大豆豆粕制备血管活性小肽及其纯化、鉴定与活性研究.pdf

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1、上海海洋大学硕士学位论文学校代码：10264研究生学号：M150208401上海海洋大学硕士学位论文大豆豆粕制备血管活性小肽及其纯题目：化、鉴定与活性研究Isolation,Purification,and英文题目：IdentificationofVasoactiveSmallPeptidesfromSoybeanMeal专业：食品科学与工程研究方向：功能食品姓名：崔云云指导教师：汪立平、王正全二O一八年五月I上海海洋大学硕士学位论文大豆豆粕制备血管活性小肽及其纯化、鉴定与活性研究摘要食源性的具有特定功能的食品因其纯天然来源的属性在补充基础营养素的同时且还能有益身体健康，提

2、高抵抗力，降低血压或舒张血管，因而功能性食品备受现代人们的关注。大豆作为易获得的优质蛋白质，其蛋白制品常被用于制造营养保健产品并很受欢迎，市场前景广阔，例如婴儿配方乳大量使用了完全水解的大豆分解氨基酸。而大豆豆粕是大豆压榨油后的副产物，富含大豆蛋白而油脂较少，在我国资源丰富价格低廉易获得。虽然其营养价值较高，但存在利用率低下的现状。因此利用成本低廉的天然大豆压榨副产物二浸豆粕制备大豆血管活性小肽，不但获得高附加值大豆水解蛋白产品，还完成了大豆加工副产物二次再利用，获得了无毒副作用、安全性高和生物功能的大豆活性肽，且规避了功能食品开发中漫长的毒理学实验。大豆豆粕经过微生物作用

3、降解为更彻底的大豆豆粕发酵产物，所含蛋白质分子量更小，营养更容易吸收，预计还可以投用于水产品的高级饲料，市场前景极佳。因此本课题主要以大豆豆粕为原料，对豆粕蛋白进行特定菌种的发酵和特别的酶水解制备，对发酵物的水提物精制纯化、对小分子蛋白和肽混合物分离出来的纯品肽类进行序列鉴定及其血管活性筛选，旨在获得大豆血管活性小肽，对其血管活性效果进行探讨，为制备大豆蛋白血管活性小肽的工业化生产提供理论基础和技术基础。本文首先从陕西民间豆豉中筛选产蛋白酶的菌株，通过以透明圈与菌落直径的比值初筛出9株产蛋白酶的菌株，而其中以Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7比值较大，这6株菌再经过复筛，以

4、蛋白酶酶活力为指标，Y4的蛋白酶活力最高。通过菌落形态和分子生物16SrRNA鉴定出Y4的基因序列，得到的基因序列提交到GenBank数据库，获得登录号为：KY419575.1，经GenBank数据比对和菌株系统发育树，Y4与蜡样芽孢杆菌在同一支，相似度达到了98%，可以判断出优势菌株Y4属于蜡样芽孢杆菌属。大豆豆粕采用微生物发酵法分解豆粕蛋白，用本文筛选出的产蛋白酶活力最高的Y4菌株发酵大豆豆粕，发酵后水提取得到豆粕发酵粗提液。粗提液通过2次II上海海洋大学硕士学位论文8层纱布过滤、静止沉降、活性炭和DA201-C大孔树脂吸附、400目滤袋、板式过滤机过滤得到更澄清的发酵

5、液，用截留分子量为10000、1000、500Da的超滤膜分级过滤得到3个多肽混合液组分F1（10000Da）、F2（1000Da）、F3（500Da），浓缩并干燥。血管活性的实验结果显示，F1和F3组分都具有血管舒张活性，EC50值分别为5.22mmol/L、2.37mmol/L，而F2则无血管舒张活性，相反具有收缩血管的效果，同样在高低剂量实验中所呈现出相同的结果，F1和F3组分可以看出不论剂量高低，F1和F3都表现出了较强的血管舒张活性。从F3分离纯化出的6个小肽的血管活性测定结果显示，GPANV、PANV2个小肽表现出了较高的血管活性，EC50值分别为0.42mmo

6、l/L、0.72mmol/L，而其中小肽则显示CQ无血管舒张活性而相反表现出了血管收缩的效果。另外，判断3个组分ACE抑制率的高低，F1、F2、F3组分ACE抑制率分别为28.78%、38.98%、40.40%，选取活性最高F3为分离纯化目标组分。F3组分经过凝胶过滤色谱分离并收集出P1、P2、P3、P4这4个主峰，4个峰又经过2遍HPLC色谱分离纯化，共分离出6个单峰物质，利用PPSQ-21和MALDI-TOF-TOF/MS双重定性对6个目标肽段的氨基酸序列结构进行鉴定，鉴定出这些小肽分别为GPANV、PANV、CQ、QC、CGAAP、HAGR。可以看出大部分都是2~5个

7、氨基酸序列的寡肽。ACE抑制活性的测定结果显示，这6个小肽都表现不同的ACE抑制率，其中3个小肽QC、CGAAP、CQ的ACE抑制率分别为80.66%、79.77%、76.17%，其他的小肽均表现出较低的ACE抑制率，最低的为小肽YN，ACE抑制率只有12.19%，这一点与血管活性数据不完全相关。从血管活性和ACE抑制率的数据来看，ACE抑制率高的小肽并不一定表现出较强的血管活性，血管活性的强弱与ACE抑制无关，两者并没有直接的相关性，或许这存在其他潜在作用机理，其结构-功能等机理研究还需要后续进一步实验的研究去证