原核表达及抗体制备

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1、猪精子黏附蛋白AWN、PSP、MCP的原核表达及抗体制备实验材料15日龄杜洛克猪睾丸组织。实验菌株及载体大肠杆菌E.coliDH5a克隆菌株大肠杆菌E.coliBL21表达菌株pET-28a质粒图谱如下：OraIM(5W)Bpu11021(80)Xbol(1M)N0<1(166)Eagkite)Hind111(173)Salkm)Sacl(iw)EcoR1(192)BamHNhe1(231)Nd«l(2M)NCOl(2M)XbaIp3&)CiaM117)Nrul(40«)Smak<»0>Pvu1(4426)Sgfk442S)Eco571(3772)A/wNBsaS1(3397)BspLU

2、IIUS血“、Sap008)厂、Bst1107l(2«»)/Tth1111(2969)BstE11(1304)Aoal(l334>Mlul(1123)Bd1(1137)ECORV(1573)Hpa1(1629)Sphkfi6B>PE陵)PshAI(i9«>卜Bgl1(2187)、Fsp1(2205)P»p5110230)主要试剂主要试剂DNA提取试剂盒质粒小提试剂盒胶冋收纯化试剂盒OneStepCloning试剂盒TransStartFastPfuDNAPolymeraseEcoRI和HindHI限制性内切酸酶EB核酸染料DNAmarker（DM2000）5xTAEIPTG卡那霍素（Am

3、p）中分子量预染蛋白Marker乙醇（分析纯）醋酸（分析纯）考马斯亮蓝G-250丙烯酰胺（Bis・Acr）过硫酸镀（AP）SDS来源生工公司Omega公司Omega公司Vazyme公司北京全式金公司NEB公司BioTeke公司东盛公司本实验室保存Merck公司Tiangen公司鼎国昌盛公司杨凌三立化玻杨凌三立化玻Amresco公司Amresco公司Amresco公司本实验室保存灭菌水本实验室自制一、基因的克隆1•提取睾丸组织DNA(DNA抽提试剂盒)(1)取约20嗎杜洛克猪睾丸组织，用液氮研磨成粉末状，加到1.5ml离心管中，再加入180卩1BufferACL、20u1Proteinas

4、eK溶液，震荡混匀。在56°C水浴lh；(2)加入200ulBufferCL,并进行充分颠倒混匀;加入200U1的无水乙醇，并进行充分颠倒混匀；(3)将试剂盒中的吸附柱放入收集管中，用移液器将进行消化了的产物全部加入吸附柱中，静置3min,再用lOOOOrpm室温离心lmin,倒掉收集管中的废液；(4)将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加500P1CW1Solution,室温,lOOOOrpm离心30S,倒掉收集管中废液；(5)将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加500P1CW2Solution,lOOOOrpm离心30S,倒掉收集管中废液；(6)将吸附柱放回收集管中，在12000rpm,室

5、温离心2min,将残留的CW2Solution离去；(7)取岀吸附柱，放入到一个新的1.5ml离心管中，加入60U1CEBuffer静置4min,12000rpm,室温离心2min,收集DNA溶液。最后将提取的DNA放入-20°C保存。2.PCR扩增Awn部分外显子基因根据Genbank数据库得知，猪的Awn基因全长465bp,共有5个外显子，根据实验目的设计三对overlap扩增引物。其中，Awn-F,Awn-R扩增的是第2外显子部分序列和第3号外显子，设计产物大小189bp；Awn-1和Awn-2扩增第4号外显子，设计产物大小229bp；Awn-3和Awn・4扩增第5号外显子，设计产

6、物大小109bp。表1.引物序列名称引物序列大小Awn-FATGGGTCGCGGATCCGAATTCGCATGGAACAGAAGGTCTCGTTCCTGTGGCG52bpAwn-RCTCCTTCCCGCAGCTGAGGTTGAGAGGCGGTATTGCCAG39bpAwn-1CTGGCAATACCGCCTCTCAACCTCAGCTGCGGGAAGGAG39bpAwn-2AGTAAGGAAAAGGTAAGGGGCCTTCTGGATCAGCATAGTAATAT44bpAwn-3ATATTACTATGCTGATCCAGAAGGCCCCTTACCTTTTCCTTACT44bpAwn-4CTCGA

7、GTGCGGCCGCAAGCTTAGGGATGTTTTTCTCTGTAG41bpPCR反应体系如下（50卩1反应体系）组分添加量5xPCRstimulant10ul5xTransStartFastPfuBuffer10P1dNTPs5p1上游引物Awn-F/Awn-1/Awn-31Ml下游引物Awn-R/Awn-2/Awn-41U1猪睾丸DNA1Pl灭菌水21MlTransStartFastPfuDNAPolymerase1ulPC