoechst33258染色检测细胞凋亡各组细胞UVB照射结束后继续培养18h,吸尽各孔培养液,按照Hoechst33258染色试剂盒说明进行操作,荧光显微镜下观察结果。同一处理组随机选择6个观察视野,每个视野观察200个细胞,计数凋亡细胞数,重复3次,计算细胞凋亡率。  1.2.3琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡将细胞按实验分组处理后,继续培养18h。然后收集细胞,按照DNALadder抽提试剂盒说明

6、进行操作。将获得的DNA应用20g/L琼脂糖凝胶电泳。  1.2.4蛋白印迹法(RTreagentkit说明逆转录为cDNA备用。XIAPcDNA引物序列分别为:上游为5′ATATACCCGAGGAACCCTGCC3′,下游为5′TTCCGGCCCAAAACAAAGA3′,扩增片段长度为245bp;内参GAPDH的引物序列分别为:上游为5′CGTGGAAGGACTCATGACCA3′,下游为5′TCCAGGGGTCTTACTCCTTG3′,扩增片段长度为509bp。按照PCRAmplificationkit说明进行反应。扩增条件为:95℃预变性3

7、min;94℃40s、60℃40s、72℃40s,循环35次;最后72℃延伸3min。10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,实验重复3次。采用凝胶分析软件Quantityone进行半定量分析,XIAPmRNA的表达水平以XIAP与GAPDH比值表示。  1.3统计学分析  用SPSS12.0软件进行数据处理,数据间比较采用单因素方差分析。  2结果  2.1PCF抑制UVB诱导HaCaT细胞凋亡作用  琼脂糖凝胶电泳结果显示,B组有明显的DNA梯形条带,且梯形带灰度较高,A、F组及加入PCF各组(C、D、E组)均未见明显的梯形条带(图1)。  图1DNALad

8、der琼脂糖凝胶电泳图(

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