《基因操作的工具酶》PPT课件

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1、基因工程华中师范大学生命科学学院陈明清《基因工程》第一章导论第二章基因操作的工具酶第三章基因克隆的载体第四章基因克隆的策略第五章克隆基因的表达第六章基因工程的基本技术第二章基因操作的工具酶第一节限制性核酸内切酶及其应用第二节DNA连接酶及其应用第三节DNA聚合酶及其应用第四节修饰性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegenet

2、icengineer.1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类合命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节限制性核酸内切酶及其应用50年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象(B)(K)大肠杆菌B大肠杆菌K114×10—410—4E.O.P成斑率efficiencyofplating限制—修饰的酶学假说(B)(B)酶切位点不被修饰噬菌体DNA被切割酶切位点被修饰Methylation基因组DNA不被切割1968年，Meselson和Yuan从大肠杆菌K和B中发现

3、了I型限制性核酸内切酶；1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶HindII，使得DNA分子的体外精确切割成为可能。1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类合命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的概念限制性核酸内切酶（Restrictionendonucleases）：是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。已经从近300中

4、微生物中分离出了500余种限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶的分类1.限制修饰活性2.内切酶的蛋白质结构3.限制辅助因子4.切割位点5.特异性切割6.基因克隆中I型单一多功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点1000bp不是无用II型限制酶和修饰酶分开单一成分Mg2+特异性位点及其附近是非常有用III型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点3‘端24-26bp处是有用限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源

5、的菌种名称，如大肠杆菌Escherichiacoli表示为Eco,流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae表示为Hin；2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如EcoRI、HindIII。1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类合命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶的3大特点1、识别位点的特异性每种酶都有其特定的DNA识

6、别位点，通常是由4、5、6或7个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。2、识别序列的对称性靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’产生平齐末端切割位点切开双链DNA。形成粘性末端（sticky

7、end）或平齐末端（bluntend）。如：识别位点处。与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端cohesiveends因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。平末端Bluntend因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。同裂酶isoschizomers能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。同尾酶isocaudamers识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的

8、一类限制性核酸内切酶。注意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：①5’端凸出（如EcoRI切点）GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3