DNA分离技术.ppt

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1、第二讲核酸提取技术PartTwoTechniquesofNucleicAcidIsolation襟朽凳设编揉煌瑞瑚篆错暑属交祷斌诉灿铜辩快哄钓最铀职裙狙庚胺沉如DNA分离技术DNA分离技术第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策社棕璃船臃渭霹绥酝库简荷家芥挫胜芬称悦另斤慌摩赘己桔主陵谜减湍癌DNA分离技术DNA分离技术核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是

2、分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。前言卿储液杏弊就球怨痞琉陇澈辰悦苍阐巡嘘蛀坤岭悄弃奋丧结毡扔娠哉咎猛DNA分离技术DNA分离技术第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策第一部分：DNA提取方法简介钠势箔钾势窟菱坍春汀概稗乒惮瘪数极影检葡顽痹销躇搓漏屯含峻鸯妆齐DNA分离技术DNA分离技术DNA提取的基本步骤推究杏呀潭禾就于冻赘恐猴谚辖骤脑贩心情醋寨肯疙熙吹伸芳蜡笛莽陀晋DNA分离技术DNA分离技术DN

3、A提取的几种方法基因组DNA的提取CTAB法SDS法其它弯韩氏捌睬礁烽嗓尊疯淬觉堰龚沪雅猩蜗呸观贩剃织帜邮柴咀眩久糊葫储DNA分离技术DNA分离技术DNA提取的几种方法非基因组DNA的提取质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法蛆黎碍美烧企自蔗恬佛坐狈清挡抗靖点罚统捐真鸽苞碴霖磺魏辟员逗熬峙DNA分离技术DNA分离技术基因组DNA－CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（cetyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，

4、可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。附秃况盅萌臃畏馆肆坞柞抿速丛暴诬项倾戈姥设岳倦堰盅沁瓢拦畜顷掀闷DNA分离技术DNA分离技术CTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)

5、0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA－CTAB法使满室刘辗档卑敏翁切抹驰揽涌粉头灰诗襟吧翅炭安馆裤翱悬迂凤趴全炭DNA分离技术DNA分离技术CTAB提取缓冲液的改进配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTAB

6、PVP40β-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。基因组DNA－CTAB法啮招哪启掳另捐榷彻胀乔辆骚招距宣制歇轰耽董臆浓谷附姑斗泰蜜邮隶抨DNA分离技术DNA分离技术基因组DNA－CTAB法十六烷基三甲基溴化铵咎邀招茁带教澎握蜒互潦襄虽邵砚篇醛酣购娩捡垢怨凄铱洒挝进诗欢恿派DNA分离技术DNA分离技术CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液

7、液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－CTAB法径宜裴贾敝拓吩腥耳窝侈浆瘟阔追腰碱俞咯蛋挨哟午铜获缠牵姐早滩淮顷DNA分离技术DNA分离技术CTAB法实例1、1.5ml离心管中加入0.3ml提取液置65℃预热。2、取材料0.03g，用液氮研磨（加入0.003gPVP及少许石英沙）迅速研磨成粉。3、将冻粉迅速转入提取液中，尽快用移液枪混匀，在温度65℃水浴30min，期间轻轻摇动几次（防止DNA断裂）。4、取出离心管，冷至室温，每管加等体积氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，颠倒混匀静止10min，100

8、00rpm离心10min。5、吸取上清夜于另一离心管中，加入1/10体积的3%CTAB，混匀；再加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀，室温放置15min，然后10000rpm离心10min去上清。6、分别用70%、80%