blcap和nnat在小鼠发育中的表达及其调控机制研究

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1、硕士学位论文Blcap和Nnat在小鼠发育中的表达及其调控机制研究EXPRESSIONANDREGULATIONMECHANISMANALYSISOFBLCAPANDNNATDURINGMOUSEDEVELOPMENT郑涛哈尔滨工业大学2015年06月国内图书分类号：Q71学校代码：10213国际图书分类号：577.21密级：公开理学硕士学位论文Blcap和Nnat在小鼠发育中的表达及其调控机制研究硕士研究生：郑涛导师：吴琼教授申请学位：理学硕士学科：生物学所在单位：生命科学与技术学院答辩日期：2015年06月授予学位单位：哈尔滨工业大学C

2、lassifiedIndex:Q71U.D.C:577.21DissertationfortheMasterDegreeinScienceEXPRESSIONANDREGULATIONMECHANISMANALYSISOFBLCAPANDNNATDURINGMOUSEDEVELOPMENTCandidate:TaoZhengSupervisor:Prof.QiongWuAcademicDegreeAppliedfor:MasterofScienceSpecialty:BiologyAffiliation:SchoolofLifeScienc

3、e&TechnologyDateofDefence:June,2015Degree-Conferring-Institution:HarbinInstituteofTechnology哈尔滨工业大学理学硕士论文摘要印记基因BladderCancer-AssociatedProtein(Blcap)和Neuronatin(Nnat)位于小鼠2号染色体末端。Blcap为父本印记母本表达，Nnat为母本印记父本表达，且位于基因Blcap长为8.5kb的内含子中。之前的研究发现，Blcap和Nnat在转录本水平可能存在相互作用，但未详细阐明。此外，

4、相关研究推测，位于NNAT第一外显子上游1.5kb的三个潜在CTCF结合位点的低甲基化与NNAT及BLCAP_V2a在肾母细胞瘤组织中的高表达水平有一定关系。因此，本文以Blcap和Nnat为研究对象，分析了二者在小鼠胚胎发育中的表达模式，转录水平的相互影响以及CTCF在其表达调控中的作用。首先，我们利用原位杂交及定量PCR技术系统的分析了Blcap及Nnat在小鼠发育过程中的表达模式。定量结果显示，Blcap和Nnat的表达水平从E9.5至E13天左右一直呈现上升趋势，并分别在E12.5和E13.5天达到最高。此后随着发育阶段的进行，到E

5、18.5天过程中两基因表达水平都出现了不同程度的下降。通过分析定量PCR及RNA-seq数据发现，与其他组织相比，Blcap和Nnat在E14.5,E15.5天及成体小鼠中脑组织中高表达。原位杂交结果也显示，Blcap和Nnat在E9.5,E11.5和E15.5天胚胎主要表达于前脑泡、中脑泡、菱脑泡及间脑等中枢神经系统中，并且在这些神经发育的关键时期中，Nnat的表达较Blcap更广泛、更丰富，特别是Nnat在体节、前肢、后肢及垂体中都有表达信号。脑不同发育时期的定量结果显示，从E15.5至P30天，Blcap在脑组织中的表达逐渐升高，但N

6、nat表达明显下降。之后，我们通过脑切片原位杂交实验进一步研究了Blcap和Nnat在出生后随小鼠脑发育过程的表达变化情况。结果显示，Blcap和Nnat都普遍表达于新出生小鼠脑组织(P0)。而从P10到P30天过程中，Blcap的信号特异表达于小脑、海马。随后，Blcap的表达水平出现了下降，但在成体小脑的内颗粒细胞层、嗅球及海马中都有明显的信号。然而，不同于Blcap的表达模式，Nnat的转录本仍然存在于P10天小鼠整个脑组织中，但从P10至成体发育过程中，Nnat表达出现了明显下调，并只在小脑和嗅球中少量表达。这些结果提示Blcap和

7、Nnat在神经系统中发育中起到重要的作用，特别是与小脑、嗅球及海马的发育成熟及功能有密切关系。其次，为了初步研究Blcap和Nnat的相互调控，我们设计了靶向这对印记基因的siRNA，并构建了Blcap和Nnat的过表达载体，转染N2a或NIH-3T3细胞系。结果显示，干扰或过表达Nnat转录本后，Blcap的表达水平并未发生I哈尔滨工业大学理学硕士论文变化，同样，干扰或过表达Blcap后，Nnat的表达水平也未发生变化。这些结果表明说明在转录水平Blcap和Nnat不存在相互调控。最后，我们构建了靶向敲除Nnat第一外显子上游的三个潜在C

8、TCF结合位点（CTCFBS#1~CTCFBS#3）的CRISPR/Cas9系统，以此来研究此区域是否作为一个可以同时调节Blcap和Nnat的印记调节区存在。研究结果显示，在敲