重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物抑癌作用的动物实验

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硕士学位论文重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥论文题目：复合物抑癌作用的动物实验AnExperimentalStudyontheAntitumorEffectofrAd-p53PLGASustainedReleaseMicrospherecombinedCalciumPhosphateCement研究生姓名:汪东指导教师:牛国旗（副教授）学科专业:外科学研究方向:脊柱外科论文工作时间:2011年12月至2014年4月 目录中文摘要...........................................................................................................................................1英文摘要...........................................................................................................................................4前言...........................................................................................................................................7第一部分PLGA包埋重组人p53腺病毒缓释微球的制备及其缓释特性..............................10前言...............................................................................................................................10仪器与材料.............................................................................................................................11实验方法.................................................................................................................................12实验结果.................................................................................................................................14讨论.................................................................................................................................16结论.................................................................................................................................19参考文献.................................................................................................................................20第二部分重组人p53腺病毒PLGA缓释微球与磷酸钙骨水泥复合物的体外释药实验及其对胃癌细胞的抑制作用.................................................................................................................23前言.................................................................................................................................23材料与器材.............................................................................................................................25实验方法.................................................................................................................................26实验结果.................................................................................................................................28讨论.................................................................................................................................30结论.................................................................................................................................33参考文献.................................................................................................................................34第三部分重组人p53腺病毒PLGA缓释微球复合磷酸钙骨水泥体内抗胃癌动物实验.......37材料与方法...........................................................................................................................37实验结果.................................................................................................................................39讨论.................................................................................................................................42结论.................................................................................................................................45参考文献.................................................................................................................................46致谢...........................................................................................................................................48主要英文缩略词表.........................................................................................................................49附录：综述.....................................................................................................................................50 重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物抑癌作用的动物实验中文摘要目的：研究重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物的抗肿瘤性能，探讨制作新型载生物制剂抗肿瘤骨填充材料的可能性。磷酸钙骨水泥（CPC）不仅可以在体内吸收降解，被再生骨组织替代，而且还有良好的生物相容性和骨传导性，能够自行固化的骨填充物。还有它不像PMMA聚合固化时产生高热，且水泥粉末之间有相当的空间所以能成为良好的药物载体。常将CPC作为多肽类、有生物活性药物的载体。将抗肿瘤药物载入磷酸钙骨水泥，既能修复骨缺损同时又能杀灭残存的肿瘤细胞，主要用于骨肿瘤切除术后缺损充填，是近年来骨充填材料的研究热点之一。p53基因是得到医学认可的抑制肿瘤基因之一，在人类百余种肿瘤中，有六成以上的发生与该基因的突变有关。重组人p53腺病毒由人基因p53与腺病毒（5型）充当载体重组而成的基因治疗肿瘤的药品，它有很高的安全性，还有很高的转染率等优点。它是一种广谱抗癌制品，能明显抑制肿瘤细胞的生长，特异性地引起肿瘤细胞凋亡，而正常细胞则无损伤。重组人p53腺病毒可以使机体受到刺激而发生抗肿瘤特异性的免疫变态反应，肿瘤组织局部用药后，能聚集肿瘤相关的杀伤性细胞在肿瘤组织周边，从而使肿瘤组织被灭亡。本研究旨在探讨复合具有抗肿瘤活性的骨充填材料即重组人p53腺病毒－CPC抗肿瘤复合骨水泥的方法，以获得有一定承载强度的抗肿瘤复合骨充填材料。合成聚乳酸－乙醇酸共聚物(PLGA)包埋重组人p53腺病毒的缓释微球，并将缓释颗粒以一定的百分比与磷酸钙骨水泥（CalciumPhosphateCement，CPC）混合，这样就得到了一种全新的抗肿瘤骨水泥。研究其中抗肿瘤基因药物的体外释放、活性、抗肿瘤效应。抗肿瘤复合人工骨水泥的体外试验、动物试验，探讨其对肿瘤增长抑制。方法：本实验共三步：第一步运用乳化溶剂挥发法（w/o/o）制备重组人p53腺病毒PLGA缓释微球，制备出后在光学显微镜下观察其形态；第二步将重组1 人p53腺病毒PLGA缓释微球以8%的质量百分比与磷酸钙骨水泥复合，观察复合后其形态，并体外测定重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物中抑癌基因药物缓释情况；第三步荷瘤裸鼠模型将植入重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物，观察肿瘤生长情况，并进行对比参照实验，数据分析，以确定重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物是否对肿瘤有抑制治疗作用。