《基因操作工具酶》PPT课件

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1、第一节基因操作工具酶第二节核酸的分离纯化第三节聚合酶链式反应（PCR）第四节凝胶电泳系统第五节核酸的分子杂交第六节载体系统第十章分子生物学实验技术第一节基因操作工具酶酶酶限制性核酸内切酶逆转录酶DNA连接酶末端转移酶大肠杆菌DNA聚合酶ⅠS1核酸酶Klenow酶DNA酶ⅠTaqDNA聚合酶RNA酶A多核苷酸激酶碱性磷酸酶基因工程操作中最常用的工具酶主要内容1限制性核酸内切酶2DNA连接酶3DNA聚合酶4修饰酶5小结酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切割DNA分子DNA连接酶连接两个DNA分子或片段大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ或Klenow酶1制作D

2、NA探针；2合成cDNA第二链；3填补双链DNA3`凹端；4DNA测序。TaqDNA聚合酶聚合酶链式反应（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端标记探针末端转移酶使3`-末端加同聚物尾S1核酸酶降解单链DNA或RNADNA酶Ⅰ在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解RNA逆转录酶补平反应，合成cDNA或制探针碱性磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARYHome1限制性核酸内切酶1.1引言1.2命名1.3分类1.4活性及影响因素Home核酸酶（Nuclease）：通过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。（

3、1）按作用对象分:DNAase&RNAase（2）按断裂核酸分子不同方式分：Endonuclease&Exonuclease1.1引言—两个概念限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease):指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统（Restriction-ModificationSystem)。Back1.2命名命名原则：第一个字母（大写,斜体）：该酶来源的微生物属名；第二、三个字母（小写、斜体）：微生物种名；若该微生物有不同的变种和

4、品系，再加上该变种和品系的第一个字母（大写）若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。例如：EcoRⅠ从大肠杆菌R株分离的第一种限制酶命名为EcoRⅠ，其中E代表属名（Escherichia)，co代表种名（coli)，R代表株系（RY13），Ⅰ代表该菌株中首次分离到。Back1.3分类1.3.1Ⅰ型限制性内切酶1.3.2Ⅱ型限制性内切酶1.3.3Ⅲ型限制性内切酶Back1.3.1Ⅰ型限制性内切酶功能：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，无固定切割位点；应用：不常用。

5、Back1.3.2Ⅲ型限制性内切酶功能：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，切割位点在距识别位点3`端24-26bp处。应用：数量很少，无实际作用。Back1.3.3Ⅱ型限制性内切酶功能：识别并特异切割DNA分子。即通常所指DNA限制性核酸内切酶；反应特点：仅需Mg2+作催化反应辅助因子，能识别双链DNA特殊序列，并可特异切割DNA，产生特异片段；应用：种类繁多，分子克隆中最为常用(1)基本特性识别长度为4-8个核苷酸的特异序列；许多识别序列具回文结构，如HindⅢ的识别序列：5`AAGCTT3`3`TTCGAA5切割

6、产生末端有粘端(cohesive/stickyend)如BamHI(G↓GATCC)和平端(bluntend)如SmaI(CCC↓GGG)EnzymeRecognitionseuqenceEnzymeRecognitionseuqenceBamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCG

7、CXhoIC↓TCGAGRecognitionSequencesandCuttingsitesofRestrictionEndonucleases(2)同功异源酶(isoschizomer)来源不同但能识别和切割同一位点的酶。又称同裂酶。如：BamHI(G↓GATCC)和BstI(G↓GATCC)注：有一些同功异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感度有所不同。(3)同尾酶（isocaudamer)识别序列不同，但产生相同粘性末端的限制酶。如：BamHI:G↓GATCCBglII:A↓GATCTBack1.4活性及影响因素(1)活性大小：酶对DNA水解程度

8、不同。(2)酶的活性单位：指1μg纯的指定DNA在指定缓冲液中，于37℃（最适温