DNA分离技术.ppt

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1、第二讲核酸提取技术PartTwoTechniquesofNucleicAcidIsolation第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。前言第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其

2、RT-PCR常见问题、原因分析及其对策第一部分：DNA提取方法简介DNA提取的基本步骤DNA提取的几种方法基因组DNA的提取CTAB法SDS法其它DNA提取的几种方法非基因组DNA的提取质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法基因组DNA－CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（cetyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl

3、）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。CTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一

4、个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA－CTAB法CTAB提取缓冲液的改进配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除

5、多糖。基因组DNA－CTAB法基因组DNA－CTAB法十六烷基三甲基溴化铵CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－CTAB法CTAB法实例1、1.5ml离心管中加入0.3ml提取液置65℃预热。2、取材料0.03g，用液氮研磨（加入0.003gPVP及少许石英沙）迅速研磨成粉。3、将冻粉迅速转入提取液中，尽快用移液枪混匀，在温度65℃水浴30min，期间轻轻摇动几次（防止DNA断裂）。4、取出离心管，冷至室温，每管加等体积氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀

6、，颠倒混匀静止10min，10000rpm离心10min。5、吸取上清夜于另一离心管中，加入1/10体积的3%CTAB，混匀；再加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀，室温放置15min，然后10000rpm离心10min去上清。6、分别用70%、80%酒精洗涤沉淀。在风扇下将沉淀吹干。基因组DNA－CTAB法CTAB法实例7、加30μlTE缓冲液回溶DNA沉淀（不要反复吸打，用手指轻弹），同时加入终浓度50μl/mgRNase，置37℃处理1h。8、加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提1-3次。9、吸取

7、上清，加入终浓度为0.2-0.4mol/l的NaCL，2倍体积的无水乙醇，放置1h左右，10、12000rpm离心10min除去上清夜。11、用70%乙醇洗涤沉淀2-3次，自然干燥后，溶于30μl去离子水中形成DNA提取液。12、以DNA提取液/去离子水1/100的比例加入石英杯中在蛋白质核酸分析仪中进行测定。基因组DNA－CTAB法SDS法原理基因组DNA－SDS法SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使

8、蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度10mM20mM0.4M2%SDS法DNA提取缓冲液SDS法流程图（以动物组织为例）动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