结果：1、运用乳化溶剂挥发法，以聚乳酸－乙醇酸共聚物（PLGA）为载体，制备出重组人p53腺病毒PLGA缓释微球，微球无明显粘连、呈规则球形，表面光滑，大小分布均匀。制作过程方法简单，重复性好，可控性好。用该法制备的PLGA包裹的缓释微球在突释期释放药物较少，但是释放速度较快，稳定期释放药物长期稳定，主要是PLGA不断被分解吸收，药物不断释放出，时间可长达12天以上。2、载体为磷酸钙骨水泥的缓释系统在药物缓慢释放的过程中，局部的药物浓度可以长期稳定存在。重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物能够缓慢释放重组人p53腺病毒12天之久，前期突放量小。磷酸钙骨水泥与PLGA包埋重组人p53腺病毒的缓释微球复合物所产生的缓释液可有效抑制胃癌细胞的增殖，具有很好的抑制肿瘤生长的生物活性。3、重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物使荷瘤裸鼠体内的胃癌细胞大片坏死，可有效的抑制肿瘤的增殖。重组人p53腺病毒将来有希望是肿瘤治疗举足轻重的一员。重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物不仅可以填补骨缺损，而且可以释放药物起局部抗肿瘤作用，是一种全新的骨填充材料。可望成为骨肿瘤切除后良好的骨填充物或椎体转移性肿瘤经皮椎体成形强化的新型材料。结论：采用可降解的聚合物PLGA作为药物载体材料，制备重组人p53腺病毒PLGA缓释微球，工艺简便易行，稳定性好；重组人p53腺病毒能够从PLGA包埋微球中持续稳定的释放；重组人p53腺病毒PLGA缓释微球与磷酸钙骨水泥复合物(rAd-p53-PLGA-CPC)可提供理想的药物缓释作用；该复合物缓释液可在体外有效抑制胃癌细胞的增殖；rAd-p53-PLGA-CPC复合物在祼鼠体内可抑制胃癌移植瘤的生长、侵袭。本实验制备的rAd-p53-PLGA-CPC复合物集骨修复和抗肿瘤药物于一体，为骨肿瘤术后骨缺损或椎体转移性椎体肿瘤经皮微创椎体强2 化治疗提供了新思路，有望成为一种新型的具有抗肿瘤作用的骨充填材料。本研究新思路：首次率先合成重组人p53腺病毒（基因药物）PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物，其不仅起到肿瘤术后的骨缺损的填充作用，而且同时具有可以长时间持续的抗肿瘤作用。既可用于四肢肿瘤，同时又能应用于脊柱肿瘤术中重建（如PKP、PVP），具有广泛的临床应用前景，为其它后期研究奠定了基础。还有望在肿瘤骨内或肿瘤椎体内注入该混合物，在有效杀灭肿瘤细胞的同时诱导骨替代，最终实现骨肿瘤逆转，使肿瘤组织转变成为骨组织，而避免了外科手术切除甚至截肢的可能性。关键词：乳化溶剂挥发法，重组人p53腺病毒，聚乳酸一聚羟基乙酸共聚物(PLGA)，p53，磷酸钙骨水泥，微球，缓释、腺病毒，胃癌3 AnExperimentalStudyontheAntitumorEffectofrAd-p53PLGASustainedReleaseMicrospherecombinedCalciumPhosphateCementAbstractObjectives:ThepaperstudiestheantitumorpropertiesofrAd-p53-PLGA–CPCandexploresthepossibilityofmakingnewbiologicalcarriedantitumorbonepackingmaterials.CPCisthebonefillingrestorationmaterialforselfcuring.Withfinebiocompatibilityandosteoconduction,itcanassimilateanddegradeinthebodyandbereplacedbyregenerativebone.ItisdifferentfromPMMA,whichhashighfeverduringcurablepolymerization.Besides,ithasporesbetweenparticles,soitisoftenusedasgooddrugcarrierforpolypeptideandbiologicaldrugs.LoadingantitumormedicineintoCPCcanbothrepairbonedefectsandkilltheepibiotictumorcells.Thedefectsfillingafterbonetumorexcisionisoneofthehotissuesforbonepackingmaterial.P53geneisoneofthemedicallyapprovedtumorsuppressorgenes,whosemutationisconcernedwith60%ofthehumantumor.rAd-p53isthemedicinefortumortreatmentcarriedbyhumanp53adenovirusgeneandischaracterizedbyhighsecurityandtransfectionefficiency,etc.Itisakindofbroad-spectrumanti-cancerproductswhichcanobviouslysuppressthegrowthorspecificallycausetheapoptosisoftumorcellwithouthurtingothernormalcells.rAd-p53canefficientlystimuliorganismtogeneratethespecificantitumorimmuneresponse.Localinjectionhasagoodapplicationtotumordestructioncellssoastokillthetumororganizations.Thisresearchaimsatdiscussingthemethodofcombiningbonefillingmaterialwithantitumoractivity,namely,recombinantHumanAd-p53—CPCantitumorcompoundbonecement,soastoobtainsomeantitumorcompoundbonefillingmaterialwithcertainbearingcapacity.Namely,thisresearchdiscussesthesustainedreleasemicrosphereofrAd-p53PLGA,andthecombinationofSustained-releaseGranuleswith4 CPCsoastostudytheinvitrorelease,activityandantitumorefficiencyofthemedicineinthecombinedantitumorcompositeartificialbonecement.Besides,itisthediscussionofthetumorinhibitionofantitumorcompositeartificialbonecementbyanimalexperimentandinvitroexperiment.Methods:Theexperimentcanbedividedinto3stages.First,makethesustainedreleasemicrosphereofAd-p53PLGAbyw/o/o,andobserveitsformwithopticalmicroscope;second,compoundthemicrosphere(8%qualitypercentage)withCPC,observeitsformaftercompounding,andinvitroanalysisthesustainedreleaseofthecompoundmedicine.Third,implantthecompoundintoatumor-burdenednudemousemodelandconductthecontrastexperimenttospecifythetumor-inhibitionfunctionofthecompound.Results:1.Theproductionprocessissimplewithfinestabilitybyw/o/o,PLGAasthemedicinecarriermaterialtomaketherAd-p53PLGAsustainedreleasemicrospherewithregularshape,smoothsurface,uniformdistributionandnoclearadhesion.ThePLGAsustainedreleasemicrosphereproducedbythismethodreleaselittleandfastatbeginning,stableatthelateperiod.Itmainlyslowlyreleasesdrugs,whichcanlastfor12moredays.2.Theslow-releasemedicinesystemcarriedbyCPCcanmakethelocaldrugshighconcentrated,stable,lastingandcontrollableduringthereleaseprogress.ThissystemcanslowlyreleaseRecombinantHumanAd-p53for12dayswithlittleInitialburstreleasepossibility.RecombinantHumanAd-p53PLGAsustainedreleaseliquid,withgreatcancerinhibition,canefficientlysuppresstheproliferationofgastriccancercells.3.rAd-p53PLGAsustainedreleasemicrosphereCPCcompoundbonecementcansuppressthegrowthofgastriccarcinomatransplantedtumorinnudemice.ItisexpectedtobepartofcomprehensivecancertherapyandHumanAd-p53-CPCantitumorcompoundbone.Ad-p53-PLGA-CPCisakindofnewfunctionalbonecementcombinedthefunctionasdrugtherapy,bonerepairfillerandisexpectedtobegoodbonefilleraftertumorresection.Conclusion:CarriedbydegradablepolymerPLGA,Ad-p53canbemadeintosustainedreleasemicrospherewithsimpleandpracticalcraftandgoodstability.5 