基因工程操作技术.ppt

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1、Chapter4DNA操作技术DNA操作技术主要有：切割、连接、缩短、加长、转录成RNA，或者合成新的DNA，化学修饰、或者去掉特殊的化学基团。学习内容：DNA操作酶核酸酶连接酶聚合酶DNA修饰酶限制性内切酶分类和命名酶切体系、反应条件、结果鉴定定位酶切位点连接1.1核酸酶作用：降解磷酸二酯键分为：外切酶内切酶1.DNA操作酶1.1核酸酶Bal31(来自于细菌Alteromonasespejiana)单链特异的核酸内切酶活性，双链特异的外切酶活性。依赖于Ca2+用途：构建限制酶图谱产生末端缺失突变DNA超螺旋线性化1.1核酸酶来自于真菌Aspergillusoryzae的S1内切酶作

2、用于单链DNA或RNA。用途：分析内元的位置获得平端ds-DNA酶量大时，降解双链DNA1.1核酸酶来自于牛胰腺的DNaseI既可以降解单链也可以降解双链，没有特异性，产生单核苷酸或短链。DNAFingerprintingwithDNaseI1.1核酸酶RNaseH（E.coli）降解RNA:DNA杂交分子中的RNA。1.2连接酶连接3‘端羟基和5’端磷酸形成磷酸二酯键。在DNA复制、修复、以及体外重组过程中起重要作用。1.2连接酶T4-DNA连接酶连接粘性末端、平端修复双链DNA或RNA-DNA杂交双链上的缺口。E.coliDNA连接酶连接粘性末端（主要用于cDNA第二链的合成）1

3、.3聚合酶DNA聚合酶I5’-3’聚合酶活性3’-5’外切酶活性5’-3’外切酶活性核酸内切酶活性可以被枯草杆菌蛋白酶水解成：Klenow片段和N端具5’-3’外切酶活性的分子。1.3聚合酶1.3聚合酶Klenow酶修复限制性内切酶造成的粘端标记DNA探针催化cDNA第二条链的合成末端终止法测序1.3聚合酶T4DNA聚合酶与Klenow酶相似，外切酶活性更高。体外诱变反应中效率很高。T7DNA聚合酶测序酶TaqDNA聚合酶1.3聚合酶逆转录酶：将mRNA转录成cDNAAMV逆转录酶（鸟类成髓细胞性白血病病毒）M-MLV逆转录酶（Moloney鼠白血病病毒）1.3聚合酶两种逆转录酶的区

4、别肽链的组成禽酶2条肽链，具聚合酶和很强的RNaseH活性鼠酶1条，较弱的RNaseH活性反应的最适温度禽酶42°C，二级结构丰富RNA，禽酶效率高反应的最适pH值禽酶pH8.3鼠酶pH7.61.4DNA修饰酶碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）可以去掉DNA分子的5‘端的磷酸基团。polynucleotidekinase:来自于T4侵染的大肠杆菌，在5’端增加磷酸基团。末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltansferase）来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3‘端增加一个或多个脱氧核苷酸。甲基化酶与限制性内切酶具有相同的识别序列。1.4DNA

5、修饰酶碱性磷酸酶（BAP,CIP）作用于载体的5’端，提高重组效率作用于外源DNA的5’端，防止自连1.4DNA修饰酶T4--多核苷酸激酶（T4-PNP）将γ-磷酸转移到DNA或RNA的5’端放射性标记DNA的5’端连接反应中，使缺少5’端磷酸的DNA片段和接头磷酸化1.4DNA修饰酶末端脱氧核苷酰转移酶（TDT）3’端突出的双链DNA，Mg2+平端或3‘凹端的低物，Co2+1.5拓扑异构酶在共价闭合双链上通过磷酸二酯键的短暂断裂和重新连接解开超螺旋2限制性内切酶2限制性内切酶RestrictionEndonuclease催化双链DNA分子的断裂，产生限制性片段。不同来源的DNA具有

6、不同的酶切位点以及不同的位点排列顺序，因此各种生物的DNA均呈现特征性的限制性酶切图谱。在生物分类、基因定位、疾病诊断、刑事诊断以及基因重组领域起重要作用，并誉为“分子手术刀”。限制-修饰现象2.1限制性内切酶的发现限制-修饰现象1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，HindII和HindIII，为基因工程技术的诞生奠定基础。2.2限制性内切酶分类限制性核酸内切酶可分为三大类：I类II类*III类I类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割,但是切割的核苷酸顺序是随机的。代表EcoB、EcoK(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸

7、顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序(palindrome)，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。III型限制性内切酶有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。2.3限制性内切酶的命名原则命名原则：取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。该种中发现的不同的酶按照顺序编号I,II,III等。如存在变种和品系，取变种或品系的