螺旋藻多糖对hsv

《螺旋藻多糖对hsv》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、螺旋藻多糖对HSV【关键词】螺旋藻多糖；单纯疱疹病毒2型；原位杂交InhibitionofHSV-2glycoproteingBmRNAexpressionbypolysaccharidefromspirulinaplatensis(PSP)【Abstract】ObjectiveToexploretheeffectsandmechanismofPSPontheexpressionofHSV-2gBmRNAandtoprovideatheoreticalsupportfordevelopingne

2、RNARNAechanismofPSPagainstHSV-2maybeexplainedbytheconsiderableinhibitionofHSV-2gBgenetrscription.【Keyspirulinaplatensis;HSV-2;insituhybrization单纯疱疹病毒2型(herpessimplexvirus-2，HSV-2)在人群中感染较为普遍。孕妇生殖器感染可引起早产、流产、死胎、胎儿畸形以及智力低下等，并与子宫颈癌的发生密切相关［1，2］。近几年研究表明：钝顶

3、螺旋藻多糖（polysaccharidesfromSpirulinaplatensis，PSP）是钝顶螺旋藻中具有抗肿瘤、抗辐射、抗病毒和免疫调节作用的重要生物活性物质［3，4］。我们的前期实验结果表明，PSP有抗HSV-1的作用，但PSP抗HSV-2的实验研究未见报道。本文研究了PSP对HSV-2糖蛋白gBmRNA表达的抑制作用，结果报告如下。1材料与方法1.1药品与试剂配制螺旋藻多糖：参照文献［5，6］，采用改良的三氯乙酸去蛋白法提取螺旋藻多糖，纯度达92％以上。以双蒸水配成10mg/ml母

4、液，过滤除菌，分装，4℃保存，临用时以DMEM培养基稀释至所需浓度。细胞培养所用的DMEM干粉培养基为美国GIBCO公司产品，胰酶为Amersco公司产品，新生牛血清为杭州四季青公司产品；地高辛DNA检测试剂盒为Roche公司产品。1.2细胞株与病毒非洲绿猴肾细胞Vero细胞株为本室保存传代细胞系。于DMEM基础培养液中加入10%的新生牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，置5％CO2孵箱中37℃培养，3天传代1次。标准单纯疱疹病毒2型（HSV-2）333株于中国协和医科大学，V

5、ero细胞中传代，毒种保存于-70℃。1.3病毒滴度的测定以TCID50表示病毒毒力。取上述制备好的毒株，做10倍系列稀释，10-1至10-10。将各稀释度的毒株接种于Vero细胞，各6复孔，同时设阴性对照。37℃培养3天后，观察细胞病变，以出现细胞病变的最高稀释倍数的倒数作为TCID50。1.4原位杂交检测HSV-2糖蛋白gBmRNA的表达1.4.1探针的设计［7，8］根据GenBank中HSV-2全基因序列，设计对应于HSV-2糖蛋白gB基因序列的寡核苷酸探针序列为5’-ggcgactttg

6、tgtacatgtccccgttttacggctaccgg-3’，由上海生工公司合成，并于5’末端标记地高辛。1.4.2原位杂交［9］Vero细胞制成2×105/ml细胞悬液，接种在放有盖玻片（飞片）的培养板中，每孔加入1.8ml细胞，于5％CO2孵箱中37℃培养24～48h，弃生长液，加约100TCID50病毒液50μl，37℃吸附2h，吸出病毒液，加200μl不同浓度的PSP（100μg/ml、50μg/ml和10μg/ml），置5％CO2孵箱中37℃培养。24h后，取出细胞飞片经4%多聚甲

7、醛室温下固定20min，PBS漂洗2次，梯度乙醇脱水，蛋白酶K（1μg/ml）37℃消化30min，PBS漂洗2次，2×SSC洗2次，梯度乙醇脱水，空气干燥。每张飞片滴加50μl杂交液，预杂交2h；加入含探针的杂交液，置于密闭湿盒中，60℃过夜。杂交结束后，飞片在室温下依次经2×SSC、1×SSC、0.5×SSC漂洗各2次，于BufferⅠ洗液中10min，封闭液BufferⅡ中37℃孵育30min，加入抗体液37℃孵育30～60min，BufferⅠ洗液中10min，置BufferⅢ平衡10m

8、in，新鲜配制的显色液中避光孵育10min至数小时，终止反应。中性树胶封片。实验同时设3个阴性对照：(1)杂交前用RnaseA100μg/ml预处理细胞飞片，37℃，1h；(2)加未标记的探针进行反应；(3)正常的Vero细胞。阳性对照为未加PSP作用的HSV-2感染Vero细胞组。所有操作步骤与其他样本相同。结果判定：400×光镜下随机选择视野，观察200个细胞，计数杂交阳性的细胞数。阳性信号呈明亮的蓝紫色。1.5统计学方法核酸杂交结果以(x±s)表示，多组数据比较采用方差分析。表1PSP对H