RAd-p53canbereleasedfromPLGApersistentlyandstably.RAd-p53-PLGA-CPCcanprovideperfectsustainedreleaseeffectandCPCsustainedreleaseliquidcanefficientlysuppresstheproliferationofgastriccancercells.RAd-p53-PLGA-CPCcansuppressthegrowthandinvasionofgastriccarcinomatransplantedtumorinnudemice.RAd-p53-PLGA-CPCinthisexperimentcombinesthefunctionofantitumorandbonedefectrepairandpavesanewwayforpostoperativebonedefectsandstrengtheningtreatmentofvertebralmetastaticvertebraltumorpercutaneousminimallyinvasivevertebral.Itisexpectedtobecomeabonepackingmaterialwithantitumorfunction.Thenewideasoftheresearch:Ad-p53PLGAsustainedreleasemicrosphereCPCcompoundbonecementnotonlyplaysthefunctionofreconstructionaftertumorsurgery,butalsotheantitumorfunctionforalongtime.Itcanbeusedbothinthelimbstumorandthereconstructionofspinaltumorsurgery(suchasPKP,PVP).Ithasbroadclinicalapplicationprospectsandpavesthewayforotherlaterstudies.Itisexpectedtoinjectthemixtureinthetumorboneandtumorcentrumstoeffectivelykillthetumorcellandinducethebonesubstituteaswell.Andlastitcomestothereverseofbonetumor.Itcanreducethepossibilityforamputation.Keywords:W/O/O,rAd-p53,PLGA,P53CPC,microsphere,sustainedrelease,adenovirus,gastriccancer6 前言随着材料科学与医学科技的发展，抗肿瘤骨填充材料的研究越来越受到众多研究工作者的关注，传统的细胞毒性化疗药物与骨填充材料复合已有相关报道，而将重组人p53腺病毒抗肿瘤生物制剂与骨填充材料复合未见相关报道。近年来，肿瘤治疗迈上了基因治疗的新台阶。一位北美洲医学家在一次实验中，在肿瘤内注射了一定量的基因重组的腺病毒，这时肿瘤组织内腺病毒转染至肿瘤细胞内，并繁殖复制，致使肿瘤细胞死亡，最终杀灭肿瘤组织。发现了p53基因是与肿瘤相关性很高的抑癌基因，人类多种肿瘤与p53基因突变相关，p53不仅能够诱导细胞凋亡，而且加大了肿瘤组织对放化疗的敏感性。腺病毒因为其性质稳定，毒性不高，且有很高的转染率等优点，已经成为一种最常用的肿瘤基因治疗的载体。重组p53腺病毒注射液(rAd-p53)是我国最先应用于临床治疗的基因药物，它是深圳市赛百诺基因技术有限公司研制开发的，主要用于恶性肿瘤的后期治疗。该基因药物能在肿瘤内特异性激活机体并表达出p53蛋白，从而发挥抗肿瘤的生物学效应。重组人p53腺病毒(rAd-p53)是一种广谱的抗肿瘤药物，在美国自1995年以来首次被批准应用于临床试验，现在在多个国家研究，跟多种类型的肿瘤治疗有关，而且治疗效果相当显著，由于患者对其耐受性好，无严重的毒副作用而得到广泛应用。一项研究中，19例患者虽然肿瘤未发生转移但由于肿瘤类型或者肿瘤位置不能手术，通过特定方案局部注射rAd-p53联合放疗，63%（12/19例)经病理活检未见肿瘤组织；Swisher在重组人p53腺病毒联合放疗治疗Ⅱ期非小细胞肺癌研究中，用RT-PCR分析技术发现p53相关基因p21、BAK等在肿瘤组织中表达增高，这说明了由重组人p53腺病毒带来的p53基因在体内产生了生物学效应。2)乳腺癌：在国外的一所医学中心对一组乳腺癌Ⅱ期患者运用重组p53-腺病毒基因治疗的临床试验研究发现，局部应用rAd-p53与两种化疗药物（Taxotere,Adriamyacin）联合使用对晚期乳腺癌的疗效，绝大多数的患者的肿瘤出现缩小，甚至部分完全消失。病理检查也支持这个结果，只发现散在的少量肿瘤细胞。此外，在头颈部鳞癌、卵巢癌、食道癌、膀胱癌等的治疗中也都取得显著效果。可见，重组人p53腺病毒(rAd-p53)带给恶性肿瘤患者的效果是惊人的。7 基因药物重组人p53腺病毒(rAd-p53)注射液局部注射使用通常需要反复多次，如果将基因药物重组人p53腺病毒(rAd-p53)制备成长期缓释系统，就解决了反复多次给药的复杂性。聚乳酸－乙醇酸共聚物（PLGA）具有良好的成膜性能而被制备成膜性材料、微球或者微泡，且有很好的生物相容性。而微球被广泛应用于药物的缓释系统。目前，国内外对rAd-p53药物剂型方面的报道很少，由于在体内rAd-p53易失活，常需反复多次注射方能起效，这样增加了患者的痛苦，同时也加大了穿刺注射的风险。因此如能将重组人p53腺病毒应用于经皮椎体成形术所需的骨水泥中，治疗椎体转移性肿瘤缓解疼痛、提高患者生存质量，局部抗癌治疗，即以“椎体强化+抗骨肿瘤活性”复合作用机制实施局部治疗作用，则不仅能降低传统手术所带来的机体组织结构损伤的发生率，同时也对于局部肿瘤生长具有抑制作用。磷酸钙骨水泥（CPC）是目前较为常用的可在机体内被吸收的骨水泥，有很好的骨传导性、可塑性和生物相容性，能够自行固化且缓慢被机体自身骨组织替代的填充材料。在矫形外科和口腔外科已被广泛使用。同时它还因为其固化时产热温和，以及颗粒间存在有孔隙，所以能成为良好的药物载体。常将CPC作为多肽类、有生物活性药物的载体。将抗肿瘤药物与其复合，这样不仅增强椎体的强度和力学稳定性或者填充了骨缺损，而且因为抗肿瘤药物能够不断从复合物中缓慢释放出来而起持续的抗肿瘤作用。局部用药不仅能最大限度直接作用于肿瘤，持续杀灭肿瘤，同时也降低了全身用药的副反应。就CPC复合的抗肿瘤药物种类而言，目前大多为细胞毒类药物，如甲氨喋呤、顺铂和阿霉素等，而将生物制剂rAd-p53与CPC复合目前未见文献报道。由于采用某种包埋材料使抗肿瘤药物缓慢释放，达到持续抗肿瘤作用的方法目前较为成熟，因此本研究设计先采用可降解的聚合物PLGA作为包埋材料，将重组人p53腺病毒包埋制备缓释微球，再将其与磷酸钙骨水泥CPC复合，而获得具有持续抗癌作用的骨填充物材料，该材料最终目的是应用于骨肿瘤切除术后骨缺损充填或者椎体转移性肿瘤经皮椎体成形术，在充填骨缺损或椎体强化的同时对局部产生持续抗肿瘤作用。本实验研究由三部分组成：第一部分是重组人p53腺病毒PLGA缓释微球的制备，光学显微镜观察微球大小、形态，缓释微球体外的缓释药物情况。第二部分是重组人p53腺病毒PLGA缓释微球与磷酸钙骨水泥复合后的体外药物缓释情8 况及其所得的缓释液对胃癌细胞的抑制情况。第三部分是rAd-p53-PLGA-CPC复合物的动物实验，将重组人p53腺病毒PLGA缓释微球复合磷酸钙骨水泥、甲氨蝶呤复合磷酸钙骨水泥和磷酸钙骨水泥植入荷瘤裸鼠模型对比研究证明重组人p53腺病毒PLGA微球磷酸钙骨水泥复合物对肿瘤的增值的抑制。9 第一部分PLGA包埋重组人p53腺病毒缓释微球的制备及其缓释特性前言随着医学生物学技术与理论的快速发展，恶性肿瘤的基因治疗越来越被人认知并取得了令人较为满意的结果。肿瘤基因治疗的方法主要有：引入自杀免疫基因治疗、肿瘤血管基因治疗、替代缺陷的抑癌基因、多药耐药基因治疗和灭活癌基因等方面。p53基因是得到医学认可的抑制肿瘤基因之一，在人类百余种肿瘤中，其中有六成以上的发生与它的突变有关。p53蛋白所具有的功能不仅在诱导细胞凋亡的过程中，对细胞周期进行调控，发挥极其重要的作用，而且保护着整体细胞[1]基因组的完整性及稳定性。这样如果能够恢复因p53基因缺陷所引发的肿瘤，就有可能被治愈。这将是全新的治疗肿瘤的理想方法。国外一项研究发现，把一种基因重组的腺病毒注入到肿瘤体内后，肿瘤组织坏死，治愈了肿瘤。重组人p53腺病毒(rAd-p53)是抗肿瘤的广谱药品之一，在美国自1995年以来首次被批准应用于临床试验，现在在多个国家研究，与多种类型的肿瘤治疗有关，而且治疗效果相当显著，由于其自身的多种优点，人体对其耐受性好，并没有严重毒副作用出现。在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、食道癌等各种肿瘤晚期的治疗中也都取得明显的效果。在临床实践上应用[2-3]重组人p53腺病毒的将帮助我们对基因治疗更好的理解和准确的评价效果，重组人p53腺病毒(rAd-p53)带给恶性肿瘤患者的效果是惊人的。重组腺病毒p53注射液(rAd-p53)是基因治疗在我国首次应用于临床的生物制剂，它是深圳市赛百诺基因技术有限公司研制开发的，主要用于恶性肿瘤的后期治疗。该药物能在肿瘤内特异性激活机体并表达出p53蛋白，从而发挥抗肿瘤的[4、5]生物学效应。后者发挥效能的原因可能因为：1）阻滞肿瘤细胞周期，导致肿瘤细胞凋亡；2）可能刺激人体内产生特异性的抗肿瘤免疫反应；3）促进肿瘤组织对化疗药物的敏感性；4）通过旁观者效应等抑制肿瘤血管上皮生长因子生成，从而抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长。基因药物重组人p53腺病毒(rAd-p53)注射液局部注射使用通常需要反复多次，10 如能制备出缓释系统，就解决了给药的复杂性,同时减轻了患者的痛苦，降低了穿刺注射的风险。制备药物缓释系统最常采用可降解的聚合物PLGA，该材料具有良好的成膜性能而被制备成膜性材料、微球或者微泡。正是由于其良好的成膜性能和成囊性能以及良好的生物相容性，并且这种材料能在人体内长期滞留，而不会引起各种不良反应，目前已被现代医学工程广泛应用，它作为组织工程中的支架[6]材料性质优良。将基因药物重组人p53腺病毒(rAd-p53)，采用可降解的聚合物PLGA制备药物缓释系统，探讨其药物缓释及其进一步相关研究尚未见文献报道，因此，这是值得研究的课题。本部分实验研究主要目的是先将重组人p53腺病毒用包埋材料PLGA制成缓释微球，为后续实验作好准备。仪器与材料（一）仪器光学显微镜：奥林巴斯（OLYMPUS）超声乳化仪：日本JY92-超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技有限公司Centrifage5417R-离心机：eppendorf公司Satire全波长酶标仪：TECAN公司SHZ-B型恒温水浴振荡器：上海跃进医疗器械厂FD5-3冷冻干燥机：美国SIM公司Centrifage5810R-离心机：eppendorf公司电子分析天平：上海仪器仪表有限公司ZD-9556摇床：金坛市盛蓝仪器制造有限公司数显恒温测速磁力搅拌机：金坛市金南仪器制造有限公司（二）试剂重组人p53腺病毒注射液(rAd-p53，商品名为今又生，深圳市赛百诺基因技术12有限公司1X10VP/ml)、聚乙烯醇(PVA,Mv3万-7万,Sigma公司)、PLGA(山东医疗器械研究所，MW=l,6000,GA/LA=50:50)二亚甲基氯化物（天津市富宇精细化工有限公司），丙酮、氢氧化钠等试剂均为分析纯制剂。11 实验方法[13、14](一)制备缓释微球技术现在新型给药技术已经发展到允许临床生产的新剂型。可生物降解的微球，可作为需要肠胃外给药的途径比如蛋白质、多肽等生物活性药物，该技术拥有很大希望为新的蛋白质制剂，将提供改进的患者护理，或许增加药物效力。但是传统制备缓释微球的乳化法的最大的不足微球存在较低的药物包封率和载药量；特别是液相性药物。主要是因为制备缓释微球乳化阶段时，油相中药物扩散至水相。这个过程使得微球的表面零散分布着很多细小的通道，在释药过程使粒子有“突释”效应。根据相关研究报道，常用的乳化剂聚乙烯醇（polyvinylalcohol，PVA）作为外水相有两个作用，分别为乳剂保护作用与乳化作用。聚乙烯醇百分之十浓度以下，[15]形态良好的微球均能制备出，缓释微球粒径跟PVA浓度成反比。本试验根据文献及预试验结果，外水相的PVA水溶液选用的浓度为2%。