基因工程―基因操作技术课件.ppt

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1、2基因工程操作常规技术2.1DNA操作基本技术2.2RNA操作基本技术2.3蛋白质操作基本技术DNA的提取与纯化凝胶电泳聚合酶链式反应分子杂交-DNA印迹杂交DNA序列测定DNA提取的几种方法核基因组DNA的提取CTAB法SDS法其它2.1DNA操作的基本技术DNA提取的几种方法非核基因组DNA的提取质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法2.1.1基因组DNA提取条件提取DNA总原则：p141保证核酸一级结构的完整性；2排除蛋白质、脂类、糖类和RNA的污染；3核酸样品中不应存在对酶有抑制作

2、用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。①减少化学因素对DNA的降解：避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4-10条件下进行；②减少物理因素对DNA的降解：避免强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中等操作，以避免破坏大分子量的线性DNA分子；③防止核酸的生物降解：避免细胞内、外各种核酸酶对核酸磷酸二酯键的水解作用，DNA酶需要Mg2+、Ca2+的激活，因此实验中常利用金属二价离子螯合剂EDTA，柠檬酸盐，可基本抑制DNA酶的活性。实验注意事项：p14基因组DNA－CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（

3、hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。CTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM

4、1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA－CTAB法CTAB提取缓冲液的改进配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)

5、5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。基因组DNA－CTAB法CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－CTAB法SDS法原理基因组DNA－SDS法SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心

6、后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度10mM20mM0.4M2%SDS法DNA提取缓冲液SDS法流程图（以动物组织为例）动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－SDS法（1）质粒：存在于细菌细胞质中独立于染色体外的遗传因子，能自我复制，大多数为双链、闭环DNA分子，少数为线性。p16广泛存在于细菌细胞中，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目

7、前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。大肠杆菌的质粒主要有F质粒（F因子）、R质粒（抗药性因子）和Col质粒（大肠杆菌素因子）三种。2.1.2质粒DNA提取技术（2）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种（3）赋予宿主细胞性状-抗性基因物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱抗菌素名称抗菌素作用方式宿主菌抗性机理氨苄青霉素（Amp）干扰细菌细胞壁合成编码-内酰胺酶,切割Amp-内酰胺环氯霉素（Cml）抑菌剂,与50S结合,干扰编码乙酰转移酶,使氯霉素蛋白质合成乙酰

8、化失活卡那霉素（Kan）杀菌剂,与70S结合,mRNA编码氨基糖苷磷酸转移酶,发生错读修饰Kan失活链霉素（Sm）杀菌剂,与30S结合,mRNA编码特异修饰酶发生错读四环素（Tet）抑菌剂,与30S结合，阻止编码特异蛋白,修饰细菌膜蛋白合成结构,阻