雌黄(三硫化二砷)诱导hl

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1、雌黄(三硫化二砷)诱导HL【关键词】雌黄(三硫化二砷)；HL-60细胞；凋亡ExperimentalstudyonAs2S3(Orpiment)inducedapoptosisandnecrosisofhumanleukemiacelllineHL-60【Abstract】ObjectiveThecurrentstudyent)anacutemyloidleukemiacelllineHL-60.MethodsAcuteleukemiacelllineHL-60odel.HL-60celllineorphology

2、（includingmicroscopeandelectronmicroscope）andfloetry，thelattercandistinguishlivecell，apoptoticcellandnecroticcellthroughdoublestainingofAnnexinVandpropidiumiodide，ofeasuredonfloetry.Results2.5μmol/LofAs2S3couldinducemostofcellHL-60necrosisandasmallpartofcellap

3、optosisol/LAs2S3couldinduceapoptosisofhumanleukemiacelllineHL-60yloidleukemia.SinceitcaninduceapoptosisandnecrosisofHL-60cell.【Keyent)；HL-60cell；Apoptosis近年来对急性早幼粒细胞白血病（APL）的治疗方面的有关研究取得了重大进展，全反式维甲酸、三氧化二砷以及复方青黛片（主要成分为As4S4）对APL治疗均有较高完全缓解率，尤其后两者对APL治疗作用，主要是通过凋亡来

4、实现的［1］，因此诱发细胞凋亡已成为白血病治疗的新思路。本研究旨在进一步探索中药雌黄(又称黄砷，主要成分为As2S3)在体外对急性粒细胞性白血病细胞株HL-60的凋亡与坏死作用。1材料与方法1.1制剂As2S3（上海化学试剂公司）配成500μmol/L的储存液，过滤灭菌，4℃存放备用，临用前稀释成所需浓度。1.2细胞培养及细胞生长状况测定HL-60细胞（由江苏省血液研究所陈子兴教授惠赠）细胞以2×105/ml接种于RPMI1640培养液（10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素）中培养（37℃、

5、5%CO2）。加药后逐日取药物处理组与对照组细胞台盼蓝染色，光镜下计数活细胞总数连续6天，绘制生长曲线。1.2.1细胞形态观察及流式细胞仪测定培养细胞经3.0μmol/LAs2S3孵育一定时间后收集2×106细胞PBS洗2遍，1500r/min离心5min，弃上清，4℃2%戊二醛固定72h后，1%锇酸固定，梯度脱水，EPON-812包埋，超薄切片，铀和铅双重染色后透射电镜下观察。Annexin-V标记按Immuno-tech公司的说明书进行，1×106细胞用冰PBS洗2次，调整细胞浓度为1×106/ml，加5μlA

6、nnexinV（1：10稀释）和5μl碘化丙锭（PI）（250μg/ml）于490μl细胞悬液中，放置冰浴10min，用流式细胞仪(型号COULTEREPICS-XL)分析细胞凋亡情况。1.2.2杀伤力检测以MTT（四甲偶氮唑蓝）比色法检测As2S3对HL-60细胞的杀伤率。将生长良好的HL-60细胞以2×105/ml浓度加入96孔培养板，每孔100μl，加入不同浓度的As2S3，每一浓度设3个复孔，并设对照孔，置37℃、5%CO2条件下培养48h，加入MTT（5mg/ml）10μl/孔，继续孵育2h后，再加入DM

7、SO　100μl/孔，打匀后酶标仪（型号MicroReaderTM4Plus）570nm处读吸光度A值。并利用对数几率图解法测定药物的半数抑制浓度（IC50）。2结果2.1As2S3对HL-60细胞增壮的抑制作用经0.5μmol/LAs2S3处理的HL-60细胞生长受到轻微抑制，经1μmol/L、2μmol/LAs2S3处理的HL-60细胞生长受到明显抑制（见图1），As2S3处理48h，对HL-60细胞的IC50为1.23μmol/L。2.2形态学变化HL-60细胞经As2S3处理后，在透射电镜下可见典型的凋亡形

8、态学特征：细胞固缩，胞浆浓缩，染色质聚集，核碎裂，有的形成凋亡小体（见图２），亦可见到坏死细胞(见图3)。在倒置显微镜下可见凋亡细胞体积缩小，胞膜完整，细胞折光度明显加深，坏死细胞膜破裂，活细胞则细胞透亮、折光度好。图1As2S3对HL-60细胞的增殖抑制作用图2HL-60凋亡细胞超微结构(×8000)图3HL-60坏死细胞超微结构(×8000)2.3流式细