制备缓释微球应用乳化剂挥发法有较多的影响因素，不必要对所有影响的因素筛选和研究考察，且因为试验费用的有限，和实验室仪器的稀少，因此本实验结合文献只进行了重组人p53腺病毒的缓释微球初步的制备，并未考察相关影响因素。重组人p53腺病毒PLGA缓释微球制备方法如下：①精密量取PVA0.600g，加热溶解于30ml超声纯化水中，配成2%PVA水溶液备用。精密量取PLGA0.6000g，溶解于2ml二氯甲烷溶液中，配比0.3000g/mlPLGA的二氯甲烷溶液备用。②精密量取重组人p53腺病毒（rAd-p53）1ml，冷冻干燥机冷冻干燥24h,得重组人p53腺病毒冻干粉，再用40ul超声纯化水溶解所得的重组人p53腺病毒冻干粉，得到的重组人p53腺病毒超浓缩液作为内水相。③配比0.3000g/mlPLGA的二氯甲烷溶液2ml作为有机相，将该有机相溶液与上面得到的重组人p53腺病毒超浓缩液的内水相相混合，混合液冰浴超声乳化得到初乳。④浓度2%PVA水溶液（30ml）立即加入初乳，超声冰浴形成复乳。⑤立即将所得的复乳倒入200ml的超纯水中，磁力低速搅拌（400转/分）4小时，使得二氯甲烷有机相彻底挥发出来，然后低温高速离心混合液（4℃，400012 转/分，60分钟），所得的微球无菌超纯水洗涤三次后，送冷冻干燥一整天。所得的微球4℃保存。（二）重组人p53腺病毒浓度曲线1、标准曲线的制定方法1）配制PBS（pH=7.4）溶液2）OD260法测定病毒总颗粒数梯度稀释病毒（10μl病毒+90μl病毒保存液）以分光光度计测260nm吸光度值。依据公式：腺病毒颗粒/ml=A值×稀释倍数12[16]×1.1×10计算病毒总颗粒数。123）精密量取1ml重组人p53腺病毒原液1ml（1×10VP/ml)置于10ml容量瓶11中，加入9mlPBS溶液稀释，得到1×10VP/ml的重组人p53腺病毒溶液。用移液管吸取定容瓶中溶液0.9ml病毒液，至于另一1ml试管中，病稀释到刻度，得10到9×10VP/ml的溶液，用移液管精密吸取定容瓶中溶液0.8ml病毒液，至于另一101ml试管中，病稀释到刻度，得到8×10VP/ml的溶液，以此类推，配比1010101010107×10VP/ml，6×10VP/ml，5×10VP/ml，4×10VP/ml，3×10VP/ml，2×10VP/ml病毒液。用移液管精密吸取定容瓶中溶液1ml病毒液，至于另一10ml定容瓶中，10病稀释到刻度，得到1×10VP/ml的溶液，以PBS调零，病毒均需经SDS处理后，在260nm波长处测各浓度腺病毒的吸光度。（三）重组人p53腺病毒PLGA微球在体外的释放情况的检测在含有5mlPBS缓冲液(pH7.4)的10ml的塑料离心试管中加入精密称取重组人p53腺病毒PLGA缓释微球20mg，放入ZD-9556摇床（金坛市盛蓝仪器制造有限公司）上摇晃，定期不同时间段用移液管吸取离心试管中的上清溶液(离心后)0.2ml，同时加入0.2ml的PBS缓冲液，使得每天取样时原溶液总体积保持不变。缓释的重组人p53腺病毒溶液用OD260法测定溶液中重组人p53腺病毒的含量。13 实验结果（一）重组人p53腺病毒PLGA缓释微球的形态学观察在玻片上放置少量的缓释微球，均匀涂布，用光学显微镜观察缓释微球的大小形态及微球表面的形态，光学显微镜照片见图1-1。显微镜下观察到的微球无明显粘连、呈规则球形，表面光滑，大小分布均匀。图1-1在不同的放大倍数的显微镜下的重组人p53腺病毒PLGA微球表面形态（二）重组人p53腺病毒浓度曲线：以重组人p53腺病毒浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。见图1-2图1-2重组人p53腺病毒浓度曲线14 （三）重组人p53腺病毒PLGA微球的体外释放曲线图1-3重组人p53腺病毒PLGA微球的体外释放曲线15 讨论1、包埋材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是一种新型的可降解材料，由于其良好的品性，已成为多种药物的缓释系统的载体。因此，随着大家深入研究PLGA共聚物缓释系统，PLGA共聚物在药物缓释系统领域中因有良好的成膜性能常常被制备成微球。良好的成膜和成囊的性质，在体内不会引起明显的免疫反应、细胞毒性反应和炎性反应等不良反应，被广泛应用于现代化工业领域、医用工程材料和[29]制药。它是良好的组织工程中支架材料，越来越重要并具有独特性能的材料[24-27]。通过PLGA包埋后药物微球，能够缓慢释放药物，使得药物能够长期作用于靶器官，一次给药能够维持较长时间，从而减少了穿刺注射的次数和风险，提高了患者的舒适性，因此在现代医用工程材料和制药方面较为广泛的使用。有关报道，PLGA包埋抗生素微球以一定的比例与磷酸钙骨水泥复合，形成了良好的缓[7]释药物系统，而它的力学性能、凝结时间并未增加、抗压强度亦未降低。抗肿瘤药物与CPC复合时会导致骨水泥的理化性质的改变,在临床应用之前应当做好相关[9]药物复合后的CPC的理化性质基础研究。Van等发现由于破骨细胞活性增加存在于骨质疏松的动物,CPC/PLGA的降解所获得的空间会被迅速地填充有新骨形成。另有动物实验表明，PLGA复合磷酸钙骨水泥微球后，在动物体内不断吸收降解PLGA，动物自身的骨组织也不断的爬行替代填充PLGA吸收后所遗留的空间，力[10]学实验表明体内的骨水泥的抗剪切强度跟爬行替代填充的骨组织成正比。聚乳酸和聚乳酸-羟基乙酸共聚物通常通过调节聚合物的种类、药物的水溶性、分子量、[13]微球粒径、内部结构等方法达到缓释或控释目的。2、缓释微球的制备方法[11]根据文献报道，微球固化的方法主要有3大类，即溶剂蒸发法、喷雾干燥法和相分离法，我们医学研究常用熔融法喷雾干燥法等方法制备PLGA缓释微球，微球对于有生物活性的药物能起到很好的保护作用，但在这些方法中尤其乳化溶剂[12]挥发法(w/o/o)最为常用。O'Donnell与McGinity采用了O/W型乳化法，O/O型乳化法，W/O/W型多重乳化法，和W/O/O/O的多重乳化法四种乳化法来制备了PLGA微球，研究发现采用复乳化的方法，能够更好的降低药物从球内向16 球外扩散。其结果表明，用该方法制得的PLGA微球，所得的微球粒径分布小，理化性质好、包封率高。现代医学可以通过调节一些影响因素比如搅拌速度、温度、聚合物的种类来制得所需要的缓释微球，它有很高的开发价值。乳化溶剂挥发法(w/o/o)工艺易行简单，是目前制备DNA、多肽、蛋白及水溶性药物等的微球主要方法之一。本部分研究采用复乳法制备的微球做为缓释载体制备工艺简便，性能优良，与组织工程支架的结合应用具有可行性。制得缓释微球无明显粘连、呈规则球形，表面光滑，大小分布均匀。3、缓释药物微球的缓释特性及其影响因素缓释微球药物的释放常有三个阶段：第一个阶段为突释药物阶段，既是突释期，第二个阶段为释放稳定阶段，既是稳定期，第三个阶段为释放加速阶段既是加速[17]期。在缓释微球药物缓慢释放过程中，早期常常发生突释药物阶段，既是早期药物相对的大量释放，这样能使机体早期得到有效的治疗，但如果突释药物过多，这样药物浓度达到了中毒剂量，对于机体就相当有损害了。决定缓释微球的第一阶段的药物突释的因素有微球的大小、药物的浓度等。但最重要的是微球表面的[18]形态和其大小。Juan等人对PLGA微球的渗透性和形态学研究观察来探索突然释放的机制。最初24小时，发现微球发生突释，该微球内部和外部的明显的发生了形态学变化，24小时后，微球穿透急速停止，表面致密，药物再难以释放，结束了药物突释。缓释系统第二个阶段既释放稳定阶段是最主要的阶段，在这个阶段，微球外面的体液向微球里面扩散，并且带走一部分药物从内部扩散至微球外，同时微球外壳的组成材料PLGA也在不断地被机体分解吸收，使得微球外面的体液更易从微球内带走药物，药物浓度能够维持在一定水平。这个过程是由液体的扩散和微球外壳分解吸收一起影响的。图1-3中可见微球载药的稳定释药稳阶段时间从第2天到第14天。第三个阶段为药物释放加速期既是加速期。因为微球外[28]壳被机体降解吸收到一定程度时，微球内部的药物会大量从微球内释放。Singh等开发用于重组胰岛素样生长因子（rhIGF-Ⅰ）的控释给药系统研究中发现，PLGA微胶囊化处理后能够有生物活性蛋白质14-18天，还有在体外和体内的释放速率之间的令人惊讶的密切相关性。影响药物释放的因素可分为两个方面，一个是与微球的表面形貌，聚合物分[19]子量、粘度和聚合物LA/GA比值相关。Blanco等总药物释放所需的的时间为17 28-129小时依据PLGA与PLA百分比，时间长短时间顺序为PLGA>PLGA75/25>PLGA50/50。二是与药物本身的结构特性和分子量有关。另外还与药物和聚合物[20]的作用有关。Qi等系统地研究了微球大小和膜的孔径大小的关系的制剂的效果。[21][22]而KIM等报道，微球的内部结构决定着药物释放控制。LI等采用PLGA微球单剂量乙肝疫苗的制药及免疫学评价研究表明，药物释放与该聚合物的组合物（LA/GA的比值），聚合物（粘度）的分子量和微球的形态有关联。这是因为如果微球的直径小，那么总体的微球与外界接触的表面积自然就大，那样体液更易从[23]球外渗透到球内，带走的药物自然增多，药物突释量就大。HE等在PLGA固化包封葡激酶变体（K35R）微球研究中报道，外水相溶液加入一定量的氯化钠后，制得的微球突释减少。本部分实验中制备的PLGA微球体外释放实验显示，重组人p53腺病毒在1d内吸光度小，显示突释较小，但前期药物释放较快，后期稳定，主释药过程时间长可长达12天，这说明重组人p53腺病毒从PLGA微球中能够持续稳定的释放是由PLGA材料缓慢溶蚀控制的。本实验采用乳化溶剂挥发法制备重组人p53腺病毒PLGA缓释微球第一阶段释放药物较少，但速度较快，其能够长期稳定释放重组人p53腺病毒长达12天，这样需多次给药只需一次，从而降低了患者的痛苦，并提高了药物的有效率。注射型缓控释制剂逐渐成为热点，相信会有更多的缓释微球产品上市。18 结论1、PLGA微球作为药物载体材料，制备重组人p53腺病毒PLGA缓释微球，制备工艺简便易行，稳定性好；2、重组人p53腺病毒能够从PLGA包埋微球中持续稳定的释放。19 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第二部分重组人p53腺病毒PLGA缓释微球与磷酸钙骨水泥复合物的体外释药实验及其对胃癌细胞的抑制作用前言远位转移是恶性肿瘤所具有的特征性表现，最好发转移性肿瘤的部位是肝、肺，其次是骨组织，其中脊柱是骨组织发生转移性肿瘤最常见的部位。据相关统计报道脊柱发生转移性恶性肿瘤是骨原发性肿瘤的38倍左右。据国外报道每年新发恶性肿瘤患者大部分都已发生了远处转移。原发性肿瘤的远处转移病灶逐渐成为影响生存质量和生存率的重要因素。因恶性肿瘤发生骨转移，造成患者病理性骨折，或脊髓马尾神经受压等并发症，已经超过恶性肿瘤本身给患者生活质量带来的巨大损害。由于脊柱解剖复杂及其周围组织结构重要，目前常采用放疗或化疗、少数手术的治疗手段，脊柱转移瘤的彻底根治性切除非常困难，且创伤大，并发症较多，经皮椎体成形术(percutaneousvertebroplasty，PVP)自从应用于C2椎体血管瘤患者获得良好效果以来，该技术以及随后发展起来的椎体后凸成形术(percutaneouskyphoplasty，PKP)被应用于椎体肿瘤、椎体血管瘤等疾病，均获得了显著疗效。目前该技术已经成为各级医院广泛开展的脊柱微创技术，是经皮向病变椎体内直接注入(PVP)骨水泥或者先通过球囊扩张后再注入(PKP)骨水泥，从而增强椎体的强度和稳定性，临床证实其有稳定可靠、迅速缓解疼痛的效果，且并发症少，深受患者及医生们的喜爱。但是常规采用的PMMA材料，由多聚体粉剂和液态单体混合组成，不具有抗癌作用，对治疗脊柱转移瘤而言只是姑息性止痛和强化椎体，仅仅能够在术后短期内缓解患者的症状，提高生存质量。磷酸钙骨水泥(CalciumphosphatecementCPC)是近年来逐渐开始应用于临床的一种新型非陶瓷类人工骨材料，是能够自行固化且产生骨再生效果的骨骼修复材料，具有聚合时不产热，塑型能力强，生物相容性、体内降解性，较生物玻璃、羟基磷灰石引导成骨能力强等的优点。