乳酸乳球菌中高耐酸srna的筛选及提高nisin产量的研究

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1、乳酸乳球菌中高耐酸sRNA的筛选及提高nisin产量的研究Screenofhighacid-tolerantsRNAsinLactococcuslactisandinvestigationoftheireffectonimprovingnisinyield学科专业：制药工程程作者姓名：赵秀丽丽指导教师：李艳妮副研究员员企业教师：刘鼎阔高级工程师天津大学化工学院二零一七年五月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已

2、经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作

3、者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日摘要摘要乳酸乳球菌在工业发酵过程中产生的乳酸会抑制其自身的生长从而影响nisin产量。细菌非编码sRNA在应对多种环境胁迫方面起着关键的调节作用。因此乳酸乳球菌中耐酸相关的sRNA的研究对提高nisin产量具有重要意义。本研究在前期筛选得到高耐酸的s004、s144和c263过表达菌株的蛋白组学分析的基础上，结合多个靶标预测软件来预测s004，s144和c263的靶基因，然后用eGFP融合蛋白实验对靶标进行验证。结果表明，yjdC为s144的抑制靶标，add为

4、c263的激活靶标，groES为c263的抑制靶标。并通过预测的sRNA与其靶标基因结合位置初步分析了它们之间相互作用方式。将前期通过RNA-seq和qRT-PCR技术筛选鉴定获得的sRNA中5个sRNA构建过表达菌株，表型实验显示s013、s087和s224过表达菌株的在酸胁迫下存活率以及nisin效价较高。将这3个sRNA和前期筛选出的高耐酸sRNA（s004、s015、s144、c263和s042）进行串联共表达，构建的3株共表达菌株的耐酸能力显著提升，s004-s015-s144-c263串联共表达菌

5、株在pH4.0应激3h后其存活率时相对对照菌株提高了83.15倍。然后将耐酸性显著的s004-s015-s144-c263串联基因及s004、s144、c263单个sRNA基因分别导入到另一株产nisin乳酸菌菌株xl1中，相应发酵结果显示过表达sRNA的菌株的nisin效价普遍高于对照菌株，新构建的菌株最高效价达到了6959.70IU/ml，相对原始菌株提高了10%左右。本研究利用sRNA来提高乳酸菌的耐酸性，填补了乳酸菌中sRNA研究的空白，并对乳酸乳球菌在酸胁迫下sRNA作用的分子机制有了一定的认识。揭

6、示了sRNA调控的复杂性和层次性，也为研究乳酸乳球菌在酸性胁迫下的生存机制提供了重要线索。关键词：乳酸乳球菌，sRNA，耐酸，nisinIABSTRACTABSTRACTNisinissecretedbycertainLactococcuslactis.InL.lactis,carbohydratesaremainlyconvertedintolacticacid.Theaccumulationoflacticacidinfluencesstraingrowthandnisinproduction.Bacte

7、riasmallnon-codingRNA(sRNA),asanimportantposttranscriptionregulator,playsakeyroleinresponsetomanystressconditions.Therefore,theresearchofsRNArelatedtoacidresistanceinL.lactisisveryimportanttoincreasenisinproduction.Previousexperimentshaveidentifiedseveralac

8、idresistancerelatedsRNAsincludings004,s144andc263inL.lactisF44andproteomicanalysisofL.lactisF44underacidstresshasalsobeenperformed.Targetgenesofs004,s144andc263werepredictedbyproteomiccombinedwithcompu