第六章色层分离法

《第六章色层分离法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、Pleasebequiet,上课了！！第六章色层分离法化学分离法色层法的发现色谱法的诞生M.C.Tswett进行了分离植物叶中各种色素的实验。创立了色谱法。碳酸钙（固定相）色素混合液石油醚(流动相）Tsweet发现色层分离现象色谱柱色带植物色素分离图示色层分离定义色层分离过程中，一种流动相（石油醚）带着被分离的物质（叶绿素）流经固定相（碳酸钙），使欲分离物质中的各种组分分离。色层分离（色谱分离，层析分离，分析检测中又称色谱分析）利用混合物中各组分物理化学性质的差异使各组分在两相中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。吸

2、附力分子形状及大小分子亲和力分配系数色层分离的基本原理性质固定相流动相固定不动的物质称作固定相(固体或液体)推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体色层系统组成色层分离的特点分离效率高：是所有分离纯化技术中最高的；尤其适合极复杂混合物的分离。应用范围广：从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质、热稳定到热不稳定化合物，尤其对生物大分子样品的分离是其它方法无法代替的。色层分离分类根据流动相性质不同分类气相色谱（GC）仅限于能够气化的物质，且主要用于分析。气相色谱包括气液色谱GLC、气固色谱GSC。液

3、相色谱（LPC）可分为液液色谱LLC、液固色谱LSC。进样阀流动相检测器高压泵脱气装置安捷伦推出《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》层析分离分类按固定相所处状态不同分类：柱层析：纸层析：薄层层析：层析分离分类按溶质分子与固定相相互作用机理吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力）分配层析（溶质在两液相间分配系数不同）离子交换层析凝胶过滤（分子大小与形状）纸层析小实验当滤纸接触到溶剂时，溶液将上升。滤纸上的小圆点是4种不同的氨基酸的混合物。看看接下来会发生什么事情…可以看出1号氨基酸上升的最高，在滤纸上跑得最快。而4号氨基酸与滤纸的结合最紧，

4、因此跑的速度比其他的氨基酸慢。1234这就是纸层析法。纸层析法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。1234甘氨酸半胱氨酸组氨酸缬氨酸纸层析小实验动画演示纸层析原理纸上层析是利用混和物中各组分在固定相和流动相中的溶解度不同而达到分离目的。在纸色谱分离过程中，由于滤纸纤维素的毛细管现象，使得溶剂在纸上渗透展开。毛细管现象将毛细管插入液面后，会发生液面沿毛细管上升(或下降)的现象，称为毛细管现象。(a)液体在毛细管中上升h(b)液体在毛细管中下降h纸层析操作纸层析法操作步骤样品处理点样定性平衡展层显色1.样品处理试样的溶解固体样一般用乙醇、丙酮

5、、氯仿等，尽量避免用水。液体样直接点样。2.点样a先用铅笔在距纸条一端2～3cm处划一条直线（起始线）并在线上隔一定距离划一“x”号表示点样位置；见下示意图：b.点样工具：定性分析可用普通毛细管，定量分析需用微量注射器；每次点样的位置应完全重合，否则会出现斑点畸形现象。c.点样方法：用点样工具吸取试液轻轻与“x”号接触，使点样的斑点直径为0.2～0.5cm,每次点样后，以冷风吹干；d.干后，将纸的两边用线缝好，以圆筒形式置于层析缸中展开。3.平衡展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为“平衡”。用于减少边缘效应和提

6、高分辨率。平衡一般在密闭的层析缸内进行。4.展层平衡结束后，将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中，展开开始：溶剂液面距原线距离约1cm，展开结束：当溶剂前沿到达滤纸另一端0.5-1cm处时，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标记，晾干或用冷风吹干。按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上行、下行和环行三种方式。（1）上行法将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中优点：操作简单，重现性好，是最常用的展开方法，缺点：展开时间较长。(2)下行法：在层析缸上部有一盛展开剂的液槽，将滤纸点样的一端朝上浸入槽中优点：展开速度快缺点：重现性较差，斑点易扩散。玻片玻璃棒原点玻皿剪

7、成锯齿状，便于溶剂滴下5.显色a有色物：直接观察各个色斑b无色物：物理法显色：用紫外灯照化学法显色：利用各种物质的特性反应，喷洒适当的显色剂。氨基酸分离实验视频演示红蓝墨水层析化学分离法计算Rf测=？abRf＝原点到溶剂前沿的距离原点到层析斑点中心的距离比移值Rf6.定性分析aa+bb各种化合物的值Rf随结构、滤纸的种类、展开剂、温度等的不同而异。但上述条件固定的情况下，对于某一化合物来说，Rf值是一个常数。故Rf值可作为定性鉴定的依据。7.定量分析对被分离的物质进行定量的方法很多，常用的有：(1)剪洗比色法：(2)直接比色法：(3)面积测量

8、法：实验注意事项（1）不要倾斜层析瓶，不要让层析液沾到容器内壁上；（2）滤纸插入层析瓶中要挺直；（3）不能使点好的混合物碰到层析液（4）点层析试样时，直径0.3-0