因此将其用作药物缓释载体具有广阔的应[1-5]用前景。临床研究表明，磷酸钙骨水泥用于增强椎体强度、骨缺损的治疗是相当有效的。在脊柱肿瘤椎体成形术治疗中，由于肿瘤的存在，椎体强度只能在很短时间内有效。手术治疗骨肿瘤，手术切除肿瘤组织，肿瘤组织往往不能被彻底23 清除干净，还有残留，从而导致肿瘤复发。如果利用药物局部定点缓释治疗，将抗癌药物与磷酸钙骨水泥复合，这样就能达到增强椎体强度或者修复骨缺损的同时，又能达到抗肿瘤治疗的目的。CPC中复合抗肿瘤药物，利用药物局部缓释以保持局部长期的有效药物浓度，从而提高了治疗效果、并简化了给药方式、更降低药物的毒副作用，使磷酸钙骨水泥材料不仅充当骨修复填充作用同时也具有进一步的抗癌治疗功效。抗肿瘤药物复合磷酸钙骨水泥有效的提高局部血药浓度、可直接局部杀伤肿瘤、延长了药物有效时间、同时减低了药物的全身毒副作用。它的应用解决了传统给药方式所带来的药物利用效率低和半衰期短，药体系内药物浓度不稳定、而产生毒副作用等问题。[6]研究结果表明磷酸钙骨水泥与小剂量药物复合后对CPC固化后的组成未产生明显影响,载药CPC固化后仍维持原有羟基磷灰石晶体结构,药物引入对CPC固[21]化后的微孔结构和力学强度也无明显影响。陈华江等研究发现将甲氨蝶呤(MTX)表柔比星(EPI)羟基喜树碱(OH-CPT)三氧化二砷(As2O3)每种药物分别以2%、5%、8%的比例与CPC复合,检测其固化时间、抗压强度及微结构改变。结果：EPI对CPC复合量为2%时显著延长固化时间(P<0.05)，OH-CPT复合量为5%以及MTX、EPI复合量为8%时CPC最大抗压强度显著下降(P<0.05)。电镜扫描显示药物复合后CPC晶体结构无明显改变。因此，CPC不但可以用为骨修复物，而且在局部可以用作释放药物的载体，治疗多种需促进骨愈合骨科疾病。与其他载体不同，磷酸钙骨水泥不是单纯在材料表面，因磷酸钙骨水泥的孔隙相通，全部材料内都可结合药物。这样磷酸钙骨水泥随着材料不断被骨组织替代，则更长久的释放药物，起到治疗和修复的双重功效。目前载药CPC报道主要集中于四肢长骨骨缺损的替代和充填。对于CPC载药的研究，主要集中于部分化疗抗肿瘤药物、rh-BMP、抗生素、[7-10]及生长因子。而将磷酸钙骨水泥与重组人p53腺病毒PLGA缓释微球复合，以达到骨修复与基因治疗肿瘤的双重目的尚未见有文献报道。本试验旨在将重组人p53腺病毒缓释微球与磷酸钙骨水泥相复合并观察复合物的形态以及体外释放情况，并探讨复合物的体外缓释液对肿瘤细胞的抑制作用。24 材料与器材一、材料1、重组人p53腺病毒PLGA缓释微球：12重组人p53腺病毒注射液(rAd-p53，1X10VP/ml商品名为今又生，深圳市赛百诺基因技术有限公司)PLGA(山东医疗器械研究所，MW=l,6000,GA/LA=50:50)2、自固化磷酸钙骨水泥(CalciumphosphatecementCPC)：上海瑞邦生物材料有限公司3、PBS缓冲液（PH=7.4含0.06％NaN3,0.02％聚山梨酯-80）自制4、胃癌细胞系BGC-8235、胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司磷酸盐缓冲液：赛默飞世尔生物化学制品有限公司胰酶细胞消化液：美国Gibco公司改良型RPMI-1640培养基：赛默飞世尔生物化学制品有限公司6、其它药物：氯化钠(分析纯)天津市河东区红岩试剂厂氯化钾(分析纯)天津市河东区红岩试剂厂氢氧化钠(分析纯)天津市河东区红岩试剂厂二、试验器材：1、恒温SHZ-B型水浴振荡器：上海跃进医疗器械厂2、电子分析天平：上海仪器仪表有限公司3、试管、量杯等上海医疗器械厂4、调刀、调皿上海瑞邦公司5、数显恒温测速磁力搅拌机：金坛市金南仪器制造有限公司6、塑料细胞培养板、培养瓶上海医疗仪器设备厂7、ZD-9556摇床：金坛市盛蓝仪器制造有限公司8、二氧化碳细胞培养箱Thermo公司9、SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台10、微量加样器浙江绍兴东浦医疗25 11、Centrifage5810R-离心机：eppendorf公司12、Satire全波长酶标仪TECAN公司实验方法1、重组人p53腺病毒PLGA释微球在磷酸钙骨水泥中的复合：将缓释微球以8%的质量百分比混入CPC粉末中，反复搅拌混合，使缓释微球与CPC粉末充分混合均匀；进一步固化液调和，使缓释微球均匀分散在固化体中。这时将骨水泥薄薄涂于玻片上，用显微镜观察复合物中的微球的表面形态、大小和形状。2、模拟体液的配置：配制PBS（pH=7.4）溶液：NaCl=137.0mmol/L，KCl=2.7mmol/L，Na2HPO4=4.3mmol/L，KH2PO4=1.4mmol/L。3、重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物体外缓释：精密称取0.25g重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物置于5mlPBS缓冲液(pH7.4)的10ml的塑料离心试管中，旋紧塞子，置于恒温摇床中振摇，37℃下在预先设定的时间内取离心试管离心，取出0.1ml上清溶液，同时添加等量的新鲜缓冲液。缓释的重组人p53腺病毒溶液用OD260法测定溶液中重组人p53腺病毒的含量(见图2-2)，并将重组人p53腺病毒缓释液留用。4、原代细胞复苏、培养、传代、及缓释液对胃癌细胞的作用：操作前净化工作台用75%的酒精擦洗，30分钟紫外线消毒后，风淋10分钟。胃癌BGC-823细胞株由液氮中取出后，迅速放入37℃左右温水水浴摇床中，快速摇晃至原代细胞株液融化。离心去掉冻存液后，加入用无血清培养基洗涤一次，移液枪小心吹散细胞，得到胃癌细胞悬浮液。将其加入含有青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml、10%胎牛血清的培养液中，补足培养液至5ml，将细胞培养瓶置于37℃，饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中常规培养。3-4天更换胃癌细胞培养液，待细胞铺满瓶底90%后开始传代。用0.25%胰蛋白酶消化细胞，消化过程中摇晃培养瓶，使得消化均匀，光镜下观察，待细胞膜皱缩呈球形时，吸出消化液，迅速加入2ml培养液而终止消化。这时用移液器小心吹打，把贴壁细胞从瓶壁上脱落，离心去除上清液，再加入培养基，分别接种于2个不同的培养瓶中,补足培养基继26 续培养。如此反复操作4次。将其中数瓶培养瓶中加入重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物体外缓释液2ml，查看缓释液对肿瘤细胞增殖的抑制性。27 实验结果（一）重组人p53腺病毒PLGA释微球磷酸钙骨水泥复合物光镜下形态学观察，显微镜照片见图2-1。图2-1在不同的倍数的显微镜下的重组人p53腺病毒PLGA微球与CPC混合物光镜下形态微球表面光滑度均未表现出明显差异，固化物未见晶体结构明显变化，微结构变化不大，都是由极小的微粒构成。（二）重组人p53腺病毒PLGA微球磷酸钙骨水泥混合物的体外释放曲线图2-2（三）重组人p53腺病毒PLGA缓释微球与CPC复合体缓释液的抑癌作用：加入重组人p53腺病毒PLGA与CPC复合体的缓释液后的培养瓶在36小时内通过光学显微镜观察细胞形态的变化结果表明，当样品加入到培养基中作用细胞时，p5328 腺病毒可有效抑制胃癌细胞的增殖，加入缓释液的胃癌细胞在24小时后出现不同程度生长抑制（图2-3）存活的胃癌细胞数量减少。图2-3胃癌细胞在重组人p53腺病毒PLGA与CPC复合体缓释液作用下的形态学表现29 讨论1、磷酸钙骨水泥（CPC）磷酸钙骨水泥（CPC）是目前唯一能够自行固化并且能被再生骨组织替代的骨骼填充修复材料，具有良好的生物相容性和骨传导性，并能在体内降解等优点，[13-14]已经成为良好的药物载体。常将CPC作为多肽类、有生物活性药物的载体。近年来椎体成形术中CPC应用于治疗骨质疏松所导致的椎体压缩性骨折取得了良[15,16][17]好的疗效。使用结果表明，该材料对于骨缺损的修复是相当有效的。CPC它不像PMMA聚合时释放大量的热，磷酸钙骨水泥有两类：磷酸氢钙骨水泥[12]（brushitecement）和磷灰石骨水泥（apatitecement）。其主要生物学特性有以下几点：1)生物活性(bioactivity)骨的表面可以形成HAP和磷灰石，可与周围的松质骨直接、紧密、突起结合；2)可吸收性，被机体不断吸收，被自身骨组织爬行替代；3)骨传导性为新骨形成提供了支架；4)可促进细胞的表达和功能；5)与骨组织的相似性(similarity)。与临床常使用的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)相比，但也存在一些问题，脆性大；屈服强度稍差；其无机性使之在体内环境下聚合后强度比体外有明显下降，而且CPC溶剂易与血液混合发生游走，引起并发症。将磷酸钙骨水泥与抗生素相复合，已得到了较为广泛的研究。小剂量的药物与可吸收骨水泥混合后，未对后者产生明显的影响，其固化后仍然维持着原来晶体结构，原有的水泥间的孔隙及力学强度未见明显变化。其不仅可以作为骨填充材料，同时也可以在局部应用作为载药缓释系统。它不像其他载体一样，不仅仅只是在表面可携带药物，由于其内部的孔隙是相通的，其全体都能载药。这样在骨水泥不断被机体自身的骨组织爬行替代时，药物也在不断被吸收，起到了修复和治疗的双重功效。2、磷酸钙骨水泥相关复合物磷酸钙骨水泥（CPC）具有良好的生物相容性和骨传导性，并能在体内降解等优点已被少数学者在后凸成形术中试用，国内外学者将CPC与各种材料进行复合，如骨形态发生蛋白（BoneMorphogeneticProtein，BMP）、TGF-β、壳聚糖、可吸收纤维、胶原等，但均未能取得突破性进展。而CPC与BMP复合物具有良好的[11][31]骨诱导性已经得到肯定。研究结果发现，磷酸钙骨水泥具有生物活性，当其作为药物载体时，在体内表面形成磷灰石层，能调节药物释放速率或被蛋白质吸30 [32]收，动物体内和体外实验发现，发现在体内释放率比体外慢。俞玮等发现骨水泥复合阿霉素形成的缓释体在体外释放实验中第1天药物释放浓度较大，第2天[33]下降明显；以后长期维持在相对稳定缓慢释放，时间长达70d以上。黄波等实验研究结果表明顺铂和CPC构成的缓释体在动物实验体内可持续释放长达16周以上，8周时骨组织局部含量为55.21ug/g，在体外实验中该浓度能抑制胃癌细胞[34]的生长。Lou等研究发现将DNA抗子宫颈癌疫苗和聚甲基丙烯酸甲酯复合，微球被巨噬细胞吞噬后，机体可产生抗癌抗体，表明抗癌疫苗通过骨水泥微粒承载后，是一种非常理想的基因枪，为抗癌疫苗的使用提供了一种途径。但是将CPC与抗肿瘤药物，主要集中在传统的化疗药物，如甲氨蝶呤、阿霉素等，尤其是基因药物相结合研究甚少。基于此，将基因药物尤其是重组人p53腺病毒引入磷酸钙骨水泥，利用药物定点缓释的方式可以提高抗肿瘤治疗效果、简化用药方式、降低毒副作用，使其在填充修复骨质缺损的同时也具有抗肿瘤治疗的功效。而且，在骨肿瘤切除后的骨缺损治疗过程中，肿瘤细胞不一定被彻底清除干净，并有可能局部转移，从而使得治疗失败，导致肿瘤复发和转移。将CPC与抗肿瘤药物复合，尤其是基因药物相结合应用于骨肿瘤切除后的骨缺损修复重建可以在局部形成长期药物缓释系统，保持较长时间的有效药物浓度，达到抑制肿瘤转移和短时期复发的目的。目前与CPC复合的抗肿瘤药物主要为药物粉剂，如顺铂、多柔比[20]星等。其缺点在于在早期这种复合体系常在短期内常释放药物的半数以上。大剂量抗肿瘤药物在短期内释放既造成对周围正常组织的损害，同时也不能保证局部维持长期有效的剂量浓度。有研究表明，在CPC中复合以PLGA白蛋白微粒后[18、19]其力学强度未见明显下降，反而有所强化。