毕业论文--傅立叶变换离子回旋共振质谱分析与鉴定骨桥蛋白的多肽片段

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1、傅立叶变换离子回旋共振质谱分析与鉴定骨桥蛋白的多肽片段作者：蒋鑫萍程舸于雷王韶刘晓梅石磊【摘要】采用高效液相色谱(HPLC)SCX及C4色谱柱从人乳样品的乳清部分分离与纯化出骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)，在一定条件下将其用胰蛋白酶酶解后，利用高分辨傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICRMS)，结合微喷雾(Nanospray)技术，并借助Mascot软件数据库，获得了OPN相关多肽片段GDSVVYGLR和QNLLAPQTLPSK的质谱结构信息，分析了其裂解机理。研究表明，利用FTICRMS并结合HPLC等化学方法，可以高效、快速地分离与纯化人乳

2、样品中的OPN，借助Mascot软件数据库进行质谱分析，能够简洁、准确地鉴定相关多肽片段的结构信息，为OPN多肽片段不同翻译后修饰位点的确定与其生物学活性关系的研究提供了理论依据。【关键词】傅立叶变换离子回旋共振质谱，人乳，骨桥蛋白，多肽片段　1引12言　　随着现代生物技术的进步和生命科学的发展，多肽在生物体内的生理功能越来越受到重视，从天然产物中获得具有生物活性多肽类物质的方法也不断发展。骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是一种重要的多功能细胞外基质蛋白[1]，能在骨组织细胞、巨噬细胞、上皮细胞等多种细胞上表达[2]，在介导细胞的趋化、粘附、增殖和迁移，以

3、及骨组织的矿化与重建、免疫调节、信号传导等方面起着重要作用[3,4]。OPN是一种含精氨酸甘氨酸天冬氨酸(ArgGlyAsp,RGD)带负电荷的分泌型糖基化磷蛋白，其中包含16个氨基酸的信号肽，剪切后形成298个氨基酸的成熟蛋白，理论分子量约为33kDa。但由于高度的糖苷化及磷酸化，其分子量可以达到75kDa[5,6]。OPN含有多个与整合素结合的功能域，磷酸化后的OPN主要是以RGD结构与细胞表面的整合素受体(αγβ1，αγβ3)结合，SVVYGLR多肽位点可以结合α4β1，α4β7和α9β1，而未磷酸化的OPN则不依赖于RGD结构与某些CD44的变异体结

4、合，OPN和细胞表面受体相互作用能诱导信号传导，从而促进细胞的粘附和迁移[7～10]。在类风湿性关节炎(Rheumatoidarthritis,12RA)的病灶中会出现OPN的过度表达，它可能通过调节病灶部位细胞因子的分泌来调控RA病理过程中的炎症反应[11,12]，并且由于病因不同以及与药物的作用将导致OPN细微结构的复杂化，即会出现不同位点磷酸化或糖基化修饰的OPN多肽片段。因此，从OPN中典型的多肽片段入手，寻找RA中促炎症作用调控网络起关键作用的炎症因子靶点，对于深入认识RA的发病机理和研发新的RA药物具有重要的指导作用。　　傅立叶变换离子回旋共振质谱(FT

5、ICRMS)以高分辨率、高质量检测上限、高扫描速度、宽的动态范围和高质量准确度等技术优势[13～15]，越来越广泛地应用到生命科学，特别是在生物大分子的研究中。同时，以基质辅助激光解吸离子化技术和电喷雾离子化技术为代表的新型离子化方法也给FTICRMS拓展了更广泛的应用空间。迄今为止，蛋白质组学研究策略主要包括“BottomUp”和“TopDown”两种方法。“TopDown”是在蛋白质水平上鉴定和研究蛋白质，将完整的蛋白质分子离子有效地解离以获得蛋白质翻译和翻译后修饰及蛋白质非共价键复合物等结构信息[16]。而“BottomUp”是在多肽水平上鉴定和研究蛋

6、白质，对蛋白质纯度要求不需象二维电泳纯化的蛋白那么高，即可将蛋白质酶解成多肽后再进行分析，覆盖率可达100%，不仅增强了鉴定的可信度，也能更好地鉴定蛋白质翻译后的修饰位点[17,18]。　　本研究采用“BottomUp”并结合HPLC和配有Nanospray技术的高分辨FTICRMS等化学方法，快速分离并纯化了人乳中的OPN，借助Mascot软件数据库进行质谱分析，准确鉴定了OPN中有代表性的多肽片段GDSVVYGLR和QNLLAPQTLPSK的质谱裂解机理。　　212实验部分　　2.1仪器与试剂　　7.0T傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICRMS，T

7、hermo公司);超高速离心机(美国AlfaWassermann公司);高压液相色谱(美国Waters公司);SCX和C4色谱柱(Sigma公司)。　　尿素、DDT、TFA、碘化乙酰胺、胰蛋白酶、柠檬酸、柠檬酸铵和乙腈均购自Sigma公司;其它试剂均为国产分析纯。　　2.2骨桥蛋白的分离与纯化　　将人乳样品从-20℃冰箱中取出，室温放置2h后，量取若干样品于Eppendorf管中，以14000r/min离心45min，温度控制在不超过0℃。离心处理后，参看分离与纯化人乳的流程(图1)，将人乳样品进行初步的分离，得到乳脂部分、乳清部分和乳粒部分。OPN在中层的乳清