用环磷酰胺建立小鼠疫抑制动物模型

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1、1材料与方法1.1.2主要试剂环磷酰胺、RPMI1640培养液(含L-谷氨酰胺，)、Hanks液(HyClone)、MTT试剂、PBS缓冲溶液(pH值7.2～7.4，HyClone)、丝裂霉素C、SA缓冲液，绵羊红细胞，补体(豚鼠血清)、都氏试剂、LDH基质液、P815细胞(购于协和医科大学基础医学细胞中心)、YAC-1细胞、FITC-Anti-CD3、PE-Anti-CD4、PerCP-Anti-CD8荧光抗体)。1.2动物与分组Balb/C小鼠90只，雌性，6～8周龄，体重18～22g。颗粒饲料，室温(22±2)℃，湿度60%～80%。动物

2、在实验室条件下检疫1周后，实验分为3项处理进行，(1)处理一:测定动物体重、脾脏重量及系数;(2)处理二:测定NK细胞活性，细胞毒性T细胞活性;(3)处理三:测定血清半数溶血值。每项处理随机分为空白对照组、CTX-1组和CTX-2组。1.3实验方法和测定指标1.3.1剂量选择试验前经急性经口毒性试验确定CTX的LD50为240mg/kg，以1/4LD50做为本试验中CTX-1组的CTX剂量，即60mg/kg环磷酰胺，用蒸馏水配制，每日经口给予。CTX-2组每日经口给予蒸馏水，试验结束前一天经腹腔注射给予动物200mg/kg环磷酰胺［2，3］(用

3、蒸馏水配制)。另设空白对照组，蒸馏水代替受试物，每日经口给予。动物灌胃容积为0.3ml/10g，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃4周后测定各项免疫指标。1.3.2血液中T、B淋巴细胞分类计数［4］动物处死前眼眶内眦静脉取血，EDTA-K2抗凝，每只设定3支流式试管进行测定，每管加入50μl抗凝血。分别在3管中加入CD3/CD19，CD3/CD4/CD8.不同荧光素标记的单克隆小鼠抗体。每管加入2mlFACS红细胞裂解液，室温下避光保存20min。1200r/min离心5min，弃去上清液。每管再加入2mlPBS，1200r/min离心5min，

4、弃去上清液。加入0.5mlPBS混匀后上流式细胞仪进行检测。1.3.3细胞毒性T淋巴细胞活性试验［5，6］1.3.3.1脾细胞悬液的制备(效应细胞)无菌取脾，用4层纱布将脾磨碎，制成单细胞悬液。用Hank＇s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5ml灭菌水20s，裂解红细胞后再加入5mlHank’s液，混匀后1000r/min，10min离心，用1ml含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，调整细胞浓度为2×107个/ml;加0.5ml此细胞悬液于24孔培养板，留一孔不加脾细胞作为对照孔。1

5、.3.3.2制备刺激细胞1000r/min，10min离心处于对数生长期的P815细胞，用5mlDMEM培养液悬浮P815细胞于15ml离心管中，计数细胞。加入丝裂霉素C，相当于50μg/(2～5)×107个细胞。用锡纸包裹离心管以避光，在37℃水浴30min。用Hank’s液洗P815细胞3次，之后Hank’s液悬浮P815细胞，室温孵育15～20min后，离心1次。将P815悬浮于培养液中，计数细胞及活性，调整终浓度为1.2×106个/ml，加0.5ml此悬液于含有脾细胞悬液的24孔(包括对照孔)板中。37℃、5%CO2孵育5天。5天期间，

6、每隔一天换一次液。1.3.3.3制备效应细胞收集24孔培养板中的培养物，用Hank’s液洗1次，200r/min离心10min，收集细胞，重悬于RPMI1640培养液中，计数细胞及活性，调整细胞浓度2×107/ml。用完全培养液配制3个系列稀释的细胞悬液，每个稀释度100μl，做3个复孔。1.3.3.4制备靶细胞离心处于对数生长期的P815细胞，重悬于0.5mlHank’s液里，离心后重悬于RPMI1640完全培养液，调整细胞浓度为2×105个/ml。1.3.3.5CTL检测按效应细胞和靶细胞比为100∶1、50∶1、25∶1和12.5∶1(各

7、加100μl)在圆孔96孔培养板的培养孔中加入细胞，每孔液体总体积为200μl，设3个复孔。同时设靶细胞自然释放对照组(0.1ml靶细胞+0.1m培养液)和最大释放对照组(0.1ml靶细胞+0.1ml1%NP-40液)，效应细胞对照孔(0.1ml效应细胞+0.1ml培养液)，用96孔板水平转头500r/min离心5min，37℃、5%CO2培养4～6h。1000r/min离心5min，每孔吸取100μl上清，加于另一ELISA反应板的孔中，每孔中加入新鲜配制的底物液50μl，室温避光反应30min后，每孔加入50μl终止液，终止酶促反应。在酶联

8、检测仪492nm波长下读取各孔A值，CTL活性用杀伤率表示，按如下公式计算:CTL杀伤率(%)=(实验孔A值－靶细胞对照孔A值－效应细胞对照孔A值)/