因此本研究以PLGA微球复合CPC进行局部缓释研究。3、创新以及展望本课题釆用重组人p53腺病毒PLGA缓释微球与CPC复合与传统抗癌药物相比具有以下创新意义：CPC与载药微球复合后能使抗肿瘤药物释放浓度更为平缓，有助于在病变局部长时间保持抗肿瘤药物相对有效浓度。该实验选用制备抗肿瘤药物微球的材料是生物降解聚乳酸－乙醇酸共聚物（PLGA），PLGA是目前被大量应用于微球控释系统的合成高分子生物降解材料，在体内降解为乳酸和乙酸，[22-25]具有良好的生物相容性，是组织工程中良好的支架材料。国外有研究表明，CPC作为药物载体复合PLGA包埋抗生素微球后，形成了良好的药物缓释系统，31 而CPC的凝结时间未增加、力学性能并未降低，抗压强度也未减少。另有动物实验表明，CPC复合PLGA微球后，随着PLGA在体内的降解，其孔隙逐渐被新生的骨组织沉积，同时骨水泥的抗剪切强度随取代降解PLGA新生的骨组织增加而逐渐增加。目前国内外关于CPC内载抗肿瘤药物的研究主要限于阿霉素、顺铂和[26-30]氨甲喋呤的粉剂。近年来新出现了很多疗效好的抗肿瘤基因药物，少见CPC载此类药物的报道。抗肿瘤药物，尤其是基因药物，重组人p53腺病毒PLGA缓释微球复合磷酸钙骨水泥是骨肿瘤局部治疗的新思路。重组人p53腺病毒PLGA缓释微球如果和CPC复合可应用于椎体转移性肿瘤经皮充填骨水泥强化椎体，甚至再应用于骨肿瘤切除后遗留的骨缺损空腔中能够满足所需抗肿瘤药物持续存在的要求，这将是一种创举。综上所述，CPC作为一种理想的提供局部负荷力学重建与药物缓释的载体，在临床上将PLGA包埋的重组人p53腺病毒缓释微球的与CPC复合可能提供理想的局部负荷力学重建，并可以作为药物缓释的载体。使复合的CPC磷酸钙骨水泥材料在填充修复的同时也具有进一步治疗的疗效，使得治疗效果提高，使复杂用药方式简便化。复合物是否能提供理想的局部负荷力学重建，这需要下步进一步对复合物的力学测试研究。本实验的药物缓释系统用磷酸钙骨水泥为载体（CPC），可以使得缓释药物在局部使用缓慢释放过程中，局部的血药浓度高，并可以长期存在。重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物是一种集骨修复和药物治疗于一体的较理想的新型功能人工骨，作为重组人p53腺病毒的控释载体，该体系能有效缓释具有生物活性的重组人p53腺病毒超过12天，且突释较小。重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物的缓释液良好的生物活性，可有效抑制胃癌细胞的增殖。提示重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物对于骨肿瘤有极大的临床应用价值。这一结果为进一步应用该复合物进行体内实验，研究其对荷瘤裸鼠的肿瘤抑制情况提供了理论基础。32 结论1、PLGA包埋的重组人p53腺病毒缓释微球与CPC复合后可提供理想的药物缓释作用；2、重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物的缓释液良好的生物活性，可有效抑制胃癌细胞的增殖；3、重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物集骨修复和抗肿瘤药物于一体骨填充材料。33 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第三部分重组人p53腺病毒PLGA缓释微球复合磷酸钙骨水泥体内抗胃癌动物实验材料与方法一、细胞、材料及主要实验试剂1、重组人p53腺病毒PLGA缓释微球CPC复合物：重组人p53腺病毒注射液(rAd-p53，商品名为今又生，深圳市赛百诺基12因技术有限公司1X10VP/ml)；PLGA(山东医疗器械研究所，MW=l,6000,GA/LA=50:50)。自固化磷酸钙骨水泥(CalciumphosphatecementCPC)（上海瑞邦公司）2、人胃癌细胞株：胃癌细胞BGC一8233、甲氨蝶呤：广东岭南制药有限公司4、胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司5、胰酶细胞消化液：美国Gibco公司6、改良型RPMI-1640培养基：赛默飞世尔生物化学制品有限公司7、磷酸盐缓冲液：赛默飞世尔生物化学制品有限公司二、实验器材1、Centrifage5810R-离心机：eppendorf公司2、光学显微镜：奥林巴斯（OLYMPUS）23、25CM细胞培养皿24、75CM细胞培养皿5、二氧化碳细胞培养皿6、SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台7、液氮生物容器三、实验动物及饲养从中国科学院实验中心引进的BALB/c-nu/nu裸鼠，在蚌埠医学院科研中心组织移植安徽省重点实验室SPF条件下饲养。笼具、垫料、饮水及饲料均经消毒处理，无菌操作。37 四、实验方法：1、胃癌细胞的培养和扩增1.1胃癌细胞BGC-823的解冻和复苏：操作前净化工作台用75%的酒精擦洗，30分钟紫外线消毒后，风淋10分钟。胃癌BGC-823细胞株由液氮中取出后，迅速放入水浴摇床中，37℃左右温水快速摇晃至完全融化后。无菌条件下1000转/分钟离心去掉冻存液，无血清培养基洗涤一次，适量培养基吹散细胞，将悬浮细胞加入含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml的培养液中，补足培养液5ml，将细胞培养瓶置于37℃，饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中常规培养。1.2胃癌细胞BGC-823的换液、传代培养：3-4天细胞换液一次，换液时弃旧培养基，PBS2ml冲洗3-5次后加入5ml含10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的RMPI-1640培养基。待胃癌BGC-823细胞铺满整个培养瓶底面90%时，对数期生长状态良好的胃癌BGC-823细胞，吸除培养液后，去上清，胰蛋白酶2ml于37℃条件下消化30秒，消化期间不断摇晃培养瓶，至细胞变圆。加入2ml培养基终止消化，并轻轻反复吸吹液体冲洗贴壁细胞，使细胞从瓶壁上脱落。将细胞转至无菌离心管中，1000转/分离心5分钟，弃去2上清液，加入培养液悬浮细胞并转至2个25cm培养瓶，补足培养液继续培养。2、裸鼠胃癌模型的制备：待胃癌BGC-823细胞培养至将铺满瓶壁时去上清，将细胞收集至15ml无菌离心管中，加入PBS溶液至10ml，反复吸吹液体混匀细胞悬液；1000转/分低温离心5min，去上清；加入PBS缓冲液至10ml，反复吸吹液体混匀细胞悬液；再次1000转/分低温离心5min，去上清；加入0.9%NaCl溶液2ml，反复吸吹液体混匀细胞悬液；从中精量吸取少量细胞悬液用于细胞计数仪测量细胞浓度，将6细胞悬液稀释为5.0×10/ml。接种组每只裸鼠于右腋窝皮下注射细胞悬液0.2ml。3、重组人p53腺病毒PLGA微球磷酸钙骨水泥复合物植入3.1实验裸鼠的分组：裸鼠18只，雌雄不限，重量20g左右，4-6周龄。随机分成三组，分别为A、B、C组，每组6只。其中A组为重组人p53腺病毒PLGA微球磷酸钙骨水泥复合物组、B组为MTX复合磷酸钙骨水泥组，C组为单纯磷酸钙骨水泥组。3.2复合物植入实验裸鼠：38 打开净化工作台紫外灯消毒30分钟，裸鼠体表碘伏消毒腋窝瘤体部位皮肤。消毒、将注射针头刺入瘤体内，将重组人p53腺病毒PLGA微球磷酸钙骨水泥复合物、MTX复合磷酸钙骨水泥、单纯磷酸钙骨水泥推入其中。拔出针头后碘伏棉签按压皮肤。4、观察指标4.1接种肿瘤后每天观察裸鼠的生存状态，比较成瘤时间、成瘤率、成瘤大小。用药后定期用游标卡尺测量肿瘤的长、短径，计算肿瘤的体积。以标准公式V=长2×宽/2计算肿瘤体积。4.2接种肿瘤2周后植入复合物21天后，引颈法处死各组裸鼠，取出肿瘤后观察肿瘤大并称重，常规石腊包埋固定标本，HE染色切片，观察肿瘤生长情况及坏死情况。4.3病理组织学观察：标本苏木素-伊红（HE）染色进行病理组织学观察，观察坏死情况并计算肿瘤细胞坏死率（计算肿瘤细胞坏死率=坏死肿瘤细胞面积/全部肿瘤细胞面积×100%）。5、统计学处理采用SPSS19.0统计软件，数据都以均数±标准差表示，采用完全随机设计资料的方差分析及多个样本均数间的两两比较分析。实验结果一、胃癌动物模型治疗前后肿瘤瘤体体积比较：（见图3-1）1、接种瘤细胞的各组裸鼠在接种后1周均于前臂右侧腋窝处出现米粒大小3肿块，后期肿瘤快速增大。12天后肿瘤体积为(101.3±12.7)mm。2、A组重组人p53腺病毒PLGA微球磷酸钙骨水泥复合物植入后出现瘤体明显缩小，肿瘤生长不仅受到抑制，而且被杀死。肿瘤最终体积为肿瘤终体积为3(59.3±9.4)mm，（0.053±0.008）克。3、B组裸鼠MTX复合酸钙骨水泥植入后瘤体出现生长受到一定的抑制，肿瘤体积与对照组相比增长缓慢，但较植入前，肿瘤仍然增长。肿瘤最终体积为3，(181.2±11.6)mm（0.163±0.011）克。4、C组裸鼠植入单纯磷酸钙骨水泥后肿瘤生长迅速，呈现恶性持续增长，裸39 3鼠呈现恶体质状态，至21天后肿瘤体积达(472.9±37.1)mm，（0.426±0.033）克。5、采用SPSS19.0统计软件统计分析表明A、B组与C组各组之间肿瘤差别非常显著(P<0.01)。图3-1A为注射重组人p53腺病毒PLGA微球磷酸钙骨水泥复合物组B为MTX复合磷酸钙骨水泥C为单独磷酸钙骨水泥组图3-2A为注射重组人p53腺病毒PLGA微球磷酸钙骨水泥复合物最终瘤体B为MTX复合磷酸钙骨水泥最终瘤体C为单磷酸钙骨水泥组最终瘤体二、肿瘤病理学检查表3-1各组肿瘤坏死率（%）ABC178.0240.671.43279.0542.165.51370.8140.023.50479.9747.793.81583.2042.571.54670.4146.556.53Mean76.9143.293.72SD5.183.172.06HE染色（图3-3A、B、C）：A组肿瘤切面可见大片明显坏死灶，且局部纤维组织增生明显。B组主要为大面积的变性为主，坏死区相对于A组较小。C组肿瘤增殖旺盛，肿瘤细胞密集，40 分化可，核质深染，核仁粗大，可见较多核分裂相，瘤细胞中可见小灶性坏死，可能是肿瘤快速生长后，中央局部缺血所导致。肿瘤细胞坏死率（表3-1）：计算A组肿瘤细胞坏死率为76.91%±5.18；B组肿瘤细胞坏死率为43.29%±3.17。C组肿瘤有部分坏死可能是CPC直接压迫所致。图3-3A组重组人p53腺病毒PLGA微球磷酸钙骨水泥复合物41 讨论1、p53基因p53基因是目前了解最多的肿瘤抑制基因之一，它的产物是以转录调节因子的方式调节核转录和细胞周期的核蛋白。它定位于染色体17p13.1，编码的正常p53蛋白（野生型）存在于核内，是一种核结合蛋白。正常的p53蛋白在DNA损伤或缺氧时活化，使依赖p53的CDK抑制物P21和DNA修复基因上调性转录，细胞在G1期出现生长停滞，进行DNA修复。临床研究均显示，在肺癌中导入野生型p53基因能抑制肿瘤生长，促进细胞凋亡及增加肿瘤的化放疗敏感性，并且不受肺[12、13]癌细胞内源性p53状况的影响。野生型p53基因在保持细胞增长，抑制细胞的恶性增殖中起到至关重要的作[1]用。发生突变的p53蛋白，其空间构象亦发生了改变，不仅其自身失去了抑制肿[2-3]瘤作用，而且自身也有了致癌活性，从而决定着和影响了肿瘤对化疗和放疗的[4]敏感性、转移以及肿瘤的生长。已有文献报道,肿瘤细胞导入野生型p53基因后，p53基因影响了肿瘤细胞周期和诱导肿瘤细胞凋亡、增加肿瘤组织对放疗和化疗的[4-6]敏感性。p53抑癌基因具有调节p21、mdm2、GADD45等下游基图3-3B组MTX复合磷酸钙骨水泥42 图3-3C组单独磷酸钙骨水泥组因的作用，调节与凋亡有关的基因如Bax、DRS、IGFs和干扰生长因子的信号转导通路的作用。