【综述】无筛选标记转基因作物的研究进展

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1、无筛选标记转基因作物的研究进展中国农业科学院研究生院生物技术研究所曹建随着生物技术的发展，转基因技术已经成为作物育种的一种重要手段并且已经取得显著的成就。从2004年批准的第一个商业化转基因大豆起至2010年我国含Bt基因的转基因水稻和含phyA基因的转基因玉米相继获得了安全证书，转基因的安全性也越来越受到公众的关注。这其中包括转基因作物本身的安全性及转基因作物存在的筛选标记的安全性。大部分的转基因技术都得借助抗性基因筛选转化子，从而引起了公众对转基因作物安全性的担忧，这些安全性包括对环境和人类本身，极

2、大地阻碍了转基因作物商业化的进程。此外，这些筛选标记的存在给基因聚合带来了巨大的困难。因此，消除筛选标记成为了转基因技术应用的一大难题。为了消除转基因作物中的筛选标记，一种全新的策略即获取无选择标记的转基因技术迅速发展起来。该技术一方面能够获得所需的转基因植株，另一方面又能消除标记基因，因而受到了转基因作物育种学家的推崇，成为现阶段转基因作物育种的主要手段，极大地推动了转基因技术的发展。本文主要对无标记转基因技术不同方法做一论述。1.3.1共转化－分离的方法（Co-Transformation-Segr

3、egationmethod）所谓的共转化（co-transformation）是指将不同的外源基因分别构建到不同的载体或同一载体的不同区段，将多种载体同时转入同一受体细胞，筛选出共转化植株。它为无标记转基因技术提供了一种可行的方法，分别将目的基因和筛选标记构建到不同的载体上，通过共转化使其整合到植物基因组，由于自身不连锁，其可能整合到基因组的不同位点，T2便会出现彼此分离的植株（SripriyaRet.al2008）。通过适当的方法筛选便可获得无筛选标记的转基因植株。该方法消除筛选标记原理简单，而在具体

4、使用过程中却有不同的途径。1.3.1.1农杆菌介导的双T-DNA载体的共转化农杆菌介导的共转化方法已经成功的应用于筛选标记的剔除。分别将含筛选标记基因和目的基因的T-DNA通过农杆菌介导转化。包含筛选标记（SMG）和目的基因（GOI）的两个T-DNA既可以通过单一农杆菌株转化(DaleyMetal,1998)，也可以通过不同的农杆菌株转化(DepickerAetal,1985;McKnightTDetal,1987)。当然，两个T-DNA也可以整合到同一质粒载体实现共转化(KomariTetal,199

5、6;MatthewsPRetal,2001)，这些策略原理相同，但使用效果却千差万别。A:单菌法单菌法是指分别将含有目的基因和筛选标记的两个T-DNA构建到不同或同一载体上，导入同一农杆菌细胞并转化。根据所用载体数目的不同又有不同的策略。B:双载体－单菌株转化所用的农杆菌细胞含有2个载体，分别携带目的基因和筛选标记。Daley等利用此方法获得了无筛选标记的转基因油菜和烟草，其共转化效率都在50%以上，且大部分整合基因组的不同位点。Miller等(2002)利用此方法转化玉米，共转化效率高达90%。可见此

6、方法获得共转化的效率非常高。C:单载体（双T载体）－单菌株转化所用的农杆菌仅含有1个载体，其上包含有目的基因和筛选标记的不同T－DNA区。Mattew等利用此方法转化大麦，共转化效率高达66%，而其中25%的共转化植株后代出现了分离。C:混菌法混菌法是将含有目的基因和筛选标记的两个T-DNA构建到不同的载体上并导入到不同的农杆菌细胞，将这些农杆菌以一定的比例混合转化。这种转化方法的转化效率与菌液的配比有关。Park等(2004)人以不同的比例混合菌液并转化烟草，获得共转化植株的比率差异显著（0~54%）

7、.此外，混合菌株的特性也影响共转化的效率。陆美芳等(2005)将两个双元载体分别导入到EHA105-AGL-1、EHA105和EHA105-LBA4404中检测其共转化效率，结果发现前两组的共转化效率相当且明显高于第三组,推测可能的原因为EHA105和AGL-1的特性比较接近。研究表明，混菌法共转化效率较单菌法低，而其中又以双T载体的转化效果为最好。Miller等在玉米中比较了上述三种策略，发现共转化的效率分别为93.4%、98.2%和11.7%。Chen等(2005)在比较了混菌法与双T载体之后也得出

8、了相似的结论。然而，由于载体容量和酶切位点的限制，双T载体构建的难度很大，尤其是对大片段的目的基因。1.3.2基因枪介导的共转化方法利用基因枪进行共转化一直不被人们重视主要是人们认为基因枪介导的双元载体的共转化形成单一位点重组，造成目的基因和筛选标记连锁，后代得不到分离的植株，此外，基因枪轰击所形成的多拷贝问题也一直被人们所诟病。然而，利用基因枪进行共转化获得无筛选标记的转基因植物也有报道，Rooke等（2003）人利用该方法成功的获得了无