奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定ppt课件

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奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定汇报人：赵新芳

1奶牛乳房炎是奶牛的常见病和多发病，是造成奶养殖业经济损失的重要因素之一。其中微生物因素是引发奶牛乳房炎的主要因素，多种非特定的病原微生物均能引起奶牛乳房炎，如细菌、霉形体、真菌、病毒等。较常见的致病菌约为150多种，以金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌为主。准确的检测出奶牛乳房炎的致病菌，利用药敏试验选出适合药物，对临床上预防和治疗奶牛乳房炎起指导作用。

2细菌的初步分离及鉴定药敏试验PCR扩增琼脂凝胶电泳目录

3试验流程图

4细菌的初步分离及鉴定一1.奶样采集采集奶样时，先用温水将乳房擦洗干净后，以75％的酒精消毒乳头，弃去前3把奶，然后以无菌操作方法挤下约5mL～10mL奶样于灭菌试管中，低温保存。乳样标明牛号和日期后，随即带回实验室进行病原菌的分离鉴定。在南阳飞龙、驻马店牛硕、新密民康、淇县维尔、焦作奔奔、鼎元等奶牛场共采样品60个。

5细菌的初步分离及鉴定一2.细菌的分离培养无菌操作吸取0.1mI乳样分别接种于5mLBHI，脑心浸出液肉汤37℃恒温培养箱过夜培养，→划线血平皿（用于溶血定性试验，革兰氏阳性菌）和麦康凯琼脂平板（革兰氏阴性菌）→次日观察菌落形态（颜色，大小，是否溶血）、革兰氏染色→血平皿上挑单个菌落，将培养基平板置于37℃恒温培养箱培养24h，观察细菌菌落生长情况

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8二药敏试验结果

9PCR的扩增三菌液保存采用甘油冻干法保存菌液，加菌液500μL，60%甘油500μL。封口膜密封-20℃保存。细菌基因组的提取取培养好的肉汤于离心管中，10000r/min离心3min，弃上清，加入200μLElutionBuffer，混匀，用封口膜封口；煮沸8min，冷却；10000r/min离心3min，取上清液，-20℃保存备用

10PCR扩增三根据已发表的细菌的16SrRNA基因保守序列，设计合成引物。提取基因组DNA作为模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。16SrRNA基因保守序列，PCR引物设计见表1。

11PCR扩增四PCR反应条件50μL的PCR反应体系：包括25μLEsTaqMix，上下游引物各0.8μL，模板2μL，去离子水21.4μL。PCR反应条件：先94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；末轮循环结束后72℃延伸7min。

12琼脂糖凝胶电泳四称取1.0g琼脂糖，加入TAE缓冲液100mL，用微波炉中火加热至沸腾，时间一般为4分钟。冷却至50℃左右，加入EB 3μL轻轻震荡使其混合均匀，倒入胶版中，厚度大约为齿子高度的1/3处即可，冷却至凝固。将固态凝胶放入电泳槽中，移去梳子，加入TAE缓冲液至胶面以上1mm处；用微量移液器依次加入5μLPCR产物，DNAMarkerDL2000作为标准,加入5μL。电压100V，时间30min。用凝胶成像系统拍照，保存结果。测序。

13琼脂糖凝胶电泳四M电泳图

14不足之处请各位批评指正！谢谢观看！