并具有抑制血管内皮生长因子(VEGF)基因和药物多抗性(MDR)基[7,8]因表达的作用，从而使癌细胞凋亡。2、重组人p53腺病毒重组人p53腺病毒(rAd-p53)是将p53基因和腺病毒（5型）经过基因重组技术构建成的。今又生注射液就是rAd-p53，抗肿瘤作用机制是通过病毒载体所携带得p53基因进入靶细胞内发挥生物效能作用。另外其还能通过抑制肿瘤血管生成，[9][10]旁观者效应，提高机体对化疗药物敏感性等机制来抑制肿瘤生长。DpOrazi等报道，重组人p53腺病毒注射液在可以杀死乳腺癌细胞的安全剂量下，它对外周[11]血细胞和骨髓干细胞都没有影响。国外相关报道表明，重组人p53腺病毒(rAd-p53)是广谱抗癌制品，可以经过多种途径给药，单独使用或联合其他抗癌治疗多种肿瘤疗效显著且安全可靠。对患者肿瘤组织的p53基因分析发现，重组人p53腺病毒注射液的疗效与肿瘤细胞中的p53基因状态没有显著的关系，这都表明重组人p53腺病毒注射液可以适用于大部分肿瘤的治疗，提示其有良好的临床应用前景。[14-16]目前，重组人p53腺病毒基因治疗正被广泛用于各种肿瘤的临床实验。[17,18]并且其在临床研究中，发现重组p53基因对多种肿瘤的治疗有着显著地效果。目前，重组人p53腺病毒在体内的抗瘤效果的研究可以用肿瘤大小和患者的生存43 期来进行评估。从本研究结果中可看到，A组重组人p53腺病毒PLGA微球磷酸钙骨水泥复合物植入后出现瘤体明显缩小，肿瘤生长不仅受到抑制，而且被杀死。B组裸鼠MTX复合酸钙骨水泥植入后瘤体出现生长受到一定的抑制，肿瘤体积与对照组相比增长缓慢，但较植入前，肿瘤仍然增长。C组裸鼠植入单纯磷酸钙骨水泥后肿瘤生长迅速，呈现恶性持续增长。病理结果也与其相符合，A组肿瘤切面可见大片明显坏死灶，且局部纤维组织增生明显。B组主要为大面积的变性为主，坏死区相对于A组较小。C组肿瘤增殖旺盛，肿瘤细胞密集。这正说明了重组人p53腺病毒通过包埋与CPC复合后，在裸鼠体内能够继续发挥生物学效应，持续抗肿瘤效应。44 结论1、重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物在祼鼠体内可抑制胃癌移植瘤的生长、侵袭；2、重组人p53腺病毒PLGA缓释微球磷酸钙骨水泥复合物既能填充修复骨缺损，同时又能持续发挥抗肿瘤作用，为骨肿瘤术后骨缺损或椎体转移性椎体肿瘤经皮微创椎体强化治疗提供了新的思路，有望成为一种新型的具有抗肿瘤作用的骨充填材料。45 参考文献[1]KimJH,ChoiKY,LeeDJ.LossofHeterozygositiesinFiveTumorSuppressorGenes(FHITGene,p16,pRb,E-Cadherinandp53)inThyroidTumors.ClinExpOtorhinolaryngol.2014,7(1):53-8.[2]HoeKK,VermaCS,LaneDP.Druggingthep53pathway:understandingtheroutetoclinicalefficacy.NatRevDrugDiscov.2014,13(3):217-36.[3]LoweSW,BodisS,McClatcheyA,etal.p53statusandtheefficacyofcancertherapyinvivo.Science,1994,266(5186):807-810.[4]TokalovSV,PieckS,GutzeitHO.Varyingresponsesofhumancellswithdiscrepantp53activitytoionizingradiationandheatshockexposure[J].CellProlif,2007,40(1):24-37.[5]SwitherSG，RothJA,KomakiR,etal.Inductionofp53-regulatedgenesandtumorregressioninlungcancerpatientsafterintratumoraldeliveryofadenovirualp53(INGN201)andradiationtherapy[J].ClinCancerRes,2003,9(1):93-101.[6]VenturaA,KirschDG,MclaughlinME,etal.Restorationofp53functionleadstotumourregressioninvivo[J].Nature,2007,445(7128)：661-665.[7]LawlerJ,MiaoWM,DuquetteM,etal.Thrombospondin-1geneexpressionaffectssurvivalandtumorspectrumofp53-deficientmice.AmJPathol,2001,159(3):1949-1956.[8]BushJA,LiG.Cancerchemoresistance:therelationshipbetweenp53andmultidrugtrans-porters[J].IntJCancer,2002,98(3):323-330.[9]PengZ.CurrentstatusofgendicineinChina:recombinanthumanAd-p53agentfortreatmentofcancers[J].HumGeneTher,2005,16(9):1016-1027.[10]DpOraziG,MarchettiA,CrescenziM.Exogenouswt-p53proteinisactiveintransformedcellsbutnotintheirnon-transformedcounterparts:implicationsforcancergenetherapywithouttumortargeting[J].JGeneMed,2000,2(1):11-21.[11]LorneJH，PerwezH,CurtisCH.p53:25yearsafterritsdiscovery[J].TrendsPharmacolSci,2004,25(4):177-181[12]LinMT,LeeRC,YangPC,etal.Cyclooxygenase-2inducingMcl-1-dependentsurvivalmechanisminhumanlungadenocarcinomaCL1.0cells.Involvementofphosphatidylinositol3-kinase/Aktpathway..InvolvementofPhosPhatiydlinositol3-kinase/AktPhatway.JBiolChem.2001,276(52):48997-9002.[13]MasferrerJL,LeahyKM,KokiAT,etal.Antiangiogenicandantitumoractivitiesofcyclooxygenase-2inhibitors.CancerRes,2000,60(5):1306-1311.[14]SchulerM,HerrmannR,DeGreveJL,etal.Adenovirus-mediatedwild-typep53genetransferinpatientsreceivingchemotherapyforadvancednon-small-celllungcancer:resultsofa46 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致谢三年的研究生生涯即将结束，在许多前辈老师的悉心指导和同学朋友的关怀鼓励下，我顺利完成了学业，这些年点点滴滴的进步都凝聚着他们的心血。值此论文完成之际，向所有给予我支持与关怀的人们致以深深的谢意！通过三年的学习，我的理论、实践、科研都有了全面的提升，为此我要由衷地感谢所有关心帮助我的人们！首先特别感谢的是我的导师牛国旗副教授，导师精深的学术修养、严谨的治学态度、渊博的学识、积极豁达的处世风格令我受益匪浅。生活中，导师也无时无刻给予关怀、鼓励，让我这三年里度过了无忧无虑的时光。感谢蚌埠医学院第一附属医院骨科胡汝麒教授、潘功平教授、周建生教授、肖玉周教授、周新社副教授、张长春副教授、官建中副教授、丁海副教授和王志岩副主任医师等各位老师在本论文的开题和实验过程中给予的支持和指导！感谢李昭程副主任医师等科室各位老师以及科室的护士和师兄妹们在临床学习中的无私帮助和指导，这些是我一生享用不尽的财富和珍贵的回忆！最后感谢我的家人，是他们的物质和精神上的支持让我可以全身心的投入到学习和工作中来！衷心感谢所有在求学和生活中给予我真诚帮助的人！48 主要英文缩略词表缩写词英文全称中文全称rAd-p53Recombinantadenovirusmediatedp53gene腺病毒介导p53基因PLGApoly(lactic-co-glycolicacid)聚乳酸－乙醇酸共聚物PVApolyvinylalcohol聚乙烯醇CPCCalciumPhosphateCement磷酸钙骨水泥HAPHydroxyapatite羟基磷灰石W/O/OW/O/Ophaseseparationmethod乳剂溶剂挥发法MTXMethotrexate甲氨喋呤49 附录：综述经皮椎体成形术及椎体后凸成形术的现状及进展汪东综述牛国旗审校经皮椎体成形术(percutaneousvertebroplasty,PVP)自从第一次应用于C2椎体血管瘤患者获得奇效，随后与椎体后凸成形术(percutaneouskyphoplasty,PKP)被应用于原发继发椎体肿瘤、侵袭性椎体血管瘤、骨质疏松引起的压缩性骨折，均获得了良好的疗效。它们是脊柱外科近十几年迅速发展的一项新型微创脊柱外科技术,是通过经皮向病变的椎体内直接注入(PVP)或者先通过球囊扩张再注入(PKP)骨水泥等填充物,从而增强椎体的强度和力学稳定性,临床应用证实其有稳定可靠、迅速有效的治疗效果,且并发症少。引起各地医院的广泛关注,现就此综述如下。1适应症与禁忌症1.1适应症目前PVP与PKP绝大多数用于多种病因引起的椎体压缩性骨折(vertebralcompressionfractures,vCF)的治疗中,常见的原发性疾病种类有:①外伤性VCF。②侵袭性血管瘤。③骨髓瘤。④转移性肿瘤。⑤骨质疏松症。1.2禁忌证①急性椎体骨折及椎体高度的完全丧失;②硬膜外脓肿、败血症、［1］椎体骨髓炎、椎间盘炎;③椎板减压术、椎体骨质破坏和椎体塌陷>75%④椎体骨折造成严重的压迫脊髓症状⑤患者有严重肺疾和严重的出、凝血性疾病⑥成骨细胞转移肿瘤。1.3二者相比PKP与PVP比较，优点如下：（1）与PVP相比，PKP可通过气囊的扩张作用能够更好地将骨折椎体丢失的高度尽可能的恢复，研究表明PVP能将丢［2］失的高度恢复大约在30％，PKP则可以将丢失的高度恢复到原来97％的高度；（2）与PVP相比，PKP还能将椎体的稳定性更好地增加；（3）PKP是先通过球囊在病变椎体扩张后，再注入骨水泥的，这时推注骨水泥需要的力量相比PVP推注时，明显减小。由于扩张的球囊将疏松空洞的椎体压实，将骨水泥可能发生渗漏的通道50 ［3］封闭，所以相比于PVP，PKP可以大大降低骨水泥的渗漏的发生可能性。相比于PVP，当然PKP也有相当一些不足和缺点，比如所需的昂贵的费用、在扩张球囊时，病人有时会有严重的疼痛感，手术完成所需时间比较长及手术过程中，患者对所用的显影剂来说，有可能过敏等。在椎体肿瘤治疗方面的适应证，PVP与PKP基本相同，主要有肿瘤细胞吞噬和破坏椎体引起剧烈的椎体局限性疼痛和新发的病理性椎体压缩性骨折等。在禁忌证方面，PVP与PKP也基本相同。还有如过敏性体质［4］（尤其对手术所用显影剂）、妊娠、粉碎性椎体骨折、成骨性病变等。2手术方法及注意事项2.1手术方法对于颈椎进行PKP与PVP手术，常采用前外侧入路的方法,腰胸椎段则采用后外侧入路或者通过椎弓根入路。经椎弓根入路方法降低了损伤节段神经的发生率、降低了椎旁骨水泥渗漏的危险,但是肿瘤病变侵犯椎弓根时，使得椎弓根在影像学显影不清楚时应当谨慎小心的使用。