含survivin启动子重组的条件复制腺病毒联合

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1、含survivin启动子重组的条件复制腺病毒联合【摘要】观察含survivin启动子的条件复制腺病毒CRAd-survivin-RGD4C联合顺铂对卵巢癌细胞株HO-8910的抑制作用。方法不同浓度的条件复制腺病毒CRAd-survivin-RGD4C病毒、顺铂以及该病毒联合顺铂体外处理人卵巢癌HO-8910细胞，四甲基偶氮唑蓝比色法检测人卵巢癌HO-8910细胞的生长情况，流式细胞技术检测细胞凋亡。结果该腺病毒对肿瘤细胞生长具有明显的抑制效应，并有浓度依赖性，联合化疗可以取得更佳的抑制肿瘤细胞生长的效果。结论溶瘤病毒联合顺铂治疗卵巢

2、癌可能具有良好的前景。【关键词】卵巢癌survivin条件复制腺病毒基因治疗联合治疗Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofanovelconditionallyreplicatingadenovirusCRAd-survivin-RGDinbinationinedbyMTTassay;therateofapoptosis,byfloetry.ResultsTheCRAdkilledHO-8910cellsinadose-dependantmanner.Theinhibitoryrateen

3、tgroupthaninthegroupstreatedminedichloroplatinum,CDDP)对卵巢癌细胞株HO-8910的抑制作用。1材料和方法1.1实验材料卵巢癌细胞株HO-8910购于中国科学院上海细胞所，RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，小牛血清购自Hyclone公司，青霉素、链霉素、CDDP、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、RNA酶、dNTP等均购自美国Sigma公司，CRAd-survivin-RGD4C条件复制病毒质粒由美国阿拉巴马癌症基因研究中心的朱正卞教授惠赠。1.2实验方法1.2.1细胞培养HO

4、-8910细胞贴壁生长在含有10%新生胎牛血清、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI1640培养基中，细胞培养在5%CO2、37℃条件下进行。1.2.2CRAd的繁殖、纯化、滴度测定、转导效率测定参照文献［3］进行。1.2.3细胞实验将1.0×103个/孔的HO-8910细胞接种到96孔板中，分别进行如下实验。①CRAd实验：24h后分别转染不同浓度（0、0.01、0.1、1、10和100pfu/cell）的CRAd，2h后换新鲜的培养基。②CRAd＋CDDP实验：不同浓度CRAd转染HO-8910细胞实验同上，24h

5、后加入10mg/L的CDDP，孵育24h，换新鲜的培养基后继续培养。③CDDP实验：24h后加入10mg/LCDDP。④阴性对照实验：不加入CRAd、CDDP，仅以磷酸盐缓冲液（PBS）替代（PBS组）。以上实验各浓度组各设3个复孔。1.2.4细胞活力检测应用MTT法，分别于细胞培养的第2、4、6、8、10天取样进行检测。收集细胞后加入10g/LMTT20μl，同样条件继续培养4h，吸出培养液，加入200μl二甲基亚砜（DMSO）振荡溶解10min,放入全自动酶标仪，上机检测光密度(D)值。阴性对照调零，测定波长为490nm。细胞存活

6、率(%)＝实验组D值/阴性对照组D值×100%。1.2.5细胞凋亡检测各组细胞培养10天后，应用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。收集处理后的细胞，以1000r/min离心5min，弃上清液，PBS洗涤2遍,细胞重新悬浮于PBS中，调整细胞浓度为1.0×106个/L，70%乙醇固定，4℃过夜后加入1mlPI染液〔50mg/LPI，20mg/LRNA酶，10ml/L屈立通X2100，1g/L枸橼酸钠（pH值7.12～7.14）〕，4℃避光染色30min，上流式细胞仪检测细胞核DNA含量。多功能软件系统分析测定结果。1.3统计学处理采用SPSS

7、10.0软件进行统计分析，各组间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1不同浓度CRAd对肿瘤细胞的抑制作用经MTT检测，各时点不同浓度的CRAd对于卵巢癌HO-8910细胞有程度不同的抑制，以第8、10天较为明显；当CRAd浓度达到1pfu/cell以上时对卵巢癌HO-8910细胞才有明显的抑制效应，即CRAd对卵巢癌HO-8910细胞的抑制作用具有剂量依赖性。见图1。图1不同浓度CRAd处理后HO-8910细胞存活情况2.2CRAd＋CDDP对肿瘤细胞的抑制作用不同浓度CR

8、Ad＋CDDP及单独CRAd、CDDP实验结果显示，各浓度CRAd＋CDDP对卵巢癌HO-8910细胞的抑制率较CRAd、CDDP的单独作用均有明显提高，其中以10pfu/cell的CRAd联合CDDP处理效果最佳；10