卷柏活性部位对胰岛素抵抗大鼠肝脏胰岛素受体mrna表达的影响

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1、卷柏活性部位对胰岛素抵抗大鼠肝脏胰岛素受体mRNA表达的影响【关键词】卷柏；肝脏胰岛素受体；mRNA卷柏为卷柏科植物卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring及垫状卷柏S.pulvinata(Hook.etGrev.)Maxim.的全草。具有活血通经之功效，用于经闭痛经，症瘕痞块，跌扑损伤，本实验前期工作已经筛选了活性部位，证实其50%乙醇洗脱组分为活性部位［1］。本研究在此基础上，深入探讨了卷柏对胰岛素抵抗大鼠肝脏胰岛素受体mRNA表达的影响，为其机制的进一步

2、研究提供实验依据。1材料和方法1.1实验动物清洁级雄性SD大鼠，雄性，体重180～220g，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物生产许可证编号：SCXR(宁)2005-001，自由摄食和饮水，室温保持在(20±2)℃，湿度(50±1)%。适应性喂养1周。1.2试剂与材料卷柏购自毫州药材市场，经宁夏药检所鉴定为卷柏。盐酸二甲双胍片，批号20070915，规格0.5g/片，杭州中美华东制药有限公司；AB-8型大孔吸附树脂，购自南开大学化工厂；rTaq酶，美国Promega公司；MgCl2、10×buf

3、er、PCRMarker、Trizol试剂，美国Invitrogen公司。Primer5.0软件设计，上游引物序列为5'-CCGGCGTGGCCTGCCCTCTGAT-3'，下游引物序列为5'-ATGATCACAGACTACCTGCT-3'，引物由上海博亚生物有限公司合成。β-actin(540bp)5'-GTCACCCACACTGTGCCCATC3'，5'ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3'。1.3样品制备卷柏2kg，粉碎，水煎煮3次，每次1h，滤过，合并提取液，浓缩得浓膏(1m

4、g/mL)。所得浓膏经大孔树脂柱层析(树脂与生药质量比为1∶1)，分别用水、50%乙醇洗脱，得各洗脱部位，弃去水洗脱部分，将50%乙醇洗脱液浓缩，备用。1.4实验方法1.4.1模型制备及分组大鼠40只，体重180～220g，普通饲料适应性饲养1周，随机分为5组，分别为正常对照组、模型组、阳性对照组、卷柏水提液组、大孔树脂50%乙醇洗脱组分(简称50%组分)，每组动物8只。除正常对照组外，其余组大鼠1周后改喂高热量饲料制备动物模型(饲料组成：猪油15%，花生10%，蛋黄粉及糖、盐等，其余为基础饲料

5、)10周［2］，自10周始，正常对照组和模型组灌胃(ig)给予等体积生理盐水，阳性对照组给予盐酸二甲双胍0.33g/(kg·d)，ig；治疗组分别给予卷柏水提液0.08g/(kg·d)，50%组分0.028g/(kg·d)，ig，共给药2周(以临床剂量为依据，由人鼠换算公式及提取分离转化率换算而得)。末次给药2h后，将大鼠处死，取肝组织，迅速置-70℃冰箱冻存，备用。1.4.2总RNA提取取冻存的肝组织约0.1g，采用Trizol试剂提取组织的总RNA，操作按说明进行。计算所提RNA量，使A26

6、0/A280比值保持在1.8以上。1.4.4RT-PCR检测肝脏胰岛素受体mRNAPCR扩增管中加总量25μL下述混合液。20μL反应体系：模板cDNA1.0μL；5×缓冲液5.0μL；10mmol/LdNTP2.0μL；rTaq酶1.0μL；上、下游引物各0.5μL；加入双蒸水至20μL。反应条件：94℃，30s；55℃，60s；68℃，60s，30个循环后，72℃延伸5min。1.4.5RT-PCR产物分析取10μLPCR产物，1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察并记录拍照。采用Kod

7、ak2.0软件对PCR产物琼脂糖凝胶电泳进行扫描分析及数据处理。1.5统计学方法用SPSS12.0统计软件，结果以(±s)表示，两组样本间均数比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。2结果各组β-actin扩增片段均为540bp；胰岛素受体基因mRNA为370bp片段，但各组电泳条带亮度有明显差异。与模型组比较，三个给药组均能增加胰岛素受体基因mRNA的表达(P＜0.05)，见表1、图1。表1INSR/β-actinmRNART-PCR电泳产物灰度描比值的变化3讨论卷柏水提液及其

8、活性部位具有一定的降血糖及改善胰岛素抵抗的作用［3-5］，胰岛素抵抗又与胰岛素受体活性密切相关，胰岛素的作用是通过与靶细胞膜(脂肪细胞、肝细胞和肌细胞)表面的胰岛素受体结合后而实施的。典型的胰岛素作用部位是肌肉、脂肪和肝脏，胰岛素对靶细胞发挥生理作用，首先必须与位于胞浆膜上的受体结合。胰岛素与受体结合后，因受体构象发生改变而导致β亚单位自身磷酸化，由此该酶活性被激活，活化的胰岛素受体将通过胰岛素受体低物的磷酸化与含有SH2区段蛋白质连接触发蛋白激酶、磷酸酶级联反应，实施胰岛素生物效应［6］，胰岛