在腰椎PKP与PVP手术时，采用后外侧入路方法比较容易简单,但是在胸椎节段手术时，可能引起气胸的风险。局部麻醉成功后，在C臂机透视监控下，定位成功合适后，用外科锤将10一14G穿刺针对椎体进行穿刺，经椎弓根穿入椎体，最佳的穿刺位置，应当是穿刺针尖在穿刺椎体的前部三分之一的位置,穿刺过程中，不时C臂机透视监控穿刺针在椎体内，不能刺破椎弓根的内侧缘，有损伤脊髓和神经的可能，同样不能刺破椎体后缘，增加骨水泥渗漏的风险，且保证穿刺针的针尖的方向面向需要注射的部位,可以先取肿瘤性病变并送活检。在注射前骨水泥前注入显影对比剂，以了解椎体内静脉的回流。然后在2一3min内将事先调制好待用的骨水泥在C臂机严密监视下快速注人需要强化的椎体内,最后在骨水泥硬化前期拔针。而PKP是在穿刺针在位后,将穿刺针芯拔出，插入导丝，再拔除穿刺针，顺导丝插入较粗的工作套管超过椎体后缘2mm即可；或者用带工作套管的穿刺针直接穿刺，在穿刺针到达椎体后三分之一时，将工作套管顺穿刺针推至超过椎体后缘2mm即可，将穿刺针取出。将丝锥插入工作套管，在椎体内扩大通道距椎体前缘3一5mm后拔出。将带有压力表的高压注射器抽入造影剂至少20ml，连接头端带球囊的导管后排出气体，将球囊端插入到椎体前缘的通道顶端，向球囊内注入造影剂，C臂机透视监控观察球囊扩展和椎体复位情况，复位好后，退出球囊，注入骨水泥。51 2.2注意事项2.2.1经椎弓根入路时，穿刺针水平面的角度:在胸椎阶段穿刺针离后正中平面外展角度大约为7°～10°，在腰椎阶段则离后正中平面外展角度大约为10°～15°。如果穿刺时这个角度偏小，有将前方同侧骨皮质穿破的危险，并且穿刺针不能够越过病椎的中线，这样只能够复位和将单侧的病椎填充;若穿刺时这个角度偏大，穿刺针能够越过病椎的中线，这样就能将椎体的二侧兼顾，从而减少了穿刺次数并缩短了手术所需的时间，但是这样有穿破椎弓根的内侧缘的风险，有损伤脊髓和神经的可能，甚至增加了骨水泥渗漏的危险。因此在手术操作时，C臂机透视必须时时监控，并由经椎弓根进针经验丰富的医师来操作。2.2.2单侧、双侧椎弓根穿刺的选择:依据手术前常规的X线正位片，第一步从明显压缩的一侧椎弓根穿刺、并注入骨水泥，假如手术中，经单侧椎弓根注入填充不足时，这时有必要考虑另一侧辅助注入。一般来说，单侧椎弓根穿刺的创伤比较小，所需手术时间短，穿刺次数少，从而减少了器械费用和放射暴露。双侧椎弓根穿刺能够更好获得骨水泥的填充，并且减少各侧椎体注射时的压力，从而［5］降低了骨水泥渗漏的危险。但Chen等发现各组视觉模拟评分和Oswestry功能障碍指数评分显着改善（P<0.001），单双侧组间没有显着差异。虽然双侧组的恢复率明显高于单侧组（P=0.005）在早期阶段，6个月或2年后高度丢失率二组间没有表现出显着的差异，（P=0.746，0.627）。的填充，并且减少各侧椎体注射时的压力，从而降低了骨水泥渗漏的危险。3填充材料3.1PMMA骨水泥是目前椎体成形术与后凸成形术最常采用的充填材料，由多聚体粉剂和液态单体混合组成,但其很多缺点却是致命的：生物相容性差，无生物活性，聚合时释放大量的热，将可能导致正常的细胞死亡和周围重要的组织灼伤;未聚合单体的毒性等，此外，还可能引起脂肪栓塞，低血压可能。它还有作为植入物,是无法生物降解的。这些缺点导致了PMMA在临床应用时常常会发生一些严重的并发症。3.2磷酸钙骨水泥磷酸钙骨水泥（CPC）具有良好的生物相容性和骨传导性，并能在体内降解等优点已被少数学者在后凸成形术中试用，但同样存在一些问题：脆性大，在负载情况下易碎裂；屈服强度稍差，在椎体内填充时不能承受较大的52 压力；其无机性使之在体内环境下聚合后强度比体外有明显下降，而且CPC溶剂易与血液混合发生游走，引起严重并发症；单纯CPC在体内不具备骨诱导性，尚不能在椎体内诱导成骨。国内外学者将CPC与各种材料进行复合，如骨形态发生蛋白（BoneMorphogeneticProtein，BMP）、TGF-β、壳聚糖、可吸收纤维、胶原等，但均未能取得突破性的进展，但将CPC与BMP复合物具有良好的骨诱导性[6]已经得到肯定。CPC它不像PMMA聚合时释放大量的热，磷酸钙骨水泥有两类：磷酸氢钙骨水泥（brushitecement）和磷灰石骨水泥（apatitecement）。[7]磷酸氢钙骨水泥由于降解速度过快从而大大削弱了生物力学作用，并且由于它的固化时间短，所以注射时要更快，临床应用较少。3.3高粘度骨水泥以色列Dise-O-Tech医疗技术公司研发的Confidence高粘度骨水泥是在传统PMMA骨水泥基础上改进的新产品，没有传统的骨水泥混合过程中的液态期，具有瞬间高粘度、可注射时间长、低温聚合等优点，大大降低骨水泥[8]渗漏的风险和骨水泥聚合热效应，避免了肺栓塞，提高了安全性。陈晓东等用高粘度骨水泥治疗胸腰椎骨质疏松性轻度爆裂性骨折，取得较好的疗效，但仍存在不可降解等缺点。[9、10]3.4新型复合型骨水泥Hernandz等基于水泥基本配方聚甲基丙烯酸甲酯加入锶磷灰石（SrHA）研制生物活性骨水泥。其需10和20％（质量比）单体表面处理SrHA作为合成成分。加载处理的颗粒的骨水泥显示其性能提高比如其流变行为提高，注入性和压缩参数的提高。进一步研究发现，当单体表面处理SrHA占20%时，其相容性和生物活性也表现良好。发展潜力的新材料和注射生物活性骨水泥[11]或抗癌产品，在转移性疾病的治疗，将彻底改变这种情况。4并发症4.1进行穿刺时的并发症：所穿刺部位血肿，如硬膜外血肿，椎弓根内侧壁破裂导致。如果产生脊髓压迫症状应及时手术。再有穿刺针偏下损伤神经根或偏内损伤硬模，可引起单侧神经痛或放射性疼痛。4.2骨水泥渗漏它是PKP与PVP手术最常见并发症，有学者研究发现术后如果发生[12]骨水泥渗漏，邻近的椎体常发生骨折。Rho等研究发现椎间盘的骨水泥渗漏和骨质疏松症是对于邻近的椎体继发性骨折的发生至关重要的危险因素之一。[13]Pitton等对191例患者（61名男性，130名女性，年龄70.7±9.7年）385块发53 生继发骨折的邻近椎体进行研究，发现有约三分之一的椎体与骨水泥渗漏有关。4.3肺栓塞和血管栓塞上、下腔静脉系不仅由椎静脉丛所沟通，而且交通支及静脉大都没有静脉瓣，可直接由椎静脉丛进入颅内。若注入骨水泥时，压力过大，椎体内骨水泥及组织可由静脉丛内的血液带走，最后汇入到上下腔静脉系统，再[14]通过腔静脉系统移至腔静脉,形成血栓,当到达肺动脉时,可并发肺栓塞,肺栓[15][16]塞广泛报道的发病率，从2.1％到26％不等。还有学者研究发现直接在T9的水平进行经皮椎体成形，骨水泥渗透到T9下面的蒂根动脉造成节段动脉栓塞的并发症。4.4肋骨骨折手术常发生肋骨骨折,这是由于在胸椎段进行PVP术时,从横突和肋骨头之间进入的穿刺针，可能将肋骨折断。[17]4.5临近的椎体骨折Yang等随访了11例进行了PKP患者，平均随访了24.3个月，研究发现被注射的椎体的2个相邻椎体容易发生继发性骨折。5安全性回顾[18]Ning等研究54例患者中，在PVP治疗后1个月时的疼痛均较治疗前明显缓解（VAS评分分别为2.55±1.55和6.98±1.09分，P＜0.05）。8例在PVP治疗前伴有脊髓功能障碍的患者，其中3例由治疗前的FrankelC级恢复至治疗后的FrankelD级，5例由治疗前的FrankelD级恢复至治疗后的FrankelE级。54例患者在PVP治疗后1个月时的活动能力也较治疗前明显改善（P＜0.05）。研究PVP治疗的创伤较小、手术时间较短、耐受性较好，骨转移性肿瘤引起的疼痛可以得到有效的缓解，并可增强椎体骨的强度，提高脊柱稳定性，改善患者的生活质量，具有较好的应[19]用价值。赵基民等对21例患者进行PVP手术，手术均顺利无严重并发症。随访3～24个月，X线片示骨水泥充盈良好，椎体高度无丢失，腰背疼痛明显缓解。[20]PVP治疗骨质疏松胸腰椎骨折安全有效、值得应用。Xing等对一项涵盖783例病例资料分析，经皮椎体成形术与球囊后凸成形术（KP）在治疗骨质疏松性椎体压缩性骨折（OVCF）的安全性和有效性进行评估，分析表明经皮椎体成形术与球囊后凸成形术是既安全又有效的手术治疗OVCF程序。6展望PVP及PKP由于能够迅速缓解椎体原发继发肿瘤、椎体侵袭性血管瘤、骨质疏松性压缩性骨折引起的疼痛，且安全性高，易被广大的患者接受，已在临床上广泛应用。在临床上只要严格把握适应症与禁忌症，操作规范，均能获得比较满54 意的疗效。由于传统的骨水泥的缺陷，发展潜力的新材料和注射生物活性骨水泥或抗癌产品，在转移性疾病的治疗，将彻底改变这种情况。参考文献[1]罗奋棋．经皮椎体成形术临床治疗进展[J]．福建医药杂志,2008,30(3):87-90.[2]XingD,MaJX,MaXL，etal.Ameta-analysisofballoonkyphoplastycomparedtopercutan-eousvertebroplastyfortreatingosteoporoticvertebralcompressionfractures[J].ClinNeurosci.2013Jun;20(6):795-803.[3]ZarghooniK,SieweJ,KaulhausenT,etal.Complicationsofvertebroplastyandkyphoplastyinthetreatmentofvertebralfractures:resultsofaquestionnairestudy[J].ActaOrthopBelg.2012Aug;78(4):512-8.[4]R?llinghoffM,ZarghooniK,Schlüter-BrustK,etal.Indicationsandcontraindicationsforvertebroplastyandkyphoplasty[J].ArchOrthopTraumaSurg.2010Jun;130(6):765-74.[5]ChenC,WeiH,ZhangW,etal.Comparativestudyofkyphoplastyforchronicpainfulosteoporoticvertebralcompressionfracturesviaunipedicularversusbipedicularapproach[J].SpinalDisordTech.2011Oct;24(7):E62-5.[6]BaiB,YinZ,XuQ,etal.HistologicalchangesofaninjectablerhBMP-2/calciumphosphatecementinvertebroplastyofrhesusmonkey[J].Spine(PhilaPa1976).2009Aug15;34(18):1887-92.[7]DorozhkinSV.Calciumorthophosphatecementsforbiomedicalapplication[J].MaterSci,2008,43（9）:3028-3057[8]陈晓东，易小波，王洪，等.高粘度骨水泥胸腰椎骨质疏松性轻度爆裂性骨折疗效观察[J].中国骨与关节损伤杂志，2010,25（2）:134-136.[9]HernandezL，GurruchagaM，GoniI．Injectableacrylicbonecementsforvertebroplastybasedonaradiopaquehydroxyap-atite：formulationandrheologicalbehaviour[J]．MaterSci：MaterMed，2009，20（1）：89-97．[10]HernandezL,ParraJ,VázquezB,etal.Injectableacrylicbonecementsforvertebroplastybasedonaradiopaquehydroxyap-atite;bioactivityandbiocompatibility[J]．JMaterRes,2009,88（1）:103-114.55 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