微囊藻毒素对HepG2细胞的毒性及其作用机制研究.pdf

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2、分子毒理学；．ｊ—．申请学位类别：理学博±申请人：马军国’－式＇指踩教师；李效宇教授二今：：；ｉ气二〇－六年五月与－＇讀豫替：■■；，；：滿一｜＂－；若：．：梦ｒ．；／ｆ？＊．＾：ｖ？為＼－点１：术；１．户心：．STUDIESONTHECYTOTOXICITYANDTOXICOLOGICALMECHANISMOFMICROCYSTINONHEPG2CELLSADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinP

3、artialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofPhilosophyinScienceByMaJunguoSupervisor:Prof.LiXiaoyuMay,2016摘要水体富营养化导致蓝藻水华的频繁发生已成为国内外普遍关注的水环境污染问题。蓝藻水华不仅污染水体、破坏饮用水源、造成渔业损失，而且多数蓝藻水华还由于产生蓝藻毒素（cyanotoxins）而影响和危害水生生物甚至人的健康。在众多蓝藻毒素中，微囊藻毒素（microcystins，MCs）是分布最广且毒性最强的一类环七肽肝毒素。

4、目前已发现超过100种MCs异构物，它们具有广谱的生物毒性，且化学性质稳定，在自然水体中难以降解。因此，它们对人类健康的影响尤其令人关注。近年来，关于MCs对动物或细胞的毒性及其作用机制的探索已成为MCs毒理学研究的重点和热点。关于MCs的毒性作用及其机理研究虽然有很多新的发现和见解，但其作用的具体信号通路目前尚不完全清楚，而且存在一定的争议，而该问题的解决是进行MCs环境和健康风险评价的基础。本研究选择MCs异构体中最常见且毒性最大的微囊藻毒素-LR（microcystin-LR,MC-LR），以人肝癌细胞HepG2作为实验模型，研究MC-LR对He

5、pG2细胞的毒性及其作用机制，以期进一步丰富和完善MC-LR肝细胞毒性作用机制理论、解析MC-LR毒性作用的危害及评价MC-LR的环境安全风险，为研究MCs对人类健康的影响及其防护提供理论支撑。研究内容及获得的主要实验结果：(1)MC-LR对HepG2细胞的毒性作用及其特点本研究首先通过MTT实验检测细胞活力、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡、倒置荧光显微镜检测细胞及细胞器形态，评价MC-LR对HepG2细胞的毒性作用及其特点。实验结果显示，0.1nM-10μMMC-LR短时间暴露未对HepG2细胞的活力、细胞周期和细胞凋亡产生明显影响；而0.1-50nM

6、MC-LR处理HepG2细胞96h也未显著改变细胞活力。高浓度MC-LR（20-100μM）暴露HepG2细胞却显著抑制细胞活力，并呈时间-剂量-效应关系。用0.5-50μMMC-LR暴露HepG2细胞，倒置荧光显微镜镜检发现，高浓度MC-LR暴露改变HepG2细胞形态、导致细胞损伤。Hoechst33342染色后检测发现，一定浓度的MC-LR暴露导致细胞核损伤并诱导细胞凋亡。Acridineorange染色后检测发现，高浓度MC-LR暴露对细胞溶酶体造成严重损伤，且呈时间-I剂量依赖效应关系。Rhodamine-123染色检测发现，较低浓度MC-LR

7、暴露，部分HepG2细胞线粒体出现轻微形态改变，但无明显结构损伤；而高浓度MC-LR长时间暴露后，HepG2细胞线粒体损伤明显，且弥散性地分布在细胞内，这说明MC-LR暴露对HepG2细胞的线粒体产生了损伤。该实验结果表明，MC-LR对HepG2细胞的毒性具有浓度依赖性，非细胞毒浓度染毒对细胞活力无影响，而高浓度处理可导致细胞凋亡。(2)MC-LR对HepG2细胞代谢及其耐药基因表达的影响由于0.1nM-10μMMC-LR暴露HepG2细胞24h并未影响受试细胞的细胞活力、细胞周期和细胞凋亡。因此，我们首先要确定HepG2细胞内是否表达MC-LR特异性

8、转运体—有机阴离子转运多肽（OATP1B1和OATP1B3），并确定MC-LR是否真正进入到H